CN113122527A

CN113122527A - 一种酶活提高及最适pH改变的天冬氨酸酶突变体

Info

Publication number: CN113122527A
Application number: CN202110447738.2A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 王雅玲; 杨套伟; 徐美娟; 张显; 邵明龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113122527B

Abstract

本发明提供了一种酶活提高及最适pH改变的天冬氨酸酶突变体，属于基因工程技术领域；所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的天冬氨酸酶突变体是在来源于Bacillus sp.YM55‑1天冬氨酸酶的基础上，将第12位亮氨酸突变为天冬氨酸，将第166位酪氨酸突变为谷氨酸，将第169位谷氨酰胺突变为谷氨酸，将第314位精氨酸突变为甲硫氨酸，从而提升了该酶的pH适应性，同时增强了该酶合成β‑氨基丁酸的能力，有利于工业化生产β‑氨基丁酸。

Description

一种酶活提高及最适pH改变的天冬氨酸酶突变体

技术领域

本发明涉及一种酶活提高及最适pH改变的天冬氨酸酶突变体，属于基因工程技术领域。

背景技术

β-氨基酸在制药工业上是广泛应用的靶分子，是生物活性化合物或天然产物和药物的结构单元。其中β-氨基丁酸是一种有效的引发剂，可在至少40种植物物种中提供广谱性疾病保护。另外β-氨基丁酸可以作为医药中间体β-氨基丁醇的前体物质，该物质是抗肿瘤药物4-甲基环磷酰胺、青霉烯类抗生素以及治疗艾滋病整合酶抑制药物杜鲁特韦(Dolutegravir)的关键中间体。

天冬氨酸酶的天然底物是天冬氨酸，以高底物特异性和二级羧酸盐结合口袋的特性被选择改造用于β-氨基酸的制备。但目前的天冬氨酸酶对反应的pH值条件要求苛刻，依赖高温强碱的反应环境，在温和条件下酶活较低，这一缺陷导致β-氨基酸生产成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用，本发明的天冬氨酸酶突变体在温和条件下的酶活提高，能够提高制备β-氨基酸的反应效率，同时降低反应成本。

本发明将天冬氨酸酶第12位亮氨酸突变为天冬氨酸，将第166位酪氨酸突变为谷氨酸，将第169位谷氨酰胺突变为谷氨酸，将第314位精氨酸突变为甲硫氨酸。本发明通过改造天冬氨酸酶表面电荷，改变了酶的构象状态，有利于酶调整柔性结构并呈现新的pH活性，加强了该酶合成β-氨基丁酸的能力。

本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸突变体包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸。

本发明提供了编码所述天冬氨酸突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了携带所述基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述重组质粒以pET系列载体作为出发载体。

本发明提供了表达所述突变体，或携带所述重组质粒的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌作为宿主细胞。

本发明提供了一种生产β-氨基丁酸的方法，利用所述微生物细胞转化巴豆酸生产β-氨基丁酸。

在一种实施方式中，将所述微生物细胞加入反应体系，使得微生物细胞在反应体系中的OD₆₀₀为40-60，并维持反应体系中巴豆酸含量不低于80g/L。

在一种实施方式中，在40-60℃下反应时间不少于8h。

本发明提供了所述天冬氨酸酶突变体，或所述基因，或所述重组菌在制备β-氨基酸以及衍生产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的天冬氨酸酶突变体是在来源于Bacillus sp.YM55-1天冬氨酸酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)的基础上，将第12位亮氨酸突变为天冬氨酸，将第166位酪氨酸突变为谷氨酸，将第169位谷氨酰胺突变为谷氨酸，将第314位精氨酸突变为甲硫氨酸。本发明通过对原始酶进行改造，天冬氨酸酶突变体的最适pH从9.0转移到了8.0，比酶活也得到显著提升，在pH 8.0时比酶活可达477mU/mg，加强了该酶合成β-氨基酸的能力，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。将突变体应用于全细胞转化生产β-氨基丁酸中，在500g/L的全细胞转化体系转化12h，产量可以达到590.8g/L。

附图说明

图1为原始菌株和突变株的β-氨基丁酸合成图；A：野生型AspB在pH 8.0条件下；B：野生型AspB在pH 9.0条件下；C：突变体菌株在pH 8.0条件下；D：突变体菌株在pH 9.0条件下。

具体实施方式

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2。

TY发酵培养基：0.3g/L柠檬酸铁铵，0.3g/L无水硫酸镁，2.1g/L一水合柠檬酸，2.5g/L硫酸铵，4g/L磷酸三钾，8g/L酵母粉，10g/L甘油，12g/L胰蛋白胨。

天冬氨酸酶酶活测定方法：反应体系(200μL)为300mM的氨，100mM的Na2HPO4，300mM的巴豆酸，用5M的NaOH调节pH至8，加入适量酶液启动反应，55℃下反应1h，根据反应中β-氨基丁酸的产量，计算出酶活力。

酶活定义：定义每分钟转化1μmol巴豆酸为β-氨基丁酸所需的酶量为一个酶活单位U。酶活单位为U/mL。酶比活力定义为单位蛋白的酶活U/mg。

表1 PCR所需引物

实施例1：含编码天冬氨酸酶突变体的基因的重组表达载体及重组菌的构建

将第12位亮氨酸突变为天冬氨酸，将第166位酪氨酸突变为谷氨酸，将第169位谷氨酰胺突变为谷氨酸，将第314位精氨酸突变为甲硫氨酸，具体方法为：以含有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的pET-21a重组质粒(酶切位点EcoR I和BamH I)为模板，表1所示序列为引物，采用全质粒两步PCR法构建突变体质粒(反应体系如表2所示，反应条件如表3所示)，即得到SEQ ID NO.2所示的基因。

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应条件

PCR产物经过凝胶电泳检验，然后在20μL的PCR产物中加入1μL的Dpn I限制性内切酶对模板质粒进行消化，于25℃过夜或者37℃下孵化3～4h。吸取5μL酶切产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含氨苄霉素(100mg/L)LB平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有编码天冬氨酸酶突变体的基因的重组表达载体成功转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，命名为pET21a-L12D-Y166E-Q169E-R314M。经测序验证突变成功的菌株即为pET21a-L12D-Y166E-Q169E-R314M/E.coli BL21，将菌液加入甘油并于-70℃冰箱保藏。测序工作由苏州金唯智完成。

实施例2：重组菌pET21a-L12D-Y166E-Q169E-R314M/E.coli BL21表达

将实施例1构建的重组菌pET21a-L12D-Y166E-Q169E-R314M/E.coli BL21与表达未突变的原始酶BsAspB(原始型，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)的对照菌株pET21a-AspB/E.coli BL21分别接种于10mL含氨苄霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，至OD₆₀₀为0.6～0.9次日按1％的接种量转接于50mL含氨苄霉素的LB培养基中，37℃培养2～3h后加入0.5mM的IPTG于16℃诱导12～16h。4℃，8000rpm离心10min收集细胞并破碎，收集细胞破碎上清液(粗酶液)用于后续纯化。

天冬氨酸酶或天冬氨酸酶突变体的纯化是在60℃中热水浴30min，之后12000rmp离心90min得到纯化酶。所得纯化酶于4℃贮存备用。纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，结果表明得到电泳纯的重组天冬氨酸酶及其突变体。

实施例3：天冬氨酸酶的酶活测定及β-氨基丁酸的HPLC检测

将原始酶与突变酶在70℃和pH 7.0、8.0、9.0、10.0不同条件下测酶活，反应1h后用HPLC法测产物β-氨基丁酸的含量。

HPLC：取100μL反应液，加40μL1M的NaHCO₃，混匀后加160μL2,4-二硝基氟苯(20.48mg溶于3mL丙酮)，在60℃中暗处反应1h，取出离心，0.22μ膜过滤。然后进样。色谱柱：dimosoil C18(5μL，250mm×4.6mm)，流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：100％乙腈，检测器：UVDetector，检测波长：360nm，柱温：25℃，进样量：10μL，流速：1.0mL/min。过程：0～22min:15％B→50％B；22～22.1min:50％B→15％B；22.1～26min:15％B。

计算得原始酶和突变酶L12D-Y166E-Q169E-R314M的比酶活如表4所示。结果显示，在pH 7.0的情况下，突变株的比酶活是原始酶的4.1倍，为149.4mU/mg。pH 8.0成为突变酶的最适反应pH，多位点突变使得酶在偏中性(pH 8.0)下比酶活显著提高，约是原始酶的3.1倍。

表4 原始酶和突变酶在不同pH下的比酶活(mU/mg)

实施例4：天冬氨酸酶原始型及其突变体的动力学参数

在标准条件下，通过改变反应体系中底物的浓度进行酶活里测定，根据prism软件中Michaelis-Menten方程对酶活数据进行曲线拟合，得到相应的动力学常数。动力学常数在含有不同浓度巴豆酸的含有2mM MgCl₂的50mM Tris-HCl(pH 8.0)中检测进行，底物浓度为100mM～1M。结果显示原始酶在pH 9.0时的Kcat/Km相比于低pH下更高，为0.18s^-1M^-1。突变酶的Kcat/Km在pH 8.0时显示出绝对的优势，是原始酶pH 9.0的2.6倍，pH 8.0的5.8倍，这也与比酶活的数据相对应。

表5 原始酶和突变酶的动力学参数

实施例5：天冬氨酸酶原始型及其突变体工程菌制备β-氨基丁酸

将重组大肠杆菌在100mg·L^-1氨苄霉素抗性LB平板划线，挑单菌落接种10mL LB培养基，在37℃下培养11-12h后，以3％(V/V)的接种量转接120mL LB培养基，培养6-8h后，将培养后的菌液作为种子接入装有2L的5L发酵罐中，在37℃，pH 7.0，通气量2vvm的条件下进行发酵，逐级提高转速，待菌体OD₆₀₀在15-20时，温度降至25℃，加入IPTG诱导，继续培养约12-14h后，终止发酵，离心收集菌体。

将AspB原始型与突变型L12D-Y166E-Q169E-R314M工程菌进行pH 8.0和9.0条件下的巴豆酸底物的转化。转化体系1L初始底物浓度为200g/L，将获得的细胞以终浓度OD₆₀₀＝50加入转化体系中，在50℃下、200rpm下反应。随着反应的进行，底物巴豆酸逐渐减少，产物β-氨基丁酸生成。分别在5h，7h，9h时添加100g/L的底物巴豆酸，使底物含量不低于100g/L。缓冲液由含2mM的MgCl₂的Tris-HCl组成，加入25％的氨水调节pH至9.0，在50℃下共反应12h，β-氨基丁酸产量结果如图1所示。结果显示，AspB在pH 8.0和pH 9.0转化12h的产量分别为493.3g/L和458.8g/L，而突变株在pH 8.0和pH 9.0转化12h的产量为590.8g/L和529.1g/L，分别比原始菌株高97.5g/L和70.3g/L。这意味着突变株实现了更低的成本消耗和更高效持久的转化，表明该天冬氨酸酶突变体具有广阔的工业化应用前景。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种酶活提高及最适pH改变的天冬氨酸酶突变体

<130> BAA210028A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Asp Gly Glu Lys Glu

1 5 10 15

Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu

20 25 30

Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser

35 40 45

Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly

50 55 60

Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu

65 70 75 80

Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln

85 90 95

Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala

100 105 110

Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys

115 120 125

Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala

130 135 140

Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu

145 150 155 160

Ile Glu Thr Thr Lys Glu Met Gln Glu Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Cys His Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile

195 200 205

Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp

210 215 220

Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His

245 250 255

Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp

260 265 270

Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met

275 280 285

Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Met Gln Pro Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

Ile Pro Gly Leu Val Ala Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val

325 330 335

Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu

340 345 350

Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn

355 360 365

Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr

370 375 380

Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu

385 390 395 400

Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val

405 410 415

Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly

420 425 430

Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu

435 440 445

Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile

450 455 460

Ala Gly Arg Lys

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<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列

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atgaacaccg atgtgcgcat cgagaaagac tttgatggcg agaaggaaat cccgaaagac 60

gcgtactacg gcgtgcagac catccgcgcc acggaaaact tcccgattac cggctaccgc 120

attcacccag agctgattaa gagcctcggc atcgtgaaaa agagcgccgc gctggccaac 180

atggaagttg gtctgctgga caaagaggtt ggccagtaca tcgtgaaagc cgccgacgaa 240

gtgatcgagg gtaagtggaa cgaccagttc atcgtggacc caatccaagg cggtgcgggc 300

accagcatca acatgaacgc gaacgaggtg atcgcgaatc gtgcgctgga actgatgggc 360

gaggaaaagg gcaactacag caagattagc ccaaacagcc acgtgaatat gagccagagc 420

accaacgatg cgttcccaac ggccacccac atcgccgttc tgagtctgct gaatcagctc 480

atcgagacga ccaaggagat gcaggaggag ttcatgaaga aagcggatga gtttgcgggc 540

gtgatcaaga tgggtcgctg tcatctgcaa gatgcggtgc cgattctgct gggccaagag 600

ttcgaagcct acgcgcgcgt tatcgcgcgc gacattgaac gcatcgccaa cacccgcaac 660

aatctctacg acatcaacat gggcgcgacc gccgttggta cgggtctcaa cgccgaccca 720

gagtacatca gcatcgtgac cgaacatctg gccaaattca gtggtcaccc gctccgtagc 780

gcgcagcatc tcgtggatgc gacgcagaat accgattgct acacggaggt gagcagcgcg 840

ctcaaagtgt gcatgatcaa catgagcaaa atcgccaacg atctccgtct gatggccagt 900

ggtccacgtg ccggtctgag tgaaattgtt ctgccggcga tgcaaccggg cagcagtatt 960

atcccgggtc tggttgcgcc agttatgccg gaggttatga atcaagttgc cttccaagtt 1020

ttcggtaacg atctgacgat cacgagcgcc agcgaagcgg gccagtttga gctcaacgtt 1080

atggagccgg ttctgttctt caacctcatc cagagcatta gcatcatgac gaatgtgttc 1140

aaaagcttta cggaaaactg cctcaaaggc atcaaggcca acgaggagcg tatgaaggag 1200

tacgtggaaa agagcatcgg catcatcacc gcgatcaatc cgcatgtggg ctatgaaacc 1260

gcggcgaagc tggcccgtga agcgtacctc accggtgaaa gcatccgcga gctgtgcatc 1320

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Claims

1.一种天冬氨酸酶突变体，其特征在于，所述天冬氨酸突变体包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸。

2.编码权利要求1所述天冬氨酸突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组质粒以pET系列载体作为出发载体。

5.表达权利要求1所述突变体，或携带权利要求3所述重组质粒的微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述微生物细胞以大肠杆菌作为宿主细胞。

7.一种生产β-氨基丁酸的方法，其特征在于，利用权利要求5或6所述微生物细胞转化巴豆酸生产β-氨基丁酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述微生物细胞加入反应体系，使得微生物细胞在反应体系中的OD₆₀₀为40-60，并维持反应体系中巴豆酸含量不低于80g/L。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在40-60℃下反应不少于8h。

10.权利要求1所述天冬氨酸酶突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求5～7任意一项所述重组菌在制备β-氨基酸以及衍生产品中的应用。