CN113072637A - 氨基脲抗原、胶体金免疫层析检测装置与检测判定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氨基脲抗原，由氨基脲半抗原和载体蛋白偶联制得，氨基脲半抗原的化学分子式为C12H14N4O6，氨基脲抗原应用于免疫层析的检测方面，为水发食品中检测氨基脲提供了基础；另外包含本氨基脲抗原的胶体金免疫层析检测装置，包括试纸条和反应杯，试纸条中含有氨基脲抗原以及氨基脲克隆抗体，反应杯中含有加入胶体金标记的氨基脲克隆抗体，应用了胶体金免疫层析的原理，通过试纸条中检测线与质控线之间的比色检测待测物中是否含有氨基脲等香精，可以实现短时间内快速而又准确的检测，满足食品安全对水发食品中氨基脲的检测需求。

Description

氨基脲抗原、胶体金免疫层析检测装置与检测判定方法
技术领域
本发明涉及食品检测的技术领域，尤其涉及一种用于检测呋喃西林残留的氨基脲抗原、氨基脲的胶体金免疫层析检测装置与检测判定方法。
背景技术
氨基脲是一种联胺类小分子化合物，既是禁用药物呋喃西林在生物体内的代谢产物，也是偶氮二甲酰胺高温分解的产物。呋喃西林曾在动物养殖过程中广泛应用，其在动物体内代谢速度较快，代谢物氨基脲与细胞膜蛋白结合成为结合态，能长期保持稳定，所以氨基脲一直作为特征性标志物来检测动物食品养殖过程中是否使用禁药呋喃西林。研究表明，氨基脲能够引起大鼠生殖***、免疫***和内分泌***中多个靶组织器官形态结构的改变，对人体有致畸、致突变、致癌的风险。欧盟在1995年就规定该类药物禁止在动物源性食品中使用。日本于2006年5月29日起实施食品中农业化学品残留“肯定列表制度”，规定呋喃西林及其代谢物氨基脲残留检测限是0.5μg/kg，加拿大、美国和韩国的农兽药检测规定中也禁止检出氨基脲。我国农业部也于2002年公布的《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》中规定呋喃西林在所有食品动物中不得检出。
近年来，我国毛肚、鸭肠、黄喉等水发产品中氨基脲被检出的事件时有发生，给养殖业和食品加工业带来了巨大的经济损失。目前，国内关于水发产品中氨基脲研究的报道比较少.很有必要建立水发产品中氨基脲的胶体金免疫层析检测方法。
因此本领域技术人员致力于开发一种用于检测呋喃西林残留的氨基脲抗原、氨基脲的胶体金免疫层析检测装置与检测方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种能够检测呋喃西林残留的氨基脲抗原。
为实现上述目的，本发明提供的一种氨基脲抗原，它由氨基脲半抗原和载体蛋白偶联制得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)以及血蓝蛋白(KLH)中的一种或几种的混合，所述氨基脲半抗原为如下式I所示结构的化合物：
Figure BDA0003001106620000021
式(I)。
所述氨基脲半抗原的制备方法步骤依次如下：
a1)取氨基脲、碳酸钾、4-硝基-3-羟基苯乙烯用N,N-二甲基甲酰胺(缩写为DMF)溶解之后，加入有机反应溶剂进行加热反应，蒸干DMF得到油状的粗产物，所述有机反应溶剂为4-溴丁酸叔丁酯、溴乙酸乙酯以及溴丁酸甲酯中的一种；
a2)加入适量蒸馏水溶解，用乙酸乙酯萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干乙酸乙酯，得到固体产物，所述固体产物为氨基脲半抗原丁酸叔丁酯；
a3)取所述固体产物溶于二氯甲烷并加入三氟乙酸，室温下搅拌反应，之后通过蒸干二氯甲烷及部分三氟乙酸，得到油状粗产物，所述室温为20～25℃；
a4)向所述油状粗产物中加入水以及碳酸氢钠溶液，并调节pH值至弱酸性，用乙酸乙酯萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干乙酸乙酯蒸干水分得粗产物，将所述粗产物采用质谱仪过柱纯化，得到最终目标物，即为氨基脲半抗原。
本发明还提供一种包括上述氨基脲半抗原的氨基脲的胶体金免疫层析检测装置，包括试纸条和反应杯，所述试纸条中含有氨基脲抗原以及氨基脲克隆抗体，所述反应杯中含有加入胶体金标记的氨基脲克隆抗体。
所述氨基脲抗原的制备方法步骤依次如下：
b1)取所述氨基脲半抗原溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌加入二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液；
b2)称取所述载体蛋白溶于10mL浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH＝8.0)中,加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL，搅拌溶解制备B液；
b3)磁力搅拌下，将所述A液逐渐滴入所述B液中，4℃下反应12h，得到混合液；
b4)将所述混合液放入离心机中离心，离心后，取上清液，在4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，最后得到所述氨基脲抗原；
所述氨基脲克隆抗体的制备方法步骤依次如下：
c1)动物免疫：利用所述氨基脲抗原，免疫4只6周龄BALB/C小鼠，免疫剂量为200μg/只，加强免疫三次后，使其产生抗血清；
c2)细胞融合和克隆化：在无菌条件下，取免疫BALB/C小鼠脾脏制备脾细胞，数量配比按脾细胞：骨髓瘤细胞(SP2/0)＝9﹕1进行融合，经3次以上的克隆培养和检测，筛选得到稳定分泌抗氨基脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
c3)单克隆抗体的制备与纯化：将所述杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体即所述氨基脲克隆抗体。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)，所述细胞培养基的pH为7.4。
所述加入胶体金标记的氨基脲克隆抗体的制备方法步骤依次如下：
d1)胶体金的制备：取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积，得到胶体金溶液；
d2)胶体金标记的单克隆抗体的制备：调节所述胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入所述氨基脲克隆抗体，1h后加入抗体量相当的聚乙二醇(PEG)，充分反应30min后加入抗体量相当的所述载体蛋白，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性的胶体金标记的氨基脲克隆抗体沉淀，再加对硝基苯酚丁酸盐(PNPB)重悬备用。
所述试纸条包括底板1和设置在所述底板1上的吸收垫4、反应膜2和吸水垫3，所述反应膜2位于所述吸收垫4和吸水垫3之间，所述反应膜2上设置有由所述氨基脲抗原形成的检测线5和由所述氨基脲克隆抗体形成的质控线6；所述反应杯7上盖合有微孔盖8。
所述氨基脲克隆抗体为采用氨基脲抗原通过动物免疫制得，所述氨基脲克隆抗体包括氨基脲单克隆抗体或者氨基脲多克隆抗体。
在氨基脲克隆抗体为多克隆抗体的情况下，可以通过采用氨基脲克隆抗原免疫接种哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等、随后分离血清获得。在氨基脲克隆抗体为单克隆抗体的情况下，可以通过制造和培养杂交瘤细胞并收集培养基获得单克隆抗体，或者可以将由此制备获得的杂交瘤细胞通过腹腔注射接种到哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等的体内，在被接种动物的腹部明显膨大时收集腹水，由此获得单克隆抗体。
如本领域技术人员所能理解的，对于氨基脲克隆抗体的来源，并没有特别的限制，其可以来源于任何哺乳动物，包括例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等，但不限于此。在一个具体的实施方案中，氨基脲克隆抗体为来源于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)的多克隆或者单克隆抗体。
本发明还提供一种采用上述氨基脲的胶体金免疫层析检测装置的检测判定方法，包括以下步骤：
e1)：样品前处理：将待测物置于植物油中浸泡得到植物油待测物，取0.1g或0.1mL所述植物油待测物至含有0.1％醋酸溶液的提取瓶，拧紧瓶盖大力振摇约30秒；用PBS缓冲溶液稀释10倍，摇匀备用，得到样品前处理物；
e2)：用所述氨基脲的胶体金免疫层析检测装置进行检测：将所述样品前处理物倒入所述反应杯7中，用塑料吸管上下抽吸1～3次混匀；将所述试纸条***到所述反应杯7中，于20～40℃反应3分钟；从所述反应杯7中中取出所述试纸条，并进行结果判读；
e3)：判定方法如下：
阴性(－)：若所述检测线不显色，或者与所述质控线相比显色更浅，则表明样品中含有氨基脲；
阳性(+)：若所述检测线和质控线一样显现出***条带，并且所述检测线的颜色深度与质控线的颜色深度相当或者更深，则表明样品不含氨基脲；
无效：若反应膜上所述检测线和质控线均未显色，表明试纸条失效，建议更换试纸条重复测定。
本发明的有益效果是：本发明的氨基脲抗原，由氨基脲半抗原和载体蛋白偶联制得，氨基脲半抗原的化学分子式为C12H14N4O6，氨基脲抗原应用于免疫层析的检测方面，为水发食品中检测氨基脲提供了基础；另外包含本氨基脲抗原的胶体金免疫层析检测装置，包括试纸条和反应杯，试纸条中含有氨基脲抗原以及氨基脲克隆抗体，反应杯中含有加入胶体金标记的氨基脲克隆抗体，应用了胶体金免疫层析的原理，通过试纸条中检测线与质控线之间的比色检测待测物中是否含有氨基脲等香精，可以实现短时间内快速而又准确的检测，满足食品安全对水发食品中氨基脲的检测需求。
附图说明
图1为本发明的氨基脲半抗原的合成路线；
图2为本发明的氨基脲半抗原质谱图；
图3为本发明的试纸条的剖面结构示意图；
图4为本发明的微孔反应杯的示意图；
图5为本发明的试纸条检测结果判定的示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂，本发明实施例中所采用的部分仪器和药品规格如下：30A型超高效液相色谱仪，日本岛津公司；API5500型三重四级杆质谱仪，美国应用生物***公司；台式高速离心机，TD16-WS型，长沙湘仪公司；氨基脲盐酸盐标准品购自Dr.Ehrenstorfer；氢氧化锂，上海阿拉丁试剂公司；分析级Na2CO3、NaHCO3、KH2PO4Na2HPO4·12H2O、KCl、浓硫酸和柠檬酸等，广州化学试剂有限公司；实验用水均为Millipore超纯水。
如图1所示，一种氨基脲抗原，它由氨基脲半抗原和载体蛋白偶联制得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)以及血蓝蛋白(KLH)中的一种或几种的混合，所述氨基脲半抗原为如下式I所示结构的化合物：
Figure BDA0003001106620000071
式(I)，氨基脲半抗原的化学分子式为C12H14N4O6，分子量为310。
所述氨基脲半抗原的制备方法步骤依次如下：
a1)取氨基脲、碳酸钾、4-硝基-3-羟基苯乙烯用N,N-二甲基甲酰胺(缩写为DMF)溶解之后，加入有机反应溶剂进行加热反应，蒸干DMF得到油状的粗产物，所述有机反应溶剂为4-溴丁酸叔丁酯、溴乙酸乙酯以及溴丁酸甲酯中的一种；
a2)加入适量蒸馏水溶解，用乙酸乙酯萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干乙酸乙酯，得到固体产物，所述固体产物为氨基脲半抗原丁酸叔丁酯；
具体的，采用氨基脲与4-溴丁酸叔丁酯反应得到淡黄色固体，再将淡黄色固体通过有机溶剂的萃取、洗涤和蒸干即得到氨基脲半抗原，其合成路线如图1所示。在50ml单口瓶中加入氨基脲1.0g，碳酸钾3.3g，用25mlDMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解后加入4-溴丁酸叔丁酯3.5g，升温至80℃，反应过夜。蒸干DMF，得到油状液体；加入适量蒸馏水溶解，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，将有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干乙酸乙酯，得到固体中间产物氨基脲丁酸叔丁酯2g。
a3)取所述固体产物溶于二氯甲烷并加入三氟乙酸，室温下搅拌反应，之后通过蒸干二氯甲烷及部分三氟乙酸，得到油状粗产物，所述室温为20～25℃；
a4)向所述油状粗产物中加入水以及碳酸氢钠溶液，并调节pH值至弱酸性，用乙酸乙酯萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干乙酸乙酯蒸干水分得粗产物，将所述粗产物采用质谱仪过柱纯化，得到最终目标物，即为氨基脲半抗原。
具体的，将中间产物氨基脲丁酸叔丁酯2g，用25ml二氯甲烷溶解后加入三氟乙酸10ml，室温反应2-3h，TLC监控反应。蒸干二氯甲烷及少量三氟乙酸，得到油状液体；向油状液中加入少量水及碳酸氢钠溶液，常温搅拌以除去多余的三氟乙酸，加稀盐酸调节pH值至弱酸性；用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，将有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干乙酸乙酯；采用API5500型三重四级杆质谱仪过柱纯化，最终得到白色片状固体500mg，经MS鉴定为目标物，如图2所示，如图1所示为氨基脲半抗原的质谱图，可知半抗原的分子离子峰为m/z227.2[M-H]-,且为最高峰，与该半抗原的分子量(226)相符。
一种包括上述氨基脲半抗原的氨基脲的胶体金免疫层析检测装置，包括试纸条和反应杯，所述试纸条中含有氨基脲抗原以及氨基脲克隆抗体，所述反应杯中含有加入胶体金标记的氨基脲克隆抗体。
所述氨基脲抗原的制备方法步骤依次如下：
b1)取0.1mmol所述氨基脲半抗原溶于2mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌加入0.2mmol二环己基碳二亚胺(DCC)和0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液；
b2)称取所述载体蛋白140mg，本实施例中所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，溶于10mL浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH＝8.0)中,加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL，搅拌溶解制备B液；
b3)磁力搅拌下，将所述A液逐渐滴入所述B液中，4℃下反应12h，得到混合液；
b4)将所述混合液放入离心机中离心，离心后，取上清液，在4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，最后得到所述氨基脲抗原。
得到的所述氨基脲抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中，冻存于-20℃冰箱中，同时还以同样的方式也制备了以OVA为载体蛋白的氨基脲抗原。
鉴定：将载体蛋白BSA、OVA、乙基麦芽酚半抗原、相应的乙基麦芽酚抗原用pH＝7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L、pH＝7.4、PBS调零，用紫外分光光度计在波长200nm～800nm范围内扫描，得到载体蛋白BSA、OVA、乙基麦芽酚半抗原、相应的乙基麦芽酚抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。根据出现不同的吸收曲线，表明乙基麦芽酚半抗原与载体蛋白BSA、OVA偶联成功，
所述氨基脲克隆抗体的制备方法步骤依次如下：
c1)动物免疫：利用所述氨基脲抗原，免疫4只6周龄BALB/C小鼠，免疫剂量为200μg/只，加强免疫三次后，使其产生抗血清；
c2)细胞融合和克隆化：在无菌条件下，取免疫BALB/C小鼠脾脏制备脾细胞，数量配比按脾细胞：骨髓瘤细胞(SP2/0)＝9﹕1进行融合，经3次以上的克隆培养和检测，筛选得到稳定分泌抗氨基脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
c3)单克隆抗体的制备与纯化：将所述杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体即所述氨基脲克隆抗体；所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)，所述细胞培养基的pH为7.4。
另外在步骤c2和步骤c3之间还包括步骤细胞冻存和复苏，其主要目的为长期保存，适合后续实用；将杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时从液氮灌中取出冻存管，快速放入37℃温水浴中，并轻轻摇动使其尽快融化，离心去除冻存液后，移入细胞培养瓶内培养。
所述加入胶体金标记的氨基脲克隆抗体的制备方法步骤依次如下：
d1)胶体金的制备：取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积，得到胶体金溶液；
d2)胶体金标记的单克隆抗体的制备：调节所述胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入所述氨基脲克隆抗体，1h后加入抗体量相当的聚乙二醇(PEG)，充分反应30min后加入抗体量相当的所述载体蛋白，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性的胶体金标记的氨基脲克隆抗体沉淀，再加对硝基苯酚丁酸盐(PNPB)重悬备用。
如图3、图4所示，一种包括上述氨基脲半抗原的氨基脲的胶体金免疫层析检测装置，包括试纸条和反应杯，所述试纸条中含有氨基脲抗原以及氨基脲克隆抗体，所述反应杯中含有加入胶体金标记的氨基脲克隆抗体。如图3所示，所述试纸条包括底板1和设置在所述底板1上的吸收垫4、反应膜2和吸水垫3，所述反应膜2位于所述吸收垫4和吸水垫3之间，所述反应膜2上设置有由所述氨基脲抗原形成的检测线5和由所述氨基脲克隆抗体形成的质控线6；所述反应杯7上盖合有微孔盖8，反应杯7和微孔盖8组合在一起合称为微孔反应杯。
上述氨基脲的胶体金免疫层析检测装置的制备过程如下：
制备硝酸纤维素膜：在该硝酸纤维素膜(纯纤维素膜或者羧化纤维素膜)上将制备的氨基脲抗原进行线性点样，由此形成检测线；并将羊抗鼠抗抗体(以羊作为免疫动物，以制备的鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫获得)进行线性点样，由此形成质控线。
制备试纸条：在PVC底板上，沿同一方向依次将样品吸收垫(玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚醋膜)、制备好的硝酸纤维素膜(纯纤维素膜或者羧化纤维素膜)和吸水垫(吸水滤纸或滤油纸)依次搭接粘连，由此获得试纸条，所述底板可以为不吸水的韧性材料例如硬质塑胶条如PVC底板或不吸水硬纸条或其它硬质不吸水材料。
制备微孔反应杯：将所制备的胶体金标记的单克隆抗体加入至微孔反应杯中，冻干，由此形成所需的微孔反应杯，如图4所示；
氨基脲胶体金层析检测装置：将所得到的试纸条和所得到的微孔反应杯组合的一起，形成本发明的氨基脲胶体金层析检测装置。
所述氨基脲克隆抗体为采用氨基脲抗原通过动物免疫制得，所述氨基脲克隆抗体包括氨基脲单克隆抗体或者氨基脲多克隆抗体。在氨基脲克隆抗体为多克隆抗体的情况下，可以通过采用氨基脲克隆抗原免疫接种哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等、随后分离血清获得。在氨基脲克隆抗体为单克隆抗体的情况下，可以通过制造和培养杂交瘤细胞并收集培养基获得单克隆抗体，或者可以将由此制备获得的杂交瘤细胞通过腹腔注射接种到哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等的体内，在被接种动物的腹部明显膨大时收集腹水，由此获得单克隆抗体。
如本领域技术人员所能理解的，对于氨基脲克隆抗体的来源，并没有特别的限制，其可以来源于任何哺乳动物，包括例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等，但不限于此。在一个具体的实施方案中，氨基脲克隆抗体为来源于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)的多克隆或者单克隆抗体。
一种采用上述氨基脲的胶体金免疫层析检测装置的检测判定方法，包括以下步骤：
e1)：样品前处理：将待测物置于植物油中浸泡得到植物油待测物，取0.1g或0.1mL所述植物油待测物至含有0.1％醋酸溶液的提取瓶，拧紧瓶盖大力振摇约30秒；用PBS缓冲溶液稀释10倍，摇匀备用，得到样品前处理物；
e2)：用所述氨基脲的胶体金免疫层析检测装置进行检测：将所述样品前处理物倒入所述反应杯7中，用塑料吸管上下抽吸1～3次混匀；将所述试纸条***到所述反应杯7中，于20～40℃反应3分钟；从所述反应杯7中中取出所述试纸条，并进行结果判读；
e3)：判定方法如下(如图5所示)：
阴性(－)：若所述检测线不显色，或者与所述质控线相比显色更浅，则表明样品中含有氨基脲；因为待检样品液中含有氨基脲时，扩散过程中待检样品液中的氨基脲可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上氨基脲的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上的氨基脲抗原结合，检测线不显色或检测线颜色比质控线颜色更浅，而抗抗体则可与金标抗体结合，质控线显色。
阳性(+)：若所述检测线和质控线一样显现出***条带，并且所述检测线的颜色深度与质控线的颜色深度相当或者更深，则表明样品不含氨基脲；因为待检样品液中不含氨基脲时，金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上的氨基脲抗原偶联结合，检测线显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控线亦显色，此时，检测线颜色比质控线颜色深或颜色相同。
无效：若反应膜上所述检测线和质控线均未显色，表明试纸条失效，建议更换试纸条重复测定。
本发明对于上述氨基脲胶体金层析检测装置的灵敏度也进行复测：
设置一系列的浓度梯度，氨基脲浓度分别为1.25、2.5、5、10、20μg/mL，用氨基脲胶体金层析检测装置进行测试，测试后使用仪器比较检测线与质控线颜色深浅。当氨基脲浓度为5μg/mL时，检测线颜色深度为质控线的90％以下，因此其灵敏度为5μg/mL。
选取5μg/mL平行实验5次，统计检测限颜色深度与质控线颜色深度的比例，其CV值小于15％。
本发明对于上述氨基脲胶体金层析检测装置的保质期也进行测定：
用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，每隔1个月取8个装置，用质控样本检测，分别做阴性，5μg/L，10μg/L和20μg/L样品，重复三次，观察数据变化，考察保质期时间。
阴性显色从13个月开始下降，在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定保质期为1年。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.氨基脲抗原，其特征在于：它由氨基脲半抗原和载体蛋白偶联制得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)以及血蓝蛋白(KLH)中的一种或几种的混合，所述氨基脲半抗原为如下式I所示结构的化合物：
Figure FDA0003001106610000011
Figure FDA0003001106610000012
2.如权利要求1所述的氨基脲抗原，其特征在于：所述氨基脲半抗原的制备方法步骤依次如下：
a1)取氨基脲、碳酸钾、4-硝基-3-羟基苯乙烯用N,N-二甲基甲酰胺(缩写为DMF)溶解之后，加入有机反应溶剂进行加热反应，蒸干DMF得到油状的粗产物，所述有机反应溶剂为4-溴丁酸叔丁酯、溴乙酸乙酯以及溴丁酸甲酯中的一种；
a2)加入适量蒸馏水溶解，用乙酸乙酯萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干乙酸乙酯，得到固体产物，所述固体产物为氨基脲半抗原丁酸叔丁酯；
a3)取所述固体产物溶于二氯甲烷并加入三氟乙酸，室温下搅拌反应，之后通过蒸干二氯甲烷及部分三氟乙酸，得到油状粗产物，所述室温为20～25℃；
a4)向所述油状粗产物中加入水以及碳酸氢钠溶液，并调节pH值至弱酸性，用乙酸乙酯萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干乙酸乙酯蒸干水分得粗产物，将所述粗产物采用质谱仪过柱纯化，得到最终目标物，即为氨基脲半抗原。
3.一种包括权利要求1或2所述氨基脲抗原的胶体金免疫层析检测装置，其特征在于：包括试纸条和反应杯，所述试纸条中含有氨基脲抗原以及氨基脲克隆抗体，所述反应杯中含有加入胶体金标记的氨基脲克隆抗体。
4.如权利要求3所述胶体金免疫层析检测装置，其特征在于：所述氨基脲抗原的制备方法步骤依次如下：
b1)取所述氨基脲半抗原溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌加入二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液；
b2)称取所述载体蛋白溶于10mL浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH＝8.0)中,加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL，搅拌溶解制备B液；
b3)磁力搅拌下，将所述A液逐渐滴入所述B液中，4℃下反应12h，得到混合液；
b4)将所述混合液放入离心机中离心，离心后，取上清液，在4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，最后得到所述氨基脲抗原；
所述氨基脲克隆抗体的制备方法步骤依次如下：
c1)动物免疫：利用所述氨基脲抗原，免疫4只6周龄BALB/C小鼠，免疫剂量为200μg/只，加强免疫三次后，使其产生抗血清；
c2)细胞融合和克隆化：在无菌条件下，取免疫BALB/C小鼠脾脏制备脾细胞，数量配比按脾细胞：骨髓瘤细胞(SP2/0)＝9﹕1进行融合，经3次以上的克隆培养和检测，筛选得到稳定分泌抗氨基脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
c3)单克隆抗体的制备与纯化：将所述杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体即所述氨基脲克隆抗体。
5.如权利要求4所述胶体金免疫层析检测装置，其特征在于：所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)，所述细胞培养基的pH为7.4。
6.如权利要求3所述胶体金免疫层析检测装置，其特征在于：所述加入胶体金标记的氨基脲克隆抗体的制备方法步骤依次如下：
d1)胶体金的制备：取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积，得到胶体金溶液；
d2)胶体金标记的单克隆抗体的制备：调节所述胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入所述氨基脲克隆抗体，1h后加入抗体量相当的聚乙二醇(PEG)，充分反应30min后加入抗体量相当的所述载体蛋白，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性的胶体金标记的氨基脲克隆抗体沉淀，再加对硝基苯酚丁酸盐(PNPB)重悬备用。
7.如权利要求3-6任一所述胶体金免疫层析检测装置，其特征在于：所述试纸条包括底板(1)和设置在所述底板(1)上的吸收垫(4)、反应膜(2)和吸水垫(3)，所述反应膜(2)位于所述吸收垫(4)和吸水垫(3)之间，所述反应膜(2)上设置有由所述氨基脲抗原形成的检测线(5)和由所述氨基脲克隆抗体形成的质控线(6)；所述反应杯(7)上盖合有微孔盖(8)。
8.如权利要求3所述胶体金免疫层析检测装置，其特征在于：所述氨基脲克隆抗体为采用氨基脲抗原通过动物免疫制得，所述氨基脲克隆抗体包括氨基脲单克隆抗体或者氨基脲多克隆抗体。
9.一种采用如权利要求7所述胶体金免疫层析检测装置的检测判定方法，其特征在于：包括以下步骤：
e1)：样品前处理：将待测物置于植物油中浸泡得到植物油待测物，取0.1g或0.1mL所述植物油待测物至含有0.1％醋酸溶液的提取瓶，拧紧瓶盖大力振摇约30秒；用PBS缓冲溶液稀释10倍，摇匀备用，得到样品前处理物；
e2)：用所述氨基脲的胶体金免疫层析检测装置进行检测：将所述样品前处理物倒入所述反应杯(7)中，用塑料吸管上下抽吸1～3次混匀；将所述试纸条***到所述反应杯(7)中，于20～40℃反应3分钟；从所述反应杯(7)中中取出所述试纸条，并进行结果判读；
e3)：判定方法如下：
阴性(－)：若所述检测线不显色，或者与所述质控线相比显色更浅，则表明样品中含有氨基脲；
阳性(+)：若所述检测线和质控线一样显现出***条带，并且所述检测线的颜色深度与质控线的颜色深度相当或者更深，则表明样品不含氨基脲；
无效：若反应膜上所述检测线和质控线均未显色，表明试纸条失效，建议更换试纸条重复测定。
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