CN113151187A - 一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用 - Google Patents

一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113151187A
CN113151187A CN202110327732.1A CN202110327732A CN113151187A CN 113151187 A CN113151187 A CN 113151187A CN 202110327732 A CN202110327732 A CN 202110327732A CN 113151187 A CN113151187 A CN 113151187A
Authority
CN
China
Prior art keywords
blocking
monoclonal antibody
swine fever
african swine
elisa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110327732.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113151187B (zh
Inventor
姜平
张路捷
高雁怩
白娟
夏婷婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN202110327732.1A priority Critical patent/CN113151187B/zh
Publication of CN113151187A publication Critical patent/CN113151187A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113151187B publication Critical patent/CN113151187B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用，该杂交瘤细胞株命名为小鼠SP2/0杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日为：2021年1月8日，保藏号为：CGMCC NO：21489。本发明成功制备并筛选出1株抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体，用于建立了ASFV阻断ELISA抗体检测方法。该方法敏感性和特异性高，重复性好，具有重要应用价值。

Description

一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用
技术领域
本发明属于免疫学检测方法技术领域，具体公开一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)正严重危害我国养猪业发展。目前，国际上尚无安全有效疫苗。该病毒研究进展缓慢，临床上缺少有效的抗体检测试剂。本研究成功制备并筛选出1株抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体，建立了一种阻断ELISA抗体检测方法，敏感性、特异性达到国际同类产品水平，具有重要应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒抗体检测阻断ELISA试剂盒。
本发明的又一目的在于提供上述非洲猪瘟病毒抗体检测阻断ELISA试剂盒的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种分泌非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为小鼠SP2/0 杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日为：2021年1月8日，保藏号为：CGMCC NO：21489。
一种非洲猪瘟病毒单克隆抗体，由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。
上述的非洲猪瘟病毒单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒中的应用。
上述的非洲猪瘟病毒单克隆抗体在非诊疗目的的阻断ELISA抗体检测非洲猪瘟病毒中的应用。
一种非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒包括以重组ASFV p72蛋白作为抗原包被的ELISA板、ELISA标准阳性血清、ELISA阴性血清、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体和TMB底物溶液，所述的单克隆抗体为权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
作为一种优选技术方案，该试剂盒还包括抗原稀释液、封闭液、样品稀释液和终止液；进一步优选的，所述的抗原稀释液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液(称取0.17g无水Na2CO3、0.28g NaHCO3于双蒸水中并定容至100mL)，封闭液为1％BSA，所述的样品稀释液为PBST，所述的终止液为2mol/L硫酸。
进一步优选的，所述的重组ASFV p72蛋白的制备方法为：参考GenBank数据库中ASFV Pig/HLJ/2018(GenBank MK333180)毒株的B646L(p72)基因序列设计特异性引物：：
P72-EcoR I-F：CCGGAATTCATGGCATCAGGAGGAG
P72-Xho I-R：CGCCTCGAGGAGCGCAAGAGGGGGC
扩增B646L基因1-329aa区域，将扩增得到的基因片段克隆至pET-28a(+)表达载体获得重组质粒pET-28a-His-p72t，将重组质粒转化至BL21(DE3)中进行诱导表达，收集沉淀进行纯化，得到纯化后的重组蛋白His-p72t。
上述的阻断ELISA抗体检测试剂盒在非洲猪瘟病毒抗体检测中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。
一种非诊疗目的的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法，该方法步骤如下：
(1)包被ELISA板；以His-p72t作为抗原，用抗原稀释液稀释纯化的His-p72t包被ELISA板；
(2)用封闭液封闭ELISA板；
(3)加入稀释后的待检血清孵育；
(4)加入稀释后的的酶标单抗，所述的单抗为权利要求2所述的单克隆抗体；
(5)显色，终止，并在酶标仪上读取OD450nm值；
(6)按照以下公式计算阻断率，阻断率(percentage inhibition/PI)＝[(阴性血清OD450nm值-阳性血清OD450nm值)/阴性血清OD450nm值]×100％；当PI≥50％时判为阳性； PI≤40％时判为阴性；40％＜PI＜50％时判定为可疑。
本发明主要有以下要点：
(1)研制了12株单克隆抗体，明确了其抗原表位。研制了12株稳定分泌抗ASFV p72蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blot结果表明，所有单克隆抗体均能与ASFV发生特异性的反应。IFA结果表明，只有6C6和6G5单克隆抗体能够识别ASFV。鉴定出6种不同的p72蛋白线性B细胞表位。生物信息学分析结果表明，51QIEETHL57,63HFKPYVPV70,83TPTLGNKL90,147QTPLEGAV-YTL157和208TTLVRKFCI216抗原表位在不同的ASFV毒株中高度保守。然而，243CNIHDLHK250抗原表位在不同ASFV毒株中保守性较差。51QIEETHL57抗原表位具有较高抗原性和亲水性，并且该表位完全暴露在p72蛋白表面。因此51QIEETHL57抗原表位很可能是p72蛋白中重要的线性B细胞表位。
(2)筛选出一株优良单抗，用于阻断ELISA，具有高特异性。采用上述12株单克隆抗体，分别用于阻断ELISA抗体检测方法，检测ASFV阴阳性血清抗体，发现6E5单克隆抗体检测效果最好。
(3)成功建立单抗阻断ELISA抗体检测方法。用纯化的重组p72蛋白作为包被抗原，采用棋盘法确定最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数。并对阻断ELISA的其他条件 (封闭液、封闭时间、血清反应时间、酶标抗体稀释度、酶标抗体反应时间等)进行优化，结果表明：最佳抗原包被浓度为0.5μg/mL；最佳封闭剂为1％BSA，每孔200μL，37℃封闭 2h；待检血清最佳稀释度为1:1，作用时间为37℃1h；酶标单抗最佳稀释度为1:4000，最佳反应条件为37℃1h；底物最佳反应时间为37℃10min。ELISA结果的判定标准为：血清样品阻断率PI≥50％判为阳性；PI≤40％时判为阴性；40％＜PI＜50％时判定为可疑。该方法与PRV、PRRSV、CSFV、PCV2、SVA和FMDV阳性血清无交叉反应性。ELISA重复性试验表明，批间和批内的变异系数均小于10％。比较实验结果表明，该ELISA的相对敏感性和特异性分别为93.5％和94.0％，与IDvet ASFV p30阻断ELISA试剂盒的符合率为 93.8％。该方法敏感性高，特异性强、重复率高，可用于非洲猪瘟病毒抗体检测和血清流行病学调查。
本发明的有益效果：
本发明成功制备并筛选出1株抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体，建立了一种阻断ELISA 抗体检测方法，敏感性、特异性达到国际同类产品水平，具有重要应用价值。
附图说明
图1PCR扩增ASFV B646L(1-329aa)片段。
图2His-p72t重组蛋白原核表达鉴定；
其中，A:SDS-PAGE分析His-p72t重组蛋白的原核表达；M：蛋白分子量标准；1：诱导上清；2：诱导沉淀；3：诱导全菌；4：未诱导全菌；5：诱导空载体全菌；6：His-p72t重组蛋白纯化后；B:Western blot分析His-p72t重组蛋白的抗原性；M：蛋白分子量标准；1：诱导沉淀；2：诱导空载体全菌。
图3免疫小鼠血清效价测定。
图4单克隆抗体Western blot反应性鉴定。
图5单克隆抗体IFA反应性鉴定。
图6单克隆抗体表位鉴定；
结果显示，6C6和6G5单克隆抗体能够与F1、F11、F12、F13和F14片段反应，不能与F2、F3、F4、F7和F10片段反应，证明6C6和6G5识别的抗原表位位于51QIEETHL57(图6A)；6F7和8G4单克隆抗体能够与F1、F9、F10和F13片段反应，不能与F2、F3、F4、F7和F8片段反应，证明6F7和8G4识别的抗原表位位于63HFKPYVPV70(图6B)；8B8和9H11单克隆抗体能够与F1、F6、F7、F8和F13片段反应，不能与F2、F3、F4和F5片段反应，证明8B8和9H11识别的单抗表位位于83TPTLGNKL90(图6C)；6E1和10B7单克隆抗体能够与F1、F2和F17片段反应，不能与 F15和F16片段反应，证明6E1和10B7的抗原表位位于147QTPLEGAVYTL157(图6D)； 6C1、6E5和10D2单克隆抗体能够与F2、F19、F20和F23片段反应，不能与F1、F18、 F25和F26片段反应，证明6C1、6E5和10D2识别的抗原表位位于208TTLVRKFCI216(图 6E)；5H11单克隆抗体能够与F2、F22、F23和F24片段反应，不能与F1、F18、F19、F20 和F21片段反应，证明5H11抗原表位位于243CNIHDLHK250(图6F)。
图7抗原表位保守性分析；
其中，A：不同ASFV毒株p72氨基酸序列比较；B：His-p72t(L57M)突变体反应性鉴定；1：His-p72t；2：His-p72t(L57M)；C：His-p72t(V70I)突变体反应性鉴定；1：His-p72t； 2：His-p72t(V70I)；D：His-p72t(V211A)突变体反应性鉴定；1：His-p72t；2：His-p72t (V211A)；E：His-p72t(I245V,H246Q,L248M)突变体反应性鉴定；1：His-p72t；2：His-p72t (I245V,H246Q,L248M)。
图8抗原表位空间结构分析；
其中，A：P72蛋白二级结构；B：P72蛋白表面结构。
图9p72蛋白亲水性和抗原性分析；
其中，A：P72蛋白亲水性分析；B：P72蛋白抗原性分析。
图10单抗纯化的SDS-PAGE分析；
其中，M：蛋白分子质量标准；1：6E5单抗腹水；2：纯化的6E5单抗样品。
具体实施方式
以下实施例是为了更好地理解本发明，但并不限定本发明。以下实施例中采用的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。以下实施例中所用的试验材料等，如无特殊说明，均可从常规生化试剂公司购买。
试验一、ASFV单克隆抗体研制
1.材料与方法
1.1细胞、病毒和实验动物
ASFV Pig/HLJ/2018(GenBank MK333180)强毒株由哈尔滨兽医研究所保存，并在生物安全3级实验室(BSL-3)中进行病毒感染实验。小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)由本实验室保存。原代 PAM细胞参考文献[1]记载方法取自4周龄ASFV阴性的正常仔猪。SPF级6～8周龄雌性 BALB/c小鼠和ICR小鼠均购自扬州大学实验动物中心。
1.2载体、菌株和主要试剂
原核表达载体pET-28a(+)、pET-32a(+)和大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)由本实验室保存。限制性核酸内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher公司； IPTG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT、PEG4000均购自Sigma公司；RPMI- 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；TMB显色液、羊抗鼠IgG(H+L)-HRP购自上海碧云天生物技术有限公司；FITC标记的羊抗鼠IgG购自proteintech公司；小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自Proteintech生物科技有限公司；TanonTM High-sig ECL Western blotting底物试剂盒购自上海天能科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3基因序列合成及重组质粒构建
参考GenBank数据库中ASFV Pig/HLJ/2018(GenBank MK333180)毒株的B646L基因序列设计并合成含酶切位点的PCR引物(具体引物序列见表1)扩增B646L基因1-329aa区域。引物中含有EcoR I和Xho I酶切位点以便将扩增的序列克隆到pET-28a(+)表达载体中。PCR扩增程序：95℃2min；95℃10s，53℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min。将PCR产物通过1％琼脂糖凝胶进行电泳分析并回收。pET-28a(+)载体和目的片段用EcoR I和Xho I限制性核酸内切酶处理并回收。用T4 DNA连接酶将酶切后的目的片段和载体在22℃下连接2h。将连接产物转化至DH5a中，通过菌液PCR鉴定、双酶切鉴定后送通用生物***公司测序，将测序正确的质粒命名为pET-28a-p72并置于-20℃保存备用。
表1扩增B646L基因1-329氨基酸片段的引物序列
Figure RE-GDA0003105170760000051
1.4p72重组蛋白的诱导表达及纯化
将重组质粒pET-28a-His-p72t和pET-28a(+)空载分别转化至BL21(DE3)中，挑取单菌落于37℃200×g中振荡培养16h，再将菌液按1:100的比例接种于500mL液体LB培养基(含有100μg/mL的卡那霉素)于37℃200×g中振荡培养至菌液OD450 nm值为0.6-0.8左右，加入终浓度为1mM/L的IPTG于37℃200×g中振荡培养6h，将菌液8,000×g离心10 min，用PBS(0.1mM/L)洗涤菌体3次，菌体用20mL PBS(0.1mM/L)重悬。随后用超声波破碎仪裂解菌体于4℃12,000×g离心10min收集沉淀和上清进行SDS-PAGE和Western blot分析，以鉴定其表达形式及免疫原性。His-p72t重组蛋白通过尿素透析法进行纯化[2,3]。通过BCA法测定重组p72蛋白浓度，将纯化后的His-p72t置于-80℃中长期保存。
1.5抗ASFV p72蛋白单抗制备
1.5.1动物免疫
动物实验方案经南京农业大学动物保护与伦理委员会批准。动物实验按照动物生物医学研究指导守则进行。小鼠免疫程序参考文献记载方法[4]。将纯化的His-p72t重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1混匀乳化，通过皮下多点注射方式免疫小鼠，免疫剂量为50μg/只。二免、三免用弗氏不完全佐剂乳化，每次免疫间隔两周，第3次免疫后一周对小鼠进行尾部采血，用间接ELISA方法测定血清抗体效价；融合前3天选取抗体效价最高的小鼠进行冲击免疫，腹腔注射100μg重组蛋白。
1.5.2单克隆抗体制备
P72单克隆抗体制备参考文献[4-6]记载方法。冲击免疫后三天将Balb/c小鼠安乐死并分离脾细胞，在PEG4000作用下与对数生长期的SP2/0细胞按照7:1的比例进行细胞融合。将融合细胞铺至96孔板中并在HAT选择培养基中培养。细胞融合7天后，吸取100μL培养上清进行检测。
采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，将纯化的His-p72t重组蛋白作为抗原包被酶标板(抗原包被浓度1μg/mL)于4℃包被过夜并用5％脱脂乳于37℃封闭2h。以免疫组小鼠的多抗血清作为阳性血清，对照组小鼠的血清作为阴性血清，分别进行1:500稀释，与包被抗原在37℃中反应1h；PBST洗涤板条3次后加入100μL羊抗鼠IgG(H+L)–HRP (1：1000稀释)于37℃反应45min；PBST洗涤板条3次，加入100μL TMB显色液于37℃避光显色10min后加入50μL 2M H2SO4终止反应。用酶标仪读取OD450nm吸光度。选取P/N 值大于2.1的细胞孔进行亚克隆。
阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法进行2-3次亚克隆直至抗体阳性率达100％。将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株扩大培养，细胞冻存于液氮中长期保存。选取12周龄的BALB/c小鼠制备单抗腹水，待小鼠腹部膨大且有波动感时采集腹水，8,000xg离心10min收集上清，通过间接ELISA方法测定其抗体效价。取杂交瘤细胞培养上清，按照小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书对单克隆抗体进行亚型鉴定。
1.6免疫印迹(Western blot)鉴定
将PAMs铺至12孔细胞板中(2.0×106个/孔)，ASFV Pig/HLJ/2018毒株按MOI＝1接种细胞，感染后24h后收集细胞样品，按常规方法进行SDS-PAGE电泳，通过湿转至硝酸纤维素膜上(NC膜)。NC膜用5％脱脂乳的PBST封闭液室温封闭2h，随后用PBST洗涤3次，每次10min。然后将NC膜放入ASFV标准阳性血清(1:200稀释)或单克隆抗体(1:1000稀释) 中，室温孵育1h。洗涤方式同上，将NC膜放入的葡萄球菌A蛋白-HRP(1:10000稀释)或羊抗鼠IgG(H+L)-HRP(1:1000稀释)中，室温孵育45min。用TanonTM High-sig ECL Western blotting底物试剂盒进行曝光显影鉴定。
1.7间接免疫荧光实验(IFA)
间接免疫荧光实验参考文献[7]记载方法，并进行了一些改进。将PAM细胞按照1×106个/孔的密度铺至48孔板，ASFV Pig/HLJ/2018毒株按MOI＝1接种细胞，同时设置正常细胞作为空白对照。感染后24h，用PBS洗涤细胞3次后加入预冷的无水乙醇，于-20℃固定30min。用PBS洗涤细胞3次后加入2％BSA，于37℃封闭2h。随后每孔加入100μL阳性杂交瘤细胞上清，于37℃反应1h，同时设立SP2/0细胞上清作一抗的阴性对照。洗涤后，加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1:200稀释)，于37℃反应1h后，置于荧光显微镜下观察。
1.8抗原表位的初步鉴定
为了初步鉴定单克隆抗体的抗原表位，通过PCR扩增一系列重叠截短的B646L基因(具体引物序列见表2)并克隆至pET-32a(+)。利用大肠杆菌原核表达***表达出重组蛋白，以杂交瘤细胞上清为一抗，羊抗鼠IgG(H+L)–HRP作为二抗进行Western blot鉴定。
表2扩增B646L基因重叠片段的引物序列
Figure RE-GDA0003105170760000071
Figure RE-GDA0003105170760000081
1.9生物信息学分析
通过BioEdit V7.0软件对不同ASFV毒株的同一抗原表位进行序列比对，分析其保守性。同时，从RCSB网站(http://www1.rcsb.org/)获取p72蛋白晶体结构数据(PDB:6L2T)通过 PyMol软件展示不同抗原表位在p72蛋白晶体结构中的空间分布。此外，通过IEDB网站(http://tools.immune-epitope.org/main/)分析不同抗原表位的抗原性和亲水性。
2结果
2.1B646L基因原核表达载体的构建
通过PCR扩增出B646L(1-329aa)基因片段(图1PCR扩增ASFV B646L(1-329aa)片段)。将目的片段及pET-28a(+)空载用EcoR I和Xho I限制性核酸内切酶分别酶切后进行连接、转化，重组质粒经酶切鉴定和测序鉴定后命名为pET-28a-His-p72t。
2.2His-p72t重组蛋白原核表达鉴定
表达菌通过超声破碎处理后，进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明：IPTG浓度为1mM/L时，37℃条件下诱导6h后，与空载对照组相比，pET-28a-His-p72t转化菌在40KDa 出现明显的差异条带，与预期大小相符。该重组蛋白主要以包涵体形式表达在细菌裂解物的沉淀中(图2A，第2泳道)。His-p72t重组蛋白通过包涵体纯化方式进行纯化后，目的蛋白纯度较高(图2A，第6泳道)。Western Blot结果显示，His-p72t重组蛋白能够与ASFV阳性血清发生特异性反应，在40KDa处可见特异性的反应条带(图2B，第1泳道)。
2.3小鼠血清效价测定
通过间接ELISA方法测定免疫His-p72t重组蛋白的小鼠血清效价。结果如图3所示，与阴性小鼠相比，免疫组内的所有小鼠在三次加强免疫后均表现出具有较高水平的p72蛋白抗体效价(效价范围：1:12,800至1:25,600)。
2.4P72单克隆抗体的制备与鉴定
本研究通过间接ELISA方法筛选出了12株单克隆抗体。采用Western blot实验和IFA 实验进一步验证单克隆抗体的反应性。抗体亚型鉴定结果显示，12株单克隆抗体的重链属于IgG1型，轻链属于Kappa链(表3)。用p72间接ELISA方法测定单克隆抗体腹水效价，结果显示上述腹水均具有较高水平p72蛋白抗体效价(表3)。
表3单抗的腹水效价和亚型鉴定结果
Figure RE-GDA0003105170760000091
2.5Western blot反应性鉴定
Westernblot结果显示，上述单克隆抗体均能与ASFV发生特异性反应并且在73.2KDa 出有明显的目的条带(图4)
2.6IFA反应性鉴定
IFA结果显示，只有6C6和6G5单克隆抗体与ASFV发生特异性反应可见明显的绿色荧光(图5)。
2.7单克隆抗体的表位鉴定
通过原核表达***表达一系列p72蛋白的截短体(表2)，利用Western blot实验初步鉴定上述单克隆抗体的抗原表位。结果显示，6C6和6G5单克隆抗体能够与F1、F11、F12、F13和F14片段反应，不能与F2、F3、F4、F7和F10片段反应，证明6C6和6G5识别的抗原表位位于51QIEETHL57(图6A)。6F7和8G4单克隆抗体能够与F1、F9、F10和F13片段反应，不能与F2、F3、F4、F7和F8片段反应，证明6F7和8G4识别的抗原表位位于63HFKPYVPV70(图6B)。8B8和9H11单克隆抗体能够与F1、F6、F7、F8和F13片段反应，不能与F2、F3、F4和F5片段反应，证明8B8和9H11识别的单抗表位位于83TPTLGNKL90(图6C)。6E1和10B7单克隆抗体能够与F1、F2和F17片段反应，不能与F15和F16片段反应，证明6E1和10B7的抗原表位位于147QTPLEGAVYTL157(图6D)。 6C1、6E5和10D2单克隆抗体能够与F2、F19、F20和F23片段反应，不能与F1、F18、F25和F26片段反应，证明6C1、6E5和10D2识别的抗原表位位于208TTLVRKFCI216(图 6E)。5H11单克隆抗体能够与F2、F22、F23和F24片段反应，不能与F1、F18、F19、F20 和F21片段反应，证明5H11抗原表位位于243CNIHDLHK250(图6F)。
2.8抗原表位的保守性分析
使用BioEidt V7.0软件比对18株ASFV参考毒株(表4)的p72氨基酸序列，分析上述抗原表位在不同毒株中的保守性。氨基酸比对结果如图7A所示，6种不同的抗原表位用不同颜色进行标注,83TPTLGNKL90和147QTPLEGAVYTL157抗原表位在9种ASFV基因型中高度保守。51QIEETHL57和63HFKPYVPV70抗原表位在I、II、III、IV、Va和XXa基因型中保守，但在VIII、Xb和XXI基因型中出现“L57M”,“V70I”的突变。208TTLVRKFCI216抗原表位只在ETH/1a(KT795359)毒株中出现“V211A”的突变。然而，利用原核***表达p72(L57M)、 p72(V70I)、p72(V211A)蛋白并进行Western blot反应性鉴定，结果显示突变后的蛋白仍能被相应单克隆抗体识别(图7B、C和D)，表明这些表位在ASFV各毒株间均保守。243CNIH- DLHK250抗原表位在I、II、III、IV、Va、VIII和XXa基因型中高度保守，但在Xb和XXII 基因型中出现“I245V”、“H246Q”和“L248M”的突变，并且这些突变导致5H11单克隆抗体无法识别p72蛋白。
表4本文引用的18株ASFV参考毒株情况
Figure RE-GDA0003105170760000101
Figure RE-GDA0003105170760000111
2.9抗原表位的空间结构特点分析
利用PyMol软件展示p72蛋白(PDB:6L2T)的空间构象。抗原表位的空间分布结果如图 8所示，6种不同的抗原表位用不同的颜色进行标注，208TTLVRKFCI216抗原表位呈螺旋状，并且部分裸露于p72蛋白表面(图8A和B，紫色)。63HFKPYVPV70和243CNIHDLHK250抗原表位呈无规则卷曲状，并且部分裸露于p72蛋白表面(图8A和B，绿色和棕色)。51QIEETHL57、147QTPLEGAVYTL157和83TPTLGNKL90抗原表位呈无规则卷曲状，并且完全裸露于p72蛋白表面(图8A和B，红色、亮蓝和黄色)。与此同时，通过IEDB在线网站预测了6种抗原表位的抗原性和亲水性指数，分析结果表明51QIEETHL57抗原表位的抗原性和亲水性较高(图9)。综合以上结果，我们推测51QIEETHL57抗原表位很可能时p72蛋白中重要的线性B细胞表位。
试验二、阻断ELISA方法单克隆抗体的筛选
1材料与方法
1.1细胞及主要试剂
His-p72t重组蛋白、非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体5H11、6C1、6C6、6E1、6E5、6F7、6G5、8B8、8G4、9H11、10B7、10D2由本实验室制备、鉴定及保存。非洲猪瘟病毒 (ASFV)标准阳性血清和阴性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员提供。羊抗鼠IgG(H+L)-HRP、四甲基联苯胺(TMB)购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.2杂交瘤细胞上清的阻断ELISA检测
将获得的杂交瘤细胞上清进行阻断ELISA试验，检测杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能否被ASFV阳性血清中的抗体阻断，以判断该单抗是否能够用于建立ASFV的阻断ELISA检测方法。ASFV阻断ELISA方法按照常规方法进行，具体试验步骤如下：
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释纯化的His-p72t重组蛋白至0.5μg/mL，包被96孔ELISA板，100μL/孔，置于37℃作用2h，然后用含有0.05％吐温20的0.05mol/L PBS (简称PBST，pH7.2)洗涤5次，每次1min。加入含有5％脱脂乳的PBST作为封闭液， 200μL/孔，37℃作用2h，洗涤同上。加入用PBST进行1:1稀释的ASFV标准阳性血清和阴性血清，100μL/孔，37℃作用1h，每组设置三个重复，结果取平均值。洗涤后加入杂交瘤细胞培养上清，100μL/孔，37℃作用1h，洗涤同上。再加入用PBST进行1:1000稀释的羊抗鼠IgG(H+L)-HRP，100μL/孔，37℃作用1h。洗涤后加入TMB底物溶液，100μL/ 孔，37℃显色10min至阴性对照显蓝色，阳性对照基本不显色，每孔加入2mol/L硫酸50 μL/孔终止反应。用酶标仪读取各孔OD450 nm值。按照以下公式计算阻断率，阻断率 (percentage inhibition/PI)＝[(阴性血清OD450 nm值-阳性血清OD450 nm值)/阴性血清 OD450 nm值]×100％。
2结果
按照1.2中阻断ELISA检测方法分别对上述12株非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体进行阻断ELISA检测，结果如表5所示，6E5杂交瘤细胞株上清的阻断率显著高于其他11株杂交瘤细胞上清，ASFV标准阴性血清对上述12株单克隆抗体均无明显阻断效果。由此可见，杂交瘤细胞株6E5分泌的单克隆抗体可以用于建立ASFV阻断ELISA方法。
表5杂交瘤细胞上清阻断ELISA检测结果
Figure RE-GDA0003105170760000121
试验三、ASFV阻断ELISA抗体检测方法建立与应用
1材料与方法
1.1细胞、菌株及主要试剂
宿主菌BL21(DE3)、pET-28a-His-p72t重组质粒、非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体 6E5由本实验室制备、鉴定及保存。非洲猪瘟病毒(ASFV)阳性血清和阴性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步子高研究员提供。猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、A型塞内卡病毒 (SVA)和猪***病毒(FMDV)均由本实验室收集保存。羊抗鼠IgG(H+L)-HRP、四甲基联苯胺(TMB)购自上海碧云天生物技术有限公司。非洲猪瘟病毒p30抗体阻断ELISA 试剂盒购自法国IDvet公司。
1.2His-p72t重组蛋白的表达与纯化
将pET-28a-His-p72t重组质粒转化至BL21(DE3)中，经IPTG诱导后，按照包涵体纯化方法进行重组蛋白的纯化[2,3]。纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定、BCA法测定浓度后，保存与-80℃中备用。
1.3单克隆抗体的纯化及辣根过氧化物酶(HRP)标记
本研究用分泌抗ASFV p72蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞6E5制备腹水，将腹水送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行抗体纯化和HRP标记，对纯化后抗体进行SDS-PAGE分析，并用直接ELISA对酶标抗体进行滴定。
1.4阻断ELISA操作基本步骤
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释纯化的His-p72t重组蛋白，包被96孔ELISA板，100μL/孔，置于37℃作用2h，然后用含有0.05％吐温20的0.05mol/L PBS(简称PBST， pH7.2)洗5次，每次1min。加入封闭液，200μL/孔，37℃作用1～3h，洗涤同上。加入 PBST稀释的待检血清，100μL/孔，37℃作用0.5～2.5h，洗涤后加入PBST稀释的酶标单抗 HRP-6E5，100μL/孔，37℃作用0.5～1h，洗涤后加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃显色5～15min，至阴性对照显蓝色，阳性对照基本不显色，每孔加入2mol/L硫酸50μL/孔终止反应。用酶标仪读取各孔OD450nm值。按照以下公式计算阻断率，阻断率(percentage inhibition/PI)＝[(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450nm值)/阴性血清OD450nm值]×100％。
1.5阻断ELISA最佳反应条件的选择
1.5.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择
按方阵滴定法进行，用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将抗原蛋白分别稀释至终浓度为2.0， 1.0，0.5，0.25，0.10μg/mL包被ELISA板，于37℃作用2h。洗涤后加入用PBST以1:1、 1:4、1:8、1:16稀释的ASFV阳性血清和阴性血清，按照1.4基本步骤进行阻断ELISA检测，每个稀释度重复3次，取其平均值，计算各组阳性血清的阻断率，选择阻断率最高的反应条件作为阻断ELISA最佳反应条件。
1.5.2抗原包被条件的选择
用上述确定的最佳抗原包被浓度，分别使用以下条件进行包被：(1)37℃作用2h；(2)4℃作用12h；(3)37℃作用2h后，4℃作用12h；将血清按最佳比例稀释后，按照 1.4基本步骤进行阻断ELISA，计算各组阻断率，根据阻断效果选择最适的抗原包被条件。
1.5.3最佳封闭液与封闭时间的选择
使用最佳抗原包被条件包被ELISA板，洗涤后，分别用含5％脱脂乳、1％BSA、0.1％BSA和2％明胶溶液作为封闭液进行阻断ELISA测定，计算阳性血清的阻断率，选择最佳的封闭液。选择封闭液后，分别于37℃下封闭1h、2h和3h，选择最佳的封闭时间。
1.5.4待检血清作用时间的选择
使用最佳条件包被和封闭ELISA板后，加入最佳稀释度的待检血清，于37℃分别作用0.5h、1.0h、1.5h、2.0h和2.5h，用上述优化的条件进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择合适的血清作用时间。
1.5.5酶标单抗工作浓度的选择
待检血清按最佳条件作用后，洗涤ELISA板，将酶标单抗分别用PBST按照1:2000、1:2500、1:3000、1:3500、1:4000、1:4500、1:5000进行稀释，100μL/孔，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择合适的酶标单抗工作浓度。
1.5.6酶标单抗作用时间的选择
将酶标单抗按最佳稀释倍数加入ELISA板后，于37℃分别作用0.5h、1h、和1.5h，对阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择合适的酶标单抗作用时间。
1.5.7底物最佳显色时间的选择
酶标抗体按最佳条件作用后，洗涤ELISA板，加入酶作用底物，37℃分别作用5min、10min、15min和20min，用2mol/L的H2SO4 50μL/孔终止后读数，计算各组阳性血清阻断率，以确定最佳底物作用时间。
1.6阻断ELISA临界值的确定
本研究用ASFV阴性猪血液样品，经IDvet公司生产的非洲猪瘟病毒p30抗体检测试剂盒检测为阴性的119份猪血清样品，用本文中建立的阻断ELISA检测其临界值，计算平均阻断率
Figure RE-GDA0003105170760000141
和标准差(SD)，以确定阻断ELISA结果判定的临界值。
1.7重复性试验
使用3批不同时间表达和纯化的p72蛋白包被阻断ELISA 板，选用3份ASFV阳性血清和2份健康猪血清，用相同批次和不同批次各3个ELISA酶标板进行批内和批间重复性试验，计算变异系数，以验证本方法的可重复性。
1.8交叉反应性试验
用本文建立的阻断ELISA检测猪PRV、PRRSV、CSFV、PCV2、SVA和FMDV参考阳性血清，并设立ASFV标准阴、阳性对照。分析该方法与其他常见猪病抗体是否存在交叉反应性。
1.9敏感性、特异性和符合率分析
选取已知的138份不同抗体水平的ASFV阳性血清(IDvet非洲猪瘟病毒p30抗体阻断 ELISA试剂盒检测)，在最佳条件下进行阻断ELISA测定，同时设立阴阳性对照。根据检测结果判定本方法的敏感性。另外，取217份经IDvet非洲猪瘟病毒p30抗体阻断ELISA试剂盒检测鉴定为阴性的猪血清样品用阻断ELISA方法进行检测，以判定本方法的特异性。按照如下公式计算：相对敏感性(％)＝[阳性数/(阳性数+假阴性数)]×100％；相对特异性(％)＝[阴性数/(阴性数+假阳性数)]×100％；总符合率(％)＝[(阳性数+ 阴性数)/检测总数]×100％。
2结果
2.1单克隆抗体的纯化与HRP标记
6E5小鼠腹水单抗纯化SDS-PAGE结果(见图10),抗体轻链和重链清晰可见。其蛋白的质量浓度为3.125mg/mL。对纯化的单抗进行HRP标记，标记后抗体的工作浓度为 1:4000倍稀释。
2.2阻断ELISA最佳反应条件的确定
通过对各种试剂的使用浓度进行筛选和反应条件的优化，最终确定：最佳抗原包被浓度为0.5μg/mL；最佳封闭剂为1％BSA，每孔200μL，37℃封闭2h；待检血清最佳稀释度为1:1，作用时间为37℃1h；酶标单抗最佳稀释度为1:4000，最佳反应条件为37℃1h；底物最佳反应时间为37℃10min。
2.3临界值确定
利用本研究建立的阻断ELISA方法检测119份已知阴性血清，结果经过统计分析，计算出阴性血清样品的平均阻断率
Figure RE-GDA0003105170760000152
为18.78％，标准差为10.50％，
Figure RE-GDA0003105170760000153
Figure RE-GDA0003105170760000154
当PI≥50％时判为阳性；PI≤40％时判为阴性；40％＜PI＜50％时判定为可疑。需重复检测1次，如果仍低于40％则判为血清抗体阴性。
2.4重复性试验
重复性试验结果表明，5份血清在批内和批间(见表6)试验中的变异系数均小于10％，证明该阻断ELISA检测方法具有良好的重复性。
表6阻断ELISA重复性试验
Figure RE-GDA0003105170760000151
2.5交叉反应性试验
利用本研究建立的阻断ELISA方法同时检测ASFV、PRV、PRRSV、CSFV、PCV2、 SVA和FMDV阳性血清。检测结果表明，除ASFV为阳性反应外，其他几种猪病毒参考阳性血清均为阴性反应，证明该阻断ELISA方法可特异性检测ASFV抗体，并与其他几种猪病原阳性血清无交叉反应(见表7)。
表7阻断ELISA的特异性试验
Figure RE-GDA0003105170760000161
2.6符合性试验
对355份猪血清分别用IDvet ASFV p30抗体阻断ELISA检测试剂盒和本研究建立的 p72抗体阻断ELISA方法进行检测。试剂盒检测结果为阳性138份，阴性217份。本研究建立的阻断ELISA方法检测结果为阳性142份，阴性213份。由此可知，本研究建立的阻断ELISA的相对敏感性为93.5％、相对特异性为94.0％、总符合率为93.8％(见表8)。
表8阻断ELISA的符合性试验
Figure RE-GDA0003105170760000162
参考文献
[1]Wensvoort G,Terpstra C,Pol J M A,Ter Laak E A,Bloemraad M,DeKluyver E P,Kragten C,Van Buiten L,Den Besten A,Wagenaar F J V Q.Mysteryswine disease in The Netherlands:the isolation of Lelystad virus[J].1991,13(3): 121-130.
[2]Arun,K.,Upadhyay,Anupam,Singh,K.,J.,Mukherjee,Amulya,MicrobiologyK J F I.Refolding and purification of recombinant L-asparaginase frominclusion bodies of E.coli into active tetrameric protein[J].2014.
[3]Eggenreich B,Willim M,Wurm D J,Herwig C,Spadiut O J B R.Productionstrategies for active heme-containing peroxidases from E.coli inclusionbodies–a review[J].2016,10(C).
[4]Heimerman M E,Murgia M V,Wu P,Lowe A D,Rowland R R J J O V D I O PO T a a O V L D,Inc.Linear epitopes in African swine fever virus p72recognized by monoclonal antibodies prepared against baculovirus-expressedantigen[J].2018,30(3):104063871775396.
[5]Juan,Bai,Xinhui,Chen,Kangfu,Jiang,Basit,Zeshan,Ping,Journal J JV.Identification of VP1 peptides diagnostic of encephalomyocarditis virusfrom swine[J].2014.
[6]Zhang P,Lv L,Sun H,Li S,Fan H,Wang X,Bai J,Jiang P J VM.Identification of linear B cell epitope on gB,gC, and gE proteins ofporcine pseudorabies virus using monoclonal antibodies[J].2019,234:83.
[7]Murgia M V,Mogler M,Certoma A,Green D,Monaghan P,Williams D T,Rowland R R R,Gaudreault N N. Evaluation of an African swine fever(ASF)vaccine strategy incorporating priming with an alphavirus-expressed antigenfollowed by boosting with attenuated ASF virus[J].Arch Virol,2019,164(2):359-370。

Claims (9)

1.一种分泌非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为小鼠SP2/0杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日为：2021年1月8日，保藏号为：CGMCC NO：21489。
2.一种非洲猪瘟病毒单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.权利要求2所述的非洲猪瘟病毒单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的非洲猪瘟病毒单克隆抗体在非诊疗目的的阻断ELISA抗体检测非洲猪瘟病毒中的应用。
5.一种非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以重组ASFV p72蛋白作为抗原包被的ELISA板、ELISA标准阳性血清、ELISA阴性血清、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体和TMB底物溶液，所述的单克隆抗体为权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括抗原稀释液、封闭液、样品稀释液和终止液；作为一种优选技术方案，所述的抗原稀释液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液，封闭液为1％BSA，所述的样品稀释液为PBST，所述的终止液为2mol/L硫酸。
7.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的重组ASFV p72蛋白的制备方法为：参考GenBank数据库中ASFV Pig/HLJ/2018(GenBankMK333180)毒株的B646L(p72)基因序列设计特异性引物：
P72-EcoR I-F：CCGGAATTCATGGCATCAGGAGGAG
P72-Xho I-R：CGCCTCGAGGAGCGCAAGAGGGGGC
扩增B646L基因1-329aa区域，将扩增得到的基因片段克隆至pET-28a(+)表达载体获得重组质粒pET-28a-His-p72t，将重组质粒转化至BL21(DE3)中进行诱导表达，收集沉淀进行纯化，得到纯化后的重组蛋白。
8.权利要求5-7中任一项所述的阻断ELISA抗体检测试剂盒在非洲猪瘟病毒抗体检测中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。
9.一种非诊疗目的的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法，其特征在于：该方法步骤如下：
(1)包被ELISA板；以重组ASFV p72蛋白作为抗原，用抗原稀释液稀释纯化的重组ASFVp72蛋白包被ELISA板；
(2)用封闭液封闭ELISA板；
(3)加入稀释后的待检血清孵育；
(4)加入稀释后的的酶标单抗，所述的单抗为权利要求2所述的单克隆抗体；
(5)显色，终止，并在酶标仪上读取OD450nm值；
(6)按照以下公式计算阻断率，阻断率(percentage inhibition/PI)＝[(阴性血清OD450nm值-阳性血清OD450nm值)/阴性血清OD450nm值]×100％；当PI≥50％时判为阳性；PI≤40％时判为阴性；40％＜PI＜50％时判定为可疑。
CN202110327732.1A 2021-03-26 2021-03-26 一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用 Active CN113151187B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110327732.1A CN113151187B (zh) 2021-03-26 2021-03-26 一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110327732.1A CN113151187B (zh) 2021-03-26 2021-03-26 一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113151187A true CN113151187A (zh) 2021-07-23
CN113151187B CN113151187B (zh) 2023-04-18

Family

ID=76885013

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110327732.1A Active CN113151187B (zh) 2021-03-26 2021-03-26 一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113151187B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113717945A (zh) * 2021-08-02 2021-11-30 河南农业大学 分泌抗非洲猪瘟病毒e165r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗体、抗原表位肽及应用
CN113801854A (zh) * 2021-08-27 2021-12-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用
CN114167055A (zh) * 2021-10-21 2022-03-11 山东绿都生物科技有限公司 一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒
CN114656553A (zh) * 2022-03-17 2022-06-24 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一株识别非洲猪瘟病毒p72蛋白的单克隆抗体、含有该单克隆抗体的试剂盒及其应用
CN115925887A (zh) * 2022-10-27 2023-04-07 华中农业大学 非洲猪瘟病毒pA104R蛋白免疫优势性B细胞抗原表位及其单克隆抗体与应用
CN116143888A (zh) * 2022-10-10 2023-05-23 沈阳农业大学 非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其应用
CN116444653A (zh) * 2023-03-09 2023-07-18 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一株阻断性非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用
CN116444652A (zh) * 2023-01-12 2023-07-18 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体的制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991009313A1 (es) * 1989-12-20 1991-06-27 Universidad De Oviedo Procedimiento de obtencion de una proteina recombinante y su uso en el ensayo del virus de la peste porcina africana (vppa)
CN104962581A (zh) * 2015-04-07 2015-10-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株
CN109781980A (zh) * 2019-01-30 2019-05-21 河南中泽生物工程有限公司 非洲猪瘟病毒快速检测卡及其应用
CN110642926A (zh) * 2019-12-02 2020-01-03 北京纳百生物科技有限公司 非洲猪瘟病毒p72重组蛋白、单克隆抗体及试纸
CN110658339A (zh) * 2019-12-02 2020-01-07 北京纳百生物科技有限公司 非洲猪瘟病毒的检测试纸、试剂盒及其制备方法
WO2020251284A1 (ko) * 2019-06-12 2020-12-17 연세대학교 원주산학협력단 아프리카 돼지 열병 바이러스 유래 p72, p104, p205 단백질 절편 및 이의 용도

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991009313A1 (es) * 1989-12-20 1991-06-27 Universidad De Oviedo Procedimiento de obtencion de una proteina recombinante y su uso en el ensayo del virus de la peste porcina africana (vppa)
CN104962581A (zh) * 2015-04-07 2015-10-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株
CN109781980A (zh) * 2019-01-30 2019-05-21 河南中泽生物工程有限公司 非洲猪瘟病毒快速检测卡及其应用
WO2020251284A1 (ko) * 2019-06-12 2020-12-17 연세대학교 원주산학협력단 아프리카 돼지 열병 바이러스 유래 p72, p104, p205 단백질 절편 및 이의 용도
CN110642926A (zh) * 2019-12-02 2020-01-03 北京纳百生物科技有限公司 非洲猪瘟病毒p72重组蛋白、单克隆抗体及试纸
CN110658339A (zh) * 2019-12-02 2020-01-07 北京纳百生物科技有限公司 非洲猪瘟病毒的检测试纸、试剂盒及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEIMERMAN M E等: "Linear epitopes in African swine fever virus p72 recognized by monoclonal antibodies prepared against baculovirus-expressed antigen", 《JOURNAL OF VETERINARY DIAGNOSTIC INVESTIGATION》 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113717945B (zh) * 2021-08-02 2023-08-11 河南农业大学 分泌抗非洲猪瘟病毒e165r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗体、抗原表位肽及应用
CN113717945A (zh) * 2021-08-02 2021-11-30 河南农业大学 分泌抗非洲猪瘟病毒e165r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗体、抗原表位肽及应用
CN113801854A (zh) * 2021-08-27 2021-12-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用
CN113801854B (zh) * 2021-08-27 2023-02-28 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用
CN114167055B (zh) * 2021-10-21 2023-07-18 山东绿都生物科技有限公司 一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒
CN114167055A (zh) * 2021-10-21 2022-03-11 山东绿都生物科技有限公司 一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒
CN114656553A (zh) * 2022-03-17 2022-06-24 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一株识别非洲猪瘟病毒p72蛋白的单克隆抗体、含有该单克隆抗体的试剂盒及其应用
CN116143888A (zh) * 2022-10-10 2023-05-23 沈阳农业大学 非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其应用
CN116143888B (zh) * 2022-10-10 2024-05-14 沈阳农业大学 非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其应用
CN115925887A (zh) * 2022-10-27 2023-04-07 华中农业大学 非洲猪瘟病毒pA104R蛋白免疫优势性B细胞抗原表位及其单克隆抗体与应用
CN115925887B (zh) * 2022-10-27 2024-02-09 华中农业大学 非洲猪瘟病毒pA104R蛋白免疫优势性B细胞抗原表位及其单克隆抗体与应用
CN116444652A (zh) * 2023-01-12 2023-07-18 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体的制备方法
CN116444652B (zh) * 2023-01-12 2023-08-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体的制备方法
CN116444653A (zh) * 2023-03-09 2023-07-18 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一株阻断性非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用
CN116444653B (zh) * 2023-03-09 2024-03-15 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一株阻断性非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113151187B (zh) 2023-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113151187B (zh) 一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用
US8232048B2 (en) Hybridoma cell line producing monoclonal antibody against foot-and-mouth disease virus, the monoclonal antibody therefrom, immunoassay reagent and kit, and immunoassay method
CN111848786B (zh) 一种单克隆抗体、其制备方法及用途
CN108614121B (zh) 牛病毒性腹泻病毒e2蛋白抗原多表位融合肽及其制备与应用
CN112111005A (zh) 一种能与阳性血清竞争结合非洲猪瘟病毒b646l抗原的单克隆抗体及其应用
CN114874995B (zh) 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用
AU2020102599A4 (en) Indirect ELISA Detection Method and Application of DHAV-3 Antibody Based on VP2 or VP4 Recombinant Protein Antigen
CN113740536A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p30阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN114236128A (zh) 一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白抗体的阻断elisa试剂盒
CN110845624B (zh) 一种sumo-cp融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法
CN112980802B (zh) 一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用
CN113677792A (zh) Csfv亚单位疫苗
CN108559754B (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5基因修饰的重组蛋白及其应用
CN107253979B (zh) 单克隆抗体10b10识别的***病毒血清型共享性抗原表位及其应用
KR102086089B1 (ko) 재조합 n 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 아까바네바이러스 블러킹 효소결합면역측정법
CN115057925B (zh) 一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其应用
CN116217716A (zh) 一种识别柯萨奇病毒a2、a4和a5的单克隆抗体及其应用
CN116284352A (zh) 牛白血病病毒抗体及检测试剂盒
CN113956353A (zh) 抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体、该单克隆抗体的识别区域及其应用
CN113687073A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
Jin et al. Optimized expression, purification of herpes B virus gD protein in escherichia coli, and production of its monoclonal antibodies
Longyant et al. Specific monoclonal antibodies raised against Taura syndrome virus (TSV) capsid protein VP3 detect TSV in single and dual infections with white spot syndrome virus (WSSV)
KR20100105974A (ko) 재조합 ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법
CN116333060B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白及其制备方法和用途、基因、试剂盒和检测方法
CN117487006B (zh) 一种抗a型塞内卡病毒的单克隆抗体以及抗原表位及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 210043 Nanjing Agricultural University, Baguazhou street, Qixia District, Nanjing City, Jiangsu Province

Patentee after: NANJING AGRICULTURAL University

Address before: 211225 Jiangsu Nanjing Lishui District Baima Town National Agricultural Science and Technology Park Nanjing Agricultural University base

Patentee before: NANJING AGRICULTURAL University

CP02 Change in the address of a patent holder