CN113151162A - 外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人脐带间充质干细胞外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用，及一种促进壁蜕膜间充质干细胞生长的方法。本发明将人脐带间充质干细胞外泌体与PDB‑MSCs共同培养后，PDB‑MSCs的细胞增殖能力强、细胞形态良好、细胞活力强，即本发明的人脐带间充质干细胞外泌体可提高PDB‑MSCs的质量，有效提高PDB‑MSCs分泌细胞因子VEGF和SCF的能力，从而可解决PDB‑MSCs多次传代增殖能力下降、细胞活力差等问题，进而有效有利于PDB‑MSCs的大规模培养和临床应用。

Description

外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用，以及一种促进壁蜕膜间充质干细胞生长的方法。
背景技术
壁蜕膜间充质干细胞(Parietal decidual basalis-mesenchymal stem cells，PDB-MSCs)具有间充质干细胞的多向分化潜能、低免疫原性等共同特点。与其它来源的间充质干细胞相比，PDB-MSCs来源于母体，和母体有更好的相容性，纯度更均一，成脂分化能力比围产期其它组织来源的间充质干细胞强；又有报道表明，PDB-MSCs比脐带间充质干细胞分泌更多的血管内皮生长因子(VEGF)和干细胞生长因子(SCF)，表明PDB-MSCs具有促进血管再生和细胞***等功能，证明PDB-MSCs对组织损伤修复有重要作用。PDB-MSCs在干细胞临床应用中将有较好前景。
但目前，PDB-MSCs的应用还面临一些问题：现有方法和技术能分离纯度较高的PDB-MSCs，但在传代后PDB-MSCs易衰老，细胞扁平，增殖缓慢或停止增殖，失去分化能力等，因此需要新的方法或技术以有效保持PDB-MSCs的形态，防止细胞老化，维持细胞在多次传代后的增殖活力和分化能力。
外泌体是一种直径为30～100nm的脂质栓分子囊泡，包括肿瘤细胞在内，几乎所有类型的细胞都可以产生并释放外泌体。外泌体内含有细胞特异性表达的核酸、脂质、蛋白质等，可通过胞膜融合的方式将生物分子传递给与外环境接触的靶细胞，有促进靶细胞增殖的作用。
公开号为CN105349487的专利公开了一种基于外泌体的促人骨髓间充质干细胞增殖的方法，采用第一代或第二代的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体来促进人骨髓间充质干细胞增殖，外泌体的含量和来源受到较大的限制。此外，外泌体促进人骨髓间充质干细胞的培养基，含有质量百分比5％UltraGRO和含质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基，该培养基配方复杂，难以重现试验效果。其次，促进间充质干细胞增殖实验进行放大培养时，操作较为繁琐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供了人脐带间充质干细胞外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用。
本发明还要解决的技术问题在于，提供了一种促进壁蜕膜间充质干细胞生长的方法，有效促进PDB-MSCs的增殖和缩短细胞倍增时间，增加细胞周期S期的比例，提高PDB-MSCs的质量，有效提高其分泌细胞因子VEGF和SCF的能力，有利于PDB-MSCs的大规模培养和临床应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了人脐带间充质干细胞外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用。
作为上述方案的改进，所述人脐带间充质干细胞外泌体是由P5代人脐带间充质干细胞分泌的。
作为上述方案的改进，所述人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括：
S1、将P4代的人脐带间充质干细胞按9000～12000个/cm2的浓度接种于培养瓶中，加入20～30ml无血清增殖培养基进行培养；
S2、培养至90％融合度时，收集上清液，得到第一上清液；
S3、将第一上清液离心，收集上清液，得到第二上清液；
S4、将第二上清液过滤，得到滤渣，将滤渣离心并收集底部沉淀，用0.8～1.5mlPBS重悬沉淀，最后通过过滤，滤渣即为人脐带间充质干细胞外泌体。
作为上述方案的改进，所述P4代人脐带间充质干细胞的制备方法包括：
S11、用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶，清洗后剪碎成1～2mm3碎块，采用组织贴壁法接种培养；
S2、原代细胞培养至70％融合度时进行传代培养，培养至P4代。
作为上述方案的改进，步骤S12中，每代细胞增殖融合大于80％后，采用PBS缓冲液洗涤细胞表面至少2次，用胰酶消化4～7min，加入培养基终止消化，过滤，离心，细胞培养基重悬沉淀，再次传代，直至培养至P4代。
作为上述方案的改进，所述胰酶为20～30％的Tryple-EDTA酶。
作为上述方案的改进，步骤S11中，所述组织保护液由0.5～3ml生理盐水、20～30μg硫酸庆大霉素、3～6μg两性霉素B制成。
相应地，本发明还提供了一种促进壁蜕膜间充质干细胞生长的方法，包括：
A、制备含有外泌体的细胞培养基，将上述的人脐带间充质干细胞外泌体以浓度10～30μg/ml加入到间充质干细胞无血清培养基中；
B、将壁蜕膜间充质干细胞按照每孔1.5×103～2.5×103个的浓度接种于细胞培养板，并加入含有外泌体的细胞培养基；
C、将细胞培养板置于培养箱中培养，其中，培养箱内的培养温度为35～40℃，CO2浓度为4％～7％。
作为上述方案的改进，步骤B中，P12代的壁蜕膜间充质干细胞种于细胞培养板。
作为上述方案的改进，步骤A中，将人脐带间充质干细胞外泌体以浓度20μg/ml加入到间充质干细胞无血清培养基中。
实施本发明，具有如下有益效果：
1、本发明提供的人脐带间充质干细胞外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用，尚未被文献及专利公开。
2、本发明采用P5代人脐带间充质干细胞来提取外泌体，不仅拓宽外泌体的提取条件，获得更多的外泌体，且P5代人脐带间充质干细胞的外泌体质量与P2人脐带间充质干细胞的外泌体质量的质量相近。
3、本发明用由0.5～3ml生理盐水、20～30μg硫酸庆大霉素、3～6μg两性霉素B制成的组织保护液来提取人脐带间充质干细胞，可以提高人脐带间充质干细胞的提取效率，并或者质量更好的人脐带间充质干细胞。此外，本发明用20～30％的Tryple-EDTA酶来消化人脐带间充质干细胞，在传代培养时，可以保证人脐带间充质干细胞外泌体的质量。
4、本发明人脐带间充质干细胞外泌体的提取方法快速简便，提取率和纯度相对较高。
5、本发明的人脐带间充质干细胞外泌体可有效促进PDB-MSCs的增殖和缩短细胞倍增时间，增加细胞周期S期的比例。
6、本发明将人脐带间充质干细胞外泌体与PDB-MSCs共同培养后，PDB-MSCs的细胞增殖能力强、细胞形态良好、细胞活力强，即本发明的人脐带间充质干细胞外泌体可提高PDB-MSCs的质量，有效提高PDB-MSCs分泌细胞因子VEGF和SCF的能力，从而可解决PDB-MSCs多次传代增殖能力下降、细胞活力差等问题，进而有效有利于PDB-MSCs的大规模培养和临床应用。
附图说明
图1是本发明实施例1中P5代人脐带间充质干细胞的细胞外观图；
图2是本发明实施例1中人脐带间充质干细胞外泌体的扫描电子显微镜图；
图3是本发明实施例2不同浓度的人脐带间充质干细胞外泌体培养PDB-MSCs的细胞外观图；
图4是本发明实施例2不同浓度的人脐带间充质干细胞外泌体培养PDB-MSCs的细胞生长情曲线图；
图5是本发明实施例3不同浓度的人脐带间充质干细胞外泌体培养PDB-MSCs的细胞周期的各自细胞数量占比示意图；
图6是本发明实施例4加入不同浓度外泌体的细胞培养基培养P12代PDB-MSCs至对数生长期后VEGF分泌量的柱形图；
图7是实施例4加入不同浓度外泌体的细胞培养基培养P12代PDB-MSCs至对数生长期后SCF分泌量的柱形图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。仅此声明，本发明在文中出现或即将出现的上、下、左、右、前、后、内、外等方位用词，仅以本发明的附图为基准，其并不是对本发明的具体限定。
实施例1
人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包含以下步骤：
S11、医院采集足月剖腹产胎儿胎盘组织，采集前签署客户知情同意书，组织于4℃冷藏无菌环境下运抵实验室，运输过程中使用组织保护液保护胎盘组织生物学活性，确保运输过程中无细菌和真菌污染；所述组织保护液由1ml生理盐水、25μg硫酸庆大霉素、5μg两性霉素B配制而成。
S12、实验室中用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶，清洗后剪碎成1～2mm3碎块，采用组织贴壁法接种于T75培养瓶中培养，使用无血清且成分明确的选择培养基培养；
S13、原代细胞经14天培养长至70％融合度进行传代培养；按常规细胞培养操作，培养到P4代；(传代培养：待每代细胞增殖融合大于80％后，使用PBS缓冲液洗涤细胞表面2次，用胰酶消化5min，加入培养基终止消化，过滤，离心，细胞培养基重悬沉淀，进行计数和计算存活率，进行传代，胰酶为25％的Tryple-EDTA酶)；
S14、选用生长状况良好的P4代脐带间充质干细胞，按10000/cm2密度接种于康宁T175培养瓶中，加入25ml无血清增殖培养基正常培养；
S16、培养至细胞生长至90％融合度时吸出上清液(吸上清液P5代人脐带间充质干细胞，见图1)，得到第一上清液，用于分离外泌体，间充质干细胞正常传代培养，根据细胞生长状态决定培养代次；
S17、收集的第一上清液采用3000rpm转速离心20min去除细胞碎片，收集上清液，得到第二上清液；
S18、0.22μL滤膜过滤第二上清液，120000rpm转速离心120min，弃上清，用1ml PBS重悬沉淀，沉淀即为人脐带间充质干细胞外泌体，0.22μL滤膜过滤，4℃暂时保存，-80℃长期保存。
所述的人脐带间充质干细胞外泌体的扫描电子显微镜图如图2所示，所述的人脐带间充质干细胞外泌体为茶托型或一侧凹陷的半球形。
实施例2
促进壁蜕膜间充质干细胞增殖的方法，包括以下步骤：
S21、制备含有不同浓度外泌体的细胞培养基，将实施例1所制备得到的人脐带间充质干细胞外泌体以不同的浓度(0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml)分别加入到不同的间充质干细胞无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，产品货号：NC0103)；
S22、P12代壁蜕膜间充质干细胞按照每孔2×103个细胞的浓度接种于96孔板，并分别加入步骤S21的含有外泌体的细胞培养基；
S13、放置在37℃、5％CO2饱和湿度二氧化碳培养箱中培养。
每组试验至少重复三次试验。
每隔24h收集PDB-MSCs并进行细胞计数，图3是实施例2不同浓度的人脐带间充质干细胞外泌体培养PDB-MSCs的细胞外观图；图4是实施例2不同浓度的人脐带间充质干细胞外泌体培养PDB-MSCs的细胞生长曲线图。
从图3和图4可知，加入不同浓度外泌体的细胞培养基培养PDB-MSCs，PDB-MSCs生长速度变快。
实施例3
促进壁蜕膜间充质干细胞增殖的方法，包括以下步骤：
S21、制备含有不同浓度外泌体的细胞培养基，将实施例1所制备得到的人脐带间充质干细胞外泌体以不同的浓度(0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml)分别加入到不同的间充质干细胞无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，产品货号：NC0103)；
S22、P12代壁蜕膜间充质干细胞按照每孔4×105个细胞的浓度接种于96孔板，并分别加入步骤S21的含有外泌体的细胞培养基；
S13、放置在37℃、5％CO2饱和湿度二氧化碳培养箱中培养。
每组试验至少重复三次试验。
培养48h后收集PDB-MSCs，用细胞周期检测试剂盒(Solarbio公司)反应30min后，用流式细胞仪(Beckman公司)检测细胞周期G1期、G2期和S期。图5是实施例3不同浓度的人脐带间充质干细胞外泌体培养PDB-MSCs的细胞周期流式图。
从图5可知，加入不同浓度外泌体的细胞培养基培养PDB-MSCs，细胞周期S期的比例增加，并且，外泌体含量为的20μg/ml组的细胞S期比例要高于其它组，由此可知，添加人脐带间充质干细胞外泌体到培养基与PDB-MSCs共培养，可以加快PDB-MSCs的DNA复制，加快PDB-MSCs的增殖。
实施例4
促进壁蜕膜间充质干细胞增殖的方法，包括以下步骤：
S21、制备含有不同浓度外泌体的细胞培养基，将实施例1所制备得到的人脐带间充质干细胞外泌体以不同的浓度(0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml)分别加入到不同的间充质干细胞无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，产品货号：NC0103)；
S22、P12代壁蜕膜间充质干细胞按照每孔2.5×105个细胞的浓度接种于96孔板，并分别加入步骤S21的含有外泌体的细胞培养基；
S13、放置在37℃、5％CO2饱和湿度二氧化碳培养箱中培养。
每组试验至少重复三次试验。
培养12代PDB-MSCs达到对数生长期，取上清液1ml，3000rpm离心20min后，分别用VEGF和SCF ELISA试剂盒(酶联生物)对细胞上清液VEGF和SCF含量进行检测。图6是实施例4加入不同浓度外泌体的细胞培养基培养P12代PDB-MSCs至对数生长期后VEGF分泌量的柱形图，图7是实施例4加入不同浓度外泌体的细胞培养基培养P12代PDB-MSCs至对数生长期后SCF分泌量的柱形图。
从图6和图7可知，加入不同浓度外泌体的细胞培养基培养PDB-MSCs，PDB-MSCs的VEGF和SCF分泌量增加，由此证明添加人脐带间充质干细胞外泌体可促进PDB-MSCs中两种因子的分泌。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.人脐带间充质干细胞外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用。
2.如权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞外泌体是由P5代人脐带间充质干细胞分泌的。
3.如权利要求2所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括：
S1、将P4代的人脐带间充质干细胞按9000～12000个/cm2的浓度接种于培养瓶中，加入20～30ml无血清增殖培养基进行培养；
S2、培养至90％融合度时，收集上清液，得到第一上清液；
S3、将第一上清液离心，收集上清液，得到第二上清液；
S4、将第二上清液过滤，得到滤渣，将滤渣离心并收集底部沉淀，用0.8～1.5mlPBS重悬沉淀，最后通过过滤，滤渣即为人脐带间充质干细胞外泌体。
4.如权利要求3所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备壁蜕膜间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，所述P4代人脐带间充质干细胞的制备方法包括：
S11、用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶，清洗后剪碎成1～2mm3碎块，采用组织贴壁法接种培养；
S2、原代细胞培养至70％融合度时进行传代培养，培养至P4代。
5.如权利要求4所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备壁蜕膜间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，步骤S12中，每代细胞增殖融合大于80％后，采用PBS缓冲液洗涤细胞表面至少2次，用胰酶消化4～7min，加入培养基终止消化，过滤，离心，细胞培养基重悬沉淀，再次传代，直至培养至P4代。
6.如权利要求5所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备壁蜕膜间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，所述胰酶为20～30％的Tryple-EDTA酶。
7.如权利要求4所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备壁蜕膜间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，步骤S11中，所述组织保护液由0.5～3ml生理盐水、20～30μg硫酸庆大霉素、3～6μg两性霉素B制成。
8.一种促进壁蜕膜间充质干细胞生长的方法，其特征在于，包括：
A、制备含有外泌体的细胞培养基，将权利要求1～7所述的人脐带间充质干细胞外泌体以浓度10～30μg/ml加入到间充质干细胞无血清培养基中；
B、将壁蜕膜间充质干细胞按照每孔1.5×103～2.5×103个的浓度接种于细胞培养板，并加入所述含有外泌体的细胞培养基；
C、将细胞培养板置于培养箱中培养，其中，培养箱内的培养温度为35～40℃，CO2浓度为4％～7％。
9.如权利要求8所述的促进壁蜕膜间充质干细胞生长的方法，其特征在于，步骤B中，P12代的壁蜕膜间充质干细胞种于细胞培养板。
10.如权利要求8所述的促进壁蜕膜间充质干细胞生长的方法，其特征在于，步骤A中，将人脐带间充质干细胞外泌体以浓度20μg/ml加入到间充质干细胞无血清培养基中。
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