CN113142060B - 一种日本紫珠快速高效繁殖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，属于日本紫珠繁殖培育技术领域，所述繁殖方法如下：(1)外植体：选取春季刚萌动的紫珠嫩芽为外植体；(2)外植体无菌处理：剥去嫩芽上真叶以外的所有组织进行消毒处理；(3)初代培养：将消毒好的嫩芽转入初代培养基；(4)继代培养：露出新的接触面后整芽转入继代培养基，转接3次形成丛芽；(5)瓶外壮苗、生根一体培养：将长势健壮的继代丛芽切成单芽，将基质与凝胶营养片装入孔穴盘中，将待切下的单芽用镊子***基质1cm左右，随后用生根液浇透，透明薄膜全覆盖；解决组培方法与培养基质配合不当，导致日本紫珠生根质量不好，组培苗存活率低的问题，同时缩短培育周期，降低培育成本。

Description

一种日本紫珠快速高效繁殖的方法
技术领域
本发明涉及日本紫珠繁殖培育技术领域，尤其涉及一种日本紫珠快速高效繁殖的方法。
背景技术
日本紫珠，学名：Callicarpa japonica Thunb.var.japonica，马鞭草科紫珠属落叶灌木，英文名beautyberry，被誉为美丽的浆果。花序聚伞状，淡紫色，枝条柔细，株形蓬松，秋果呈紫色，具有光泽，十分艳丽，且每节均生，连续成串，经久不落。具有较高的观赏价值，研究表明，紫珠叶还具有较好的药用价值，紫珠果提取物具有多种优秀的抗氧化成分，可抑制色斑的形成，对抗皮肤衰老。
日本紫珠野生种分化较大，园艺种现多采用扦插、播种等方式进行繁殖，但是播种成活率低，扦插苗长势相对较差，实生苗后代分化大，以上繁殖方式均不利于日本紫珠的快速繁殖，也不利于优良单株的选育及推广。组织培养技术可以实现紫珠的高效快速繁育，节约穗条、果实等繁殖材料，降低育苗生产成本，满足市场园艺观赏需求，同时也为紫珠的药性药理研究提供有效研究材料。因此日本紫珠采用组培的方式进行快速繁殖，但是在组培过程中仍然有问题存在。
在日本紫珠组织培养过程中，培养基质是影响后期植株生根率和存活率的重要因子，基质的温度、湿度、通气状况、养分含量等情况直接影响生根率和生根质量，目前常见的基质以蛭石、河沙、珍珠岩、腐殖土、椰丝等为材料混合营养成分，但是若成分配比不当，扦插基质不适宜，不仅不会促进提早生根，还会导致生根质量不好，组培苗死亡。因此，在日本紫珠快繁过程中，需要综合优化组培方法和培养基质，提高组培苗质量，明显提高生根率和存活率。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，解决组培方法与培养基质配合不当，导致日本紫珠生根质量不好，组培苗存活率低的问题。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，所述繁殖方法如下：
(1)外植体：选取春季刚萌动的紫珠嫩芽为外植体；
(2)外植体无菌处理：剥去嫩芽上真叶以外的所有组织，采用肥皂水、无菌水、升汞吐温消毒液进行消毒处理；
(3)初代培养：将消毒好的嫩芽转入初代培养基，每瓶1个芽，培养30天；
(4)继代培养：单芽长至2-4cm，修掉底部愈伤组织与培养基的接触面，露出新的接触面后整芽转入继代培养基，转接3次形成丛芽；
(5)瓶外壮苗、生根一体培养：将长势健壮的继代丛芽切成长度2-3cm的单芽进行瓶外壮苗、生根一体培养，底部继续转入继代培养，具体的一体培养方法如下：
将无菌的细椰砖、珍珠岩、细河沙按照体积比3:1:0.5的比例混合均匀得到基质，将基质与凝胶营养片装入孔穴盘中，采用1‰多菌灵浇水至基质捏起成团但不滴水，待切下的单芽切口微干以后分别转入孔穴盘，用镊子***基质1cm左右，随后用生根液浇透，透明薄膜全覆盖；前5天，待薄膜上布满水珠，揭膜透气，抖落薄膜上的水珠，5天后每天揭膜30min，10天后，上午下午各揭膜1h，待长出的新根长度为0.5cm后，白天全揭膜，夜晚覆膜，长出新叶以后喷施1‰复合肥，全揭膜正常养护。
进一步，所述凝胶营养片使用时于水中浸泡20-30min。
在常规的壮苗和生根培养过程中，长出新叶之前一般需要经常浇磷钾肥，极易导致不耐旱不耐水的紫珠苗根腐烂，繁殖失败。因此对常规的壮苗生根过程进行改进，采用凝胶营养片让根苗直接吸收肥料与分水，更加适合日本紫珠苗的繁殖发育，且凝胶营养片无毒害易分解，更适合在育苗时使用。此外采用瓶外壮苗生根一体培养，省去了组织培养瓶内生根的培养过程，缩短了壮苗生根以及炼苗的育苗周期，降低了育苗成本。
进一步，所述外植体采摘前，于冬末春初时选取连续3天以上的晴天早晚各喷施0.1wt％的甲基托布津，喷施3天后，避开烈日和露水采摘叶片未展开的紫珠嫩芽为外植体。
进一步，所述外植体无菌处理中，用流水将外植体表面灰尘冲洗干净后采用1‰的肥皂水震荡清洗1min，再采用流水冲洗15min，转入超净工作台用无菌水清洗3遍，无菌滤纸滤干水分后转入1‰升汞吐温消毒液震荡消毒6min，随后无菌水漂洗三遍，滤干水分。
进一步，所述每升初代培养基的配方为：MS+6BA 2.5mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂6mg/L+白糖30g/L。
进一步，所述每升继代培养基的配方为：MS+6BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+维生素h1.5mg/L+琼脂6mg/L+白糖30g/L。
进一步，所述每升生根液的配方为：1/2MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L。
进一步，所述初代培养、继代培养、瓶外壮苗、生根一体培养中，光照强度均为1800Lux，光照时间均为12h/d，培养温度均为23-27℃。
进一步，所述基质装入孔穴盘时，先于孔穴盘中装入部分基质随后铺上凝胶营养片，再于凝胶营养片上铺覆一层1-2cm厚的基质。
进一步，所述凝胶营养片包括以下原料：
30-50重量份硕莪淀粉、10-15重量份木质素磺酸钠、15-18重量份果胶、5-10重量份三偏磷酸钠、8-12重量份磷酸二氢钾。
进一步，所述凝胶营养片的制备方法如下：
硕莪淀粉改性：将硕莪淀粉调成质量分数为45-50％的淀粉乳，加入木质素磺酸钠，于800-1000r/min的速率下高速搅拌10-20min，常温下静置过夜；
糊化改性：将静置后的改性硕莪淀粉搅拌均匀，于40-45℃的水温下水浴加热10-30min，加入果胶搅拌10-20min，停止加热，加入磷酸二氢钾溶液的饱和水溶液，搅拌均匀后加入三偏磷酸钠，加热至70-80℃糊化，保温20min；
凝胶营养片制备：将糊化改性的淀粉倒入模具中，于4℃的冰箱内冷冻10-12h，取出，放置于热风风干机中，于50-60℃的循环热风中风干30-40min得到凝胶营养片。
进一步，所述凝胶营养片的厚度为1-2cm,优选为1.5cm。凝胶营养片的最佳厚度为1.5cm左右，当凝胶营养片厚度过厚，会导致积水以及长时间难以深入基质内，造成根腐烂，当凝胶营养片厚度过薄，会导致储水不足，达不到维持紫珠正常生长的营养和水分量。
常规的淀粉制成的凝胶片稳定性较低，且埋置于种植基质内部时更容易发霉、生菌导致幼苗腐烂发臭，因此制备凝胶营养片的时候选取了无毒副作用的硕莪淀粉作为主要的凝胶基质，并对硕莪淀粉进行改性，使其长期掩埋在基质内部不发霉、能够存储足够幼苗生长的营养和水分避免频繁的浇水和施肥，同时增加凝胶强度方便使用和制备，因此制备的凝胶营养片更加适合既不耐旱又不耐涝的日本紫珠在壮苗、生根期的培育。
有益效果：
本发明公开的繁殖日本紫珠的方法解决了组培方法与基质配合不当导致紫珠生根质量不好，组培苗存活率低的问题，同时解决了紫珠不耐旱不耐涝需要频繁浇水与严格控制浇水量的问题，简化操作节约人工，缩短育苗周期提高繁殖速度，进一步提高了紫珠的存活率，提高组培苗质量，有利于促进日本紫珠优良品种的快速繁殖和推广。
附图说明
图1：为本发明增殖培养阶段的增殖芽图片；
图2：为本发明转入壮苗生根一体培养阶段前的丛生芽图片；
图3：为本发明瓶外壮苗、生根一体培养阶段的紫珠苗图片；
图4：为本发明对比例中凝胶片发霉的图片。
具体实施方式
以下将结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明：
实施例1：
在进行日本紫珠快速高效繁殖前先制备了在壮苗、生根培养阶段使用的凝胶营养片，其制备方法如下：
首先称取30g硕莪淀粉、10g木质素磺酸钠、15g果胶、5g三偏磷酸钠、8g磷酸二氢钾。
制备方法：
硕莪淀粉改性：将硕莪淀粉调成质量分数为45％的淀粉乳，加入木质素磺酸钠，于900r/min的速率下高速搅拌15min，常温下静置12h过夜；
糊化改性：将静置后的改性硕莪淀粉再次搅拌均匀，于40℃的水温下水浴加热20min，加入果胶搅拌15min，搅拌完成后停止加热，将磷酸二氢钾制成饱和溶液，加入淀粉溶液中搅拌均匀，再加入三偏磷酸钠，搅拌均匀后加热至75℃糊化，保温20min；
凝胶营养片制备：将糊化改性的淀粉倒入模具中，于4℃的冰箱内冷冻11h，取出，放置于热风风干机中，于50℃的循环热风中风干30min得到厚度为1.5cm的凝胶营养片。
实施例2：
首先称取40g硕莪淀粉、12g木质素磺酸钠、16g果胶、8g三偏磷酸钠、10g磷酸二氢钾。
制备方法与实施例1相同。
实施例3：
首先称取50g硕莪淀粉、15g木质素磺酸钠、18g果胶、10g三偏磷酸钠、12g磷酸二氢钾。
制备方法与实施例1相同。
对比例1：
与实施例1形成对比例，按照以下重量称取原料：30g硕莪淀粉、15g果胶、5g三偏磷酸钠、8g磷酸二氢钾。
制备方法：
将硕莪淀粉调成质量分数为45％的淀粉乳，于40℃的水温下水浴加热20min，加入果胶搅拌15min，搅拌完成后停止加热，将磷酸二氢钾制成饱和溶液，加入淀粉溶液中搅拌均匀，再加入三偏磷酸钠，搅拌均匀后加热至75℃糊化，保温20min；
凝胶营养片制备：将糊化改性的淀粉倒入模具中，于4℃的冰箱内冷冻11h，取出，放置于热风风干机中，于50℃的循环热风中风干30min得到厚度为1.5cm的凝胶营养片。
对比例2：
与实施例1形成对比例，按照以下重量称取原料：30g硕莪淀粉、10g木质素磺酸钠、5g三偏磷酸钠、8g磷酸二氢钾。
制备方法：
将硕莪淀粉调成质量分数为45％的淀粉乳，加入木质素磺酸钠，于900r/min的速率下高速搅拌15min，常温下静置12h过夜；将磷酸二氢钾制成饱和溶液，加入淀粉溶液中搅拌均匀，再加入三偏磷酸钠，搅拌均匀后加热至75℃糊化，保温20min；凝胶营养片制备：将糊化改性的淀粉倒入模具中，于4℃的冰箱内冷冻11h，取出，放置于热风风干机中，于50℃的循环热风中风干30min得到厚度为1.5cm的凝胶营养片。
对比例3：
与实施例1形成对比例，按照以下重量称取原料：30g硕莪淀粉、10g木质素磺酸钠、15g果胶、8g磷酸二氢钾。
制备方法：
将硕莪淀粉调成质量分数为45％的淀粉乳，加入木质素磺酸钠，于900r/min的速率下高速搅拌15min，常温下静置12h过夜；将静置后的改性硕莪淀粉再次搅拌均匀，于40℃的水温下水浴加热20min，加入果胶搅拌15min，搅拌完成后停止加热，将磷酸二氢钾制成饱和溶液，加入淀粉溶液中搅拌均匀，加热至75℃糊化，保温20min；将糊化改性的淀粉倒入模具中，于4℃的冰箱内冷冻11h，取出，放置于热风风干机中，于50℃的循环热风中风干30min得到厚度为1.5cm的凝胶营养片。
对比例4：
与实施例1形成对比例，按照以下重量称取原料：30g壳聚糖、400ml 2wt％戊二醛、200ml2wt％醋酸溶液，8g磷酸二氢钾。
制备方法：
将壳聚糖与醋酸溶液混合，搅拌溶解后加入戊二醛搅拌10min后加入磷酸二氢钾，恒温50℃搅拌1h，倒入模具中静置过夜，得到1.5cm厚的凝胶片。
空白对照：
称取30g硕莪淀粉、8g磷酸二氢钾。
将硕莪淀粉调成质量分数为45％的淀粉乳，随后加入磷酸二氢钾搅拌均匀，搅拌均匀后加热至75℃糊化，保温20min；将糊化的淀粉倒入模具中，于4℃的冰箱内冷冻11h，取出，放置于热风风干机中，于50℃的循环热风中风干30min得到厚度为1.5cm的凝胶营养片。
对上述制备的凝胶片于水中浸泡20min后放置于室温、湿度为75％的条件中进行含水率检测，记录1天、3天、5天、10天、15天的数据，初始含水率，得到的数据如表1所示：
表1含水率(％)
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 空白组
初始值 100 100 100 100 100 100 100 100
1天 98 99 98 95 92 99 87 95
3天 92 93 92 89 83 98 74 86
5天 83 85 84 81 72 96 51 74
10天 67 68 69 66 61 94 24 53
15天 42 45 47 46 50 92 9 27
实施例4：日本紫珠繁殖
(1)外植体：外植体采摘前，于冬末春初时选取连续3天以上的连晴天早晚各喷施0.1wt％的甲基托布津，喷施3天后，在早上9:00左右避开烈日和露水，采摘叶片未展开的春季刚萌动的紫珠嫩芽为外植体；
(2)外植体无菌处理：剥去嫩芽上真叶以外的所有组织，用流水将外植体表面灰尘冲洗干净，采用1‰的肥皂水震荡清洗1min，再采用流水冲洗15min，转入超净工作台用无菌水清洗3遍，无菌滤纸滤干水分后转入1‰升汞吐温消毒液震荡消毒6min，随后无菌水漂洗三遍，滤干水分，待用；
(3)初代培养：将消毒好的嫩芽转入初代培养基，每瓶1个芽，培养30天，每升初代培养基的配方为：MS+6BA 2.5mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂6mg/L+白糖30g/L；
(4)继代培养：单芽长至2-4cm，修掉底部愈伤组织与培养基的接触面，露出新的接触面后整芽转入继代培养基，每升继代培养基的配方为：MS+6BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+维生素h1.5mg/L+琼脂6mg/L+白糖30g/L，转接3次形成丛芽；
(5)瓶外壮苗、生根一体培养：将长势健壮的继代丛芽切成长度2-3cm的单芽进行瓶外壮苗、生根一体培养，底部继续转入继代培养；
壮苗、生根一体培养的具体方法如下：
将无菌的细椰砖、珍珠岩、细河沙按照体积比3:1:0.5的比例混合均匀得到基质，将凝胶营养片浸泡水20min，先于孔穴盘中装入部分基质随后铺上泡水后的凝胶营养片，再于凝胶营养片上铺覆一层1.5cm厚的基质，孔穴盘装完后采用1‰多菌灵浇水至基质捏起成团但不滴水，待切下的单芽切口微干以后分别转入孔穴盘，用镊子将单芽***基质1cm处，随后用生根液浇透，透明薄膜全覆盖，每升生根液的配方为：1/2MS+IBA 0.5mg/L+NAA0.1mg/L；
培养前5天，待薄膜上布满水珠，揭膜透气，抖落薄膜上的水珠，培养5天后每天揭膜30min，培养10天后，上午下午各揭膜1h，待长出的新根长度为0.5cm后，白天全揭膜，夜晚覆膜，长出新叶以后喷施1‰复合肥，全揭膜正常养护。
上述初代培养、继代培养、瓶外壮苗、生根一体培养中，光照强度均为1800Lux，光照时间均为12h/d，培养温度均为25±2℃。
实施例4采用是实施例1制备的营养凝胶片，同时为了形成对比，将对比例1-4以及空白组的凝胶片也进行日本紫珠繁殖实验，对比例和空白组与实施例4的变化仅在孔穴盘中使用的凝胶片不同。每个孔穴盘中***30个单芽，观察培育20天后日本紫珠的存活率以及生长情况，同时对观察凝胶片是否发霉，得到的数据如表2所示。
表2
Figure BDA0003088727370000091
根据表1和表2的数据分析可知：
(1)实施例1-3制备的凝胶营养片1天后的含水率降低约2％，第3天降低约8％，第5天降低约17％，第10天降低约33％，第15天降低约58％，说明营养凝胶片匀速释放水以及溶于水的钾离子。对比例1未添加木质磺酸钠改性、对比例2未添加果胶增加稳定性，导致初期释放水的速率较快，容易导致壮苗生根培育初期幼苗死亡，对比例3由于未添加三偏磷酸钠导致凝胶，释水量过小，不能供给幼苗正常的水量和营养，对比例4采用壳聚糖作为主要原料，后期失水率过高不能稳定持续的保证给水量。
(2)实施例1培育日本紫珠的成活率为92％左右，与对比例1-4、空白组相比，存活率大幅增加且紫珠幼苗生长正常，根系较多，没有出现叶缘发黄，有焦斑等明显缺磷钾的症状，说明实施例1制备的凝胶片适合用于培育日本紫珠。其中对比例3和空白组的凝胶片出现了腐烂、霉斑等情况，根系出现了腐烂症状，说明在基质的掩埋下，未采用本发明公开的方法制备的凝胶片极易发生腐烂、发霉导致幼苗死亡的情况发生。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (8)

1.一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，其特征在于，所述繁殖方法如下：
（1）外植体：选取春季刚萌动的紫珠嫩芽为外植体；
（2）外植体无菌处理：剥去嫩芽上真叶以外的所有组织，采用肥皂水、无菌水、升汞吐温消毒液进行消毒处理；
（3）初代培养：将消毒好的嫩芽转入初代培养基，每瓶1个芽，培养30天；
（4）继代培养：单芽长至2-4cm，修掉底部愈伤组织与培养基的接触面，露出新的接触面后整芽转入继代培养基，转接3次形成丛芽；
（5）瓶外壮苗、生根一体培养：将长势健壮的继代丛芽切成长度2-3cm的单芽进行瓶外壮苗、生根一体培养，底部继续转入继代培养，具体的一体培养方法如下：
将无菌的细椰砖、珍珠岩、细河沙按照体积比3:1:0.5的比例混合均匀得到基质，将基质与凝胶营养片装入孔穴盘中，采用1‰多菌灵浇水至基质捏起成团但不滴水，待切下的单芽切口微干以后分别转入孔穴盘，用镊子***基质1cm，随后用生根液浇透，透明薄膜全覆盖；前5天，待薄膜上布满水珠，揭膜透气，抖落薄膜上的水珠，5天后每天揭膜30min，10天后，上午下午各揭膜1h，待长出的新根长度为0.5cm后，白天全揭膜，夜晚覆膜，长出新叶以后喷施1‰复合肥，全揭膜正常养护；
所述凝胶营养片包括以下原料：30-50重量份硕莪淀粉、10-15重量份木质素磺酸钠、15-18重量份果胶、5-10重量份三偏磷酸钠、8-12重量份磷酸二氢钾；
所述凝胶营养片的制备方法如下：
硕莪淀粉改性：将硕莪淀粉调成质量分数为45-50%的淀粉乳，加入木质素磺酸钠，于800-1000r/min的速率下高速搅拌10-20min，常温下静置过夜；
糊化改性：将静置后的改性硕莪淀粉搅拌均匀，于40-45℃的水温下水浴加热10-30min，加入果胶搅拌10-20min，停止加热，加入磷酸二氢钾溶液的饱和水溶液，搅拌均匀后加入三偏磷酸钠，加热至70-80℃糊化，保温20min；
凝胶营养片制备：将糊化改性的淀粉倒入模具中，于4℃的冰箱内冷冻10-12h，取出，放置于热风风干机中，于50-60℃的循环热风中风干30-40min得到凝胶营养片。
2.根据权利要求1所述的一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，其特征在于，所述外植体采摘前，于冬末春初时选取连续3天以上的晴天早晚各喷施0.1wt%的甲基托布津，喷施3天后，避开烈日和露水采摘叶片未展开的紫珠嫩芽为外植体。
3.根据权利要求2所述的一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，其特征在于，所述外植体无菌处理中，用流水将外植体表面灰尘冲洗干净后采用1‰的肥皂水震荡清洗1min，再采用流水冲洗15min，转入超净工作台用无菌水清洗3遍，无菌滤纸滤干水分后转入1‰升汞吐温消毒液震荡消毒6min，随后无菌水漂洗三遍，滤干水分。
4.根据权利要求3所述的一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，其特征在于，所述初代培养基的配方为：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂6mg/L+白糖30g/L。
5.根据权利要求4所述的一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，其特征在于，所述继代培养基的配方为：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1mg/L+维生素H 1.5mg/L+琼脂 6mg/L+白糖30g/L。
6.根据权利要求5所述的一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，其特征在于，所述生根液的配方为：1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1mg/L。
7.根据权利要求6所述的一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，其特征在于，所述初代培养、继代培养、瓶外壮苗、生根一体培养中，光照强度均为1800Lux，光照时间均为12h/d，培养温度均为23-27℃。
8.根据权利要求7所述的一种日本紫珠快速高效繁殖的方法，其特征在于，所述基质装入孔穴盘时，先于孔穴盘中装入部分基质随后铺上凝胶营养片，再于凝胶营养片上铺覆一层1-2cm厚的基质。
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