CN113049687A - 一种盐酸氨溴索原料和注射液有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了氨溴索原料药及制剂中存在新的杂质顺式‑4‑[[(2‑氨基‑3，5‑二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇(杂质F)；并提供了该杂质的制备方法；本发明还提供了一种能够同时检测氨溴索原料药及氨溴索注射液中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F等六种杂质的检测方法，该方法简便、灵敏度高、检测方法稳定；各杂质的分离度均能够达到2.0以上，能够有效的检测氨溴索原料药及注射液在制备、生产、储存过程中产生的六种杂质，有效的反映氨溴索原料药及注射液的质量。

Description

一种盐酸氨溴索原料和注射液有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体来说，涉及一种盐酸氨溴索原料和注射液有关物质的检测方法。
背景技术
盐酸氨溴索是新一代的呼吸道粘液调节剂，具有优越的祛痰效能。与第一代及第二代祛痰药物相比，盐酸氨溴索除具有强大的粘液溶解作用外，其最大特点在于它能刺激肺泡II型细胞，促进肺泡表面活性物质的合成和分泌，从而有力地增强粘液转运，促进排痰，是目前临床上作用最强的祛痰药，氨溴索与抗生素合用，可增加抗生素肺组织/血浆浓度比，缩短抗生素治疗的时间并且不良反应轻微。
Figure RE-GDA0002424252460000011
欧洲药典显示盐酸氨溴索的已知杂质有5种，分别是杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E。
Figure RE-GDA0002424252460000012
中国专利CN102262135A公开了盐酸氨溴索注射液杂质的检测方法及含量测定方法。该方法主要用于检测盐酸氨溴索注射液中的杂质B和杂质E，不能同时对五种杂质(杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E)进行检测。
中国专利CN106950291A公开了一种盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法，该方法可以检测盐酸氨溴索注射剂中的五种杂质，该方法采用梯度洗脱，同时需要在流动相(PH值＝4.0) 中加入丁二酸，梯度洗脱程序繁琐，对仪器配置要求也高，方法设置复杂，因此，此技术不适合应用到工业生产中。
对于原料工艺和降解产生的有关物质，在制剂中需要进行质量控制，因此，持续分析氨溴索原料及制剂中出现的杂质，实现盐酸氨溴索与其杂质的分离与分析，对于氨酸氨溴索原料及制剂的质量控制具有重要的意义。目前对盐酸氨溴索原料及制剂的有关物质的检测方法中，大部分都只检测一或两个杂质，用得都是梯度洗脱，不能同时检测多个杂质。因此，仍需对氨溴索原料药及制剂中杂质及其检测方法进行研究与改进，确保有效的控制氨溴索原料及制剂的质量，保证临床疗效及用药安全。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明人通过氨溴索原料药的制备工艺进行了分析、大量的试验研究及摸索，发现：在氨溴索原料药及制剂中，还可能存在杂质F，其在英国药典(BP)、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、中国药典等药典标准中均没有提到。
鉴于对氨溴索原料药制备工艺中发现的杂质F的结构还缺乏明确的表征，且亦缺乏其合成制备方法及分析检测方法，本发明对杂质F进行了研究，设计合成方法制备出杂质F，鉴定了其结构。杂质F是盐酸氨溴索原料合成工艺里产生的一种顺式工艺杂质，增加对此杂质的研究，可以从源头***更加全面的把控药品杂质，从而提高和保证药品的质量。
鉴于氨溴索原料药中可能杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F等六种杂质，有效、迅速、全面的检测这些杂质的含量对氨溴索原料药及盐酸氨溴索注射液的质量控制具有显著意义。本发明人通过对流动相配比、PH值、流速、中国药典和其他检测方法等进行试验研究，经过多次失败，最后开发出一种新的简单易操作、全面高效且适用于工业生产中能够同时检测盐酸氨溴索原料或注射液六种杂质的方法，且相邻峰的分离度达到2.0以上。
本发明一方面是提供一种氨溴索原料或注射液中的杂质，命名为杂质F，化学名称为顺式 -4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇，分子式为C13H16Br2N2O，具有如下式I所示的结构。
Figure RE-GDA0002424252460000031
本发明另一方面提供了顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇的制备方法。
一种顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇的制备方法，合成路线为：
Figure RE-GDA0002424252460000032
制备方法包括以下步骤：在反应釜中，加入2-氨基-3，5-二溴苯甲醛、顺式-4-氨基环己醇盐酸盐、甲醇；50-55℃搅拌反应8-10h，减压干燥，得到粗品，粗品用丙酮重结晶得到终产物顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇。
进一步的：
相对于顺式-4-氨基环己醇盐酸盐，2-氨基-3，5-二溴苯甲醛的用量可以为其1.1～2.0摩尔当量，其中优选1.2-1.4摩尔当量。
2-氨基-3，5-二溴苯甲醛与甲醇的重量比为1:5～50，更优选1:10～20。
终产物顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇的纯度不低于99％，优选不低于99.5％；更优选不低于99.6％。
进一步的，本发明提供了顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇(杂质F，下同)在氨溴索原料药及氨溴索注射液的质量控制中的应用。
在一些实施例中，本发明提供的杂质F在氨溴索原料药及注射液分析测定中作为质量控制标准品的应用。
本发明提供一种操作方便、迅速、全面准确地检测氨溴索中六种杂质的检测方法，六种杂质结构如下。使用该方法可以更加有效的控制盐酸氨溴索原料及制剂的质量。
Figure RE-GDA0002424252460000033
Figure RE-GDA0002424252460000041
一种利用高效液相色谱法测定盐酸氨溴索原料和注射液中杂质A、杂质B、杂质C、杂质 D、杂质E、杂质F的的检测方法：
1)色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格4.6×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
3)流动相：pH6.8-7.2磷酸盐缓冲液-乙腈体积比：48-52:48-52；
4)检测波长：248nm；柱温：28-32℃；流速：0.8ml/min；洗脱：等度洗脱；进样体积：20μL。
5)对照品溶液的制备及测定方法：精密称取盐酸氨溴索对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品适量至同一容量瓶中，加甲醇溶解并稀释成氨溴索、杂质A、杂质B、杂质C、杂质F、杂质D、杂质E对照品溶液；按照上述色谱条件将对照品溶液注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E、杂质C、杂质F；相邻杂质峰的分离度不低于2.0。
6)供试品溶液的制备：精密取出盐酸氨溴索原料药或盐酸氨溴索注射液适量，加甲醇稀释，作为供试品溶液；按照上述色谱条件将供试品溶液注入液相色谱仪；按外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的含量
进一步的：
所述的磷酸盐缓冲液为浓度1.0‰-1.5‰的磷酸氢二铵溶液；用磷酸调节pH值至6.8-7.2；优选1.3‰-1.4‰的磷酸氢二铵溶液；更优选1.32‰磷酸氢二铵溶液。
所述的流动相，优选pH6.8-7.2磷酸盐缓冲液-乙腈体积比：50:50；更优选pH7.0磷酸盐缓冲液-乙腈体积比：50:50。
所述的供试品溶液的制备为：
盐酸氨溴索原料供试品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索原料药，加甲醇稀释成1.0mg/ml 的溶液，作为供试品溶液；吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪；按外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的含量。
盐酸氨溴索注射液供试品溶液的制备：精密量取1ml盐酸氨溴索注射液，置于100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪；按外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质F、杂质D、杂质E的含量。
本发明的有益效果：
1)本发明人通过氨溴索原料药的制备工艺进行了大量的试验研究及摸索，发现：在氨溴索原料药及制剂中存在一种新的杂质顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇(杂质F)；并提供了该杂质的制备方法，制备方法操作简单、产品纯度高，在氨溴索原料药及注射液分析测定中作为质量控制标准品的应用。
2)本发明提供了一种能够检测氨溴索原料药及氨溴索注射液中六种杂质的检测方法，经过***的分析方法验证，本发明提供的检测方法采用等地洗脱，不需要加入其它试剂，该方法简便、灵敏度高、检测方法稳定；各杂质的分离度均能够达到2.0以上，能够有效的检测氨溴索原料药及注射液在制备、生产、储存过程中产生的六种杂质，有效的反映氨溴索原料药及注射液的质量。
附图说明
图1：本发明实施例1制备杂质F核磁谱图。
图2：本发明实施例1制备的杂质F的质谱图
图3：本发明实施例1制备杂质F的色谱图
图4：对比例4杂质B检测方法色谱图
图5：对比例4杂质C检测方法色谱图
图6：对比例4杂质E检测方法色谱图
图7：对比例4杂质F检测方法色谱图
图8：对比例5检测方法色谱图
图9：对比例6检测方法色谱图
图10：对比例7检测方法色谱图
图11：对比例8检测方法色谱图
图12：对比例9检测方法色谱图
图13：对比例10检测方法色谱图
图14：实施例1检测方法色谱图
图15：实施例12检测方法色谱图
图16:实施例13检测方法色谱图
图谱中：
VWD:Singal A:紫外检测器信号；248nm、250nm：检测波长；Retention Time：保留时间；Area：峰面积；Area％：峰面积百分比；Theoretical plates：理论塔板数；Resolution：分离度。
具体实施方式
对比例1:杂质F的合成
在反应釜中，加入2-氨基-3，5-二溴苯甲醛23.9g(0.086eq)、顺式-4-氨基环己醇盐酸盐 10g(0.066eq)、乙酸乙酯350ml；52℃搅拌反应9h，得到粗品，粗品用丙酮重结晶得到终产物顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇13.9g，摩尔收率55.8％。纯度95.31％。
对比例2:杂质F的合成
在反应釜中，加入2-氨基-3，5-二溴苯甲醛23.9g(0.086eq)、顺式-4-氨基环己醇盐酸盐 10g(0.066eq)、甲醇350ml；45℃搅拌反应9h，得到粗品，粗品用丙酮重结晶得到终产物顺式 -4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇18.3g，摩尔收率73.8％。纯度98.14％。
对比例3:杂质F的合成
在反应釜中，加入2-氨基-3,5-二溴苯甲醛23.9g(0.086eq)、顺式-4-氨基环己醇盐酸盐 10g(0.066eq)、甲醇350ml；60℃搅拌反应9h，得到粗品，粗品用丙酮重结晶得到终产物顺式 -4-[[(2-氨基-3,5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇20.7g,摩尔收率83.2％。纯度98.87％。
对比例4：检测方法
按照下述方法色谱条件进行检测。
1)色谱柱：辛烷基硅烷键合为填充剂；规格4.6×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
2)流动相：2mg/ml磷酸氢二铵(用磷酸调pH值至4.0)-甲醇(48:52)；
3)检测波长250nm；柱温30℃；流速1.0ml/min；等度洗脱；
5)对照品溶液的制备：
盐酸氨溴索杂质B对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索杂质B对照品约11.25mg，至 100ml量瓶中，以流动相溶解并稀释至刻度，定容摇匀，得对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪。液相色谱图如图4所示。
盐酸氨溴索杂质C对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索杂质C对照品约5mg，至25ml 量瓶中，以流动相溶解并稀释至刻度，定容摇匀，得对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪。液相色谱图如图5所示。
盐酸氨溴索杂质E对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索杂质E对照品约15mg，至100ml 量瓶中，以流动相溶解并稀释至刻度，定容摇匀，得对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪。液相色谱图如图6所示。
盐酸氨溴索杂质F对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索杂质F对照品(实施例1制备) 约10mg，至100ml量瓶中，以流动相溶解并稀释至刻度，定容摇匀，得对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪。液相色谱图如图7所示
图4：杂质B峰为2个，分别为保留时间为11.150分钟和保留时间为23.917分钟的峰。采用流动相溶解杂质对照品，显著影响杂质B的稳定性，杂质B发生降解，出现2个峰。
图5：该色谱条件下，无杂质C峰。杂质C在该条件下不稳定，不能被检测出。
图6：该色谱体检下，无杂质E峰。杂质E在该条件下不稳定，不能被检测出。
图7：该色谱条件下，杂质F峰异常。杂质E在该条件下不稳定，不能准确地被检测出
由对比例4可以看出：该色谱条件下，无法准确地定量各杂质的含量，不适用于检测氨溴索原料和注射液中有关物质的测定。
对比例5：检测方法
采用《中国药典》2015版盐酸氨溴索原料药有关物质检测方法；
1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格4.6mm×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
3)流动相：0.01mol/L磷酸氢二铵溶液(用磷酸调节pH值至7.0)-乙腈(50：50)为流动相；
4)检测波长为248nm；流速1.0ml/min；等度洗脱；
5)对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索对照品、杂质A、杂质B、杂质D、杂质E对照品适量至同一100ml量瓶中，加以甲醇溶解并稀释至刻度，定容摇匀，作为氨溴索、杂质A、杂质B、杂质D、杂质E对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E；液相色谱图如图8所示。
杂质B和杂质A的峰分离度为0.91，不符合要求。
对比例6：检测方法
按照下述方法色谱条件进行检测。
1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格4.6mm×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
3)流动相：0.01mol/L磷酸氢二铵溶液(用磷酸调节pH值至7.0)-乙腈(50：50)为流动相；
4)检测波长为248nm；流速0.8ml/min；等度洗脱；
5)对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索对照品、杂质A、杂质B、杂质D、杂质E对照品适量至同一100ml量瓶中，加以甲醇溶解并稀释至刻度，定容摇匀，作为氨溴索、杂质A、杂质B、杂质D、杂质E对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E；液相色谱图如图9所示。
杂质B和杂质A的峰分离度为1.14；分离度不符合要求。
由对比例4、对比例5可以看出：色谱柱对杂质的检测有很大的影响，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，杂质B和杂质A分离度达不到要求，不能准确地检测氨溴索原料和注射液中的杂质B及杂质A的含量；不适用于检测氨溴索原料和注射液中有关物质的测定。
对比例7：检测方法
按照下述方法色谱条件进行检测。
1)色谱柱：辛烷基硅烷键合为填充剂，规格4.6×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
3)流动相：0.01mol/L磷酸氢二铵溶液(用磷酸调pH值至6.5)-乙腈(50：50)；
4)检测波长：248nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；洗脱：等度洗脱。
5)对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品适量至同一100ml量瓶中，加以甲醇溶解并稀释至刻度，定容摇匀，作为氨溴索、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E、杂质C、杂质F；液相色谱图如图10所示。
图10可以看出：能同时检测出六种杂质，杂质B和杂质A的峰分离度为0.60。
对比例8：按照下述方法色谱条件进行有关物质检测
1)色谱柱；2)检测器；3)流动相同对比例7；
4)检测波长：248nm；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；洗脱：等度洗脱。
5)对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品适量至同一100ml量瓶中，加以甲醇溶解并稀释至刻度，定容摇匀，作为氨溴索、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E、杂质C、杂质F；液相色谱图如图11所示。
图11可以看出：能同时检测出六种杂质，杂质B和杂质A的峰分离度为0.69。
对比例9：按照下述方法色谱条件进行有关物质检测
1)色谱柱：辛烷基硅烷键合为填充剂，规格4.6×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
3)流动相：0.01mol/L磷酸氢二铵溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(45：55)；
4)检测波长248nm；柱温30℃；流速0.8ml/min；洗脱：等度洗脱。
5)对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品适量至同一100ml量瓶中，加以甲醇溶解并稀释至刻度，定容摇匀，作为氨溴索、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E、杂质C、杂质F；液相色谱图如图12所示。
由图12可以看出：杂质B和杂质A的峰分离度为1.34、杂质B与氨溴索峰的分离度为1.74，不符合要求。
对比例10：按照下述方法色谱条件进行有关物质检测
1)色谱柱；2)检测器同对比例9
3)流动相：0.01mol/L磷酸氢二铵溶液(用磷酸调pH值至7.0)-乙腈(55：45)；
4)检测波长248nm；柱温30℃；流速0.8ml/min；洗脱：等度洗脱。
5)对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品适量至同一100ml量瓶中，加以甲醇溶解并稀释至刻度，定容摇匀，作为氨溴索、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E、杂质C、杂质F；液相色谱图如图13所示。
由图13可以看出：杂质B和杂质A的峰分离度为1.97，分离度不符合要求。
实施例1：杂质F的合成及结构确认
在反应釜中，加入2-氨基-3，5-二溴苯甲醛23.9g(0.086eq)、顺式-4-氨基环己醇盐酸盐 10g(0.066eq)、甲醇350ml；52℃搅拌反应9h，得到粗品，粗品用丙酮重结晶得到终产物顺式 -4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇18.5g，摩尔收率74.6％。纯度99.73％。核磁谱图、质谱图、色谱图如图1、图2、图3所示。
实施例2：杂质F的合成
在反应釜中，加入2-氨基-3，5-二溴苯甲醛22.1g(0.079eq)、顺式-4-氨基环己醇盐酸盐10g(0.066eq)、甲醇220ml；55℃搅拌反应8h，得到粗品，粗品用丙酮重结晶得到终产物顺式 -4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇18.1g，摩尔收率72.8％。纯度99.68％。
实施例3：杂质F的合成
在反应釜中，加入2-氨基-3，5-二溴苯甲醛25.8g(0.092eq)、顺式-4-氨基环己醇盐酸盐 10g(0.066eq)、甲醇510ml；50℃搅拌反应10h，得到粗品，粗品用丙酮重结晶得到终产物顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇16.7g，摩尔收率67.4％。纯度99.71％。
实施例4：本发明检测方法***适用性试验
1)色谱柱：辛烷基硅烷键合为填充剂，规格4.6×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
3)流动相：pH7.0磷酸盐缓冲液(1.32‰磷酸氢二铵溶液，用磷酸调节pH至7.0)-乙腈体积比：50:50；
4)检测波长：248nm；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；洗脱：等度洗脱。
5)对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品适量至同一100ml量瓶中，加以甲醇溶解并稀释至刻度，定容摇匀，作为氨溴索、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的对照品溶液；吸取对照品溶液 20μL，注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E、杂质C、杂质 F；相邻杂质峰的分离度均不低于2.0。液相色谱图如图14所示。
表1：各杂质峰保留时间
名称 保留时间(分钟)
盐酸氨溴索杂质B 7.518
盐酸氨溴索杂质A 8.445
盐酸氨溴索 9.304
盐酸氨溴索杂质D 10.930
盐酸氨溴索杂质E 17.278
盐酸氨溴索杂质C 25.461
盐酸氨溴索杂质F 28.479
实施例5：本发明检测方法专属性试验
色谱条件(色谱柱、检测器、流动相、检测波长、柱温、流速、洗脱、进样体积)同实施例4。
空白溶剂：甲醇、水
盐酸氨溴索杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品储备溶液：精密称取盐酸氨溴索各杂质对照品约10mg，分别置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
盐酸氨溴索对照品溶液：精密称取盐酸氨溴索对照品约25mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
盐酸氨溴索杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品溶液：精密量取盐酸氨溴索各杂质对照品储备溶液1ml，分别置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
加标供试品溶液：取盐酸氨溴索原料药约100mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取盐酸氨溴索杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E及杂质F储备液各1ml，至同一100ml 量瓶中，以甲醇稀释至刻度，定容摇匀。
表2：专属性试验数据
Figure RE-GDA0002424252460000111
结论：空白溶剂对杂质测定无干扰；加标供试品溶液中盐酸氨溴索与相邻杂质峰、各杂质峰之间的分离度均大于2.0。盐酸氨溴索与各杂质在对照品溶液中保留时间应与加标供试品溶液中的保留时间一致。本发明提供的方法检测氨溴索原料药具有专属性。
实施例6：本发明检测方法专属性试验
色谱条件(色谱柱、检测器、流动相、检测波长、柱温、流速、洗脱、进样体积)同实施例4。
辅料空白溶液：按盐酸氨溴索注射液的处方，取氯化钠、枸橼酸、磷酸氢二钠适量，配制辅料溶液进行试验。
盐酸氨溴索杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品储备溶液：精密称取盐酸氨溴索各杂质对照品约10mg，分别置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
盐酸氨溴索对照品溶液：精密称取盐酸氨溴索对照品约25mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
盐酸氨溴索杂质A、杂质B、杂质C、杂质F、杂质D、杂质E对照品溶液：精密量取盐酸氨溴索各杂质对照品储备溶液1ml，分别置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
加标供试品溶液：精密量取盐酸氨溴索注射液5ml，置100ml量瓶中，精密量取盐酸氨溴索杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E及杂质F储备液各1ml，至同一100ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，定容摇匀。
表3：专属性试验数据
Figure RE-GDA0002424252460000121
结论：辅料空白溶液对杂质测定无干扰；加标供试品溶液中盐酸氨溴索与相邻杂质峰、各杂质峰之间的分离度均大于2.0。盐酸氨溴索与各杂质在对照品溶液中保留时间应与加标供试品溶液中的保留时间一致。。本发明提供的方法检测氨溴索注射液具有专属性。
实例7：强制降解试验
色谱条件(色谱柱、检测器、流动相、检测波长、柱温、流速、洗脱、进样体积)同实施例4。
对盐酸氨溴索原料药进行高温、酸、碱、氧化和光照条件的强制降解实验，对未进行降解和降解后的供试品溶液进行检测，对盐酸氨溴索峰进行峰纯度检查，以确认所有样品的主成分的色谱峰中不包含其他成分峰。
将盐酸氨溴索原料经下表处理后，用甲醇稀释制成每1ml中约含1mg盐酸氨溴索的溶液。
表4强制降解试验条件及溶液制备
Figure RE-GDA0002424252460000122
Figure RE-GDA0002424252460000131
表5强制降解试验数据
Figure RE-GDA0002424252460000132
结论：强制降解样品主峰的峰纯度均为100％；主成分的含量与总杂质的含量加和后与未降解样品的含量与总杂质加和结果进行比较，比值均为100％。氨溴索原料药经过强制降解后，本发明提供的检测方法均能够检测出强制降解的杂质。
实施例8：线性与范围试验
色谱条件(色谱柱、检测器、流动相、检测波长、柱温、流速、洗脱、进样体积)同实施例4。
(一)溶液的配制
盐酸氨溴索杂质A对照品储备溶液：精密称取盐酸氨溴索杂质A对照品约10mg，置100ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。(0.1mg/ml)
盐酸氨溴索杂质B对照品储备溶液：精密称取盐酸氨溴索杂质B对照品约10mg，置100ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。(0.1mg/ml)
盐酸氨溴索杂质C对照品储备溶液：精密称取盐酸氨溴索杂质C对照品约10mg，置100ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。(0.1mg/ml)
盐酸氨溴索杂质F对照品储备溶液：精密称取盐酸氨溴索杂质F对照品约10mg，置100ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。(0.1mg/ml)
盐酸氨溴索杂质D对照品溶液：精密称取盐酸氨溴索杂质D对照品约10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。(0.1mg/ml)
盐酸氨溴索杂质E对照品溶液：精密称取盐酸氨溴索杂质E对照品约10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。(0.1mg/ml)
线性储备溶液：精密量取上述盐酸氨溴索对照溶液1ml、盐酸氨溴索杂质A、盐酸氨溴索杂质B、盐酸氨溴索杂质C、盐酸氨溴索杂质D、盐酸氨溴索杂质E、盐酸氨溴索杂质F 储备液1ml，至同一50ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，定容摇匀，得线性储备液。
线性1(20％)：精密量取线性5溶液2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
线性2(40％)：量取线性5溶液4ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
线性3(60％)：量取线性5溶液6ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
线性4(80％)：量取线性5溶液8ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
线性5(100％)：精密量线性储备溶液5ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
线性6(200％)：线性储备液为线性6溶液。
(二)线性试验数据
表6：线性试验数据
Figure RE-GDA0002424252460000141
Figure RE-GDA0002424252460000151
Figure RE-GDA0002424252460000161
结论：各杂质峰面积与其浓度成良好的线性关系，相关系数r均大于0.99。
实施例9：检测限和定量限
色谱条件(色谱柱、检测器、流动相、检测波长、柱温、流速、洗脱、进样体积)同实施例4。
精密移取实施例8中盐酸氨溴索对照品溶液、各杂质对照线性储备液适量并用甲醇逐级稀释，进行测定，记录色谱图，测定各杂质峰高的S/N(信噪比，下同)；当S/N为3-10时，对应的浓度为检测限浓度；当S/N≥10时，对应的浓度为定量限浓度。数据如下：
表7：检测限实验数据
样品 百分含量(％) 浓度(μg/ml) 信噪比(S/N)
盐酸氨溴索 0.0015 0.015 4.5
盐酸氨溴索杂质A 0.0020 0.020 8.3
盐酸氨溴索杂质B 0.0042 0.042 5.0
盐酸氨溴索杂质C 0.0104 0.104 6.0
盐酸氨溴索杂质D 0.0044 0.044 3.8
盐酸氨溴索杂质E 0.0041 0.041 3.5
盐酸氨溴索杂质F 0.0106 0.106 5.0
表8：定量限实验数据
样品 百分含量(％) 浓度(μg/ml) 信噪比(S/N)
盐酸氨溴索 0.0030 0.030 17
表9：定量限精密度实验数据
峰面积 第1针 第2针 第3针 第4针 第5针 第6针 RSD(％)
盐酸氨溴索 23403 21912 22320 22944 22447 21784 2.8
实施例10：准确度试验
色谱条件(色谱柱、检测器、流动相、检测波长、柱温、流速、洗脱、进样体积)同实施例4。
(一)溶液的配制
供试品溶液的制备：取盐酸氨溴索约25mg，精密称定，置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
准确度储备溶液：精密量取实施例8中制备的盐酸氨溴索杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F储备液各2ml，至同一100ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，定容摇匀，平行配制3份，记为S1、S2、S3；得准确度储备液。
50％限度水平溶液配制：精密称取本品10mg置于10ml量瓶中，平行配制三份，量取准确度储备液S1、S2、S3各2.5ml，分置上述量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀作为50％水平限度溶液。
100％限度水平溶液配制：精密称取本品10mg置于10ml量瓶中，平行配制三份，精密量取准确度储备液S1、S2、S3各5ml，分置上述量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀作为100％水平限度溶液。
200％限度水平溶液配制：精密称取本品10mg置于10ml量瓶中，平行配制三份，分别加准确度储备液S1、S2、S3稀释至刻度，摇匀作为200％水平限度溶液。
(二)准确度试验数据
表10：准确度试验数据
Figure RE-GDA0002424252460000171
Figure RE-GDA0002424252460000181
Figure RE-GDA0002424252460000191
9份测试溶液中盐酸氨溴索杂质A、盐酸氨溴索杂质B、盐酸氨溴索杂质C、盐酸氨溴索杂质D、盐酸氨溴索杂质E和盐酸氨溴索杂质F的加标回收率在87.5％～111.8％范围内，RSD在0.4％～5.8％范围内，符合规定。
实施例11：耐用性实验
色谱条件(色谱柱、检测器、流动相、检测波长、柱温、流速、洗脱、进样体积)同实施例2。
在其它条件不变的情况下，改变缓冲液pH(分别调整为6.8和7.2)、流动相比例(52： 48和48：52)、柱温(分别调整为28℃和32℃)、不同品牌色谱柱，考察***适用性
6.8.2验证要求：
***适用性溶液色谱图中盐酸氨溴索峰与盐酸氨溴索杂质B之间的分离度应大于4.0，灵敏度溶液色谱图中主成分峰高的信噪比应大于10。
6.8.3验证的数据：
表11：耐用性实验数据
Figure RE-GDA0002424252460000192
改变磷酸盐缓冲液pH为6.8和7.2；改变柱温分别为28℃和32℃，流动相中磷酸盐缓冲液：乙腈调整比例为52:48和48:52，以及换用Waters 100-5-C8色谱柱，***适用性溶液色谱图中盐酸氨溴索与盐酸氨溴索杂质B分离度均大于4.0，盐酸氨溴索峰信噪比均大于10，符合规定。
实施例12：盐酸氨溴索原料药制备及检测方法
盐酸胺溴索原料药的制备：采用下述合成路线制备盐酸胺溴索。
Figure RE-GDA0002424252460000201
具体工艺步骤为：
(1)向缩合釜中投入邻氨基二溴苯甲醛55.6kg、(E)-对氨基环己醇23.6kg、甲苯128kg；升温到110℃，保温4h后，降温到室温析晶，过滤、真空干燥得到中间体I。
(2)氢化釜中投入步骤(1)得到中间体1、甲醇200Kg；铂碳1.2Kg，阀门密闭后，氮气置换2次，测定含氧量，确保在0.5％以下。升温到60℃，通入氢气，压力控制在1.2MPa，保温5h，，降温到室温，排出氢气；冷却到20℃，保温4h，离心得氨溴索。
(3)反应釜中投入步骤(2)得到的氨溴索，用乙醇160kg溶液，降温至10℃，滴加20％盐酸189Kg，滴加完毕后，保温2h，离心；得到盐酸氨溴索原料药。
对上述制备的氨溴索原料药进行杂质检测，检测方法如下：
1)色谱柱：辛烷基硅烷键合为填充剂，规格4.6×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
3)流动相：pH7.0磷酸盐缓冲液(1.32‰磷酸氢二铵溶液，用磷酸调节pH至7.0)-乙腈体积比：50:50；
4)检测波长：248nm；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；洗脱：等度洗脱。
5)对照品溶液的制备及测定方法：精密称取盐酸氨溴索对照品25mg、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质F对照品、杂质D对照品、杂质E对照品各10mg至同一容量瓶中，至同一100ml量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，定容摇匀，作为对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E、杂质C、杂质F，相邻杂质峰的分离度不低于2.0。
6)供试品溶液的准备：精密称取盐酸氨溴索原料药，加甲醇稀释成1.0mg/ml的溶液，作为供试品溶液；吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪。按外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的含量。色谱图如图15所示。
实施例13：盐酸氨溴索注射液有关物质的检测方法
氨溴索原料药：符合中国药典2015版《氨溴索》原料药质量标准。
氨溴索注射液的制备：按照CN110200905A中实施例1制备成氨溴索注射液。
对上述制备的氨溴索注射液进行杂质检测，检测方法如下：
1)色谱柱：辛烷基硅烷键合为填充剂，规格4.6×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
3)流动相：pH7.0磷酸盐缓冲液(1.32‰磷酸氢二铵溶液，用磷酸调节pH至7.0)-乙腈体积比：50:50；
4)检测波长：248nm；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；洗脱：等度洗脱。
5)对照品溶液的制备及测定方法：精密称取盐酸氨溴索对照品25mg、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质F对照品、杂质D对照品、杂质E对照品各10mg至同一容量瓶中，至同一100ml量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，定容摇匀，作为对照品溶液；吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E、杂质C、杂质F，相邻杂质峰的分离度不低于2.0。
6)供试品溶液的准备：精密量取1ml盐酸氨溴索注射液，置于100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪；按外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质F、杂质D、杂质E的含量。色谱图如图16所示。杂质B含量为0.03％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思和优点，本发明也可以具有其它的形式变化，如本领域技术人员所熟知，上述实施例仅仅起到对上述发明保护范围内的示范作用，对本领域普通技术人员来说，在本发明所限定的保护范围内还有很多常规变形和其它实施例，这些变形和实施例都将在本发明待批的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氨溴索原料或注射液中的杂质，命名为杂质F，化学名称为顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇，分子式为C13H16Br2N2O，具有如下式I所示的结构。
Figure FDA0002340035440000011
2.一种如权利要求1所述的为顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在反应釜中，加入2-氨基-3，5-二溴苯甲醛、顺式-4-氨基环己醇盐酸盐、甲醇；50-55℃搅拌反应8-10h，减压干燥，得到粗品，粗品用丙酮重结晶得到终产物顺式-4-[[(2-氨基-3，5-二溴苯基)亚甲基]氨基]环己醇。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，相对于顺式-4-氨基环己醇盐酸盐，2-氨基-3，5-二溴苯甲醛的用量为1.2-1.4摩尔当量。
4.权利要求所述的杂质F在氨溴索原料药及注射液分析测定中作为质量控制标准品的应用。
5.一种利用高效液相色谱法测定盐酸氨溴索原料和注射液中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的的检测方法：
1)色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格4.6×250mm，填料粒径5μm；
2)检测器：紫外检测器；
3)流动相：pH6.8-7.2磷酸盐缓冲液-乙腈体积比：48-52:48-52；
4)检测波长：248nm；柱温：28-32℃；流速：0.8ml/min；洗脱：等度洗脱；进样体积：20μL。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，检测方法还包括：
5)对照品溶液的制备及测定方法：精密称取盐酸氨溴索对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品适量至同一容量瓶中，加甲醇溶解并稀释成氨溴索、杂质A、杂质B、杂质C、杂质F、杂质D、杂质E对照品溶液；按照上述色谱条件将对照品溶液注入液相色谱仪，出峰顺序为杂质B、杂质A、氨溴索、杂质D、杂质E、杂质C、杂质F；相邻杂质峰的分离度不低于2.0。
6)盐酸氨溴索原料药及注射液供试品溶液的制备：精密取出盐酸氨溴索原料药或盐酸氨溴索注射液适量，加甲醇稀释，作为供试品溶液；按照上述色谱条件将对照品溶液注入液相色谱仪；按外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的含量。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为浓度1.0‰-1.5‰的磷酸氢二铵溶液；用磷酸调节pH值至6.8-7.2；优选1.3‰-1.4‰的磷酸氢二铵溶液；更优选1.32‰磷酸氢二铵溶液。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的流动相，为pH6.8-7.2磷酸盐缓冲液-乙腈体积比：50:50；更优选pH7.0磷酸盐缓冲液-乙腈体积比：50:50。
9.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，盐酸氨溴索原料供试品溶液的制备：精密称取盐酸氨溴索原料药，加甲醇稀释成1.0mg/ml的溶液，作为供试品溶液；吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪；按外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的含量。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，盐酸氨溴索注射液供试品溶液的制备：精密量取1ml盐酸氨溴索注射液，置于100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪；按外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的含量。
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