CN113087935A - 一种抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶及其制备方法，属于复合透明质酸钠凝胶制备技术领域。本发明中提高透明质酸钠凝胶抗酶解能力的方式有两种：一是含有活性官能团，可以通过接枝的方式结合到透明质酸钠结构中；二是通过直接添加的方式加入到透明质酸钠凝胶中。将透明质酸酶活性抑制剂与透明质酸钠构建凝胶体系，能够在不过量添加交联剂的情况下延缓凝胶降解时间，通过抑制透明质酸酶活性延长凝胶在体内降解时间，为面部注射凝胶类功能材料提供一种新思路。

Description

一种抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶及其制备 方法

技术领域

本发明属于复合透明质酸钠凝胶制备技术领域，具体涉及一种抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶及其制备方法。

背景技术

透明质酸钠是一种存在于高等动物机体内多种器官组织中的天然大分子多聚糖，是构成人体细胞间质、关节滑液等组织的重要成分。其是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖构成，具有良好的生物相容性，高粘弹性以及独特的分子结构和理化性质，在机体内显示出多种重要的生理功能。

注射填充剂是现阶段治疗面部老化皱纹与凹陷的最为有效地途径之一，而注射填充剂中的透明质酸钠类产品是比较稳定的产品。透明质酸钠在临床上可以用于大部分皱纹和凹陷的美容注射产品，是一种理想的软组织填充剂。现常用的透明质酸钠基本是取自细菌发酵法的非动物源性透明质酸钠，这种来源的填充剂具有非常明显的优势：一是其结构在不同物种内无区别，无免疫原性，不易引起免疫反应；二是注射后在组织内的保持时间长，如注射效果不佳还可以通过注射透明质酸酶将其溶解掉。透明质酸钠在植入人体时显示出优良的机体生物相容性，是一种理想的天然生物医药材料。透明质酸钠属于糖胺多糖，在体内极易降解，为了延长其在体内降解时间，往往对透明质酸钠结构进行交联修饰。交联度高低影响着填充剂性质，提高交联度是延长降解时间的主要方式，往往采用添加交联剂的方式，任何交联剂的残留在现有技术下都不可能完全被清除，交联剂过量会导致生物相容性降低，注入人体时易引起免疫反应。

皮肤中存在的透明质酸酶与自由基能将聚合的透明质酸钠聚合结构切断，透明质酸钠填充剂在体内降解通常是由酶降解造成的，自由基对透明质酸钠结构降解作用相对较小，所以如何抑制透明质酸酶活性成为了延缓透明质酸钠凝胶降解作用的重要手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶及其制备方法，且制得的复合透明质酸钠凝胶具有低交联剂残留，抗酶解效果好的优点；此外本发明的制备方法简单有效，应用前景广。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶的制备方法，步骤如下：

(1)将透明质酸酶抑制剂溶于碱溶液中并不断搅拌，制备成浓度为1-10％(w/w)的溶液；然后加入透明质酸钠干粉使其浓度为1-20％(w/w)，加入交联剂使其浓度为0.1-10％(w/w)，搅拌均匀，在温度为10-90℃的环境中反应2-10h，反应结束后得到初交联凝胶；用95％乙醇沉析，沉析物经水反复洗涤后干燥得到初级交联凝胶粉末；

(2)将透明质酸钠干粉溶于碱溶液中，制备成浓度为10-40％(w/w)的溶液；随后加入步骤(1)制备的初级交联凝胶粉末；搅拌均匀，在20-50℃环境中搅拌反应2-10h；反应结束后再加入交联剂使其浓度为0.1-10％(w/w)，搅拌均匀，进行二次加强交联，交联时间2-10h，温度20-50℃，交联结束后得到复合凝胶；

(3)将步骤(2)获得的复合凝胶加入凝胶体积3倍的纯化水进行自然吸涨24h(吸涨过程中可更换纯化水)，吸涨结束后用筛网将溶胀后的凝胶筛分为粒径均一的颗粒，经过醇沉、洗涤、干燥后得到复合透明质酸钠干粉，取20mg复合透明质酸钠干粉加入0.5-2mL磷酸盐缓冲液，若缓冲液没有被完全吸收，则用滤纸吸干剩余缓冲液，即为复合透明质酸钠凝胶，在凝胶中加入含有0.05％-5％透明质酸酶抑制剂的磷酸盐缓冲溶液，加入含有透明质酸酶抑制剂的磷酸盐缓冲液的量为复合透明质酸钠凝胶的5％-20％(w/w)(在此含量范围内透明质酸酶抑制剂能够有效抑制透明质酸酶活性)，即得抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶。

上述步骤(1)和步骤(2)中的透明质酸酶抑制剂可以相同也可以不同；透明质酸酶抑制剂为具有活性官能团的物质，可接枝到透明质酸钠结构中也可直接添加到制备的凝胶中，且都具有透明质酸酶抑制活性。具体可以选自以下物质中的至少一种：

糖胺聚糖类物质，如肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素等；多糖类，如壳聚糖、β-(1,4)-低聚半乳糖、硫酸纤维素、硫酸葡聚糖等；脂肪酸类，如植物神经酸、齐墩果酸；抗氧化剂类，如维生素C、D-异抗坏血酸、儿茶素、姜黄素、单宁酸、没食子酸、原花青素等；生物碱类，如马兜铃酸、阿马林、利血平；类黄酮类，如黄酮、槲皮素、芹菜素、木犀草素、橙皮苷、芦丁等。

透明质酸钠接枝反应位点可以发生在羟基、羧基和N-乙酰氨基三个上，羟基的反应主要分为醚化反应、酯化反应等；酯化反应是指透明质酸钠可以与酰氯或酰酐进行反应生成脂类化合物，例如乙酸酐与透明质酸钠反应等。羧基交联常使用碳二亚胺类，需要在酸性条件下反应，这会导致部分胺质子化，降低其亲核性导致反应不彻底。优选的采用羟基反应的交联剂进行交联，例如，1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、二已烯基砜(DVS)等环氧化合物。

在上述抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶的制备方法中，所述步骤(1)和步骤(2)中碱溶液为NaOH溶液，pH范围为7-13，优选为9-11。

优选的，所述步骤(2)中初交联凝胶粉末与透明质酸钠干粉的质量比为0.1-5:10。

优选的，所述步骤(1)中反应温度为30-50℃；反应时间为3-5h；透明质酸酶抑制剂浓度为2-5％(w/w)。

优选的，所述步骤(2)中反应温度为30-40℃；反应时间为4-6h。

上述方法制备的抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶。

上述抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶在制备医用填充材料中的应用。

本发明技术方案的优点

本发明中提高透明质酸钠凝胶抗酶解能力的方式有两种：一是含有活性官能团，可以通过接枝的方式结合到透明质酸钠结构中；二是通过直接添加的方式加入到透明质酸钠凝胶中。将透明质酸酶活性抑制剂与透明质酸钠构建凝胶体系，能够在不过量添加交联剂的情况下延缓凝胶降解时间，通过抑制透明质酸酶活性延长凝胶在体内降解时间，为面部注射凝胶类功能材料提供一种新思路。

(1)在制备过程中引入透明质酸酶抑制剂，透明质酸酶活性抑制剂具有明显的抑制酶降解作用。其中像硫酸软骨素等物质不仅具有抑制透明质酸酶活性的作用，还有抗菌、抗炎和加速伤口愈合作用，以减轻注射部位的不良反应。含有硫酸软骨素的凝胶与天然细胞外基质相似，提高了凝胶的生物相容性。

(2)通过二次强化交联提高透明质酸钠凝胶交联度，在初交联中没有反应完全的交联剂也可在二次加强交联中继续反应，减少交联剂残留，也可以提高凝胶抗酶解性以及减少注射后的免疫反应。

(3)在复溶后直接加入透明质酸酶活性抑制剂加强了凝胶的抗酶解能力，明显提高了注射凝胶在体内存留时间，加强治疗效果。

附图说明

图1：实施例2步骤制备样品测定乙醇洗涤不同次数下交联剂BDDE的残留。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

一种抵抗透明质酸酶水解的硫酸软骨素-透明质酸钠复合凝胶，具体由以下方法制备而成：

称取1g硫酸软骨素(分子量为10kDa)，将其溶于50mL的NaOH溶液(pH＝11)中并不断搅拌，加入5g透明质酸钠干粉(分子量为800kDa)后加入1mL BDDE搅拌均匀。在温度为37℃的环境中反应4h，反应结束后得到初交联凝胶。凝胶用95％乙醇沉析，沉析物经纯化水反复洗涤后干燥得到凝胶粉末。

称取10g透明质酸钠干粉(分子量为1500kDa)溶于50mL NaOH溶液(pH＝11)中，随后加入2g初交联凝胶干粉搅拌均匀，在37℃环境中搅拌反应5h。反应结束后再加入1mL的BDDE搅拌均匀，进行二次加强交联，交联时间5h，温度为37℃，交联结束后得到复合凝胶。复合凝胶中加入凝胶体积3倍的纯化水进行自然吸涨24h，用筛网将溶胀后的凝胶筛分为粒径均一的小颗粒状经过醇沉、洗涤、干燥后得到复合透明质酸钠凝胶干粉，取20mg复合透明质酸钠凝胶干粉加入1mL磷酸盐缓冲液进行溶解吸收，若缓冲液没有被完全吸收，则用滤纸吸干剩余缓冲液，则得复合透明质酸钠凝胶；加入含有2％硫酸软骨素的磷酸盐缓冲溶液，加入量为复合透明质酸钠凝胶的8％(w/w)，即得到抵抗透明质酸酶水解的硫酸软骨素-透明质酸钠复合凝胶产品，编号样品1。

硫酸软骨素具有较高的生物相容性同时还具有抗菌、抗炎和加速伤口愈合的作用，在透明质酸钠凝胶注射入皮肤内时能够减缓炎症作用。硫酸软骨素具有抑制透明质酸酶活性的作用，提高透明质酸钠凝胶的抗酶解能力，以此来延长透明质酸钠在体内降解周期。有研究表明，含有硫酸软骨素的水凝胶与天然细胞外基质相似，能够有效提高凝胶生物相容性，因此含有硫酸软骨素的凝胶适合应于生物医学领域。

实施例2

一种抵抗透明质酸酶水解的硫酸软骨素-透明质酸钠复合凝胶，具体由以下方法制备而成：

称取2g硫酸软骨素(分子量为10kDa)，将其溶于50mL的NaOH溶液(pH＝11)中并不断搅拌，加入5g透明质酸钠干粉(分子量为800kDa)后加入1mL BDDE搅拌均匀。在温度为37℃的环境中反应4h，反应结束后得到初交联凝胶。凝胶用95％乙醇沉析，沉析物经纯化水反复洗涤后干燥得到凝胶粉末。

称取10g透明质酸钠干粉(分子量为1500kDa)溶于50mL NaOH溶液(pH＝11)中，随后加入2g初交联凝胶干粉搅拌均匀，在37℃环境中搅拌反应5h。反应结束后再加入1mL的BDDE搅拌均匀，进行二次加强交联，交联时间为5h，温度为37℃，交联结束后得到复合凝胶。向复合凝胶中加入凝胶体积3倍的纯化水进行自然吸涨24h，用筛网将溶胀后的凝胶筛分为粒径均一的小颗粒进行醇沉、洗涤、干燥后得到复合透明质酸钠凝胶干粉，取20mg复合透明质酸钠凝胶干粉加入1mL磷酸盐缓冲液进行溶解，用滤纸除去凝胶表面多余水分，则得复合透明质酸钠凝胶；加入含有2％硫酸软骨素的磷酸盐缓冲溶液，加入量为透复合透明质酸钠凝胶的8％(w/w)，即得到抵抗透明质酸酶水解的硫酸软骨素-透明质酸钠复合凝胶产品，编号样品2。

实施例3

一种抵抗透明质酸酶水解的硫酸软骨素-透明质酸钠复合凝胶，具体由以下方法制备而成：

称取2g硫酸软骨素(分子量为10kDa)，将其溶于50mL的NaOH溶液(pH＝11)中并不断搅拌，加入5g透明质酸钠干粉(分子量为800kDa)后加入1mL BDDE搅拌均匀。在温度为37℃的环境中反应4h，反应结束后得到初交联凝胶。凝胶用95％乙醇沉析，沉析物经纯化水反复洗涤后干燥得到凝胶粉末。

称取10g透明质酸钠干粉(分子量为1500kDa)溶于50mL NaOH溶液(pH＝11)中，随后加入2g初交联凝胶干粉搅拌均匀，在37℃环境中搅拌反应5h。反应结束后再加入1mL的BDDE搅拌均匀，进行二次加强交联，交联时间为5h，温度为37℃，交联结束后得复合凝胶。向复合凝胶中加入凝胶体积3倍的纯化水进行自然吸涨24h，用筛网将溶胀后的凝胶筛分为粒径均一的小颗粒，经醇沉、洗涤、干燥后得到复合透明质酸钠干粉，取20mg复合透明质酸钠干粉加入1mL磷酸盐缓冲液进行溶解，用滤纸除去凝胶表面多余水分后得到抵抗透明质酸酶水解的硫酸软骨素-透明质酸钠复合凝胶产品，编号样品3。

实施例4

一种抵抗透明质酸酶水解的壳聚糖-透明质酸钠复合凝胶，具体由以下方法制备而成：

称取1.8g壳聚糖(分子量为50kDa)，将其溶于50mL的NaOH溶液(pH＝11)中并不断搅拌，加入5g透明质酸钠干粉(分子量为800kDa)后加入1mL BDDE搅拌均匀。在温度为37℃的环境中反应4h，反应结束后得到初交联凝胶。凝胶用95％乙醇沉析，沉析物经纯化水反复洗涤后干燥得到凝胶粉末。

称取10g透明质酸钠干粉(分子量为1500kDa)溶于50mL NaOH溶液(pH＝11)中，随后加入2g初交联凝胶干粉搅拌均匀，在37℃环境中搅拌反应5h。反应结束后再加入1mL的BDDE搅拌均匀，进行二次加强交联，交联时间为5h，温度为37℃，交联结束后得到复合凝胶。向复合凝胶中加入凝胶体积3倍的纯化水进行自然吸涨24h，用筛网将溶胀后的凝胶筛分为粒径均一的小颗粒，经醇沉、洗涤、干燥后得到复合透明质酸钠干粉，取20mg透明质酸钠干粉加入1mL磷酸盐缓冲液进行溶解吸收，用滤纸除去凝胶表面多余水分后得到复合透明质酸钠凝胶，在复合凝胶中加入含有2％壳聚糖的磷酸盐缓冲液，加入量为复合透明质酸钠凝胶的8％(w/w)，即得抵抗透明质酸酶水解的壳聚糖-透明质酸钠复合凝胶产品，编号样品4。

壳聚糖是几丁质的脱乙酰基衍生物，该多糖介导多种生物学作用，包括抗血管生成，抗微生物和免疫增强活性等。壳聚糖抑制透明质酸酶作用来自于壳聚糖的-NH³⁺官能团与透明质酸钠的-COO^-基团之间产生静电作用，其复合物的形成限制了酶的底物利用率。

实施例5

一种抵抗透明质酸酶水解的壳聚糖-透明质酸钠复合凝胶，具体由以下方法制备而成：

称取1.8g壳聚糖(分子量为10kDa)，将其溶于50mL的NaOH溶液(pH＝11)中并不断搅拌，加入5g透明质酸钠干粉(分子量为800kDa)后加入1mL BDDE搅拌均匀。在温度为37℃的环境中反应4h，反应结束后得到初交联凝胶。凝胶用95％乙醇沉析，沉析物经纯化水反复洗涤后干燥得到凝胶粉末。

称取10g透明质酸钠干粉(分子量为1500kDa)溶于50mL NaOH溶液(pH＝11)中，随后加入2g初交联凝胶干粉搅拌均匀，在37℃环境中搅拌反应5h。反应结束后再加入1mL的BDDE搅拌均匀，进行二次加强交联，交联时间为5h，温度为37℃，交联结束后得到复合凝胶。向复合凝胶中加入凝胶体积3倍的纯化水进行自然溶胀24h，用筛网将溶胀后的凝胶筛分为粒径均一的小颗粒，经醇沉、洗涤、干燥后得到复合透明质酸钠干粉，取20mg复合透明质酸钠干粉加入1mL磷酸盐缓冲液进行溶解，用滤纸除去凝胶表面多余水分，加入含有2％硫酸软骨素的磷酸盐缓冲溶液，加入量为复合透明质酸钠凝胶的8％(w/w)，即得抵抗透明质酸酶水解的壳聚糖-透明质酸钠复合凝胶产品，编号样品5。

对比例1

称取5g透明质酸钠干粉(分子量为800kDa)溶于50mL的NaOH溶液(pH＝11)中搅拌均匀，加入1mL BDDE，在温度为37℃的环境中反应4h，反应结束后得到初交联凝胶。凝胶用95％乙醇沉析，沉析物经纯化水反复洗涤后干燥得到凝胶粉末。

称取10g透明质酸钠干粉(分子量为1500kDa)溶于50mL NaOH溶液(pH＝11)中，随后加入2g初交联凝胶干粉搅拌均匀，在37℃环境中搅拌反应5h。反应结束后再加入1mL的BDDE搅拌均匀，进行二次加强交联，交联时间为5h，温度为37℃，交联结束后得到复合凝胶。在凝胶中加入凝胶体积3倍的纯化水进行自然溶胀24h，用筛网将溶胀后的凝胶晒分为粒径均一的颗粒，经醇沉、洗涤、干燥后得到干粉，取20mg干粉加入1mL磷酸盐缓冲液进行溶解吸收，用滤纸除去凝胶表面多余水分，即得到复合凝胶，编号对比样品1。

对比例2

称取10g透明质酸钠干粉(分子量为1500kDa)溶于50mL NaOH溶液(pH＝11)中，搅拌均匀后加入1mL的BDDE搅拌，交联时间为5h，温度为37℃，交联结束后得到凝胶。在凝胶中加入凝胶体积3倍的纯化水进行自然溶胀24h，用筛网将溶胀后的凝胶筛分为粒径均一颗粒，经醇沉、洗涤、干燥后得到干粉，取20mg干粉加入1mL磷酸盐缓冲溶液进行溶解，用滤纸除去凝胶表面多余水分后即得到复合凝胶，编号对比样品2。

实施例6

分别取样品1-5和对比样品1、2加入到透明质酸酶(200U/mL)的磷酸盐缓冲液中，37℃下降解2、4、8、24h后分别取样，测定葡萄糖醛酸含量，计算得降解率结果如表1所示：

表1

根据表1结果可知，实施例2中制备的样品抗酶解性能优于实施例1，在初交联过程中加入硫酸软骨素可有效延长凝胶降解时间，将硫酸软骨素接枝到凝胶结构中具有抗酶解作用；实施例3复溶后不添加硫酸软骨素，相比于实施例2抗酶解性弱，表明硫酸软骨素直接添加进凝胶中具有很好的抑制酶活性作用；实施例4中添加壳聚糖作为酶活性抑制剂，结果显示相比于硫酸软骨素效果相差不大；实施例5在初交联中添加壳聚糖，复溶后加入硫酸软骨素，酶抑制效果与实施例4相似，两个步骤中加入透明质酸酶抑制剂都具有抑制酶活性作用。

实施例7

取样品1-5和对比样品1、2测定葡萄糖醛酸含量，计算得凝胶中透明质酸钠含量；溶涨度参数是评价凝胶结构的量化指标，在80℃下烘干至恒重时，滴加水至膨胀后，分别测得烘干后质量m1与膨胀后质量m2。根据以下公式计算凝胶溶胀度：

Q——交联透明质酸钠凝胶溶胀度；

m1——交联透明质酸钠凝胶烘干后质量；

m2——交联透明质酸钠凝胶膨胀后质量。

表2

由表2可知，样品1中透明质酸钠含量高于样品2，是由于参与样品1反应的硫酸软骨素少，在相同交联剂存在的情况下，参与反应的透明质酸钠量多，所以测定的透明质酸钠含量稍高。总体看样品2-5的透明质酸钠含量相差不大，对比样品含量较低。溶胀度是评价凝胶结构的量化指标，一般情况下交联度高，结构紧密的凝胶溶胀度低，结果显示，样品1的溶胀度较高，样品2-5初交联过程中加入等量透明质酸酶活性抑制剂，结构相对紧密，不易被体内透明质酸酶降解，对比样品溶胀度很高。

实施例8

酶抑制剂-透明质酸钠复合凝胶交联剂残留测定实验：

以实施例2制备样品，测定经过乙醇洗涤不同次数后，交联剂BDDE的残留。图1表明，在经过6次洗涤后，交联剂残留低于2ppm，符合整形手术用交联透明质酸钠凝胶相关要求。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将透明质酸酶抑制剂溶于碱溶液中并不断搅拌，制备成浓度为1-20％(w/w)的溶液；然后加入透明质酸钠干粉使其浓度为1-10％(w/w)，加入交联剂使其浓度为0.1-10％(w/w)，搅拌均匀，在温度为10-90℃的环境中反应2-10h，反应结束后得到初交联凝胶；用95％乙醇沉析，沉析物经纯化水反复洗涤后干燥得到初级交联凝胶粉末；

(2)将透明质酸钠干粉溶于碱溶液中，制备成浓度为10-40％(w/w)的溶液；随后加入步骤(1)制备的初级交联凝胶粉末；搅拌均匀，在20-50℃环境中搅拌反应2-10h；反应结束后再加入交联剂，其浓度为0.1-10％(w/w)，搅拌均匀，进行二次加强交联，交联时间2-10h，温度20-50℃，交联结束后得到复合凝胶；

(3)向步骤(2)获得的复合凝胶中加入凝胶体积3倍的纯水进行自然吸涨24h，吸涨结束后用筛网将溶胀后的凝胶筛分为小颗粒状，经过醇沉、洗涤、干燥后得到复合透明质酸钠干粉，取20mg复合透明质酸钠干粉加入0.5-2mL磷酸盐缓冲液，加入含有0.05％-5％透明质酸酶抑制剂的磷酸盐缓冲溶液即得抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶，其中，含透明质酸酶抑制剂的磷酸盐缓冲液的添加量为复合透明质酸钠凝胶的5％-20％(w/w)。

2.根据权利要求1所述抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述透明质酸酶抑制剂为糖胺聚糖类、多糖类、脂肪酸类、抗氧化剂类、生物碱类、类黄酮类化合物中的至少一种。

3.根据权利要求2所述抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述透明质酸酶抑制剂为：肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、壳聚糖、β-(1,4)-低聚半乳糖、硫酸纤维素、硫酸葡聚糖、植物神经酸、齐墩果酸、维生素C、D-异抗坏血酸、儿茶素、姜黄素、单宁酸、没食子酸、原花青素、马兜铃酸、阿马林、利血平、黄酮、槲皮素、芹菜素、木犀草素、橙皮苷、芦丁中的至少一种。

4.根据权利要求1所述抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二已烯基砜中的一种。

5.根据权利要求1所述抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中碱溶液为NaOH溶液，pH范围为7-13。

6.根据权利要求1所述抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中初交联凝胶粉末与透明质酸钠干粉的质量比为0.1-5:10。

7.权利要求1-6任一项所述方法制备的抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶。

8.权利要求7所述抵抗透明质酸酶水解的复合透明质酸钠凝胶在制备医用填充材料中的应用。

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