CN113136432A

CN113136432A - 检测aml中prame基因相对表达量的试剂及方法

Info

Publication number: CN113136432A
Application number: CN202110490656.6A
Authority: CN
Inventors: 陈雪青; 王淑一
Original assignee: Adicon Clinical Laboratories Center Inc
Current assignee: Adicon Clinical Laboratories Center Inc
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2021-07-20

Abstract

本发明公开了用于检测PRAME基因相对表达量的引物、探针及方法和试剂盒，所述引物和探针包括：(1)检测PRAME基因表达量的引物PRAME‑F、PRAME‑R，探针PRAME‑Probe；(2)检测内参基因abl的引物abl‑F，abl‑R，探针abl‑Probe。该引物和探针经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。本发明能快速检测样本中是否存在PRAME基因及其表达量的多少，可为人类急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)提供精准的决策信息和预后信息，以辅助制定个体化治疗方案和疾病预后判断，具有重要的临床应用价值。

Description

检测AML中PRAME基因相对表达量的试剂及方法

技术领域

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中PRAME基因的方法、引物、探针和试剂盒，采用荧光探针实时定量PCR技术。

背景技术

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是急性白血病中最常见的类型，是以造血干细胞快速增殖为特征的造血干细胞恶性疾病，患者表现为未成熟细胞异常积累以及正常造血细胞受到抑制。AML预后多变，从几周生存期到完全缓解期及治愈期。在成人AML患者中，5年无病生存率与年龄密切相关，AML患者的平均5年生存率为21.4％，而年龄在75岁以上的患者的5年生存率仅为1％。由于AML发展的分子机制不同，AML患者的预后仍然难以准确估计。AML预后受多种因素影响，包括一般预后因素(发病年龄、体重、初诊外周血WBC数、继发性AML、治疗反应)和遗传学预后因素(重现性染色体异常、基因突变)，其中PRAME基因是一个研究热点。

PRAME基因最早是从黑色素瘤中分离出来的一类肿瘤相关抗原，定位于染色体22q11，在多数正常的组织和细胞中均不表达，而在正常的睾丸组织以及肺癌、肾癌、肉瘤中呈高表达状态，属于肿瘤-睾丸抗原。PRAME基因编码的产物是一类膜蛋白，能够抑制RARa途径；在维甲酸存在的条件下，PRAME能够与RARa结合并阻断了该受体的激活过程，进而通过趋化Polycomb蛋白来阻断RARE启动下游转录的功能，最终阻断了细胞凋亡的效应。

有研究指出白血病患者PRAME、WT1基因的同时表达能够很好的检测白血病患者的微小残留病，进而使白血病患者的生存率得到明显提高。提示可以通过检测PRAME基因的表达情况评估AML的预后，并且可以为患者制定个体化的治疗方案。因此AML患者PRAME基因表达量可作为临床评估疾病的发生、发展及判断预后的有效指标。

实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR)是在普通PCR反应中加入能与PCR产物结合的荧光探针或荧光染料，使之荧光信号随着扩增产物的增加而成比例增长，仪器实时检测每一个循环结束后的荧光强度，通过与标准曲线对比得出定量结果。可以直接检测目的基因的起始数量，从而动态监测目的基因水平。从扩增到产物分析都是闭管操作，最大限度避免了污染，无PCR后处理。设计的特异性TaqMan探针使整个体系灵敏度和特异性都大大提高，

发明内容

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因ABL和目的基因PRAME的定量标准曲线，检测目的基因PRAME相对于内参基因ABL的表达水平。通过调整引物和探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，可使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够满足PRAME基因的检测，用于评价治疗效果、预测预后。

本发明提供了一种用于PRAME基因相对表达量的试剂，所述试剂包括(1)检测PRAME基因的上游引物PRAME-F、下游引物PRAME-R和探针PRAME-Probe，其中，

PRAME-F：AGTGCTGATGAAGGGACAACA；

PRAME-R：GTCCTGATGAGAGTTCTTCCGTA；

PRAME-Probe：FAM-CTGGAGACCTTCAAAGCTGTGCTTGA-TAMRA。

(2)检测内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe，其中，ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA；

ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA；

ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

本发明还提供一种检测样本中PRAME基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样本中的RNA；

(2)将RNA逆转录为cDNA；

(3)将cDNA加入到反应管中，利用针对PRAME的上、下游引物和探针检测样本中的PRAME基因的荧光信号；利用针对ABL内参基因的上、下游引物和探针检测样本中的ABL内参基因的荧光信号；

(4)根据PRAME基因的荧光信号和ABL内参基因的荧光信号，确定样本中的PRAME基因的相对表达量。

本发明最后提供了检测PRAME基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括：

(1)检测PRAME基因的上游引物PRAME-F、下游引物PRAME-R和探针PRAME-Probe，其中，

PRAME-F：AGTGCTGATGAAGGGACAACA；

PRAME-R：GTCCTGATGAGAGTTCTTCCGTA；

PRAME-Probe：FAM-CTGGAGACCTTCAAAGCTGTGCTTGA-TAMRA。

ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA；

ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有PRAME cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有PRAME cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。

进一步地，所述试剂盒还包括样本RNA提取试剂，所述样本RNA提取试剂包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。

进一步地，所述样本RNA提取试剂还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钾和12.5μmol/L EDTA。

本发明中的“PRAME cDNA序列”指的是PRAME基因经转录后产生的mRNA经逆转录后产生的cDNA序列，或者根据这种cDNA序列通过化学合成手段直接合成出。将不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的PRAME cDNA序列***到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。

本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因ABL和PRAME目的基因的定量标准曲线，检测受测者体内PRAME的表达。相比于以往的免疫组化方法和2^-△△CT法等检测手段，该方法具有精确度高，结果便于判读等优点。加之该方法将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。用本发明测试部分样本发现，正常人中有83％的PRAME基因表达量集中在0.1-1，AML患者有75％的PRAME基因表达量集中在0-0.004。本发明特异性好，灵敏度高，操作简便，可为人类急性髓系白血病(AcuteMyeloid Leukemia，AML)患者提供精准的决策信息和预后信息，有助于个体化医疗方案的制定和疾病预后判断，具有重要的临床应用价值。

附图说明

图1为pUC57-T/PRAME阳性质粒在不同浓度下的扩增曲线图。

图2为不同浓度模板的扩增曲线图。

图3为24例AML患者血液样本PRAME基因及ABL内参扩增曲线图。

图4为24例正常人血液样本PRAME基因及ABL内参扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测样本中PRAME基因的试剂盒，包括：

(1)红细胞裂解液，包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钾和12.5μmol/L EDTA。

(2)RNA提取试剂，包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。

(3)RNA逆转录试剂，ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒(TOYOBO公司)。

(4)检测体系PCR反应液，THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)(TOYOBO公司)。检测体系PCR反应液包括检测PRAME基因的上游引物PRAME-F、下游引物PRAME-R和探针PRAME-Probe，和检测内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe，

PRAME-F：AGTGCTGATGAAGGGACAACA；

PRAME-R：GTCCTGATGAGAGTTCTTCCGTA；

PRAME-Probe：FAM-CTGGAGACCTTCAAAGCTGTGCTTGA-TAMRA。

ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA；

ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA；

ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

(5)阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，阳性对照品为含有PRAME cDNA序列的阳性质粒溶液，阴性对照品为不含有PRAME cDNA序列的质粒溶液，空白对照品为生理盐水或不加任何物质。

本发明所使用的引物和探针SEQ ID NO:1～6的碱基序列如表1所示。

表1.引物和探针的序列

实施例2

本发明方法的操作流程：

(1)抽提血液中的RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml实施例1中的红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀，室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml实施例1中的红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中(不要吸取白色中间层)；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20ulRNase-free水溶解沉淀。

(2)cDNA制备：参考TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将(1)中制备出的RNA反转为cDNA。

(3)试剂配制：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装，如表2所示：

X＝23ul反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；

表2 PRAME反应体系

其中Forward Primer、Reverse Primer和TagMan Probe分别选自PRAME-F、PRAME-R和PRAME-Probe，或者ABL-F、ABL-R和ABL-Probe。

(4)加样：将(3)中配制的检测体系PCR反应液和步骤(2)中制备出的cDNA 2μl加入到96孔板的孔或者反应管中；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。每个样本也需要2个重复以确保结果的稳定。

(5)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。

(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，***根据标准曲线和Ct值自动计算出拷贝数。

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；36≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。

实施例3阳性质粒检测和灵敏度检测

在制备阳性质粒时，先直接合成出PRAME cDNA，再分别***到事先选择的质粒(这里以pUC57-T质粒为例进行说明)中，这样就可制备出pUC 57–T/PRAME阳性质粒。

将制备出的pUC57-T/PRAME阳性质粒进行梯度稀释，获得拷贝数为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²copies/μl的阳性质粒，并以这些不同浓度的阳性质粒作为模板，按实施例2进行检测，结果如图1所示，其中，在图1中各条扩增曲线对应的阳性质粒浓度从左至右分别为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²。由图1可知，PRAME起线正常，本发明的引物和探针可用来检测pUC57-T/PRAME阳性质粒。随后，以不同浓度的阳性质粒对数值作为横坐标，以通过每种浓度的阳性质粒按实施例2进行检测获得的Ct值作为纵坐标，绘制标准曲线，经计算可知，扩增效率为98％，由此可见发现本发明对阳性质粒的扩增效率能达到要求。

将40个体检正常人的外周血采用Trizol酚-氯仿法抽提RNA，之后溶在一起，得到总RNA，其浓度需达到100ng/ul左右，反转成cDNA后，以此作为标准品，在此基础上设计4个稀释度，稀释倍数为10，从最高浓度开始，做4个浓度梯度。以此为阳性模版进行PCR扩增。结果如图2所示，可知本发明对这种阳性质粒的检测下限为0.1ng/ul，对应Ct值为38。

实施例4检测临床血液样本

取送检的正常人和白血病患者血液标本各24例，按实施例2所述方法提取样本RNA、配制试剂并检测。每例样本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性、阴性和空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。每个样本2个重复以确保结果的稳定。通过对PRAME基因表达量比值(PRAME表达量/ABL内参表达量)，进行统计分析可知：PRAME在83％AML患者中表达量集中在0.1-1，而在AML患者中表达量极低，PRAME基因表达量在0-0.004之间。实验结果如表3和图3、4所示。

表3 24例正常人和白血病患者血液样本PRAME mRNA表达水平

本研究采用荧光定量PCR的方法分析了血液中PRAME的mRNA含量，可能成为一个潜在的筛查和诊断AML的非侵入性生物学标志物，也可以参考PRAME基因表达量提供的信息制定出更加合理的个体化治疗方案，以不断提高AML患者的预后，具有重要的临床研究应用价值。

序列表

<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司

<120> 检测AML中PRAME基因相对表达量的试剂及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtgctgatg aagggacaac a 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcctgatga gagttcttcc gta 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggagacct tcaaagctgt gcttga 26

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatacgaagg gagggtgtac ca 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcggccagg gtgttgaa 18

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcttctgat ggcaagctct acgtctcct 29

Claims

1.用于PRAME基因相对表达量的试剂，其特征在于，所述试剂包括：

(1)检测PRAME基因的上游引物PRAME-F、下游引物PRAME-R和探针PRAME-Probe，

PRAME-F：AGTGCTGATGAAGGGACAACA；

PRAME-R：GTCCTGATGAGAGTTCTTCCGTA；

PRAME-Probe：FAM-CTGGAGACCTTCAAAGCTGTGCTTGA-TAMRA。

(2)检测内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe，

ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA；

ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA；

ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述PRAME-F、PRAME-R、PRAME-Probe的添加比例是1:1:1。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述ABL-F、ABL-R、ABL-Probe的添加比例是1:1:1。

4.一种检测样本中PRAME基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样本中的RNA，并消化DNA；

(2)将RNA逆转录为cDNA；