CN113088456A - 一种控制丝状真菌生长形态的方法 - Google Patents
一种控制丝状真菌生长形态的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113088456A CN113088456A CN202110346541.XA CN202110346541A CN113088456A CN 113088456 A CN113088456 A CN 113088456A CN 202110346541 A CN202110346541 A CN 202110346541A CN 113088456 A CN113088456 A CN 113088456A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- culture
- filamentous fungi
- culture medium
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 58
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 57
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims abstract description 39
- -1 alcohol amine Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 14
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 2
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 abstract 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 16
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 14
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 11
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 10
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 9
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 8
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 5
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229910052603 melanterite Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229940099690 malic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 3
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 241000479753 Aspergillus niger ATCC 1015 Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960004543 anhydrous citric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Substances [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种控制丝状真菌生长形态的方法，该方法主要是在丝状真菌种子培养过程中，向培养基中添加醇胺类物质，再进行培养。本发明通过在丝状真菌种子培养基中添加一定浓度的醇胺类物质，将种子形态控制为对后期发酵时期有利的球形小颗粒。本发明解决了现有技术条件中丝状真菌成球控制条件苛刻，重复性差，菌球直径分布不均一等缺点，本发明的方法可以得到表面光滑的球状的丝状真菌菌丝体，无任何毒副作用产生，安全高效，可以用于工业产酸，并且成本低廉，简便易行，可操作性强，效果显著，重复性较好，操作条件范围广，可有效降低对设备的要求，使其相对于其他技术手段而言，更具有工业化竞争力。
Description
技术领域
本发明属于生物工程，具体涉及一种控制丝状真菌生长形态的方法。
背景技术
丝状真菌在工业化生产中有着广泛的应用，可用来生产工业酶制剂、有机酸、抗生素等。在产业化生产中，深层发酵过程的丝状真菌在通常情况下存在三种形态：团块状、絮状和球状。不同形态的丝状真菌会直接影响发酵体系中物性参数、基质传递等，所以生长形态对发酵产品的生成，发酵过程的控制至关重要。不同的目标产物对菌体的形态要求各不相同，因为其生长形态对细胞代谢途径、产物积累及分离提取均有显著影响，例如在利用黑曲霉进行酶制剂生产的时候，常常需要将其生长形态控制为分散的絮状菌丝体状，而同样利用黑曲霉进行壳聚糖发酵的时候，菌体呈球状的形态更有利于产品产量的提高。因此控制丝状真菌的生长形态是工业化发酵过程中研究的重点。
团块状的真菌在搅拌式发酵罐发酵过程中，会缠绕在搅拌器上或者附壁，造成传质、传氧的限制，最终导致不能得到目标产品或产量偏低，但是在进行转盘上固定化丝状真菌进行生产时，团状的形态却能够很好的固定于转盘等载体之上，营养物质和氧气在絮状菌丝体内部传输较为顺利，但流变性相对较差，此形状利于酶制剂、抗生素等产品的生产。球状真菌可以改善上述的不足条件，改善发酵液的流变特性，有效提高传质、传氧性能，降低能耗，但也需要将球状控制在规则的、适宜大小，规则且大小适宜的球状真菌则有利于有机酸等产品的生产。值得强调的是，丝状真菌的形态在发酵过程中受到很多因素的影响，包括菌种自身的影响、生长营养环境的影响、发酵操作条件的影响等，于是就出现了在实验过程中菌丝体形态难以控制一致，平行性及重复性不好等问题。所以亟需解决这个问题，找到高效简便的形态控制技术。在利用丝状真菌产有机酸的过程中，球状成为公认的最佳形态。现有的各种有关控制丝状真菌形态的技术方案中，各自存在自己的特点与缺点。
现有的关于控制丝状真菌形态的专利主要有：一种机械式控制发酵过程中丝状真菌菌球大小的设备；一种通过形态优化定向提高丝状真菌代谢产量的突变菌株构建方法。在对生产设备的调控方面，存在成本投入较大，精密度要求较高等问题。在菌种选育方面，通过菌种选育改变菌种的特性，或者进行代谢的改造，最终使所获得的菌株能在各种培养条件下能成为菌球，但是菌种选育以及代谢工程菌种突变具有随机性，使得筛选的工作只能针对某种或某几种特定的性状进行筛选，而且筛选周期没有期限，存在菌种退化现象等。
综上可见，现有的有关丝状真菌形态控制的技术存在操作方法复杂，工艺条件苛刻，可控性低等问题。因此，进行高效便捷的技术方案的设计，控制丝状真菌发酵生长形态，成为必然需求。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种控制丝状真菌生长形态的方法，本发明的方法能高效便捷地控制丝状真菌发酵过程中的生长形态，提高目标产物发酵产率，解决了现有技术条件中丝状真菌成球控制条件苛刻，重复性差，菌球直径分布不均一等缺点。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种控制丝状真菌生长形态的方法，包括如下步骤：在丝状真菌种子培养过程中，向培养基中添加醇胺类物质进行种子培养，以控制菌丝生长成为对后期发酵有利的形态，再进行发酵培养。
其中，所述丝状真菌为曲霉属或根霉属。
其中，所述醇胺类物质包括乙醇胺，二乙醇胺和三乙醇胺。
其中，所述培养基为含有碳源，氮源和无机盐的培养基。
本发明所述的丝状真菌种子培养基和发酵培养基应理解为现有技术中丝状真菌生长(种子培养)和发酵的培养基。例如，米根霉发酵生产富马酸或苹果酸的常规发酵培养基、黑曲霉发酵生产柠檬酸或苹果酸的常规发酵培养基等。丝状真菌生长所必需的营养物质，均包括碳源、氮源、无机盐、水分，将它们配制为一定浓度的溶液，灭菌并冷却。
作为优选，所述醇胺类物质的添加量为醇胺类物质的体积占培养基体积的0.1-2.0％。待种子培养完成后，再将种子培养液以体积比5-25％的接种量转接至发酵培养基。
作为优选，在菌丝体生长阶段即种子培养阶段，向种子培养基中添加醇胺类物质进行种子培养，以获得一定数量球状的丝状真菌菌丝体，然后转接入发酵培养基中进行发酵培养。
其中，所述种子培养基中添加醇胺类物质进行种子培养，然后按体积比10-20％转接入发酵培养基中进行发酵培养。
进一步地，在丝状真菌种子培养基中添加适宜浓度的醇胺类物质控制菌体为形态大小均一的圆形颗粒状，然后按一定比例添加丝状真菌种子培养液于发酵培养基中进行液体发酵培养，在整个发酵过程中一直保持为球状的具有生物催化活性的丝状真菌团体。
其中，所述种子培养的条件为28-35℃下培养18-24小时，转速为200rpm；发酵培养的条件为28-35℃下培养60-120小时，转速为200rpm。
其中，所述的具有生物催化活性的丝状真菌团体可以作为发酵生产预培养的种子或者产品提取所需要的生物量。
本发明利用醇胺类物质，控制菌体形成表面光滑的球形，且菌体间大小一致，而形态的控制对丝状真菌发酵进行相关产物的生产至关重要。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)利用一定浓度的醇胺类物质控制菌球形态，成功解决了丝状真菌形态控制困难的技术难题，相对于现有技术方案丝状真菌菌球形态的控制，本发明的方法成本低廉，简便易行，可操作性强，效果显著，重复性较好。
(2)通过该方法进行形态控制，可有效增加发酵产物如富马酸、苹果酸等产品的产量。相对于现行技术方案，增加了发酵产品的产出，提高了生产该类产品企业的收益，同时利用醇胺类物质控制菌球形态，可有效降低生产时对设备精度的要求，从而降低生产设备的成本，使得本发明方法在工业化应用中更具有竞争优势。
(3)通过向丝状真菌种子培养基中添加适宜浓度的醇胺类物质，经培养后得到的丝状真菌成球状，实现对丝状真菌菌体形态的控制，然后将种子培养液以适宜比例接入发酵培养基进行发酵产酸。本发明重复性好，获得的菌球直径分布均一，表面光滑，发酵产品无任何毒副作用，安全高效。
附图说明
图1为不同培养条件下米根霉形态；
图2为米根霉生产富马酸产量；
图3为不同培养条件下黑曲霉形态；
图4为黑曲霉生产L-苹果酸产量。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明使用的菌种是工业生产中常用的具有典型代表的丝状真菌米根霉ATCC20344和丝状真菌黑曲霉ATCC 1015。
实施例1
通过添加三乙醇胺控制米根霉菌球形态方法
(1)培养基的配制：种子培养基包括葡萄糖20g/L，尿素1g/L，KH2PO4 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.066g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，115℃灭菌30min。
(2)种子培养：往步骤(1)培养基中加入培养基体积的1.5％三乙醇胺，同时接入浓度为1×107个/mL的米根霉孢子悬浮液1mL，35℃、200rpm培养24小时即为种子液。
同时采用上述相同培养方法只是步骤(2)不加入三乙醇胺和采用上述相同方法步骤(2)不添加三乙醇胺而是用稀H2SO4将种子培养基pH调节至3.0再接菌培养的两组种子培养液作为对照1和2；
结果如图1所示菌落形态图，分别对照1的米根霉菌丝体呈絮状(A)，用稀H2SO4调节pH至3.0的菌丝体呈现表面粗糙的球状(B)，而加入1.5％三乙醇胺的培养基中菌丝体为表面光滑的球状，直径分布均一(C)。结果表明在种子培养阶段加入适宜剂量的醇胺类物质可以控制丝状真菌米根霉形成对后期发酵阶段有利的均一球状形态，并且重复性好；而絮状米根霉不能用于产酸。
实施例2
利用三乙醇胺控制米根霉菌球生长形态方法进行富马酸发酵生产
(1)培养基的配制：种子培养基包括葡萄糖20g/L，尿素1g/L，KH2PO4 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.066g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
发酵培养基包括葡萄糖80g/L，尿素0.2g/L，KH2PO4 0.15g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.068g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO3 60g/L。培养基均115℃灭菌30min。
(2)种子培养：往步骤(1)种子培养基中加入培养基体积的1.0％三乙醇胺，同时接入浓度为1×107个/mL的米根霉孢子悬浮液1mL，35℃、200rpm培养24小时即为种子液；
同时步骤(2)不添加三乙醇胺而是用稀H2SO4将种子培养基pH调节至3.0再接菌培养的种子液作为对照。
(3)发酵培养：将以上实验组和对照组的种子培养液分别以体积比10％的接种量接入发酵培养基，两组发酵时间均在72小时，35℃，200rpm，得到富马酸发酵液。
(4)结果如图2所示，通过高效液相色谱测定发酵液中富马酸终浓度，高效液相色谱(HPLC)紫外检测法测定，使用伯乐Aminex HPX-87H色谱柱，流动相为5mM稀硫酸，柱温30℃，流动相流速0.6mL/min，波长210nm。实验组为28.6g/L，对照组为22.5g/L，添加三乙醇胺后，实验组目标产物富马酸的终浓度比对照组提高了27.1％。数据表明加入三乙醇胺控制好形态后对相关产物产量的提升作用显著。
实施例3
通过添加乙醇胺控制黑曲霉菌球形态方法
(1)培养基的配制：种子培养基包括葡萄糖40g/L，细菌蛋白胨6g/L，KH2PO4 0.75g/L，K2HPO4 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCl2·7H2O 0.1g/L和微量元素。其中微量元素的组成为0.005g/L NaCl，0.005g/L FeSO4·7H2O和0.001无水柠檬酸，115℃灭菌30min。
(2)种子培养：往步骤(1)培养基中加入培养基体积的0.1％乙醇胺，同时接入浓度为1×108个/mL的黑曲霉孢子悬浮液1mL，28℃、200rpm培养19小时即为种子液；
同时采用上述相同培养方法只是步骤(2)不加入乙醇胺的种子培养液作为对照；
结果如图3所示菌落形态图，分别显示不做任何处理(不加入乙醇胺)的菌丝体呈大小不规则的圆球状(A)，加入0.1％乙醇胺的培养基中菌丝体为表面光滑的球状，直径分布均一(B)。结果表明在种子培养阶段加入适宜剂量的醇胺类物质可以控制丝状真菌黑曲霉形成对后期发酵阶段有利的均一球状形态，并且重复性好。
实施例4
利用三乙醇胺控制黑曲霉菌球生长形态方法进行L-苹果酸发酵生产
(1)培养基的配制：种子培养基包括葡萄糖40g/L，细菌蛋白胨6g/L，KH2PO4 0.75g/L，K2HPO4 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCl2·7H2O 0.1g/L和微量元素。
发酵培养基包括葡萄糖100g/L，细菌蛋白胨6g/L，KH2PO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCl2·7H2O 0.1g/L和微量元素。其中微量元素的组成为0.005g/LNaCl，0.005g/L FeSO4·7H2O和0.001g/L无水柠檬酸，培养基均115℃灭菌30min。
(2)种子培养：往步骤(1)种子培养基中加入培养基体积0.2％三乙醇胺，同时接入浓度为1×108个/mL的黑曲霉孢子悬浮液1mL，28℃、200rpm培养19小时即为种子液；
同时采用上述相同方法只是不加入三乙醇胺的种子培养液作为对照。
(3)发酵培养：将以上实验组和对照组的种子培养液分别以体积比20％的接种量接入发酵培养基，两组发酵时间均在96小时；28℃、200rpm，得到L-苹果酸发酵液。
(4)结果如图4所示，通过高效液相色谱测定发酵液中目标产物L-苹果酸终浓度，高效液相色谱(HPLC)紫外检测法测定，使用伯乐Aminex HPX-87H色谱柱，流动相为5mM稀硫酸，柱温30℃，流动相流速0.6mL/min，波长210nm。实验组为60.2g/L，对照组为48.5g/L，实验组添加三乙醇胺目标产物L-苹果酸的终浓度比对照组提高了24.1％。
实施例5
实施例5与实施例1方法相同，不同之处在于：步骤(2)使用的醇胺类物质是二乙醇胺，所述醇胺类物质的添加量为醇胺类物质的体积占培养基体积的2.0％；35℃、200rpm培养18小时。
实施例6
实施例6与实施例3方法相同，不同之处在于：步骤(2)使用的醇胺类物质是二乙醇胺，所述醇胺类物质的添加量为醇胺类物质的体积占培养基体积的0.5％；28℃、150rpm培养24小时。
实施例7
实施例7与实施例2方法相同，不同之处在于：步骤(3)发酵时间在120小时，35℃，150rpm，得到富马酸发酵液。
实施例8
实施例8与实施例4方法相同，不同之处在于：步骤(3)发酵时间在60小时，28℃、200rpm，得到L-苹果酸发酵液。
Claims (8)
1.一种控制丝状真菌生长形态的方法，其特征在于，所述方法包括在丝状真菌培养过程中，向培养基中添加醇胺类物质。
2.根据权利要求1所述的控制丝状真菌生长形态的方法，其特征在于，所述丝状真菌为曲霉属或根霉属。
3.根据权利要求1所述的控制丝状真菌生长形态的方法，其特征在于，所述醇胺类物质包括乙醇胺，二乙醇胺和三乙醇胺中的任意一种或者多种。
4.根据权利要求1所述的控制丝状真菌生长形态的方法，其特征在于，所述培养基为含有碳源，氮源和无机盐的培养基。
5.根据权利要求1所述的控制丝状真菌生长形态的方法，其特征在于，所述醇胺类物质的添加量优选为醇胺类物质的体积占培养基体积的0.1-2.0％。
6.根据权利要求1所述的控制丝状真菌生长形态的方法，其特征在于，在菌丝体生长阶段，向种子培养基中添加醇胺类物质进行种子培养，然后转接入发酵培养基中进行发酵培养。
7.根据权利要求6所述的控制丝状真菌生长形态的方法，其特征在于，所述种子培养基中添加醇胺类物质进行种子培养，然后按体积比10-20％转接入发酵培养基中进行发酵培养。
8.根据权利要求6所述的控制丝状真菌生长形态的方法，其特征在于，所述种子培养的条件为28-35℃下培养18-24小时，转速为150-200rpm；发酵培养的条件为28-35℃下培养60-120小时，转速为150-200rpm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110346541.XA CN113088456B (zh) | 2021-03-31 | 2021-03-31 | 一种控制丝状真菌生长形态的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110346541.XA CN113088456B (zh) | 2021-03-31 | 2021-03-31 | 一种控制丝状真菌生长形态的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113088456A true CN113088456A (zh) | 2021-07-09 |
| CN113088456B CN113088456B (zh) | 2023-03-21 |
Family
ID=76671948
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110346541.XA Active CN113088456B (zh) | 2021-03-31 | 2021-03-31 | 一种控制丝状真菌生长形态的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113088456B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106635823A (zh) * | 2016-10-19 | 2017-05-10 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种控制菌丝体生长形态的方法 |
-
2021
- 2021-03-31 CN CN202110346541.XA patent/CN113088456B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106635823A (zh) * | 2016-10-19 | 2017-05-10 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种控制菌丝体生长形态的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113088456B (zh) | 2023-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tay et al. | Production of L (+)‐lactic acid from glucose and starch by immobilized cells of Rhizopus oryzae in a rotating fibrous bed bioreactor | |
| Xu et al. | Key technologies for the industrial production of fumaric acid by fermentation | |
| Liao et al. | Co-production of fumaric acid and chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material–dairy manure–using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC 20344 | |
| Zhou et al. | Production of fumaric acid from biodiesel-derived crude glycerol by Rhizopus arrhizus | |
| WO2020042481A1 (zh) | 一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法 | |
| CN110499345B (zh) | 一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法 | |
| Fu et al. | High-efficiency l-lactic acid production by Rhizopus oryzae using a novel modified one-step fermentation strategy | |
| Reddy et al. | Homofermentative production of optically pure l-lactic acid from sucrose and mixed sugars by batch fermentation of Enterococcus faecalis RKY1 | |
| CN101497901A (zh) | 米根霉半连续高密度发酵产高光学纯度l-乳酸新工艺方法 | |
| CN102304480B (zh) | 一株高产l-乳酸的鼠李糖乳杆菌菌株及发酵木薯、甘蔗糖蜜产乳酸的方法 | |
| Yu et al. | Enhanced production of L (+)-lactic acid by floc-form culture of Rhizopus oryzae | |
| CN103597087B (zh) | 丁酸、丁醇及丁酯的制备方法 | |
| US20140106421A1 (en) | Methods Of Producing Carboxylic Acids And/Or Alcohols | |
| CN112831437B (zh) | 枯草芽孢杆菌及高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法 | |
| CN109652469A (zh) | 一种利用副干酪乳杆菌发酵制备l-乳酸的方法 | |
| Liu et al. | Optimization of L-(+)-lactic acid production using pelletized filamentous Rhizopus oryzae NRRL 395 | |
| CN102093990B (zh) | 微生物发酵生产低温淀粉酶的方法 | |
| CN104561140B (zh) | 一种发酵制备柠檬酸的方法 | |
| CN113088456B (zh) | 一种控制丝状真菌生长形态的方法 | |
| Crognale et al. | Fed-batch gluconic acid production from Penicillium variabile P16 under different feeding strategies | |
| CN102212484B (zh) | 控制丝状真菌发酵过程中生长形态的方法 | |
| CN106957882B (zh) | 一种发酵制备柠檬酸的方法 | |
| CN105154360B (zh) | 一种***丛毛单胞菌hy-08d的培养方法 | |
| CN101463370B (zh) | 利用米根霉发酵马铃薯淀粉制备l-乳酸的方法 | |
| CN104561139A (zh) | 一种提高微生物终细胞密度并缩短培养时间的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |