CN113116900B

CN113116900B - 一类核苷类似物在制备预防和/或治疗脑血管疾病药物中的应用

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Publication number: CN113116900B
Application number: CN202110398882.1A
Authority: CN
Inventors: 陈新平; 刘菁菁; 赵文阳
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-04-14
Also published as: CN113116900A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及核苷类似物在制备预防或治疗脑血管疾病药物中的应用。本发明所述的核苷类似物结构通式如式(Ⅰ)所示，其中X和Y分别选自S、O、NH或烷氧基中的任意一个，R限定为胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤中的任意一个，R₁为OH、NH₂、CH₃、CH₃O、卤素、C₁‑C₆烷基、金属离子等；R₂为OH、NH₂、CH₃、CH₃O、卤素、C₁‑C₆烷基、金属离子等；0≤n≤3。所述的核苷类似物对缺血性脑卒中疗效显著，能显著的改善神经功能损伤，减少梗死面积，在临床中具有良好的临床应用前景。

Description

一类核苷类似物在制备预防和/或治疗脑血管疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，还涉及一类可用于脑血管疾病的新型小分子化合物，更具体的涉及核苷类似物例如拉米夫定、齐多夫定和阿昔洛韦在制备用于脑血管疾病的药物中的应用。

背景技术

脑血管疾病(Cerebrovascular disease)，泛指脑部血管的各种疾病，包括动脉粥样硬化、血栓形成、狭窄、闭塞、脑动脉炎、脑动脉损伤、脑动脉瘤、颅内血管畸形、脑动静脉瘘等，其共同特点是引起脑组织的缺血或出血性意外。典型的脑血管疾病主要有脑血栓、脑缺血、脑梗塞等。

脑血栓是在脑动脉粥样硬化和斑块基础上，在血流缓慢和血压偏低的条件下，血液的有效成分附着在动脉的内膜形成血栓，成为脑血栓，临床上以偏瘫为主要临床表现。脑卒中是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性卒中和出血性卒中。血栓可引起脑梗的形成，脑梗又称为缺血性脑卒中；脑血栓、脑梗塞最终均可归结于卒中。而卒中是严重危害中国国民健康的重大慢性非传染性疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率和高经济负担五大特点。随着人口老龄化的加剧，脑血管病危险因素流行趋势更加明显，导致脑血管病的发病人数持续增加。目前，临床上面对这一危害严重的疾病，尚无有效的治疗方法。因此，如何开发出一种能够显著治疗缺血性脑卒中的新药物是目前亟待解决的问题。

常见的核苷类似物临床用药主要包括拉米夫定、阿昔洛韦、阿德福韦酯、泛昔洛韦、恩替卡韦、吉西他滨、齐多夫定、阿糖胞苷、阿扎胞苷、恩曲西他平、替比夫定、克拉夫定、恩曲他滨等，其功能主要为抗病毒、抗肿瘤、提高免疫和恢复肝功。其中。拉米夫定是一种胞嘧啶核苷类似物，对病毒DNA链的合成和延长有竞争性抑制作用，其主要用于乙型肝炎和肝胆疾病的治疗，是目前临床应用中最具代表性的核苷类似物；阿糖胞苷主要作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢药物，通过抑制细胞DNA的合成，干扰细胞的增殖，主要用于治疗急性白血病，对急性粒细胞白细胞疗效最好，对急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病也有效。对恶性淋巴瘤、肺癌、消化道癌、头颈部癌有一定的疗效，对病毒性角膜炎及流行性结膜炎等也有一定的疗效。吉西他滨为一种新的胞嘧啶核苷衍生物，作用机制和阿糖胞苷相同，其主要代谢物在细胞内掺入DNA，主要作用于G1/S期。在临床上，吉西他滨和阿糖胞苷的抗瘤谱不同，对多种实体瘤有效，用于晚期胰腺癌患者的二线用药，能改善患者的生活质量；作为局部晚期和已经有转移的非小细胞肺癌的一线用药。齐多夫定是一种胸腺嘧啶核苷类似物，用于艾滋病或与艾滋病有关的综合症患者及免疫缺陷病毒HIV感染的治疗，是世界上第一个获得美国FDA批准生产的抗艾滋病药品，因其疗效确切，成为“鸡尾酒”疗法最基本的组合成分，在体外对逆转病毒包括人免疫缺陷病毒具有高度活性。阿昔洛韦是一种合成的鸟嘌呤核苷类似物，主要用于单纯疱疹病毒所致的各种感染，可用于初发或复发性皮肤、粘膜、外生殖器感染及免疫缺陷发生的单纯疱疹病毒(HSV)感染。为治疗HSV脑炎的首选药物，减少发病率及降低死亡率均优于阿糖腺苷。还可用于带状疱疹、EB病毒、及免疫缺陷者并发水痘感染。因皮肤吸收较少，仅用于局部皮肤。

目前，研究人员针对核苷及其类似物的研究中，更多的是关于其剂型、检测方法、制备方法、结构修饰等的研究，例如专利CN101511375B公开了L-胞嘧啶核苷类似物在制备用于治疗癌症和其它病症或疾病状态的药物中的应用，其主要是对于核苷类似物的结构修饰，并用修饰后的化合物治疗结肠癌、胰腺癌和肝癌。专利CN111741967A公开了核苷酸类似物、制备方法及其在核酸序列测定等方面的应用，其主要涉及核苷类似物的制备方法等；专利CN109790196A公开了使用可逆封闭核苷类似物进行核酸检测的方法；专利CN108671235A公开了一种骨架整合有核苷类似物药物的功能性核酸及其衍生物及其制备方法，以及用于基因疗法和化学疗法联合治疗疾病的用途；专利CN104211742A公开了环磷酰化基团修饰后并连接脂肪链的磷酸N-脂肪酸用于病毒性肝炎和肝癌的治疗；专利CN110643609A公开了核苷类似物药物分子构建的药物适配体、制备方法及其应用等；但是，目前并没有将核苷类似物应用于脑血管疾病的文献，亦没有任何文献提示本领域技术人员核苷类似物具有治疗脑血管疾病的新用途。

发明人在研究过程中意外的发现，核苷类似物对脑血管疾病具有显著的疗效，提供了核苷类似物的一种新用途。

发明内容

针对上述技术问题，本发明公开了一种如式(Ⅰ)所示的核苷类似物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式，及其可药用盐用于制备治疗和/或预防脑血管疾病药物中的应用；

其中，所述的结构式中X和Y分别选自S、O、NH或烷氧基中的任意一个；

R为胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤中的任意一个；

R₁为OH、NH₂、CH₃、CH₃O、卤素、C₁-C₆烷基、金属离子等；

R₂为OH、NH₂、CH₃、CH₃O、卤素、C₁-C₆烷基、金属离子等；

0≤n≤3。

优选地，所述的核苷类似物为拉米夫定、阿昔洛韦、阿德福韦酯、泛昔洛韦、恩替卡韦、吉西他滨、齐多夫定、阿糖胞苷、阿扎胞苷、恩曲西他平、替比夫定、克拉夫定或恩曲他滨中的一种。

优选地，所述的核苷类似物为拉米夫定、齐多夫定和阿昔洛韦。

优选地，所述的脑血管疾病为脑血栓、脑缺血和脑卒中。

优选地，所述的脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中。

优选地，所述的脑卒中为缺血性脑卒中。

本发明的第二目的是公开式(Ⅰ)所述的核苷类似物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式，及其可药用盐在制备治疗和/或预防神经功能损伤药物中的应用；

R为胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤中的任意一个；

0≤n≤3。

本发明的第三目的是公开式(Ⅰ)所述的核苷类似物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式，及其可药用盐用于制备治疗和/或预防脑缺血再灌注损伤药物中的应用；

R为胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤中的任意一个；

0≤n≤3。

本发明的第四目的是公开式(Ⅰ)所述的核苷类似物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式，及其可药用盐和一种或多种药学上可接受的载体组成药物组合物，所述药物组合物的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种核苷类似物的新用途，具体提供了核苷类似物例如拉米夫定、齐多夫定和阿昔洛韦在制备治疗脑血管疾病尤其是治疗缺血性脑卒中的应用，本发明的实验结果显示，所述的核苷类似物能显著降低脑卒中患者的神经功能缺损评分，降低梗死灶，对脑卒中患者具有神经保护作用，也具有治疗缺血性脑卒中的效果，可以在临床上推广应用。

附图说明

图1拉米夫定大鼠MCAO模型试验结果

与“SHAM”相比，^###p﹤0.001；与“IR”相比，*p<0.05和***p<0.001

其中“A”为脑片TTC染色图；“B”为神经功能缺损评分图；“C”为脑梗死体积比图。图2齐多夫定和阿昔洛韦大鼠MCAO模型试验结果

与“SHAM”相比，^###p﹤0.001；与“IR”相比，*p<0.05和***p<0.001

其中“A”为脑片TTC染色图；“B”为神经功能缺损评分图；“C”为脑梗死体积比图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的保护范围进行详细说明，但应当指出的是，本发明的保护范围并不限于以下实施例，同时保护核苷类似物的一类化合物在所有脑血管疾病尤其是脑卒中疾病中的治疗效果，包括不同剂型、剂量、联合用药等。凡本领域技术人员按照本发明的思路在现有技术上通过逻辑分析、推断和实验得出的技术方案，均属于本发明所请求保护的范围。

本发明以下实施例中，拉米夫定是一个抑制病毒的药物，并不能清除乙肝病毒，这是因为拉米夫定对乙肝病毒cccDNA没有作用，cccDNA在人体内的半衰期大约为3-4年，如果cccDNA持续存在，病毒就不会得到清除，停药后必然复发。因此在应用拉米夫定时，其疗效并不完全取决于药物本身，还和病人对HBV的特异性免疫反应状态及病毒毒力密切相关，对于特异性免疫反应弱的病人单独应用拉米夫定很难达到清除病毒的目的，还要想办法提高机体对HBV特异性免疫反应，可以考虑联合应用胸腺肽、治疗性疫苗及高效价乙肝免疫球蛋白等。

本发明以下实施例中，齐多夫定是一种胸腺嘧啶核苷类似物，用于艾滋病或与艾滋病有关的综合症患者及免疫缺陷病毒HIV感染的治疗，是世界上第一个获得美国FDA批准生产的抗艾滋病药品，因其疗效确切，成为“鸡尾酒”疗法最基本的组合成分，在体外对逆转病毒包括人免疫缺陷病毒具有高度活性。

本发明以下实施例中，阿昔洛韦是一种合成的鸟嘌呤核苷类似物，主要用于单纯疱疹病毒所致的各种感染，可用于初发或复发性皮肤、粘膜、外生殖器感染及免疫缺陷发生的HSV感染。阿昔洛韦作为治疗HSV脑炎的首选药物，其减少发病率及降低死亡率均优于阿糖腺苷。阿昔洛韦还可用于带状疱疹、EB病毒、及免疫缺陷者并发水痘感染的治疗。

应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本文发明主题做任何限制。在本申请中，必须注意，除非文中另有清楚的说明，否则在本说明书和权利要求书中所用的单数形式包括所指事物的复数形式。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其他形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。

本发明以下实施例中，丁苯酞主要用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中。本发明实施例将丁苯酞作为阳性药使用。

本发明以下实施例中，MCAO是指Middle Cerebral Artery Occlusion，大脑中动脉缺血。

实施例一、拉米夫定对缺血性脑卒中的治疗效果

1.实验动物和药物

SPF级健康雄性SD大鼠，体重200-240g，实验前未用过任何药物，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，动物许可证号为SCXK(甘)-2020-0002，适应性饲养一周，给予动物饮食并自由饮水，然后分组进行实验。

药物及试剂：拉米夫定(Lamivudine，3-TC，HPLC≥98％)，购自麦克林生物科技有限公司；丁苯酞软胶囊(恩必普，NBP)，购自石药集团恩必普药业有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，购自Solarbio公司。

2.MCAO模型的制备和给药时间：适应性饲养一周后，所有的SD大鼠随机分为4组，分组和给药剂量如下：

假手术组(SHAM，灌胃给予等体积0.5％CMC-Na)；

模型组(IR，灌胃给予等体积0.5％CMC-Na)；

丁苯酞组(NBP，灌胃给予丁苯酞，20mg/kg/day)

拉米夫定组(C1，灌胃给予拉米夫定，2mg/kg/day)，

预给药3天，应用Longa等(参照文献Reversible middle cerebral arteryocclusion without craniectomy in rats.)的线栓法制作大鼠右侧中动脉闭塞动物模型。

模型组：将麻醉后的大鼠固定，备皮，碘伏消毒，并消毒手术器械，预备好结扎用的5号线，沿颈部正中偏右行纵向切口约1.5cm。小心分离右侧颈动脉和迷走神经后，用手术缝合线将颈总动脉与颈内动脉结扎，颈总动脉结扎位置在分岔口10mm处，之后在离颈总动脉分叉处5mm处切口，将直径为0.32mm的线栓经切口***颈内动脉，线栓深度约为18-20mm时，停止插线，系紧结扎线。清洗后，进行分层缝合。在动物缺血2h后去除线栓，动物会自然苏醒，再灌注24h，进行相关指标检测。与永久性脑缺血不同的是，在阻断2h后拔出尼龙线栓，扎紧动脉残端，消毒后逐层缝合皮下组织和皮肤。

假手术组：除不***线栓外其余操作同模型组。待实验动物清醒后，再进行药物干预，给药24h后处死取材。

3.检测指标

3.1神经功能缺损评分

依据Zea Longa 5级评分：0分：无神经功能缺损；1分：病灶对侧前爪不能完全伸展；2分：向病灶对侧自发性旋转；3分：向病灶对侧倾倒；4分：无自发性行走且出现意识丧失。

3.2TTC染色

取每组大鼠，断头，冰上分离脑组织，去除嗅球和脑干，生理盐水冲洗后立即放入-20℃冷冻15min，取出，将大脑沿视交叉平面至垂体平面冠状切均匀切成4片冠状切片，浸入1.5％TTC溶液，37℃恒温水浴中孵育染色(避光)45min，每15min翻一次，使染色均匀，与正常组织中的脱氧酶反应呈红色，缺血区呈白色，即未染色的区域为梗死区域，根据脑组织各冠状切片梗死体积总和占全脑体积百分比测定动物脑组织梗死体积。

脑梗死体积＝(缺血侧面积均值总和-对侧面积均值总和)×梗死脑组织厚度

4.实验结果

神经功能缺损评价、TTC染色和脑梗死体积结果如附图1所示。由图1A和图1B可知，与假手术组相比，模型组的神经功能评分显著升高(^###p﹤0.001)，脑组织TTC染色呈均匀的红色，未见缺血白色梗死灶，而MCAO模型组可见大区域的白色梗死灶，表明大鼠MCAO模型制作成功。与IR模型组相比，阳性药丁苯酞与拉米夫定均能显著的降低神经功能缺损评分(*p<0.05，图1B)，改善梗死灶(**p<0.001，图1C)，表明拉米夫定与丁苯酞一样具有脑卒中的神经保护作用，且拉米夫定的神经保护作用(80.38％)强于临床用药丁苯酞的神经保护作用(60.71％)，即本发明拉米夫定具备更佳的治疗缺血性脑卒中神经损伤的作用。

由于拉米夫定属于经典的核苷类似物药物，因此，发明人推测，除了拉米夫定之外的其他核苷类似物也具有治疗缺血性脑卒中的效果，为了验证上述推测，发明人评价了齐多夫定和阿昔洛韦对缺血性脑卒中的治疗效果，具体实验过程如下。

实施例二、齐多夫定和阿昔洛韦对缺血性脑卒中的治疗效果

1.实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠，体重200-240g，实验前未用过任何药物，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，许可证号为SCXK(甘)-2020-0002，适应性饲养一周，给予动物饮食并自由饮水，然后分组进行实验。

2.试剂与实验方法

药物及试剂：齐多夫定(Zidovudine,AZT，HPLC≥98％)，购自阿拉丁生物科技有限公司；阿昔洛韦(Acyclovir,ACV，HPLC≥98％)，购自麦克林生物科技有限公司；丁苯酞软胶囊(恩必普，NBP)，购自石药集团恩必普药业有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，购自Solarbio公司。

3.动物模型的制备与检测指标方法同实施例一

实验分组如下：

假手术组(SHAM，灌胃给予等体积0.9％NaCl)；

模型组(IR，灌胃给予等体积0.9％NaCl)；

丁苯酞组(NBP，灌胃给予丁苯酞，20mg/kg/day)

齐多夫定组(AZT，灌胃给予齐多夫定，20mg/kg/day)

阿昔洛韦组(ACV，灌胃给予阿昔洛韦，20mg/kg/day)

4..实验结果

神经功能缺损评价、TTC染色和脑梗死体积结果如附图2所示。由图2A和图2B可知，与假手术组相比，模型组的神经功能评分显著升高(^###p﹤0.001)，脑组织TTC染色呈均匀的红色，未见缺血白色梗死灶，而MCAO模型组可见大区域的白色梗死灶，表明大鼠MCAO模型制作成功。与IR模型组相比，阳性药丁苯酞与齐多夫定、阿昔洛韦均能显著的降低神经功能缺损评分(*p<0.05，图2B)，降低梗死灶(**p<0.001，图2C)，表明齐多夫定、阿昔洛韦和丁苯酞一样具有脑卒中的神经保护作用，且齐多夫定的神经保护作用(72.96％)强于临床用药丁苯酞的神经保护作用(59.44％)，阿昔洛韦的神经保护作用(61.80％)略强于临床用药丁苯酞的神经保护作用(59.44％)，即本发明齐多夫定、阿昔洛韦具备更佳的治疗缺血性脑卒中神经损伤的作用。

综上所述，本发明通过采用MCAO脑缺血再灌注损伤动物模型评价拉米夫定、齐多夫定、阿昔洛韦对缺血性脑卒中治疗效果，实验结果显示拉米夫定、齐多夫定、阿昔洛韦均具有治疗缺血性脑卒中的作用，且拉米夫定的治疗效果优于齐多夫定和阿昔洛韦。因此，核苷类似物均具有治疗缺血性脑卒中的作用，在临床上具有广阔的应用前景。

本发明的保护范围不限于实施例。凡技术人员按照本发明的思路在现有技术上通过逻辑分析、推断和实验得出的技术方案，均属于权利要求书中保护的范围。

Claims

1.拉米夫定在制备治疗和/或预防缺血性脑卒中药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述拉米夫定的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂。