CN113040140B - 一种适合噬菌体浸入藤本和木本植物用的辅助渗透剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种适合噬菌体浸入藤本和木本植物用的辅助渗透剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及噬菌体生物农药技术领域，具体涉及一种适合噬菌体浸入藤本和木本植物用的辅助渗透剂，以及该噬菌体辅助渗透剂的制备方法和应用方法。本申请所述的辅助渗透剂成分包括山梨醇酐月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、曲拉通、脂肪醇聚氧乙烯醚、珀酸二辛酯磺酸钠、噻酮、硬脂酸钙和甘露醇。本申请的辅助渗透剂组分合理，物料易于获取，生产成本低，对人体无害。本申请的辅助渗透剂可以在藤本和木本植物浸入处理时增加噬菌体进入的数量，提高噬菌体的利用效率，增强噬菌体对植物细菌性病害的防治效果。

Description

一种适合噬菌体浸入藤本和木本植物用的辅助渗透剂及其制 备方法和应用
技术领域
本申请涉及噬菌体生物农药技术领域，具体涉及一种适合噬菌体浸入藤本和木本植物用的辅助渗透剂，以及该噬菌体辅助渗透剂的制备方法和应用。
背景技术
作物细菌性病害是世界性常发流行性病害，细菌性病害的危害程度比真菌性病害更加严重且更加难以防治。长期以来用于防治作物细菌性病害的农药种类较少，同时现有农药对细菌性病害的防治效果也较差。
相比于传统农药，噬菌体具有以下优势：噬菌体为有限自我复制的病毒，它们只有在有寄主的条件下才能生存与复制；在寄主缺乏的情况下，噬菌体将会很快凋亡；噬菌体对环境没有毒性，不会对环境造成污染，满足当代提倡的绿色无公害农业要求；噬菌体特异性强，只针对相应的致病菌，而不会破坏正常菌群。因此利用噬菌体制作生物农药进行细菌性病害的防治逐渐被人们重视及开发。但是，应用噬菌体进行细菌性病害防治还有很多局限性，还需要考虑气候和大田环境因素等。例如：土壤的pH值和土壤中的物理障碍等因素影响，以及气温，雨水、紫外线等因素，上述因素均可能会影响噬菌体的应用效果。其中，藤本和木本植物播种前的浸泡处理工作非常重要，目前的化学药剂浸入法有诸多的缺点。因此尝试使用噬菌体浸入，不仅可以确保生物安全性，而且可以有效杀灭病原菌。但是目前噬菌体对植物的渗透效果较差，不能有效的附着在藤本和木本植物表面，更难以进入藤本和木本植物体内。
发明内容
针对上述存在技术现状，本申请提供一种适用于噬菌体浸入藤本和木本植物的辅助渗透剂及其制备方法和应用。
本申请的第一目的是提供一种适用于噬菌体浸入藤本和木本植物的辅助渗透剂，其技术方案如下，辅助渗透剂至少包括：山梨醇酐月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、曲拉通、脂肪醇聚氧乙烯醚、琥珀酸二辛酯磺酸钠、噻酮、硬脂酸钙和甘露醇中的一种或几种。
作为实施方案之一，所述辅助渗透剂包括曲拉通、脂肪醇聚氧乙烯醚、琥珀酸二辛酯磺酸钠、噻酮、硬脂酸钙和甘露醇，各组分含量如下：以重量百分含量计，所述山梨醇酐月桂酸酯0％～0.4％；所述聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯0％～0.4％；所述曲拉通的剂量为0.8～1.6％；所述脂肪醇聚氧乙烯醚的剂量为2～2.4％；所述琥珀酸二辛酯磺酸钠的剂量为1～2.6％；所述噻酮的剂量为1～3％；所述硬脂酸钙的剂量为1.2～2.4％；所述甘露醇的剂量为4～8％；余量为去离子水。
本申请的辅助渗透剂可以用于包括但不限于茄科雷尔氏菌噬菌体或地毯草黄单胞菌噬菌体或丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体。
作为实施方案之一，本申请所述用于茄科雷尔氏菌噬菌体的辅助渗透剂，包括以下剂量的组分：以重量百分含量计，
山梨醇酐月桂酸酯：0.4％；
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯：0.4％；
曲拉通：1.4％；
脂肪醇聚氧乙烯醚：2.3％；
琥珀酸二辛酯磺酸钠：1.5％；
噻酮：2.5％；
硬脂酸钙：2.2％；
甘露醇：7％；
余量为去离子水；
或用于地毯草黄单胞菌噬菌体的辅助渗透剂，包括以下剂量的组分：以重量百分含量计，
山梨醇酐月桂酸酯：0.35％；
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯：0.3％；
曲拉通：1.4％；
脂肪醇聚氧乙烯醚：2.3％；
琥珀酸二辛酯磺酸钠：1.5％；
噻酮：2.5％；
硬脂酸钙：2.2％；
甘露醇：7％；
余量为去离子水。
或用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体的辅助渗透剂，包括以下剂量的组分：以重量百分含量计，
山梨醇酐月桂酸酯：0.3％；
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯：0.3％；
曲拉通：1.4％；
脂肪醇聚氧乙烯醚：2.3％；
琥珀酸二辛酯磺酸钠：1.5％；
噻酮：3％；
硬脂酸钙：2.2％；
甘露醇：8％；
余量为去离子水。
或用于噬菌体组合物的辅助渗透剂，包括以下剂量的组分：以重量百分含量计，
山梨醇酐月桂酸酯：0.35％；
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯：0.3％；
曲拉通：1.4％；
脂肪醇聚氧乙烯醚：2.3％；
琥珀酸二辛酯磺酸钠：1.5％；
噻酮：2.5％；
硬脂酸钙：2.2％；
甘露醇：7％；
余量为去离子水。
本申请的噬菌体辅助渗透剂组分为较优组分。
作为实施方案之一，所述辅助渗透剂在4℃下可存放18个月；在25℃下可存放12个月；在37℃下的可存放6个月。
本方案的辅助渗透剂在各种不同温度下的稳定性较好。
本申请的第二目的在于提供一种适用于噬菌体浸入藤本和木本植物的辅助渗透剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将山梨醇酐月桂酸酯0％～0.4％、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯0％～0.4％、曲拉通0.8～1.6％、脂肪醇聚氧乙烯醚2～2.4％和琥珀酸二辛酯磺酸钠1～2.6％加入到1/2重量的水中，升温溶解，磁力搅拌均匀后备用；
(2)将噻酮1～3％、硬脂酸钙1.2～2.4％和甘露醇4～8％加入到1/2重量的水中，常温溶解，磁力搅拌均匀后备用；
(3)将步骤(1)的混合液加入到步骤(2)得到的溶液中混合，磁力搅拌均匀；
(4)将步骤(3)中所得混合溶液，121℃灭菌20min，4℃储存备用，即得到噬菌体辅助渗透剂。
作为实施方案之一，用于茄科雷尔氏菌噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：称取山梨醇酐月桂酸酯4g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯4g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮25g，硬脂酸钙22g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌20min，即得到噬菌体辅助渗透剂，4℃储存备用；
或用于地毯草黄单胞菌噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：称取山梨醇酐月桂酸酯3.5g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯3g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮25g，硬脂酸钙22g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌20min，即得到噬菌体辅助渗透剂，4℃储存备用；
或用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：称取山梨醇酐月桂酸酯3g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯3g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮30g，硬脂酸钙22g、甘露醇80g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌20min，即得到噬菌体辅助渗透剂，4℃储存备用；
或用于噬菌体组合物的辅助渗透剂的制备方法如下：称取山梨醇酐月桂酸酯35g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯3g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮25g，硬脂酸钙22g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌20min，即得到噬菌体辅助渗透剂，4℃储存备用。
本申请所述的噬菌体辅助渗透剂的制备和保藏方法，工艺简单易行，效率高，应用成本低，操作简单，易于实现，应用方便。
本申请的第三目的在于提供一种适合噬菌体浸入藤本和木本植物用的辅助渗透剂的应用方法，将所述辅助渗透剂以终浓度为12％混合于噬菌体溶液中，搅拌均匀。
作为实施方案之一，在无菌条件下，将渗透剂加入噬菌体溶液中，按1:9体积比混合均匀，得到具有渗透剂的噬菌体制剂。
作为实施方案之一，所述噬菌体为茄科雷尔氏菌噬菌体或地毯草黄单胞菌噬菌体或丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体或三种噬菌体的组合物。
本申请噬菌体辅助渗透剂可以适用于不同类型的噬菌体，例如包括但不限于茄科雷尔氏菌噬菌体或地毯草黄单胞菌噬菌体或丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体。茄科雷尔氏菌噬菌体包括但不限于茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(Ralstoniasolanacearum phageGP1)，茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(Ralstoniasolanacearum phage GP2)，或茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstoniasolanacearum phage GP3)。
地毯草黄单胞菌噬菌体包括但不限于地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonasaxonopodis phage YHC5)。
丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体包括但不限于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae phage PSA-P1)。
茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(RalstoniasolanacearumphageGP1)、保藏编号为CCTCCNO:M 2016633，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日；
茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(RalstoniasolanacearumphageGP2)、保藏编号为CCTCCNO:M 2016634，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日；
茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(RalstoniasolanacearumphageGP3)、保藏编号为CCTCCNO：M 2016635，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日；
地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018579，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年08月30日。
丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1(Pseudomonas syringaepv.Actinidiae phage PSA-P1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020252，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年06月30日。
作为实施方案之一，所述用于噬菌体浸入藤本和木本植物的最佳处理浓度为12％。
噬菌体辅助渗透剂使用方便，可以用于多种不同的噬菌体及目标藤本和木本植物。噬菌体辅助渗透剂适应性好，在室温条件下即可以进行操作，具有极高的应用前景。
与现有技术相比，本申请具有以下优点：
(1)本申请的噬菌体辅助渗透剂，其组分合理，原料来源广、易于获得、成本低，可以有效增加浸入处理时噬菌体进入藤本和木本植物体内的数量，并且可以提高噬菌体进入藤本和木本植物体内的速度。
(2)本申请的噬菌体辅助渗透剂的制备、贮藏方法、方法合理、工艺简单易行、效率高、应用成本低、操作简单、易于实现，且在不同温度下均具有良好的长期稳定性(＞6m)，可一次配制后多次使用。
(3)本申请采用具有活性的微生物与化学试剂组合形成了全新的无毒、安全的渗透制剂。
(4)本申请的噬菌体辅助渗透剂具有极高的应用前景，对保存条件要求低，辅助渗透剂在不同环境条件下的加速噬菌体的渗透过程，应用便捷。
具体实施方式
以下实施例和实验例用于进一步阐述本申请，但不以任何的方式限制本申请的有效范围。
除非另有定义，本申请使用的所有技术和科学术语的含义与本申请所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本申请使用的命名是本领域公知的或常用的，若未特别指明，本申请实施例中所用的渗透剂试剂的各组分均可市售获得。
以下实例中，所涉及菌株代号均以本公司的命名方式编号。
以下实施例中，使用的试剂如下：
LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。
LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
采用设备：0.22μm无菌过滤器(Millpore)；
无菌离心管(Eppendorf)。
山梨醇酐月桂酸酯，为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式是C18H34O6，分子量为346.459。
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式是C12H18O11，分子量为338.264。
曲拉通为市购产品，纯度大于等于99.5％，分子式C34H62O11，分子量为646.86。
脂肪醇聚氧乙烯醚为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式C12H25O.(C2H4O)n，分子量为1199.55。
琥珀酸二辛酯磺酸钠为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式C20H37O7SNa，分子量为444.25。
噻酮为市购产品，纯度大于等于97.0％，分子式C11H13O3SN，分子量为239.29。
硬脂酸钙为市购产品，纯度大于等于99.0％分子式C36H70CaO4，分子量为607.01。
甘露醇为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式C6H14O6，分子量为182.17。
茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(RalstoniasolanacearumphageGP1)、保藏编号为CCTCCNO:M 2016633，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日。
茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(RalstoniasolanacearumphageGP2)、保藏编号为CCTCCNO:M 2016634，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日。
茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(RalstoniasolanacearumphageGP3)、保藏编号为CCTCCNO：M 2016635，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日。
地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018579，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年08月30日。
丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1(Pseudomonas syringaepv.Actinidiae phage PSA-P1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020252，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年06月30日。
实施例1八种试剂不同浓度制剂的制备方法
准确称取山梨醇酐月桂酸酯1g、2.5g、3g、3.5g和4g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌20min，4℃储存备用。
准确称取聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯1g、2.5g、3g、3.5g和4g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌20min，4℃储存备用。
准确称取曲拉通8g、10g、12g、14g和16g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌20min，4℃储存备用。
准确称取脂肪醇聚氧乙烯醚20g、21g、22g、23g和24g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌20min，4℃储存备用。
准确称取琥珀酸二辛酯磺酸钠10g、15g、18g、22g和26g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌20min，4℃储存备用。
准确称取噻酮10g、15g、20g、25g和30g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌20min，4℃储存备用。
准确称取硬脂酸钙12g、15g、18g、22g和24g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌20min，4℃储存备用。
准确称取甘露醇40g、50g、60g、70g和80g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌20min，4℃储存备用。
将1000mL去离子水121℃灭菌20min，作为空白对照，4℃储存备用。
实施例2噬菌体辅助渗透剂的制备
(1)适用于茄科雷尔氏菌噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：准确称取山梨醇酐月桂酸酯4g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯4g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮25g，硬脂酸钙22g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌20min，4℃储存备用。
(2)适用于地毯草黄单胞菌噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：准确称取山梨醇酐月桂酸酯3.5g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯3g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮25g，硬脂酸钙22g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌20min，4℃储存备用。
(3)适用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：准确称取山梨醇酐月桂酸酯3g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯3g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮30g，硬脂酸钙22g、甘露醇80g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌20min，4℃储存备用。
(4)适用于噬菌体组合物的辅助渗透剂的制备方法如下：准确称取山梨醇酐月桂酸酯3.5g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯3g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮25g，硬脂酸钙22g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌20min，4℃储存备用。
实施例3茄科雷尔氏菌噬菌体GP1溶液的制备
将保存的茄科雷尔氏菌单菌落接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，28℃下240rpm震荡培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(Ralstonia solanacearum phage GP1，保藏编号CCTCC NO:M 2016633)100μL，28℃下240rpm震荡培养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到茄科雷尔氏菌噬菌体溶GP1液。
实施例4茄科雷尔氏菌噬菌体GP2溶液的制备
将保存的茄科雷尔氏菌单菌落接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，28℃下240rpm震荡培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(Ralstonia solanacearum phage GP2，保藏编号CCTCC NO:M 2016634)100μL，28℃下240rpm震荡培养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到茄科雷尔氏菌噬菌体溶GP2液。
实施例5茄科雷尔氏菌噬菌体GP3溶液的制备
将保存的茄科雷尔氏菌单菌落接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，28℃下240rpm震荡培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3，保藏编号CCTCC NO:M 2016635)100μL，28℃下240rpm震荡培养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到茄科雷尔氏菌噬菌体GP3溶液。
实施例6地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5溶液的制备
将噬菌体YHC5宿主菌接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，25℃下240rpm震荡培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonasaxonopodis phage YHC5，保藏编号为CCTCC NO:M2018579)，25℃下240rpm震荡培养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5溶液。
实施例7丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1溶液的制备
将噬菌体PSA-P1宿主菌接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，28℃下240rpm震荡培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae phage PSA-P1，保藏编号为CCTCC NO:M2020252)，28℃下240rpm震荡培养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1溶液。
实施例8具有辅助渗透剂的单种噬菌体制剂的制备
取实施例3～7中得到的三种茄科雷尔氏菌噬菌体溶液、地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5溶液及丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1溶液，在无菌条件下，将实施例2中制备得到的各噬菌体辅助渗透剂分别加入上述5种噬菌体溶液中。每种噬菌体与辅助渗透剂以体积比9:1混合均匀。最后得到含有辅助渗透剂的茄科雷尔氏菌噬菌体GP1的制剂、茄科雷尔氏菌噬菌体GP2的制剂、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3的制剂、地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的制剂和丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1的制剂。
实施例9噬菌体组合物的制备
取茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(Ralstoniasolanacearumphage GP1)，保藏编号CCTCCNO:M 2016633；茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(Ralstoniasolanacearumphage GP2)，保藏编号CCTCC NO:M 2016634；茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstoniasolanacearumphage GP3)，保藏编号CCTCC NO:M2016635；地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5)，保藏编号CCTCC NO:M 2018579；丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae phage PSA-P1)，保藏编号CCTCC NO:M 2020252，按体积比1:1:1:1:1制成噬菌体组合物。
实施例10具有辅助渗透剂的噬菌体组合物制剂的制备
在无菌条件下，将实施例2制备的噬菌体组合物辅助渗透剂加入实施例9的噬菌体组合物中并混合均匀，其中辅助渗透剂与噬菌体组合物的体积比为1:9，得到具有辅助渗透剂的噬菌体组合物的制剂。
实验例1毒理试验
取实验小鼠40只，雌雄各半，适应性饲养三天后，随机分为四组：噬菌体组合物处理组(处理1)、噬菌体渗透制剂处理组(处理2)、具有噬菌体渗透制剂的噬菌体组合物处理组(处理3)、对照组，每组10只小鼠(雌雄各5只)。分别给予处理1计量为1010PFU/kg的噬菌体组合物(实施例9制得)；给予处理3计量为1010PFU/kg的具有噬菌体渗透制剂的噬菌体组合物(实施例10制得)；给予处理2等量的噬菌体渗透制剂的10倍稀释液(实施例2制得)；对照组给予等量生理盐水。连续给药15d后将实验鼠断颈处死，检查内脏情况。
实验结果显示，上述各处理均对小鼠日常行为没有影响，且解剖检查小鼠内脏未见异常。说明噬菌体辅助渗透制剂与噬菌体组合物均具有生物安全性，且二者混合后无生物毒性，可应用于藤本和木本植物浸入。
实验例2八种试剂对茄科雷尔氏菌噬菌体GP1的辅助渗透效果检测
选取实施例1种制备的山梨醇酐月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。
按实施例3分别制备41瓶450mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP1溶液(4.3x106PFU/mL)，分别向其中40瓶中加入50mL的山梨醇酐月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，混合均匀；在第41瓶中加入50mL的无菌去离子水作为对照1，混合均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。
将42个瓶中的液体分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取3个黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价，并计算样本中噬菌体增加率。实验重复3次。
噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％。
测定结果如表1所示，
不同剂量的山梨醇酐月桂酸酯处理中，加入4g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了31.03％，因此选择剂量4g为最佳剂量；
不同剂量的聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯处理中，加入4g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了34.48％，因此选择剂量4g为最佳剂量；
不同剂量的曲拉通处理中，加入14g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了34.48％，因此选择剂量14g为最佳剂量；
不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，23g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了31.03％，因此选择剂量23g为最佳剂量；
不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，15g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了58.62％，因此选择剂量15g为最佳剂量；
不同剂量噻酮处理中，25g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了61.53％，因此选择剂量25g为最佳剂量；
不同剂量硬脂酸钙处理中，22g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了62.06％，因此选择22g为最佳剂量；
不同剂量甘露醇处理中，70g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了58.62％，因此选择70g为最佳剂量；
综上，山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为4g，4g，14g，23g，15g，25g，22g和70g。
表1八种试剂的不同浓度对茄科雷尔氏菌噬菌体GP1溶液的渗透作用结果
Figure GDA0003593494170000131
Figure GDA0003593494170000141
实验例3八种试剂对茄科雷尔氏菌噬菌体GP2的辅助渗透效果检测
选取实施例1种制备的山梨醇酐月桂酸酯,聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯,曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。
按实施例4分别制备41瓶450mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP2溶液(6.5x106PFU/mL)，分别向其中40瓶中加入50mL的山梨醇酐月桂酸酯,聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯,曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，混合均匀；在第41瓶中加入50mL的无菌去离子水作为对照1，混合均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。
将42个瓶中的液体分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价，并计算样本中噬菌体增加率。实验重复3次。
直径为1cm黄瓜藤节噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％。
测定结果如表2所示，
不同剂量的山梨醇酐月桂酸酯处理中，加入4g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了39.13％，因此选择剂量4g为最佳剂量；
不同剂量的聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯处理中，加入4g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了41.30％，因此选择剂量4g为最佳剂量；
不同剂量的曲拉通处理中，加入14g和16g的处理组均使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了41.30％，因此选择最小剂量14g为最佳剂量；
不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，加入22g和23g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了28.26％，因此选择最小剂量22g为最佳剂量；
不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，15g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了28.26％，因此选择剂量15g为最佳剂量；
不同剂量噻酮处理中，25g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了50％，因此选择剂量25g为最佳剂量；
不同剂量硬脂酸钙处理中，22g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了21.73％，因此选择22g为最佳剂量；
不同剂量甘露醇处理中，70g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了45.65％，因此选择70g为最佳剂量；
综上，山梨醇酐月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为4g，4g,14g，22g，15g，25g，22g和70g。
表2八种试剂的不同浓度对茄科雷尔氏菌噬菌体GP2溶液的渗透作用结果
Figure GDA0003593494170000161
Figure GDA0003593494170000171
实验例4八种试剂对茄科雷尔氏菌噬菌体GP3的辅助渗透效果检测
选取实施例1种制备的山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。
按实施例5分别制备31份450mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP3溶液(5.0x106PFU/mL)，分别向其中40瓶中加入50mL的山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，在第41瓶中加入50mL的无菌去离子水作为对照1，混合均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。
将42个瓶中的液体分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价，并计算样本中噬菌体增加率。实验重复3次。直径为1cm黄瓜藤节噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％
测定结果如表3所示，
不同剂量的山梨醇酐月桂酸酯处理中，加入4g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了17.94％，因此选择剂量4g为最佳剂量；
不同剂量的聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯处理中，加入4g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了20.51％，因此选择剂量4g为最佳剂量；
不同剂量的曲拉通处理中，加入14g和16g的处理组均使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了17.94％，因此选择最小剂量14g为最佳剂量；
不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，加入23g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了20.51％，因此选择剂量23g为最佳剂量；
不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，18g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了25.64％，因此选择剂量18g为最佳剂量；
不同剂量噻酮处理中，30g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了25.64％，因此选择剂量30g为最佳剂量；
不同剂量硬脂酸钙处理中，22g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了33.33％，因此选择22g为最佳剂量；
不同剂量甘露醇处理中，70g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了30.76％，因此选择70g为最佳剂量；
综上，山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为4g，4g，14g，23g，14g，30g，22g和70g。
表3八种试剂的不同浓度对茄科雷尔氏菌噬菌体GP3溶液的渗透作用结果
Figure GDA0003593494170000191
Figure GDA0003593494170000201
实验例5八种试剂对地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的辅助渗透效果检测
选取实施例1种制备的山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。
按实施例6分别制备31份450mL的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(3.3x106PFU/mL)，分别向其中40瓶中加入50mL的山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，在第41瓶中加入50mL的无菌去离子水作为对照1，混合均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。
将42个瓶中的液体分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价，并计算样本中噬菌体增加率。实验重复3次。
直径为1cm黄瓜藤节噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％
测定结果如表4所示，
不同剂量的山梨醇酐月桂酸酯处理中，加入3.5g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了25％，因此选择剂量3.5g为最佳剂量；
不同剂量的聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯处理中，加入3g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了34.09％，因此选择剂量3g为最佳剂量；
不同剂量的曲拉通处理中，加入14g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了34.09％，因此选择14g为最佳剂量；
不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，加入23g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了31.81％，因此选择剂量23g为最佳剂量；
不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，加入15g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了20.54％，因此选择剂量23g为最佳剂量；
不同剂量噻酮处理中，25g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了20.54％，因此选择剂量25g为最佳剂量；
不同剂量硬脂酸钙处理中，22g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了29.54％，因此选择22g为最佳剂量；
不同剂量甘露醇处理中，70g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了31.81％，因此选择70g为最佳剂量；
综上，山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为3.5g，3g，14g，23g，15g，25g，22g和70g。
表4八种试剂的不同浓度对地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5溶液的渗透作用结果
Figure GDA0003593494170000221
Figure GDA0003593494170000231
实验例6八种试剂对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1的辅助渗透效果检测
选取实施例1种制备的山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。
按实施例7分别制备31份450mL的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1(5.1x106 PFU/mL)，分别向其中40瓶中加入50mL的山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，在第41瓶中加入50mL的无菌去离子水作为对照1，混合均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。
将42个瓶中的液体分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价，并计算样本中噬菌体增加率。实验重复3次。
噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％
测定结果如表5所示，
不同剂量的山梨醇酐月桂酸酯处理中，加入3g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量提高了19.44％，因此选择剂量3g为最佳剂量；
不同剂量的聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯处理中，加入3g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量提高了27.77％，因此选择剂量3g为最佳剂量；
不同剂量的曲拉通处理中，加入14g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量提高了27.77％，因此选择14g为最佳剂量；
不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，23g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量提高了22.22％，因此选择剂量23g为最佳剂量；
不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，15g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量提高了22.2％，因此选择剂量15g为最佳剂量；
不同剂量噻酮处理中，30g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量提高了33.3％，因此选择剂量30g为最佳剂量；
不同剂量硬脂酸钙处理中，22g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量提高了36.11％，因此选择22g为最佳剂量；
不同剂量甘露醇处理中，80g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量提高了38.88％，因此选择80g为最佳剂量；
综上，山梨醇酐月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为3g，3g，14g，23g，15g，30g，22g和80g。
表5八种试剂的不同浓度对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1溶液的渗透作用结果
Figure GDA0003593494170000251
Figure GDA0003593494170000261
Figure GDA0003593494170000271
实验例7噬菌体辅助渗透剂浓度对噬菌体浸入黄瓜藤节效果的影响
分别取由实施例3～实施例7和实施例9制备的噬菌体GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各5份。分别向其中加入终浓度分别为5％、12％、15％、20％和25％(与噬菌体的体积比v/v)的辅助渗透剂(实施例2制得)并混合均匀，使得溶液总体积为500mL且效价为8.2x104 PFU/mL；同时取500mL无菌去离子水作为对照。将其分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价。实验重复3次。
结果如表6所示，六组处理中，黄瓜藤根部中的各株噬菌体在辅助渗透剂终浓度为12％和15％时均具有较高效价。结合生产成本等综合因素，噬菌体辅助渗透剂浸入处理黄瓜藤根部的最佳工作浓度为12％(该浓度由辅助渗透剂与噬菌体的体积比计算而得v/v)。
表6不同浓度噬菌体辅助渗透剂处理黄瓜藤根部中的噬菌体效价
Figure GDA0003593494170000281
实验例8噬菌体辅助渗透剂浓度对噬菌体渗入柑橘叶片效果的影响
分别取由实施例3～实施例7和实施例9制备的噬菌体GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各5份。分别向其中加入终浓度分别为5％、12％、15％、20％和25％(与噬菌体的体积比v/v)的噬菌体辅助渗透剂(实施例2制得)并混合均匀，使得溶液总体积为500mL且效价为8.2x104 PFU/mL；同时取500mL无菌去离子水作为对照。取上述液体各3mL，将其分别均匀喷洒于直径约为5cm的柑橘叶片表面，于室温下静置2h后，测定各处理中柑橘叶片内噬菌体效价。实验重复3次。
结果如表7所示，六组处理中，柑橘树叶中的噬菌体在辅助渗透剂终浓度为12％和15％时均具有较高效价。结合生产成本等综合因素，噬菌体辅助渗透剂浸入处理柑橘树叶的最佳工作浓度为12％(v/v)。
表7不同浓度噬菌体辅助渗透剂处理柑橘树叶中的噬菌体效价
Figure GDA0003593494170000291
实验例9存放条件对噬菌体辅助渗透剂作用效果的影响
将噬菌体辅助渗透剂(实施例2制得)分别置于4℃、25℃及37℃，每6个月取出，直至18个月。将其分别与由实施例3～实施例7和实施例9制备的效价为8.2x104 PFU/mL的噬菌体GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液混匀，使辅助渗透剂终浓度为12％(与噬菌体的体积比v/v)。上述溶液各制备8份，每份500mL。取上述液体各3mL，将其分别均匀喷洒于直径约5cm的柑橘叶片表面，于室温下静置2h后，测定各处理中柑橘叶片内噬菌体效价，实验重复3次，此处作为柑橘叶片处理I。将其分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价，实验重复3次，此处作为黄瓜藤根部处理I。
分别取由实施例8和实施例10制得的效价为8.2x104 PFU/mL的具有辅助渗透剂的噬菌体GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各8份，每份500mL。取上述液体各3mL，将其分别均匀喷洒于直径约5cm的柑橘叶片表面，于室温下静置2h后，测定各处理中柑橘叶片内噬菌体效价，实验重复3次，此处作为柑橘叶片对照I。将其分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价，实验重复3次，此处作为黄瓜藤根部对照I。对照I中所采用辅助渗透剂为新鲜配制的辅助渗透剂。
分别取由实施例3～实施例7和实施例9制备的效价为8.2x104 PFU/mL的噬菌体GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各8份，每份440mL，向其中分别加入60mL无菌去离子水并混合均匀。取上述液体各3mL，将其分别均匀喷洒于直径约5cm的柑橘叶片表面，于室温下静置2h后，测定各处理中柑橘叶片内噬菌体效价，实验重复3次，此处作为柑橘叶片对照II。将其分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价，实验重复3次，此处作为黄瓜藤根部对照II。
取8份3mL无菌去离子水，将其分别均匀喷洒于直径约5cm的柑橘叶片表面，于室温下静置2h后，测定各处理中柑橘叶片内噬菌体效价，实验重复3次，此处作为柑橘叶片对照III。
取8份500mL无菌去离子水，将其分别对黄瓜藤进行灌根。灌根处理3h后，取黄瓜藤根部的样本，以双层平板法测定样本中噬菌体效价，实验重复3次，此处作为黄瓜藤根部对照III。
噬菌体辅助渗透剂长期置于4℃下对渗透效果的影响如表8-1～表8-3所示：噬菌体辅助渗透剂于4℃下存放18个月后其辅助渗透效果与新配置的渗透剂的效果相近，柑橘叶片及黄瓜藤根部内噬菌体效价均接近噬菌体喷洒液效价。
噬菌体辅助渗透剂长期置于25℃下对渗透效果的影响如表8-4～表8-6所示：噬菌体辅助渗透剂于25℃下存放12个月后其辅助渗透效果与新配置的渗透剂的效果(对照I)相近，柑橘叶片及黄瓜藤根部内噬菌体效价均接近噬菌体喷洒液效价；存放18个月后其辅助渗透效果减弱，柑橘叶片及黄瓜藤根部内噬菌体效价与噬菌体喷洒液效价数量级相同，但其辅助渗透效果仍远优于纯噬菌体溶液渗透效果(对照II)。
噬菌体辅助渗透剂长期置于37℃下对渗透效果的影响如表8-7～表8-9所示：噬菌体辅助渗透剂于37℃下存放6个月后其辅助渗透效果与新配置的渗透剂的效果(对照I)相近，柑橘叶片及黄瓜藤根部内噬菌体效价接近噬菌体喷洒液效价；存放12个月后其辅助渗透效果减弱；存放18个月柑橘叶片及黄瓜藤根部内噬菌体效价方与噬菌体喷洒液效价数量级相同，但其辅助渗透效果仍远优于纯噬菌体溶液渗透效果(对照II)。
上述试验结果说明噬菌体辅助渗透剂在4℃下具有良好的稳定性，可存放18个月其辅助渗透效果不受影响；噬菌体辅助渗透剂在25℃与37℃下的稳定存放时间则分别为12个月与6个月。噬菌体辅助渗透制剂易于保存，可置于多种环境中，一次配制后多次使用，应用便捷。
表8-1不同噬菌体处理渗透后柑橘叶片及黄瓜藤根部内噬菌体效价(PFU/mL)
Figure GDA0003593494170000311
表8-2不同噬菌体处理浸入后块茎内柑橘叶内噬菌体效价(PFU/mL)
Figure GDA0003593494170000321
表8-3不同噬菌体处理浸入后柑橘叶内噬菌体效价(PFU/mL)
Figure GDA0003593494170000331
表8-4不同噬菌体处理渗透后柑橘叶片内噬菌体效价(PFU/mL)
Figure GDA0003593494170000341
表8-5不同噬菌体处理浸入后柑橘叶内噬菌体效价(PFU/mL)
Figure GDA0003593494170000351
表8-6不同噬菌体处理浸入后柑橘叶内噬菌体效价(PFU/mL)
Figure GDA0003593494170000361
表8-7不同噬菌体处理浸入后柑橘叶内噬菌体效价(PFU/mL)
Figure GDA0003593494170000371
表8-8不同噬菌体处理浸入后柑橘叶内噬菌体效价(PFU/mL)
Figure GDA0003593494170000381
表8-9不同噬菌体处理浸入后柑橘叶内噬菌体效价(PFU/mL)
Figure GDA0003593494170000391
上述实验例结果说明噬菌体辅助渗透制剂在不同温度下均具有良好的长期稳定性(＞6m)，易于保存。同时噬菌体辅助渗透制剂可持续有效地帮助噬菌体附着于藤本和木本植物体内，进而维持藤本和木本植物体内噬菌体的有效浓度。
本发明的辅助渗透剂可显著加速噬菌体进入藤本和木本植物体内的速度，同时显著增加单位时间内进入藤本和木本植物体内的噬菌体数量。
本发明不仅极大节约了研究人员处理样本的时间，而且可以减少藤本和木本植物因长时间浸入对其质量造成的影响，从而有助于预防藤本和木本植物的外来细菌性病害。
本申请的辅助渗透剂适用对象除上述黄瓜或柑橘外，还适用于其它藤本或木本植物，此处不应受到限制。
上述实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种适合噬菌体浸入藤本和木本植物用的辅助渗透剂，其特征在于，所述辅助渗透剂包括：
用于茄科雷尔氏菌噬菌体的辅助渗透剂，包括以下剂量的组分：以重量百分含量计，
山梨醇酐月桂酸酯：0.4%；
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯：0.4%；
曲拉通：1.4%；
脂肪醇聚氧乙烯醚：2.3%；
琥珀酸二辛酯磺酸钠：1.5%；
噻酮：2.5%；
硬脂酸钙：2.2%；
甘露醇：7%；
余量为去离子水；
或用于地毯草黄单胞菌噬菌体的辅助渗透剂，包括以下剂量的组分：以重量百分含量计，
山梨醇酐月桂酸酯：0.35%；
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯：0.3%；
曲拉通：1.4%；
脂肪醇聚氧乙烯醚：2.3%；
琥珀酸二辛酯磺酸钠：1.5%；
噻酮：2.5%；
硬脂酸钙：2.2%；
甘露醇：7%；
余量为去离子水；
或用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体的辅助渗透剂，包括以下剂量的组分：以重量百分含量计，
山梨醇酐月桂酸酯：0.3%；
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯：0.3%；
曲拉通：1.4%；
脂肪醇聚氧乙烯醚：2.3%；
琥珀酸二辛酯磺酸钠：1.5%；
噻酮：3%；
硬脂酸钙：2.2%；
甘露醇：8%；
余量为去离子水；
或用于噬菌体组合物的辅助渗透剂，包括以下剂量的组分：以重量百分含量计，
山梨醇酐月桂酸酯：0.35%；
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯：0.3%；
曲拉通：1.4%；
脂肪醇聚氧乙烯醚：2.3%；
琥珀酸二辛酯磺酸钠：1.5%；
噻酮：2.5%；
硬脂酸钙：2.2%；
甘露醇：7%；
余量为去离子水；
所述茄科雷尔氏菌噬菌体为GP1 (Ralstonia solanacearum phage GP1)、保藏编号为CCTCC NO:M 2016633，或GP2(Ralstonia solanacearum phage GP2)、保藏编号为CCTCCNO:M 2016634，或茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)、保藏编号为CCTCC NO： M 2016635；
所述地毯草黄单胞菌噬菌体为地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodisphage YHC5)，保藏编号为 CCTCC NO:M 2018579；
所述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体为PSA-P1 (Pseud omonas syringae pv.Actinidiae phage PSA-P1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020252；
所述噬菌体组合物为以上五种噬菌体的混合物，它们按体积比1:1:1:1:1 配制而成。
2.权利要求1所述的辅助渗透剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将山梨醇酐月桂酸酯0%~0.4%、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯0%~0.4%、曲拉通0.8~1.6%、脂肪醇聚氧乙烯醚2~2.4%和琥珀酸二辛酯磺酸钠1~2.6%加入到1/2重量的水中，升温溶解，磁力搅拌均匀后备用；
（2）将噻酮1~3%、硬脂酸钙1.2~2.4%和甘露醇4~8%加入到1/2重量的水中，常温溶解，磁力搅拌均匀后备用；
（3）将步骤（1）的混合液加入到步骤（2）得到的溶液中混合，磁力搅拌均匀；
（4）将步骤（3）中所得混合溶液，121℃灭菌20min，4℃储存备用，即得到噬菌体辅助渗透剂。
3.根据权利要求2所述的辅助渗透剂的制备方法，其特征在于，用于茄科雷尔氏菌噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：称取山梨醇酐月桂酸酯4g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯4g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮25g，硬脂酸钙22g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000 mL；121℃条件下灭菌20min，即得到噬菌体辅助渗透剂；
或用于地毯草黄单胞菌噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：称取山梨醇酐月桂酸酯3.5g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯3g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮25g，硬脂酸钙22g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000 mL；121℃条件下灭菌20min，即得到噬菌体辅助渗透剂；
或用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：称取山梨醇酐月桂酸酯3g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯3g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮30g，硬脂酸钙22g、甘露醇80g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000 mL；121℃条件下灭菌20min，即得到噬菌体辅助渗透剂；
或用于噬菌体组合物的辅助渗透剂的制备方法如下：称取山梨醇酐月桂酸酯3.5g、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯3g、曲拉通14g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠15g、噻酮25g，硬脂酸钙22g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000 mL；121℃条件下灭菌20min，即得到噬菌体辅助渗透剂。
4.权利要求1所述的辅助渗透剂的应用方法，其特征在于，将所述辅助渗透剂以终浓度为12%混合于噬菌体溶液中，搅拌均匀；
所述噬菌体为茄科雷尔氏菌噬菌体GP1、GP2、GP3、地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5或丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1中的一种或噬菌体组合物；
所述茄科雷尔氏菌噬菌体为GP1 (Ralstonia solanacearum phage GP1)、保藏编号为CCTCC NO:M 2016633，或GP2(Ralstonia solanacearum phage GP2)、保藏编号为CCTCCNO:M 2016634，或茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)、保藏编号为CCTCC NO： M 2016635；
所述地毯草黄单胞菌噬菌体为地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodisphage YHC5)，保藏编号为 CCTCC NO:M 2018579；
所述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体为PSA-P1 (Pseud omonas syringae pv.Actinidiae phage PSA-P1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020252；
所述噬菌体组合物为以上五种噬菌体的混合物，它们按体积比1:1:1:1:1 配制而成。
5.根据权利要求4所述的辅助渗透剂的应用方法，其特征在于，在无菌条件下，将辅助渗透剂加入所述噬菌体溶液中，按1:9体积比混合均匀，得到具有辅助渗透剂的噬菌体制剂。
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