CN113039290A - 用于癌症治疗的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明总地涉及用于确定癌症受试者是否可能响应癌症治疗的生物标志物。本发明因此涉及用于确定受试者是否可能响应癌症治疗的方法、试剂盒和组合物，并涉及基于癌症受试者可能响应癌症治疗的确定的治疗方法。本发明还涉及使癌症受试者对癌症治疗敏感的方法。

Description

用于癌症治疗的生物标志物
领域
本发明总地涉及可用于确定患有癌症的受试者是否可能响应癌症治疗的生物标志物。因此，本发明涉及用于确定受试者是否可能响应癌症治疗的方法、试剂盒和组合物，并且涉及基于患有癌症的受试者可能响应癌症治疗的确定的治疗方法。本发明还涉及使患有癌症的受试者对癌症疗法敏感的方法。
相关申请
本申请要求于2018年9月6日提交的发明名称为“用于癌症治疗的生物标志物”的澳大利亚临时申请No.2018903318的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
背景
癌症疗法随时间流逝已有显著发展，从一般性的放射疗法和化学疗法到最近的靶向疗法和免疫疗法。在这些较新的癌症疗法中，最令人兴奋和最有希望的一类是被称为免疫检查点抑制剂的分子组。迄今为止是抗体的免疫检查点抑制剂阻断免疫检查点分子之间的特异性相互作用，从而导致免疫***下调的逆转，而在肿瘤环境中这些相互作用通常具有免疫***下调。免疫检查点抑制剂，阻断细胞毒性T细胞上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)与抗原呈递细胞(APC)上的簇分化80(CD80)/簇分化86(CD86)之间的相互作用，或细胞毒性T细胞上的程序化细胞死亡-1(PD-1)和APC上的程序化死亡配体1(PD-L1)之间的相互作用，重新激活抗肿瘤免疫反应，从而改善了各种类型癌症患者的生存结局。然而，尽管免疫检查点抑制剂已在某些患者中显示出显著的疗效，但仍有相当一部分患者没有响应这些昂贵的治疗方法。因此，仍然需要改进的方法来确定哪些患者可能响应使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗，从而优化对那些患者的治疗并减少其他病人暴露于可能会产生有害的副作用的不必要治疗。还需要使受试者对这些疗法敏感的方法，以提高受试者对疗法的响应程度，和/或增加响应疗法的受试者的数量。
概述
本发明是部分基于以下确定：MAP1LC3B基因的表达产物是响应癌症疗法并且特别是使用免疫检查点抑制剂的疗法的可靠指标。因此，本发明人确定MAP1LC3B是癌症受试者将响应使用免疫检查点抑制剂的治疗的可能性增加或降低的可靠生物标志物。本发明人还确定了EHMT2的表达产物也指示对治疗的响应，因此可以被包括在本文所教导的诊断和预后测定中。基于这些确定，提出了MAP1LC3B表达产物的浓度、水平或丰度，任选结合EHMT2表达产物的浓度、水平或丰度，指示罹患癌症的受试者响应癌症治疗的能力，并且具有用于确定受试者是否可能响应癌症治疗，且特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗的效用。因此，MAP1LC3B，任选结合EHMT2，具有作为生物标记物将受试者分层或分类为可能是响应者的那些(即可能对癌症治疗表现出阳性响应)和可能是非响应者的那些(即可能对癌症治疗无响应或阴性响应)的效用。此外，如本文所教导的，被分类为响应者的那些受试者可以进一步被分类为完全或部分响应者。基于本文提供的实验发现，本发明人还提供了用于使罹患癌症的受试者对癌症治疗，且特别是使用疫检查点抑制剂的治疗敏感的方法，以及用于治疗罹患癌症的受试者的方法。
因此，在一个方面中，本发明提供了用于确定指标的方法，所述指标用于评估罹患癌症的受试者响应癌症治疗的可能性，所述方法包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：(1)测量受试者样品中至少一种癌症治疗生物标志物的生物标志物值，所述癌症治疗生物标志物是MAP1LC3B的表达产物；和(2)使用所述生物标志物值确定指标，其中所述指标至少部分指示响应癌症治疗的可能性；其中所述癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
在一些实施方案中，MAP1LC3B的表达产物是多核苷酸，并且MAP1LC3B的生物标志物值指示样品中多核苷酸的丰度或浓度。在这样的实施方案中，多核苷酸表达产物可以包含与SEQ ID NO:1中所示序列具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列。在其他实施方案中，MAP1LC3B的表达产物是多肽，并且MAP1LC3B的生物标志物值指示样品中多肽的丰度或浓度。在这样的实施方案中，多肽表达产物可以包含与SEQ ID NO:2中所示序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况中，MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度而言增加了，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阳性响应(例如，完全或部分响应)；
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与与癌症治疗的阳性响应(例如，完全或部分响应)相关的丰度或浓度大致相同，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阳性响应(例如，完全或部分响应)；
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度大致相同，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阴性响应；或MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应(例如，完全或部分响应)相关的丰度或浓度而言降低了，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阴性响应。
在本发明方法的更多实施方案中，至少一种癌症治疗生物标志物之一是EHMT2的表达产物。例如，EHMT2的表达产物可以是多核苷酸，并且EHMT2的生物标志物值指示样品中多核苷酸的丰度或浓度。在这样的实例中，多核苷酸表达产物可以包含与SEQ ID NO:3、5、7、9和11中所示序列具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列。在其他实例中，EHMT2的表达产物是多肽，并且EHMT2的生物标志物值指示样品中多肽的丰度或浓度。在这样的实例中，多肽表达产物可以包含与SEQ ID NO:4、6、8、10和12中所示序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，通过测量EHMT1表达产物的丰度或浓度来确定EHMT2表达产物的生物标志物值。
在这些方法的特定实施方案中，EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应(例如，完全或部分响应)相关的丰度或浓度而言增加了，则由此确定指标是至少部分指示对治疗的阴性响应；EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度大致相同，则由此确定指标是至少部分指示对治疗的阴性响应；EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度而言降低了，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阳性响应(例如，完全或部分响应)；或EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度大致相同，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阳性响应(例如，完全或部分响应)。在一个特定的实例中，MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应(例如，完全或部分响应)相关的丰度或浓度而言降低了；EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度而言增加了；则由此确定指标至少部分指示对治疗的阴性响应。
在本发明方法的特定实例中，指标源自MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度的比例。在一些实例中，所述比例相对于与治疗的阴性响应相关的比例更高，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阳性响应；所述比例与与治疗的阳性响应相关的比例大致相同，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阳性响应；所述比例相对于与治疗的阳性响应相关的比例更低，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阴性响应；或所述比例与与治疗的阴性响应相关的比例大致相同，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阴性响应。
在更多实例中，对治疗的阳性响应是对治疗的完全或部分响应。例如，在一些实施方案中，所述比例相对于与治疗的部分响应相关的比例更高，则由此确定指标至少部分指示对癌症治疗的完全响应；所述比例与与治疗的完全响应相关的比例大致相同，则由此确定指标至少部分指示对癌症治疗的完全响应；所述比例相对于与治疗的完全响应相关的比例更低，则由此确定指标至少部分指示对治疗的部分响应；所述比例与与治疗的部分响应相关的比例大致相同，则由此确定指标至少部分指示对治疗的部分响应；所述比例相对于与治疗的部分响应相关的比例更低，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阴性响应；或所述比例与与治疗的阴性响应相关的比例大致相同，则由此确定指标至少部分指示对治疗的阴性响应。
在更多实施方案中，至少一种癌症治疗生物标志物包括LDH、BRAF和NRAS。可以通过测量血清LDH的丰度或浓度来测定血清LDH的生物标志物值。BRAF和NRAS的生物标志物值是BRAF/NRAS突变状态，其中通过检测BRAF和NRAS中存在或不存在突变来确定BRAF/NRAS突变状态，由此检测到BRAF和NRAS中的一个或多个突变是阳性BRAF/NRAS突变状态，而未检测到BRAF和NRAS中的突变是阳性BRAF/NRAS突变状态。
在一个实例中，MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平增加了；血清LDH的丰度或浓度与健康受试者的相同；BRAF/NRAS突变状态是阴性或阳性；则由此将指标确定为至少部分指示对治疗的完全响应；或MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平增加了；血清LDH的丰度或浓度相对于健康受试者的增加了；BRAF/NRAS突变状态是阴性；则由此将指标确定为至少部分指示对治疗的完全响应。
在另一个实例中，MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平降低了；血清LDH的丰度或浓度与健康受试者的相关；BRAF/NRAS突变状态是阴性；则由此将指标确定为至少部分指示对治疗的部分响应。
在另一个实例中，MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平增加了；血清LDH的丰度或浓度相对于健康受试者的增加了；BRAF/NRAS突变状态是阳性；则由此将指标确定为至少部分指示对治疗的阴性响应；MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于健康受试者的降低了；血清LDH的丰度或浓度相对于健康受试者的增加了；BRAF/NRAS突变状态是阴性或阳性；则由此将指标确定为至少部分指示对治疗的阴性响应；或MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平降低了；血清LDH的丰度或浓度与健康受试者的相关；BRAF/NRAS突变状态是阳性；则由此将指标确定为至少部分指示对治疗的阴性响应。
在本发明的方法中，可以使用核酸扩增技术、测序平台、阵列和杂交平台、显微镜检查、流式细胞术、免疫测定、质谱或其组合来测量生物标志物值。在一个实例中，使用定量RT-PCR测量生物标志物值。此外，样品可以包括癌症或肿瘤细胞。
本发明的再一个方面提供了用于治疗受试者癌症的方法，所述方法包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：进行以上和本文描述的方法，用于确定评估罹患癌症的受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标；并基于指标至少部分指示对癌症治疗是阳性响应，使受试者暴露于癌症治疗；其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
还提供了用于使罹患癌症的受试者对癌症治疗敏感的方法，所述方法包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：进行以上和本文所述的方法，用于确定评估罹患癌症的受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标；基于指标至少部分指示对癌症治疗是阴性响应，将EHMT2或EHMT1抑制剂施用于受试者；其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。EHMT2抑制剂可以选自小分子(例如，A-366、BIX01294、BRD4770、CM-272、E72、UNC0224、UNC0321、UNC0638、UNC0642、UNC0646和verticillin A)、特异性的抗体或其抗原结合部分、适体和核酸分子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使受试者暴露于癌症治疗。
在本发明方法的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自CTLA-4抑制剂(例如，伊匹单抗(ipilimumab)或曲美木单抗(tremelimumab))、PD-1抑制剂(例如，派姆单抗(pembrolizumab)、pidilizumab、纳武单抗(nivolumab)、REGN2810、CT-001、AMP-224、BMS-936558、MK-3475、MEDI0680和PDR001)和PD-L1抑制剂(例如，阿特珠单抗(atezolizumab)、杜鲁伐单抗(durvalumab)、奥维单抗(avelumab)、BMS-936559和MEDI4736)或其组合。
在用于治疗癌症的方法或用于使罹患癌症的受试者对癌症治疗敏感的方法的特定实例中，所述癌症治疗包括另外的化疗剂和/或放疗。
对罹患癌症的受试者进行本发明的方法。在特定实施方案中，癌症是实体肿瘤。在其他实施方案中，癌症是血液肿瘤。
还提供了用于确定评估罹患癌症的受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的组合物，所述组合物或固体支持物包括以下物质、由以下物质组成或基本上由以下物质组成：MAP1LC3B转录物或其cDNA和至少一个与MAP1LC3B转录物或其cDNA杂交的寡核苷酸引物或探针，以及EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA和至少一个与EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA杂交的寡核苷酸引物或探针，其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。cDNA可以对应于源自细胞或细胞群(例如，是肿瘤细胞或肿瘤细胞群)的mRNA。
在再一个方面中，提供了用于确定在评估罹患癌症的受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的固体支持物，所述固体支持物包括以下物质、由以下物质组成或基本上由以下物质组成：固定于固体支持物的至少一个第一寡核苷酸引物或探针，其中至少一个第一寡核苷酸引物或探针与MAP1LC3B转录物或cDNA杂交；和固定于固体支持物的至少一个第二寡核苷酸引物或探针，其中至少一个第二寡核苷酸引物或探针与EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA杂交，其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。在一个实施方案中，支持物进一步包括与至少一个第一寡核苷酸引物或探针杂交的MAP1LC3B转录物或其cDNA；与至少一个第二寡核苷酸引物或探针杂交的EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA。cDNA可以对应于源自细胞或细胞群(例如，是肿瘤细胞或肿瘤细胞群)的mRNA。
在本发明的另一个方面中，提供了用于确定评估罹患癌症的受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的组合物，所述组合物包括以下物质、由以下物质组成或基本上由以下物质组成：肿瘤细胞、结合MAP1LC3B的多肽表达产物的检测剂和结合EHMT2或EHMT1的多肽表达产物的检测剂，其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。在一些实例中，检测剂是抗体或其抗原结合片段。
还提供了用于确定评估罹患癌症的受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的试剂盒，所述试剂盒包括以下物质、由以下物质组成或基本上由以下物质组成：(a)至少一种可以定量生物样品中的MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的试剂；和任选(b)至少一种试剂的使用说明；其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括至少一种可以定量生物样品中的EHMT2或EHMT1的多核苷酸或多肽表达产物的试剂。
附图简述
图1显示了来自八个测试的黑素瘤细胞系以及正常黑素细胞(Norm)的EHMT2(G9a)的免疫印迹分析的图像。将微管蛋白用作上样对照。
图2是用介质(DMSO)或5μM UNC0642处理48小时的黑素瘤细胞系的细胞活力的图示。通过针对正常黑素细胞的MTT测定测量了细胞活力。
图3表示用介质(DMSO)或5μM UNC0642处理48小时的四种黑素瘤细胞系(D05(BRAF突变体)、C006(NRAS突变体)、C008(NF1突变体)和C092(三重野生型))的研究结果。(A)使用IncuCyte ZOOM延时成像分析评估的细胞相对增殖的图示。(B)来自D05和C008的H3K9me2的免疫印迹分析图像，总H3用作上样对照。
图4表示使用shG9a或非沉默对照(shNS)评估G9a被敲减后D05细胞系的细胞增殖和活力的研究结果。(A)通过IncuCyte ZOOM成像分析的细胞增殖。(B)通过MTT测定评估的细胞活力。数据表示为平均±SEM，通过未配对的t检验来确定显著性比较，并如下表示：*P<0.05，**P<0.01，(所有实验进行两次，每个实验3至6个重复组)。
图5显示了来自各种黑素瘤细胞系以及正常黑素细胞的LC3B I/II和ATG5的免疫印迹分析图像。将微管蛋白水平用作上样对照。
图6显示了来自用介质(-)或5μM UNC0642处理的黑素瘤细胞系的LC3B I/II的免疫印迹分析图像。将微管蛋白被用作上样对照。
图7显示了来自表达shNS(-)和shG9a(+)的D05和C092黑素瘤细胞系的G9a和LC3BI/II的免疫印迹分析图像。将微管蛋白水平用作上样对照。
图8是通过定量RT-PCR评估的用UNC0642处理24小时的四种黑素瘤细胞系中MAP1LC3B的表达水平的图示。结果表示为与介质对照(DMSO)相比的倍数变化。
图9表示用UNC0642(5μM，24h)处理的D05细胞中MAP1LC3B启动子(左图)或MAP1LC3B启动子的5kb上游(右图)上的H3K9me2，Pol II的染色质免疫沉淀分析的结果。*P<0.05，**P<0.01，n＝3。
图10表示评估G9a抑制剂对小鼠肿瘤的作用的研究结果。在第0天，向各组SCID小鼠(n＝6-9)皮下注射D20黑素瘤细胞(2×106)。荷瘤小鼠每两天通过腹膜内接受介质(DMSO)或5mg/kg UNC0642治疗。(A)使用数字卡尺测量了肿瘤生长，并将肿瘤体积表示为平均±SEM。肿瘤体积的统计学差异通过未配对的t检验确定(*P<0.05)。(B)终点的肿瘤重量表示为平均±SEM。(C)使用qRT-PCR测定的用介质或UNC0642处理的小鼠中提取的肿瘤的MAP1LC3B基因表达。将数据显示为平均±SEM。通过未配对的t检验来确定统计学差异，**P<0.01。(D)从小鼠切除的D20异种移植物中MAP1LC3B蛋白表达的免疫组织化学分析。将染色的肿瘤切片细分为染色的肿瘤切片的5个非重叠区域，分析其阳性染色像素的数量，并使用Aperio ImageScope软件对每单位面积(μm2)进行定量。结果概括为条形图，并显示为平均±SEM。通过未配对的t检验来确定统计学差异，*P<0.01，n＝5。
图11表示TCGA黑素瘤RNA-seq数据集中EHMT2和MAP1LC3B表达的分析结果。(A)TCGA黑素瘤患者队列(n＝473)中EHMT2(G9a)和MAP1LC3B mRNA的共表达(z-score)。通过GraphPad Prism生成Pearson相关系数(Pearson r)和P值(两尾)。根据患者的EHMT2和MAP1LC3B mRNA表达将他们分组。EHMT2高/MAP1LC3B低(EHMT2hi/MAP1LC3Blo)，EHMT2高/MAP1LC3B高(EHMT2hi/MAP1LC3Bhi)，EHMT2lo/MAP1LC3Bhi和EHMT2lo/MAP1LC3Blo。(B)具有四种不同的EHMT2和MAP1LC3B表达模式的黑素瘤患者的总体生存。报告了每组中的对数秩P值和患者人数。(C)具有EHMT2和MAP1LC3B四种不同表达模式的黑素瘤患者的无复发生存。报告了每组的对数秩P值和患者人数。(D)比较四个EHMT2/MAP1LC3B表达组的BRAF、NRAS、NF1和Triple wt突变状态。使用卡方检验(GraphPad Prism)。
图12显示了黑素瘤患者中的G9a和/或LC3B表达。(A)转移性黑素瘤患者的治疗前肿瘤活检样品采集的图解，用于MAP1LC3B转录本分析。(B)使用肿瘤MAP1LC3B转录本水平的转移性黑素瘤患者的生存曲线。显示了两个患者组(MAP1LC3B高(灰色)和MAP1LC3B低(黑色))的生存情况。(C)代表来自两个患者组(治疗前)的EHMT2和MAP1LC3B的相对基因表达的图。(D)来自转移性黑素瘤患者的用于TMA处理和IHC分析的治疗前肿瘤活检样品图。(E)响应者和非响应者的TMA切片中LC3B染色的数量和平均强度的图示。P＜0.05。
图13显示了LC3B的接收者操作特征(Receiver Operator Characteristic,ROC)曲线，作为用免疫疗法治疗的黑素瘤患者结局的预测器。针对我们的队列中所有可用的终点，使用
Figure BDA0003052083820000111
(版本12.7)构建了ROC曲线，包括生存(死亡vs.存活)、响应(初始SD/PD vs.CR/PR)、进展(新生的或获得性PD vs.静息)，以及获得性抵抗(获得性PD vs.静息)。终点分析显示为(A)，LC3阳性细胞百分比(％LC3B+细胞)或(B)，绝对LC3B染色强度(LC3B表达)。
图14显示了根据(A)LC3B阳性细胞百分比(％LC3B+细胞)或(B)绝对LC3B染色强度(LC3B表达)对患者进行分类。分类基于ROC曲线的截留值，以定义低(黑色)或高(灰色)组。KM图显示了总体生存、响应(CR或PR)、进展(新生的或响应后)和获得性抵抗(初始响应后的PD)。每个图显示了使用GraphPad Prism的对数秩(Mantel-Cox)检验的危险比和P值。患者总数＝40；16例患者具有LC3B+细胞百分比>18.5％，和15例患者具有LC3B染色强度>753.31(绝对单位)。
图15显示了来自黑素瘤患者的CTC中的G9a和LC3B表达。(A)来自转移性黑素瘤患者的治疗后液体活检样品采集的图解，用于CTC G9a和LC3B蛋白分析。(B)CTC中LC3B与G9a的总荧光强度比例的图示。****P<0.0001。
图16显示了用于黑素瘤细胞死亡诱导的G9a抑制剂介导的MAP1LC3B重新表达的模型，以及G9a和MAP1LC3B作为患者选择和免疫检查点抑制剂(ICI)治疗响应标记物的实用性。(A)G9a抑制剂通过减少组蛋白H3K9甲基化诱导MAP1LC3B表达，从而调节自噬并带来对ICI治疗的更好响应。(B)G9a和MAP1LC3B水平可以将黑素瘤患者分为不同的预后组。低G9a和高LC3B的黑素瘤患者应当响应标准ICI治疗，但是，固有地抵抗标准免疫检查点抑制剂治疗的高G9a和低LC3B的患者，可以用G9a抑制剂治疗，而带来的G9a活性降低和MAP1LC3B表达增加，将使这些患者对标准免疫检查点抑制剂治疗敏感。
图17显示了不同分类的黑素瘤患者的结局。(A)按LC3B阳性细胞百分比和BRAF/NRAS突变状态分类的患者的结局。(B)按LC3B阳性细胞百分比和LDH状态分类的患者的结局。(C)将患者分为1-3组。(D)分为1-3组的患者的结局。
图18表示来自AT3肿瘤的免疫效应细胞的分析，该免疫效应细胞每2天暴露于25mg/kg的介质或UNC0642，共14天。然后通过FACs分析肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和NK细胞。(A)CD4+T细胞的频率(％)。(B)CD8+PD-1+T细胞和CD8+PDL-1+T细胞的频率(％)。(C)CD4+CD39+T细胞和CD8+CD39+T细胞的频率(％)。(D)CD4+CD73+T细胞和CD8+CD73+T细胞的频率(％)。(E)每毫克组织的NK细胞数。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
详述
1.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用于指代该冠词语法对象的一个或多个(即，至少一个)。举例来说，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
如本文使用的，术语“丰度”、“水平”和“含量”在本文可互换使用，是指定量的含量(例如重量或摩尔)、半定量的含量、相对含量(例如，等级内的重量％或摩尔％)、浓度等。因此，这些术语涵盖样品中癌症治疗生物标志物的绝对或相对含量或浓度。
如本文使用的，“和/或”是指并且包括一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及在备选方案(或)中解释时缺少组合。
术语“抗体”及其语法等同物是指能够特异性结合靶抗原的蛋白质，并且包括对抗原具有特异性结合亲和力的任何物质或物质组，合适地排除其他物质。该术语包括免疫球蛋白分子，其能够通过至少一个可变区内所含的抗原结合位点特异性结合靶抗原。该术语包括四链抗体(例如，两条轻链和两条重链)、重组或修饰的抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体、灵长类化抗体、去免疫的抗体、半抗体、双特异性抗体)和单域抗体，如域抗体和仅有重链的抗体(例如，骆驼科动物抗体或软骨鱼免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR))。抗体通常包含恒定结构域，其可以排列成恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。在特定实施方案中，抗体包括四链结构作为其基础单元。全长抗体包括共价连接的两条重链(≈50-70kDa)和两条轻链(各自≈23kDa)。轻链通常包括可变区和恒定结构域，并且在哺乳动物中，是κ轻链或λ轻链。重链通常包括可变区和一个或两个恒定结构域，其通过铰链区连接其他恒定结构域。哺乳动物的重链是以下类型之一：α、δ、ε、γ或μ。每条轻链也共价连接重链之一。例如，两条重链以及重链和轻链通过链间二硫键和通过非共价相互作用保持在一起。链间二硫键的数量在不同类型的抗体间可以改变。每条链具有N-末端可变区(VH或VL，其中各自≈110个氨基酸长)以及C-末端的一个或多个恒定结构域。轻链的恒定区(CL，其是≈110个氨基酸长)与重链的第一恒定结构域(CH，其是≈330-440个氨基酸长)对齐且二硫键连接。轻链可变区与重链可变区对齐。抗体重链可以包含两个或更多个额外的CH结构域(如，CH2，CH3等)，并且可以包含可以在CH1和Cm恒定结构域之间鉴定的铰链区。抗体可以是任何类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。在一实例中，抗体是鼠(小鼠或大鼠)抗体或灵长类(合适地人)抗体。术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括变体、包含具有抗原结合位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、灵长类抗体、去免疫的抗体或单板(veneered)抗体。术语“抗体”的范围还包括抗原结合片段，其保留对抗原的特异性结合亲和力，合适地排除其他物质。该术语尤其包括Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、单链抗体(SCA或SCAB)。“Fab片段”由抗体分子的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体分子来产生，以产生由完整的轻链和一部分重链组成的片段。抗体分子的“Fab’片段”可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子，接着还原来获得，以产生由完整轻链和一部分重链组成的分子。以这种方式处理每个抗体分离获得两个Fab’片段。抗体的“F(ab’)2片段”由两个二硫键连接一起的两个Fab’片段的二聚体组成，并通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子来获得，没有随后的还原。F(ab’)2片段。“Fv片段”是含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的遗传工程化片段。“单链抗体”(SCA)是含有通过合适的柔性多肽接头连接的轻链可变区和重链可变区的遗传工程化单链分子。
如本文使用的，“大致”、“约”或“大约”通常将表示给定值或范围的20％，优选10％，且更优选5％内。本文给出的数值数量是近似值，表示如果没有明确指出，可以推断为术语“大致”、“约”或“大约”。
术语“生物标志物”宽泛地是指存在于或源自样品的任何可检测化合物，如蛋白质、肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂质、核酸(例如DNA，诸如cDNA或扩增的DNA，或RNA，诸如mRNA)、有机或无机化学物质、天然或合成的聚合物、小分子(例如，代谢物)或上述任何物质的区分分子或区分片段。如这段内容中使用的“源自”是指检测时指示存在于样品中的特定分子的化合物。例如，特定cDNA的检测可以指示样品中特定RNA转录物的存在。作为另一个实例，特定抗体的检测或与特定抗体的结合可以指示样品中特定抗原(例如，蛋白质)的存在。在此，区分分子或片段是检测时指示以上鉴定的化合物的存在或丰度的分子或片段。生物标志物例如可以分离自样品、直接在样品中测量，或在样品中检测或测定。生物标志物可以例如是功能性的、部分功能性的或非功能性的。在特定实施方案中，“生物标志物”包括“癌症治疗生物标志物”，以下将更详细地描述。
术语“生物标志物值”是指针对受试者的至少一种相应的生物标志物测量或推导的值，并且其通常至少部分指示取自受试者的样品中的生物标志物的丰度或浓度。因此，生物标志物值可以是测量的生物标志物值，其是针对受试者测量的生物标志物值，或可替换地可以是推导的生物标志物值，其是推导自一个或多个测量的生物标志物值的值，例如，通过将函数应用于一个或多个测量的生物标志物值推导的。生物标志物值可以是任何合适的形式，这取决于其中确定值的方式。例如，可以使用高通量技术，诸如测序平台、阵列和杂交平台、质谱、免疫测定、免疫荧光、流式细胞术或这些技术的任意组合来确定生物标志物值。在一个优选的实例中，生物标志物值涉及表达产物或其他可测量分子的丰度或活性水平，使用如定量RT-PCR、测序等技术来定量。在这种情况中，如本领域技术人员已知的并且如以下将更详细描述的，生物标志物值可以是扩增含量或循环次数的形式，其是样品内生物标志物浓度的对数表示。在其他优选实例中，使用含有表达产物的细胞的免疫荧光来定量生物标志物值。
术语“生物标志物谱”是指一个或多个一种或多种类型的生物标志物(例如，mRNA分子、cDNA分子和/或蛋白质等)，或其指示，与特征一起，如生物标志物的可测量的方面(例如，生物标志物值)。生物标志物谱可以包括单个生物标志物，其水平、丰度或含量与病症或临床状况(例如，响应或未响应癌症治疗)相关。或者，生物标志物谱可以包括至少两种这样的生物标志物或其指示，其中生物标志物可以是相同或不同类别的，诸如，例如，核酸和多肽。因此，生物标志物谱可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多种生物标志物或其指示。生物标志物谱可以进一步包括一个或多个对照或内标。在某些实施方案中，生物标志物谱包括至少一种生物标志物，或其指示，其作为内标。如本文使用的术语“指示”在这段内容中仅指其中生物标志物谱含有针对生物标志物的符号、数据、缩写或其他相似标记的情况，而不是生物标志物分子实体本身。术语“生物标志物谱”在本文中还用于指生物标志物值或至少两个生物标志物值的组合，其中单独的生物标志物值对应于可以从一个或多个受试者测量或推导的生物标志物值，其组合是病症或临床状况或病症或临床状况预后特征性的(例如，响应或未响应癌症治疗)。术语“谱生物标志物”用于指已经鉴定的生物标志物的子集，所述子集用于可以用于进行临床评估的生物标志物谱中，如归入或排除特定病症或临床状况。谱生物标志物的数量可以改变，但通常为10或更少的数量级。在一个实例中，生物标志物谱包括选自MAP1LC3B的表达产物、EHMT2的表达产物、血清LDH和BRAF/NRAS突变状态的生物标志物的谱。示例性谱因此包括MAP1LC3B表达产物和EHMT2表达产物的谱，以及MAP1LC3B表达产物、血清LDH和BRAF/NRAS突变状态的谱。
术语“BRAF/NRAS突变状态”是指受试者关于他们是否带有BRAF和NRAS基因的一个或多个突变的状态，如影响基因产物活性(例如，将基因产物的任一种活性降低或增加至少或约20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多)并且与癌症(例如黑色素瘤)相关的一个或多个突变。阴性BRAF/NRAS突变状态表示BRAF或NRAS基因中不存在突变。相反，阳性BRAF/NRAS突变状态表示BRAF和/或NRAS基因中存在至少一个突变。影响基因产物活性的示例性突变包括并且已经与癌症相关的包括，但不限于，BRAF中的G7S，H57Y，F294L，S365L，G464E，S465Y，G466E，G469E，L496V，A497V，N581S，N581Y，L584S，D594G，L597S，A598A，V600E，V600K，V600R，K601E，V624F和T740A，以及NRAS中的G12S，G12D，G12A，G13R，G13V，A59D，Q61K，Q61R，Q61L，Q61V，Q61H和A146T。在一些实例中，只评估了BRAF的V600处的突变，并且只评估了NRAS的G12、G13和Q61处的突变。
在整个说明书中，除非内容另外需要，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将理解为表示包括所述的步骤或元素或步骤或元素的组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素的组。因此，术语“包含”等的使用表示所列元素是需要的或强制的，但其他元素是任选的并且可以存在或可以不存在。“由……组成”表示包括并限于短语“由……组成”后面的内容。因此，短语“由……组成”表示所列的元素是需要的或强制的，并且不存在其他元素。“基本上由……组成”表示包括短语后所列的任何元素，并且限于不干扰或促进本公开针对所列元素指定的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列元素是需要的或强制的，但其他元素是任选的并且根据它们是否影响所列元素的活性或作用可以存在或可以不存在。
短语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对原则仅有一些核酸的碱基是匹配的。或，在核酸之间存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。
术语“相关”是指确定一种类型的数据与另一种类型或与病症或临床状况之间的关系(例如，响应或未响应癌症治疗)。
如本文使用的，关于血清LDH水平、丰度或浓度的短语“与健康个体的相关”表示测试样品(例如，来自癌症患者的血清或血液样品)中检测的水平、丰度或浓度与认为是相同年龄的健康个体的正常水平或范围大约相同或在相同范围中。相反，关于血清LDH水平或丰度的短语“相对于健康个体的增加了”表示测试样品(例如，来自癌症患者的血清或血液样品)中检测的水平、丰度或浓度与认为是相同年龄的健康个体的正常水平相比增加了(例如，增加至少或约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％或更多)。常规地针对肝病、心脏病和肺或肾脏肿瘤的诊断和治疗评估血清LDH。通常，在评估LDH活性的酶测定中评估LDH水平。例如，所述测定可以涉及LDH催化L-乳酸氧化成丙酮酸，同时β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)还原成β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原形式)(NADH)。检测固定时间间隔中在340nm处的吸光值的变化速率，其中吸光值的变化速率与样品中LD活性成正比。如所知的，可以使用一组或一群给定年龄或年龄范围的健康受试者来确定任何给定年龄或年龄范围的健康个体的正常血清LDH水平或范围。示例性正常范围包括：0-5岁：140-304IU/L；5-10岁：142-290IU/L；10-15岁：115-257IU/L；>15岁：93-198IU/L。
如本文使用的，术语“诊断(diagnosis)”、“诊断(diagnosing)”等在本文可互换使用，以涵盖确定受试者将发展或具有病症或临床状况的可能性(例如，响应或未响应癌症治疗)。这些术语还涵盖，例如，确定临床状况的水平(例如，响应癌症治疗的水平)，以及在合理治疗的情况下，其中诊断指导治疗，包括治疗的初始选择、治疗的改变(例如，调整剂量或给药方案)等。“可能性”表示基于给定的数学模型对具有特定测量或推导的生物标志物值的受试者实际上是否具有病症或临床状况的度量。例如，增加的可能性可以是相对的或绝对的，并且可以定性或定量地表达。例如，可以基于先前的人群研究，简单地通过确定受试者针对一种或多种癌症治疗生物标志物的测量或推导的生物标志物值并将受试者置于“增加的可能性”类别中，来确定可能性的增加。术语“可能性”在本文中也与术语“概率”互换使用。
如本文使用的，术语“基因”是指编码具有功能的多肽或RNA链的核酸链。尽管该基因的外显子区域才是转录以形成mRNA的，但术语“基因”还包括控制外显子区域表达的调节区，如启动子和增强子。
如本文使用的，术语“指标”是指结果或结果的表示，包括技术人员可以据其以估计和/或确定患有癌症的受试者是否会响应癌症治疗的可能性的任何信息、数字、比率、信号、符号、标记或注释。在本发明的情况下，“指标”可以任选地与其他临床特征一起使用，以确定受试者可能或不可能响应癌症治疗。“确定”这样的指标并不意味着该指标是100％准确的。熟练的临床医生可以将指标与其他临床标记一起使用以得出结论。
术语“固定的”表示将目标分子物质适当地通过共价键固定在固相支持物上。取决于分子物质的分子性质，可以通过不同的方式来实现该共价键。此外，分子物质还可以通过静电力、疏水性或亲水性相互作用或范德华力而固定在固体支持物上。上述物理化学相互作用通常发生在分子之间的相互作用中。在特定的实施方案中，所需要的只是在打算使用支持物的条件下，例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中或在抗体结合测定中，将分子(例如，核酸或多肽)保持固定或附着在支持物上。例如，固定寡核苷酸或引物，使得3'端可用于酶促延伸和/或序列的至少一部分能够与互补序列杂交。在一些实施方案中，固定化可以通过与表面附着的引物杂交而发生，在这种情况下，固定的引物或寡核苷酸可以处于3'-5'方向。在其他实施方案中，固定化可以通过碱基配对杂交以外的方式发生，如共价连接。
如本文使用的，术语“标记”及其语法等同物是指可用于提供可检测和/或可量化信号的任何原子或分子。特别地，标记可以直接或间接地附着于核酸或蛋白质。可以附着的合适标记包括但不限于放射性同位素、荧光团、猝灭剂、生色团、质量标记、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记、发出化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。标记可以包括与酶反应时能够产生视觉上可检测信号的原子或分子。在一些实施方案中，标记是“直接”标记，其能够在不添加辅助试剂的情况下自发产生可检测信号，并且可以通过视觉手段检测而无需借助仪器。例如，胶体金颗粒可以用作标记。许多标记是本领域技术人员众所周知的。在特定的实施方案中，标记不是天然存在的核苷。术语“标记”还指已经经由化学操作人工添加、连接或附着到分子上的试剂。
生物标志物的“水平”、“丰度”或“含量”是样品中可检测的水平或含量。这些可以通过本领域技术人员已知的以及还在本文中公开的方法来测量。这些术语包括定量的含量或水平(例如，重量或摩尔)、半定量的含量或水平、相对含量或水平(例如，等级内的重量％或摩尔％)、浓度等。因此，这些术语包括样品中生物标志物的绝对或相对含量或水平。评估的生物标志物的表达水平或含量可以用于确定对治疗的响应。在其中生物标志物的水平相对于参照或对照“降低了”的特定实施方案中，降低的水平可以是指与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织相比，生物标志物(例如，蛋白质或核酸(例如，基因或mRNA))水平至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的整体降低，通过标准的本领域已知的方法来检测，如本文描述的那些方法。在某些实施方案中，降低的水平是指样品中生物标志物的水平/含量的降低，其中降低为至少约0.9×，0.8×，0.7×，0.6×，0.5×，0.4×，0.3×，0.2×，0.1×，0.05×或0.01×参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中相应生物标志物的水平/含量。在其中生物标志物的水平与参照或对照“大约相同”的某些实施方案中，通过标准的领域已知方法诸如本文描述的那些来检测，与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中的生物标志物(例如，蛋白质或核酸(例如，mRNA或cDNA))的水平相比，生物标志物的水平相差低于约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％或甚至更低。
如本文使用的术语“核酸”或“多核苷酸“包括RNA、mRNA、miRNA、cRNA、cDNA、mtDNA或DNA。该术语通常是指至少10个碱基长的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种类型的核甘酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA或RNA。
“获得的”表示拥有。由此获得的样品包括例如从特定来源分离或产生的核酸提取物或多肽提取物。例如，提取物可以直接从受试者的生物流体或组织分离。
术语“MAP1LC3B表达”(或“LC3B表达”)和“EHMT2表达”(或“G9a表达”)分别是指MAP1LC3B(LC3B)和EHMT2(G9a)的转录和/或翻译和/或活性。有几种方法可以用于测定表达水平，如以下详细描述的。
如本文使用的，术语“阳性响应”表示治疗方案的结果包括一定的临床上显著的益处，如症状的严重程度的阻止或降低，或病症进展的减缓。例如，肿瘤大小或肿瘤负荷的减小，或肿瘤生长或扩散(即，转移)的速率减缓，可以表示阳性响应。相反，术语“阴性响应”或“无响应”表示治疗方案没有提供或提供了最小的临床上显著的益处，如症状的严重程度的阻止或降低，或提高了病症的进展速率。在一些情况中，使用实体肿瘤的响应评价标准(RECIST)来评估对治疗的阳性或阴性响应(Eisenhauer等，(2009)Eur J Cancer.45:228-47；和http://www.irrecist.com/recist/)。阳性响应可以包括“部分响应”或“完全响应”，如由RECIST 1.1定义的，同时阴性响应可以等同于“稳定的疾病”。
“引物”是指与DNA链配对时能够在合适的聚合剂存在下引发引物延伸产物合成的寡核苷酸。引物优选是单链的，以实现最大的扩增效率，但也可以是双链的。引物必须足够长，以在聚合剂存在下引发延伸产物的合成。引物的长度取决于许多因素，包括应用、待使用的温度、模板反应条件、其他试剂和引物来源。例如，根据靶序列的复杂性，引物可以为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500到引物3’端比模板序列短一个碱基的长度，以允许核酸链的延伸，尽管引物的5'端可以在长度上延伸超过模板序列的3'端。在某些实施方案中，引物可以是大的多核苷酸，如约35个核苷酸至几千个碱基或更多。可以选择引物，以与模板上被设计成与其杂交的并且用作合成起始位点的序列“基本上互补”。“基本上互补”表示引物足够互补以与靶多核苷酸杂交。理想地，引物不含与设计成与其杂交的模板的错配，但这不是必需的。例如，非互补核苷酸残基可以连接至引物的5'端，而引物序列的其余部分与模板互补。或者，可以将非互补核苷酸残基或一段非互补核苷酸残基链散布在引物中，只要该引物序列与模板序列具有足够的互补性以与其杂交，从而形成用于合成引物延伸产品的模板。
如本文使用的，术语“探针”是指结合另一个分子的特定序列或子序列或其他部分的分子。除非另外指出，否则术语“探针”通常是指通过互补碱基配对结合另一个核酸(在本文也称为“靶多核苷酸”)的核酸探针。探针可以结合缺少与探针的完整序列互补性的靶多核苷酸，这取决于杂交条件的严格性。探针可以直接或间接标记并且包括它们范围内的引物。
“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用，用来指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。
如本文使用的术语“预后”是指对临床病症或疾病的可能进程和结果的预测。通常通过评估指示疾病的有利或不利进程或结果(例如，响应治疗)的因素或症状来进行预后。本领域技术人员将理解，术语“预后”是指发生某种病程或结果的可能性增加；即，与那些没有呈现病症的那些个体相比，呈现出给定病症的受试者中更可能出现病程或结果。
如本文使用的术语“样品”包括可以来自受试者的提取的、未处理的、处理的、稀释的或浓缩的任何生物样本。样品可以包括，不限于，生物液体，如全血、血清、红细胞、白细胞、血浆、唾液、尿液、粪便(即，屎)、泪液、汗液、皮质、***抽吸物、导管灌洗物、肿瘤渗出液、滑膜液、腹水、腹膜液、羊水、脑脊髓液、淋巴液、细针抽吸液、羊水、任何其他体液、细胞裂解物、细胞分泌产物、炎症液、***和***分泌物。样品可以包括组织样品和活检，组织匀浆，等等。有利的样品可以包括包含可检测量的如本文教导的任何一种或多种生物标志物的样品。合适地，样品可以通过最小入侵方法容易地获得，使得从受试者取出或分离样品。在某些实施方案中，样品含有血液，尤其是外周血，或其级分或提取物。在特定实施方案中，样品包含癌细胞或肿瘤细胞。
如本文使用的术语“固体支持物”是指分子物质(如核酸和多肽)可以固定于其的固体惰性表面或主体。固体支持物的非限制性实例包括玻璃表面、塑料表面、乳胶、葡聚糖、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面和硅片。在一些实施方案中，固体支持物是以膜、芯片或粒子的形式。在一些实施方案中，固体支持物可以是玻璃表面(例如，流通池通道的平面)。在一些实施方案中，固体支持物可以包括已经“官能化的”惰性表面或基质，如通过施用包含反应基团的中间体材料的层或涂层来官能化，所述反应基团允许与分子(如多核苷酸)共价连接。例如，这样的支持物可以包括惰性表面(如玻璃)上支持的聚丙烯酰胺水凝胶。分子(例如，多核苷酸)可以直接共价连接中间体材料(例如，水凝胶)，但中间体材料可以自身是非共价连接基底或基质(例如，玻璃基质)。支持物可以包括多个颗粒或珠子，各自具有不同的附着分子物质。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，是指动物受试者，特别是脊椎动物受试者，并且甚至更特别是哺乳动物受试者。落入本发明范围内的合适的脊椎动物包括，但不限于，脊索动物门(Chordata)，脊椎动物亚门的任何成员，包括灵长类、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、兔形目(例如，兔子、野兔)、牛类(例如，黄牛)、羊类(例如，绵羊)、山羊类(例如，山羊)、猪类(例如，猪)、马类(例如，马)、犬类(例如，狗)、猫类(例如，猫)、禽类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟类诸如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸鱼)、爬行类(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼类。优选的受试者是灵长类(例如，人、猿、猴、黑猩猩)。受试者合适地患有癌症。
如本文使用的，术语“治疗方案”或“疗法”是指预防性和/或治疗性(即，特定病症发作后)治疗，除非文中特意表明是其他含义。该术语包括天然物质和药剂(即，“药物”)以及任何其他治疗方案，包括但不限于膳食治疗、物理治疗或锻炼方案、手术干预及其组合。
将认识到本文使用的术语以及相关的定义仅是用于解释的目的，而并非旨在限制。
2.癌症治疗生物标志物及其用途
本发明涉及用于评估罹患癌症的受试者响应癌症治疗(并且特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗)的可能性的方法、组合物、固体支持物和试剂盒。因此，所述方法、组合物、装置和试剂盒可以用于将受试者分成可能响应癌症治疗的那些和不可能响应癌症治疗的那些。
2.1癌症治疗生物标志物
本发明已经确定了某些生物标志物(癌症治疗生物标志物)的水平或丰度指示癌症受试者响应癌症治疗的可能性，并且特别是使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗。本文呈现的结果提供了明显的证据：独特的生物相关的生物标志物谱预测了受试者是否可能响应癌症治疗。本发明的方法、组合物、支持物和试剂盒因此可用于给癌症受试者提供更好的治疗干预的信息。在这点上，提出了本文公开的基于这些生物标志物的方法、组合物、支持物和试剂盒可以用于床边即时(point-of-care)诊断，允许快速且廉价地确定癌症受试者响应治疗的可能性，这使得节约了相当大的医疗***成本，因为癌症受试者可以暴露于可能有效的治疗剂。此外，并且如本文更详细描述的，本发明的发明人已经鉴定出可以用于提高癌症受试者响应癌症治疗的可能性的干预，由此提高给定的癌症受试者的治疗功效，和/或扩大响应治疗的受试者的比例。
本发明公开的癌症治疗生物标志物包括MAP1LC3B，且更特别地是MAP1LC3B的表达产物。MAP1LC3B基因编码微管相关蛋白1轻链3β(MAP1LC3B)，一种涉及自噬途径的蛋白质，并且在本文和本领域中也被简称为LC3B。人MAP1LC3B基因的表达获得SEQ ID NO:1中所示的转录物(表示为cDNA)和SEQ ID NO:2中所示的MAP1LC3B蛋白。
如本文所证明的，MAP1LC3B可以用作癌症治疗生物标志物，以预测受试者是否可能响应癌症治疗，并且特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗。MAP1LC3B的表达产物，包括多核苷酸(例如，mRNA)和MAP1LC3B的多肽表达产物，与受试者对癌症治疗的响应性有关，并且可以进行评估，以预测受试者是否可能响应或不响应癌症治疗，并且特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗。因此，在特定的实施方案中，MAP1LC3B生物标志物可以单独使用或结合一种或多种其他癌症治疗生物标志物，用于确定用于评估受试者响应癌症治疗的可能性的指标。
本发明还已经确定了其他癌症治疗生物标志物结合MAP1LC3B生物标志物使用时具有强诊断性能。在一个实例中，已经确定了EHMT2可以结合MAP1LC3B用于确定用于评估受试者响应癌症治疗的可能性的指标。
EHMT2编码常染色质组蛋白-赖氨酸甲基转移酶2(EHMT2)，在本文中也称为G9a。人EHMT2基因的表达可产生具有SEQ ID NO：3、5、7、9和11中任一个所示序列(表示为cDNA)的转录物和SEQ ID NO：4、6、8、10和12中任一个所示的EHMT2蛋白。EHMT2是可以将组蛋白H3赖氨酸9(H3K9)甲基化从未修饰状态变为二甲基化状态(H3K9me2)的一大类酶。H3K9的二甲基化与基因抑制相关，并被用作表观遗传沉默基因的标记。在许多类型的人类癌症中已观察到EHMT2表达水平升高，并且已显示出EHMT2的敲减抑制癌细胞系的增殖。如本文所证明的，EHMT2通过组蛋白甲基化直接调节肿瘤细胞中的MAP1LC3B，从而抑制该基因的表达。抑制EHMT2可逆转这种抑制并增加自噬作用(参见以下实施例)。
值得注意的是，与MAP1LC3B结合使用时，EHMT2可以用作癌症治疗生物标志物，以预测受试者是否可能响应癌症治疗，且特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗。如本文所教导的，MAP1LC3B和EHMT2两者的表达产物均与受试者对癌症治疗的响应性相关，并且可以被评估以预测受试者是否可能响应癌症治疗，特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗。
在另一个实例中，已经确定了血清乳酸脱氢酶(LDH)可以结合MAP1LC3B和BRAF/NRAS突变状态使用，用于确定用于评估受试者响应癌症治疗的可能性的指标。
LDH是已确立的、独立的黑素瘤存活预后因子(Agarwala等，2009，Eur J Cancer45:1807-1814；Weide等，2012，Br J Cancer 107:422-428；Kelderman等，2014，CancerImmunol Immunother 63:449-458)并且是美国联合委员会关于IV级黑素瘤癌症分类的一部分(Balch等，2009，J Clin Oncol 27:6199-6206)。相似地，BRAF和NRAS中的突变与各种癌症相关也是已知的(参见，例如，Carlino等，2014,Br J Cancer 111(2):292-9；Heppt等，2017,BMC Cancer 17(1):536)。已经与癌症相关的示例性突变包括，但不限于，BRAF中的G7S、H57Y、F294L、S365L、G464E、S465Y、G466E、G469E、L496V、A497V、N581S、N581Y、L584S、D594G、L597S、A598A、V600E、V600K、V600R、K601E、V624F和T740A，以及G12S、G12D、G12A、G13R、G13V、A59D、Q61K、Q61R、Q61L、Q61V、Q61H、A146T(Garman等，2017，Cell Reports 21,1936-1952；Heppt等，2017,BMC Cancer.17:536)。
因此，本文公开了特定的基因表达产物和突变状态作为癌症治疗生物标志物，提供了一种用于确定受试者是否可能响应癌症治疗的方式。通过分析癌症受试者中的或来自癌症受试者的样品中的水平和/或存在来评价这些癌症治疗生物标志物，提供针对每种生物标志物的测量的或推导的生物标志物值，用于确定可以用于评估受试者响应癌症治疗的可能性的指标。
癌症治疗生物标志物的评估可以是直接的(例如，通过直接测量MAP1LC3B或EHMT2的表达产物的水平、含量或活性；血清LDH的水平、含量或活性，或BRAF和NRAS基因中突变的存在)，或可以是间接的。例如，EHMT1(常染色质组蛋白-赖氨酸甲基转移酶1；也称为GLP)是由EHMT1基因编码的组蛋白甲基转移酶。EHMT1基因表达具有SEQ ID NO：25所示序列(以cDNA表示)的转录物和SEQ ID NO：26中所示的EHMT1蛋白。EHMT1和EHMT2以化学计量比1：1的比例组装成异二聚复合物，且一起作用以催化H3K9二甲基化(参见例如Tachibana等(2005)Genes Dev，19：815-26)。因此，EHMT1可以用作EHMT2的替代品，从而可以通过评估EHMT1的表达产物的水平或活性来间接评估EHMT2的水平或活性，因为已知EHMT1和EHMT2作为异二聚体(以1：1比率)，以通过组蛋白甲基化调节肿瘤细胞中的MAP1LC3B。
2.2样品制备
通常，在癌症治疗生物标志物检测或定量前，对癌症受试者的样品进行处理。例如，在分析前可以从样品提取、分离和/或纯化核酸和/或蛋白质。各种DNA、mRNA和/或蛋白质提取技术是本领域技术人员公知的。所述处理可以包括离心、超速离心、乙醇沉淀、过滤、分馏、重悬、稀释、浓缩等。在一些实施方案中，所述方法和***提供了原始样品(例如，生物液体，如血液、血清等)的分析(例如，RNA或蛋白质生物标志物的定量)，而没有处理或使用了有限的处理。在一些实例中，分离完整的细胞或组织切片并分析癌症治疗生物标志物表达，如使用免疫组织化学(IHC)或流式细胞术来分析。
方法可以包括以下步骤：将样品在合适的缓冲液中匀浆，去除污染物和/或测定抑制剂，添加癌症治疗生物标志物捕获试剂(例如与寡核苷酸连接的磁珠，所述寡核苷酸与靶癌症治疗生物标记物互补)，在促进靶生物标记物与捕获试剂缔合(例如通过杂交)的条件下孵育以产生靶生物标记物：捕获试剂复合物，在目标生物标记物释放条件下孵育靶标生物标记物：捕获复合物。在一些实施方案中，通过向溶液中添加多种癌症治疗生物标志物捕获试剂(例如，所需生物标志物特异性的)，多种癌症治疗生物标志物在每一轮分离中得到分离。例如，可以将多种癌症治疗生物标志物捕获试剂(每种包含不同靶癌症治疗生物标志物特异性的寡核苷酸)添加到样品中，用于分离多种癌症治疗生物标志物。预期该方法涵盖多个实验设计，其在捕获步骤的数目和在每个捕获步骤中捕获的靶癌症治疗生物标志物的数目两者均有变化。在一些实施方案中，捕获试剂优选是(例如，特异性地和选择性地)与试图分离、纯化、检测和/或定量的特定生物标志物相互作用的分子、部分、物质或组合物。对特定癌症治疗生物标志物具有期望的结合亲和力和/或特异性的任何捕获试剂都可以用于本技术中。
例如，捕获试剂可以是大分子，如肽、蛋白质(例如，结合癌症治疗生物标志物的抗体或其他配体)、寡核苷酸、核酸(例如，能偶与癌症治疗生物标志物杂交的核酸)、寡糖、碳水化合物、脂质或小分子，或其复合物。作为说明性且非限制性的实例，亲和素靶标捕获试剂可用于分离和纯化包含生物素部分的靶标，抗体可用于分离和纯化包含适当的抗原或表位的靶标，和寡核苷酸可用于分离和纯化互补多核苷酸。
能够结合或特异性地结合靶癌症治疗生物标志物的任何核酸，包括单链和双链核酸，可以用作捕获试剂。这样的核酸的实例包括DNA、RNA、适体、肽核酸和其他糖修饰、磷酸盐或核苷碱基。因此，存在许多用于捕获靶标的策略，而且相应的许多类型的捕获试剂也是本领域技术人员已知的。
此外，癌症治疗生物标志物捕获试剂可以包括用以定位、浓缩、聚集捕获试剂等的功能性，并且因此提供了一种捕获(例如，结合、杂交等)捕获试剂(例如，形成靶:捕获试剂复合物时)分离和纯化靶癌症治疗生物标志物的方式。例如，在一些实施方案中，将与癌症治疗生物标志物(例如，寡核苷酸)相互作用的捕获试剂的一部分连接到允许通过使用者以宏观规模操作的固体支持物(例如，珠子、表面、树脂、柱子等)上。通常，固体支持物允许使用机械方式从异质溶液中分离和纯化靶:捕获试剂复合物。例如，结合珠子时，可以通过从异质溶液中取出珠子来实现分离，例如，通过物理运动来分离。在其中珠子是磁性或顺磁性的实施方案中，使用磁场来实现捕获试剂(并且因此靶癌症治疗生物标志物)与异质溶液的物理分离。
可以使用任何合适的技术来定量或检测癌症治疗生物标志物。在特定的实施方案中，使用测定单独的癌症治疗生物标志物的水平、丰度或含量的试剂来定量癌症治疗生物标志物，作为分离的生物标志物或作为在细胞中或在细胞上表达的来测量。这种类型的非限制性实例包括用于基于核酸和基于蛋白质的测定中的试剂。
在特定的实例中，评估BRAF/NRAS突变状态时，分离样品的基因组DNA并接受测序(例如，如本领域技术人员公知的，下一代测序、焦磷酸测序、Sanger测序等)。
2.3生物标志物核酸的评价
在一些实施方案中，通过测定生物标志物核酸转录物水平来评估生物标志物。在说明性的基于核酸的测定中，根据标准方法(Sambrook等，1989，上文；和Ausubel等，1994，上文)从生物样品中所含的细胞分离核酸。核酸通常是分级后的(例如，多A+RNA)或全细胞RNA。在一些实施方案中，通过模板依赖性核酸扩增技术来扩增核酸。多种模板依赖性方法可用于扩增给定模板样品中存在的癌症治疗生物标志物序列。示例性核酸扩增技术是聚合酶链式反应(称为PCR)，其详细描述于美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159，Ausubel等(上文)和Innis等(“PCR Protocols”,Academic Press,Inc.,San DiegoCalif.,1990)。简而言之，在PCR中，制备与生物标志物序列的相对互补链上的区域互补的两个引物序列。将过量的脱氧核糖核苷酸三磷酸与DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)一起加入反应混合物中。如果样品中存在相关的癌症治疗生物标志物序列，则引物将结合生物标志物，且聚合酶将通过在核苷酸上添加核苷酸使引物沿着生物标志物序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物将与生物标志物解离以形成反应产物，过量的引物将与生物标志物和反应产物结合，并重复该过程。为了定量扩增的mRNA的量，可以进行逆转录酶PCR扩增程序。将RNA逆转录为cDNA的方法是众所周知的，并描述于Sambrook等，1989，上文。逆转录的替代方法利用了热稳定的、RNA依赖性的DNA聚合酶。这些方法描述于WO 90/07641中。聚合酶链式反应方法是本领域公知的。在其中使用全细胞RNA的特定实施方案中，使用全细胞RNA作为样品的cDNA合成产生全细胞cDNA。
在某些有利的实施方案中，模板依赖性扩增涉及实时的转录物定量。例如，可以使用实时PCR技术来定量RNA或DNA(Higuchi，1992等，Biotechnology 10:413-417)。通过确定完成相同数目的循环并在其线性范围内的PCR反应中靶DNA扩增产物的浓度，可以确定原始DNA混合物中特定靶序列的相对浓度。如果DNA混合物是从不同组织或细胞分离的RNA合成的cDNA，则可以针对各个组织或细胞确定衍生该靶序列的特定mRNA的相对丰度。这种PCR产物的浓度与相对mRNA丰度之间的直接比例关系仅在PCR反应的线性范围内正确。曲线平台部分中靶DNA的最终浓度取决于反应混合物中试剂的可用性，并且与靶DNA的原始浓度无关。在特定的实施方案中，采用了多重串联PCR(MT-PCR)，其使用两步法从少量RNA或DNA进行基因表达谱分析，例如在美国专利申请公开No.20070190540中描述的。第一步，将RNA转化为cDNA，并使用多重基因特异性引物扩增。第二步，通过实时PCR对每个单独的基因进行定量。实时PCR通常使用本领域可用的任何PCR仪器进行。通常，用于实时PCR数据收集和分析的仪器包括热循环仪，用于荧光激发和发射收集的光学器件，和任选的计算机和数据采集与分析软件。
在RT-PCR测定的一些实施方案中，将
Figure BDA0003052083820000321
探针用于定量核酸。这样的测定可以使用能量转移(“ET”)，如荧光共振能量转移(“FRET”)，以检测和定量合成的PCR产物。通常，
Figure BDA0003052083820000322
探针包含与一端(例如，5’端)偶联的荧光标记(例如，荧光染料)，并且淬灭分子与另一端(例如，3’端)偶联，使得荧光标记和淬灭剂接近，使得淬灭剂通过FRET遏制染料的荧光信号。聚合酶复制与荧光标记探针结合的嵌合扩增子模板时，聚合酶的5'核酸酶裂解探针，将荧光标记和淬灭剂解偶联，从而检测到标记信号(例如荧光)。信号(如荧光)随着每个PCR循环的增加与裂解的探针量成正比。
Figure BDA0003052083820000323
探针通常包含连续核苷酸的区域，其具有相同地存在于或互补于癌症治疗生物标志物多核苷酸的区域的序列，使得探针可与所得到的PCR扩增子特异性杂交。在一些实施方案中，探针包含至少6个连续核苷酸的区域，其具有完全互补于或相同地存在于靶癌症治疗生物标志物多核苷酸的区域的序列，如包含至少8个连续核苷酸的区域，至少10个连续的核苷酸，至少12个连续的核苷酸，至少14个连续的核苷酸或至少16个连续的核苷酸，其具有互补于或相同地存在于待检测和/或定量的靶癌症治疗生物标志物多核苷酸的区域的序列。
除了
Figure BDA0003052083820000324
测定，可用于检测本文介绍的方法中的PCR产物的其他实时PCR化学方法包括但不限于分子信标(Molecular Beacon)、Scorpion探针和嵌入染料，如SYBR Green、EvaGreen、噻唑橙、YO-PRO、TO-PRO等。例如，分子信标，与
Figure BDA0003052083820000325
探针一样，使用FRET通过具有荧光标记(例如，荧光染料)的探针和连接在探针末端的淬灭剂来检测和定量PCR产物。但是，与
Figure BDA0003052083820000326
探针不同，Molecular Beacons在PCR循环中保持完整。Molecular Beacons探针在溶液中游离时会形成茎环结构，从而使荧光标记和淬灭剂足够靠近，以引起荧光淬灭。Molecular Beacons与靶标杂交时，茎环结构被消除，从而使荧光标记和猝灭剂在空间上分离，并且荧光标记发出荧光。Molecular Beacons可获自例如Gene LinkTM(参见，www.genelink.com/newsite/products/mbintro.asp)。
在一些实施方案中，Scorpion探针可以用作序列特异性引物以及用于PCR产物检测和定量。与Molecular Beacons一样，Scorpion探针不与靶核酸杂交时形成茎-环结构。然而，与Molecular Beacons不同，Scorpion探针同时实现序列特异性启动和PCR产物检测。荧光标记(例如，荧光染料分子)连接Scorpion探针的5’-端，而淬灭剂连接3’-端。探针的3’部分通过不可扩增的部分连接探针的5’-端。Scorpion引物延伸后，探针的靶特异性序列结合其在延伸的扩增子内的补体，因此打开茎-环结构并使得5’-端上的荧光标记发出荧光并产生信号。Scorpion探针可获自例如Premier Biosoft International(参见，www.premierbiosoft.com/tech_notes/Scorpion.html)。
在一些实施方案中，可以用于FRET探针上的标记包括比色和荧光染料，如AlexaFluor染料，BODIPY染料，如BODIPY FL；Cascade Blue；Cascade Yellow；香豆素及其衍生物，如7-氨基-4-甲基香豆素，氨基香豆素和羟基香豆素；花青染料，如Cy3和Cy5；曙红和赤藓红素；荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素；镧系离子的大环螯合物，如Quantum DyeTM；滨海蓝；俄勒冈绿色；罗丹明染料，罗丹明红，四甲基罗丹明和罗丹明6G；德州红；荧光能量转移染料，如噻唑橙-乙啶异二聚体；以及，TOTAB。
染料的特定实例包括，但不限于，以上和以下鉴定的那些：Alexa Fluor 350，Alexa Fluor 405，Alexa Fluor 430，Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 500，Alexa Fluor514，Alexa Fluor 532，Alexa Fluor 546，Alexa Fluor 555，Alexa Fluor 568，AlexaFluor 594，Alexa Fluor 610，Alexa Fluor 633，Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 660，Alexa Fluor 680，Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750；胺-反应性BODIPY染料，如BODIPY493/503，BODIPY 530/550，BODIPY 558/568，BODIPY 564/570，BODIPY 576/589，BODIPY581/591，BODIPY 630/650，BODIPY 650/655，BODIPY FL BODIPY R6G，BODIPY TMR和BODIPY-TR；Cy3，Cy5，6-FAM，异硫氰酸荧光素，HEX，6-JOE，Oregon Green 488，OregonGreen 500，Oregon Green 514，Pacific Blue，REG，罗丹明绿，罗丹明红，Renographin，ROX，SYPRO，TAMRA，2',4',5',7'-四溴砜荧光素和TET。
染料/淬灭剂对(即，供体/受体对)的实例包括，但不限于，荧光素/四甲基罗丹明；IAEDANS/荧光素；EDANS/达贝基(dabcyl)；荧光素/荧光素；BODIPY FL/BODIPY FL；荧光素/QSY 7或QSY 9染料。在一些实施方案中，供体和受体相同时，可以通过荧光去极化来检测FRET。染料/猝灭剂对(即供体/受体对)的某些特定实例包括，但不限于，Alexa Fluor 350/Alexa Fluor488；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor555；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 594；AlexaFluor 488/Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 555/Alexa Fluor594；Alexa Fluor 555/Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 568/Alexa Fluor 647；AlexaFluor 594/Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 350/QSY35；Alexa Fluor 350/达贝基(dabcyl)；Alexa Fluor 488/QSY 35；Alexa Fluor 488/达贝基(dabcyl)；Alexa Fluor488/QSY 7或QSY 9；Alexa Fluor 555/QSY 7或QSY9；Alexa Fluor 568/QSY 7或QSY 9；Alexa Fluor 568/QSY 21；Alexa Fluor 594/QSY 21；在一些实施方案中，相同的淬灭剂可用于多种染料，例如，广谱淬灭剂，如
Figure BDA0003052083820000341
淬灭剂(Integrated DNATechnologies，Coralville，Iowa)或Black Hole QuencherTM(BHQTM；Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo.)。
在一些实施方案中，例如，在其中同时检测两个或多个部分(如扩增子)的多重反应中，每个探针包含检测上不同的染料，使得在同一反应中同时检测时可以区分染料。本领域技术人员可以选择一组检测上不同的染料，以用于多重反应中。在一些实施方案中，在单个多重反应中检测和/或定量多个靶癌症治疗生物标志物多核苷酸。在一些实施方案中，靶向不同癌症治疗生物标志物多核苷酸的每个探针从探针释放时通过光谱可区分。因此，通过独特的荧光信号来检测每个靶癌症治疗生物标志物多核苷酸。
用于本文描述的方法的一些实施方案中的实时PCR探针的制备中有用的荧光标记核糖核苷酸的特定实例可获自Molecular Probes(Invitrogen)，并且这些包括AlexaFluor 488-5-UTP，Fluorescein-12-UTP，BODIPY FL-14-UTP，BODIPY TMR-14-UTP，四甲基罗丹明-6-UTP，Alexa Fluor 546-14-UTP，Texas Red-5-UTP和BODIPY TR-14-UTP。其他荧光核糖核苷酸可获自Amersham Biosciences(GE Healthcare)，如Cy3-UTP和Cy5-UTP。
用于本文描述的方法中的实时PCR探针的制备中有用的荧光标记的脱氧核糖核苷酸的实例包括二硝基苯基(DNP)-1'-dUTP，Cascade Blue 7-dUTP，Alexa Fluor 488-5-dUTP，荧光素-12-dUTP，Oregon Geen 488-5-dUTP，BODIPY FL-14-dUTP，若丹明绿5-dUTP，Alexa Fluor 532-5-dUTP，BODIPY TMR-14-dUTP，四甲基罗丹明6-dUTP，Alexa Fluor 546-14-dUTP，Alexa Fluor 568-5-dUTP，Texas Red 12-dUTP，Texas Red -5-dUTP，BODIPY TR-14-dUTP，Alexa Fluor 594-5-dUTP，BODIPY 630/650-14-dUTP，BODIPY 650/665-14-dUTP；Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP，Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP，Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP，Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTP。荧光标记的核苷酸是可商购的并且可以从例如Invitrogen购买。
在某些实施方案中，使用印迹技术来定量靶核酸，这是本领域技术人员公知的。Southern印迹涉及使用DNA作为靶标，而Northern印迹涉及使用RNA作为靶标。各自提供不同类型的信息，尽管在许多方面，cDNA印迹与印迹或RNA物质类似。简而言之，使用探针来靶向已经固定于合适基质(常常是硝基纤维素滤器)上的DNA或RNA物质。不同的物质应在空间上分开，以利于分析。这通常是通过核酸物质的凝胶电泳，然后“印迹”到滤器上来完成的。随后，在促进变性和再杂交的条件下，将印迹的靶标与探针(通常是标记的)一起孵育。因为探针被设计为与靶碱基配对，所以探针将在复性条件下结合一部分靶序列。然后去除未结合的探针，并如上所述完成检测。在检测/定量之后，可以将在给定受试者中观察到的结果与本文定义的对照响应或统计学显著的参照组或对照受试者群进行比较。这样，可以将检测到的癌症治疗生物标志物核酸的量与疾病的进展或严重程度相关联。
芯片杂交利用连接固体基底的生物标志物特异性寡核苷酸，其可以由设计成微阵列的颗粒状固相组成，如尼龙滤器、载玻片或硅片(Schena等(1995)Science.270：467-470)。微阵列在本领域是已知的并且由表面组成，序列对应于基因产物(如cDNA)的探针可以在所述表面上的已知位置特异性杂交或结合，以检测生物标志物基因表达。
杂交复合物的定量是本领域公知的并且可以通过几种方法中的任何一种来实现。这些方法通常是基于标记或标志物的检测，如本领域标准使用的任何放射性、荧光、生物或酶标签或标记。可以将标记应用于寡核苷酸探针或源自生物样品的RNA。
在某些实施方案中，癌症治疗生物标志物是靶RNA(例如，mRNA)或靶RNA的DNA拷贝，其水平或丰度是使用至少一种在至少低，中或高严格条件下与靶RNA或DNA拷贝杂交的核酸探针测量的，其中核酸探针包含至少15个(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个)癌症治疗生物标记多核苷酸的连续核苷酸。在一些实施方案中，测量的靶RNA或其DNA拷贝的水平或丰度被标准化为参考RNA或参考RNA的DNA拷贝的水平或丰度。合适地，将核酸探针固定在固体或半固体支持物上。在这种类型的说明性实例中，核酸探针形成核酸探针的空间阵列的一部分。在一些实施方案中，通过杂交(例如，使用核酸阵列)来测量结合靶RNA或DNA拷贝的核酸探针的水平。在其他实施方案中，通过核酸扩增(例如，使用聚合酶链式反应(PCR))来测量结合靶RNA或DNA拷贝的核酸探针的水平。再在其他实施方案中，通过核酸酶保护测定法测量结合靶RNA或DNA拷贝的核酸探针的水平。
通常，mRNA定量可与校准曲线一起合适地进行，以实现准确的mRNA测定。此外，优选通过与对照样品比较来对源自生物样品的转录物进行定量，所述样品的特征在于所检查的转录物的已知表达模式。
2.4生物标志物蛋白的评价
在一些实施方案中，通过证明蛋白质的存在(分离的或一种或在细胞中)，或通过生物标记物的一种或多种已知功能特性，在蛋白质表达水平上评估癌症治疗生物标记物。例如，用于EHMT2特异性或MAP1LC3B特异性蛋白检测中的抗EHMT2和抗MAP1LC3B抗体是本领域已知的，可商购，并且也可以由本领域技术人员容易地生产。类似地，用于LDH特异性蛋白检测的抗LDH抗体是可商购的，并且也可以由本领域技术人员容易地生产。抗体和抗原-抗体复合物可以通过本领域几种熟知的测定法进行检测，包括免疫荧光测定法，免疫组织化学，荧光激活细胞分选(FACS)分析，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)，光发射免疫分析和蛋白质印迹分析。在其他实例中，评估生物标志物的活性。例如，可以通过检测LDH将乳酸转化为丙酮酸和NADH时产生的NADH的量来评估LDH的活性。
在特定的实施方案中，进行免疫荧光或免疫细胞化学来检测蛋白质。细胞，如肿瘤细胞，可以通过本领域已知的方法来分离或富集。细胞的分离或富集是指其中特定细胞(例如，肿瘤细胞)的百分比相对于富集程序前样品中的百分比增加的过程。纯化是富集的一个实例。例如，通过第一步CD45+耗尽来除去CD45+细胞，接着密度梯度离心来分离循环肿瘤细胞(参见以下的实施例6和Boulding等(2018)Scientific Reports 8:73)。在其他实施方案中，可以将针对肿瘤细胞上的表面标志物的抗体连接到固体支持物上，以进行分离。用于分离的程序可包括使用抗体磁珠(例如MiltenyiTM珠)的磁分离、亲和色谱法、使用连接固体基质的抗体“淘选”或任何其他方便的技术，例如Laser Capture Microdissection。提供特别精确的分离的其他技术包括FACS。一旦将细胞沉积在载玻片上，就可以将其固定，并用标记的抗体探测以检测癌症治疗生物标志物。
癌症治疗生物标志物特异性的抗体可以直接缀合荧光标志物，包括荧光素、FITC、罗丹明、Texas Red、Cy3、Cy5、Cy7和其他荧光标志物，并在配备有合适滤镜的荧光显微镜下观察滤器。抗体也可以与酶缀合，酶在添加适当的底物后开始反应，从而在细胞上提供带有检测到的生物标记蛋白的有色沉淀。然后可以通过标准光学显微镜观察载玻片。或者，可以将癌症治疗生物标志物特异性的一抗进一步结合缀合至可检测部分的二抗。因此，可以评估细胞表面表达，并可以添加细胞渗透溶液，例如Triton-X和皂苷，以促进试剂渗透到胞质中(“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,Volumes 1-111Cellis,J.E.编辑(1994)；“Current Protocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等(编辑)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.(1994)；Mishell and Shiigi(编辑),“Selected Methods in Cellular Immunology”,W.H.Freeman and Co.,New York(1980))。
免疫组织化学原理上与免疫荧光或免疫细胞化学非常相似，然而，例如，与细胞悬浮液相反，用癌症治疗生物标志物特异性的抗体探测组织标本。固定并处理活检标本，并任选将其包埋在石蜡中，如果需要，切片，以提供随后用乙酰肝素酶特异性抗体探测的细胞或组织载玻片。或者，可将冷冻组织低温恒温器上切片，然后进行抗体探测，从而避免了固定诱导的抗原掩盖。将抗体，如在免疫荧光或免疫细胞化学中的，偶联至荧光或酶联的可检测部分，并通过针对免疫荧光描述的方法用于探测组织切片，然后根据所用的检测方法通过荧光或共聚焦显微镜观察。反应产物形成后，如果利用了酶促可检测的部分，则可以通过标准光学显微镜观察反应产物沉淀物的可视化(“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,Volumes 1-111 Cellis,J.E.编辑(1994)；“Current Protocols in Immunology”VolumesI-III Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等(编辑)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.(1994)；Mishell and Shiigi(编辑),“SelectedMethods in Cellular Immunology”,W.H.Freeman and Co.,New York(1980))。
在其他实施方案中，使用如ELISA和RIA这样的测定，其遵循类似的原理用于检测特异性抗原。作为说明性实例，可以通过通常用125I放射性标记的MAP1LC3B特异性抗体使用RIA来测量MAP1LC3B。在ELISA测定中，MAP1LC3B特异性抗体与酶化学连接。MAP1LC3B特异性捕获抗体被固定在固体支持物上。然后在其中阻断非特异性结合的条件下，将未标记的样本，例如来自生物样品的蛋白质提取物，与固定的抗体一起温育，并通过洗涤除去未结合的抗体和/或蛋白质。结合的MAP1LC3B通过第二个MAP1LC3B特异性标记抗体来检测。在RIA中，通过测量放射性直接测量抗体结合，而在ELISA中，结合是通过将无色底物转化为有色反应产物的反应来检测的，作为连接的酶的活性的函数。因此，可以通过分光光度法容易地检测到变化(Janeway CA等，(1997年)，“Immunobiology”，第3版，Current Biology Ltd.，Garland Publishing Inc.；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”，第I-III卷Cellis，JE编辑(1994)；“Current Protocols in Immunology”，第I-III卷，Coligan JE编辑(1994)；Stites等(编辑))。因此，两种测定都提供了一种定量生物样品中MAP1LC3B或EHMT2蛋白含量的方法。
蛋白质生物标志物表达也可以通过发光免疫测定来检测。与ELISA和RIA极为相似，在发光免疫测定中，将待测试的生物样品/蛋白质提取物固定在固体支持物上，并用特异性标记(标记的抗体)进行探测。该标记又是发光的，并在结合时发光，以作为特异性识别的指示。发光标记包括在通过电磁辐射、电化学激发或化学激活而在激活时发光的物质，并且可以包括荧光和磷光物质、闪烁体和化学发光物质。标记可以是催化反应***的一部分，如酶、酶片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶或催化剂；色原***的一部分，如荧光团、染料、化学发光剂、发光剂或敏化剂；可分散颗粒(可以是非磁性或磁性的)、固体支持物、脂质体、配体、受体、半抗原放射性同位素等(美国专利No.6,410,696、美国专利No.4,652,533和欧洲专利申请No.0,345,776)，并提供了另一种高度灵敏的用于检测蛋白质表达的方法。
Western印迹分析是评估生物样品中癌症治疗生物标志物多肽含量的另一种方法。来自细胞(例如肿瘤细胞)的生物样品的蛋白质提取物在变性电离环境中溶解，并将等分试样施加到聚丙烯酰胺凝胶基质上。随着向阳极迁移，蛋白质会基于分子大小特性进行分离。然后将抗原转移到硝酸纤维素膜、PVDF或尼龙膜上，然后进行膜阻断以最小化非特异性结合。用与可检测部分直接偶联的抗体探查膜，或随后用含有可检测部分的二抗探查膜。通常，将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶与抗体偶联，并使用发色或发光底物使活性可视化(Harlow E.等(1998)Immunoblotting.见Antibodies:A Laboratory Manual,pp.471-510CSH Laboratory,cold Spring Harbor,N.Y.和Bronstein I.等(1992)Biotechniques 12:748-753)。
在特定的实施方案中，使用允许同时检测和/或定量大量蛋白质的蛋白质捕获阵列。例如，滤膜上的低密度蛋白质阵列，如通用蛋白质阵列***(Ge,2000Nucleic AcidsRes.28(2):e3)允许使用标准ELISA技术和扫描电荷耦合器件(CCD)检测器对阵列抗原进行成像。还开发了能够同时检测临床分析物的免疫传感器阵列。现在有可能使用蛋白质阵列来分析体液中蛋白质的表达，如健康或患病受试者的血清中以及药物治疗前后的受试者中的蛋白质表达。
示例性蛋白质捕获阵列包括包含空间寻址的抗原结合分子的阵列，通常称为抗体阵列，其可以促进限定蛋白质组或亚蛋白质组的多种蛋白质进行广泛的平行分析。已经显示抗体阵列具有所需的特异性和可接受背景的特性，并且一些可以商业获得(例如，BDBiosciences、Clontech、Bio-Rad和Sigma)。已经报道了各种用于制备抗体阵列的方法(参见，例如，Lopez等，2003J.Chromatogram.B 787:19-27；Cahill,2000Trends inBiotechnology 7:47-51；U.S.专利申请公开2002/0055186；U.S.专利申请公开2003/0003599；PCT公开WO 03/062444；PCT公开WO 03/077851；PCT公开WO 02/59601；PCT公开WO02/39120；PCT公开WO 01/79849；PCT公开WO 99/39210)。此类阵列的抗原结合分子至少可以识别细胞或细胞群表达的蛋白质的子集，其说明性的实例包括生长因子受体、激素受体、神经递质受体、儿茶酚胺受体、氨基酸衍生物受体、细胞因子受体、细胞外基质受体、抗体、凝集素、细胞因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)、蛋白酶、激酶、磷酸酶，ras样GTP酶、水解酶、类固醇激素受体、转录因子、热休克转录因子、DNA结合蛋白、锌指蛋白、亮氨酸拉链蛋白、同源结构域蛋白、细胞内信号转导调节剂和效应子、细胞凋亡相关因子、DNA合成因子、DNA修复因子、DNA重组因子和细胞表面抗原。
各个空间上不同的蛋白质捕获剂通常连接支持物表面，其通常为平面或轮廓的。常见的物理支持物包括载玻片、硅片、微孔、硝酸纤维素膜或PVDF膜，以及磁性和其他微珠。
悬浮液中的颗粒也可以用作阵列的基础，条件是对它们进行编码以进行识别；***包括微珠(例如，可从Luminex、Bio-Rad和Nanomics Biosystems获得)和半导体纳米晶体(例如，QDotsTM，可从Quantum Dots获得)的颜色编码，以及珠子(UltraPlexTM，可从Smartbeads获得)和多金属微棒(NanobarcodesTM颗粒，可从Surromed获得)的条形码编码。珠子也可以在半导体芯片上组装成平面阵列(例如，可从LEAPS technology和BioArraySolutions获得)。在使用颗粒的情况下，通常将单个蛋白质捕获剂连接单个颗粒，以提供阵列的空间限定或分离。然后可以分开测定颗粒，但以平行的、区隔化的方式进行，例如在微量滴定板或分开的试管中进行。
在操作中，将任选片段化以形成肽片段的蛋白质样品(参见，例如，美国专利申请公开2002/0055186)，在适于蛋白质或肽结合的条件下递送至蛋白质捕获阵列，并洗涤阵列以从阵列中除去样品的未结合或非特异性结合的组分。接下来，使用合适的检测***检测结合阵列的每个特征的蛋白质或肽的存在或含量。可以相对于结合阵列的第二特征的第二蛋白质的含量来确定结合阵列的特征的蛋白质的含量。在某些实施方案中，样品中第二蛋白质的含量是已知的或已知是不变的。
在一些实施方案中，癌症治疗生物标志物是多肽表达产物(靶多肽)，使用至少一种与靶多肽免疫相互作用的抗原结合分子来测量其水平。在这些实施方案中，将测量的靶多肽水平标准化为参照多肽的水平。合适地，将抗原结合分子固定于固体或半固体支持物上。在这种类型的说明性实例中，抗原结合分子形成抗原结合分子的空间阵列的一部分。在一些实施方案中，通过免疫测定法(例如，使用ELISA)测量与靶多肽结合的抗原结合分子的水平。
在其他实例中，活性
2.5推导生物标志物值
生物标志物值可以是测量的生物标志物值，其是直接针对受试者测量的生物标志物值，或替换地，可以是“推导的”生物标志物值，其是从一个或多个测量的生物标志物值推导的值，例如通过将函数应用于一个或多个测量的生物标志物值来推导的。如本文使用的，将已经应用了函数的生物标记物称为“推导的生物标记物”。
可以通过本领域公知的多种方法中的任何一种来确定生物标志物值。例如，生物标志物值测定的比较性描述可以在国际专利公开No.WO 2015/117204中找到，将其全部按引用并入本文中。在一个实例中，测定生物标志物值的方法可以包括测量生物标志物值，例如，通过对受试者或对获自受试者的样品进行测试来测量。
然而，更常见地，测定生物标志物值的步骤包括使电子处理设备接收或以其他方式获得先前已经测量或推导的生物标志物值。这可以包括例如从诸如远程数据库之类的数据存储中取得生物标志物值，使用输入设备获得已经手动输入的生物标志物值，等等。适当地，可以使用多个生物标志物值的组合来确定指标，该指标至少部分地指示对癌症治疗的响应性。假设该方法是使用电子处理设备进行的，则指标的指示可任选地显示或以其他方式提供给用户。
在一些实施方案中，将生物标志物值进行组合，例如，通过将生物标志物值相加、相乘、相减或相除来确定指标值。进行这个步骤，使得多个生物标志物值可以合并成单个指标值，以提供更有用的和更直接的允许指标被解释的机制并因此用于确定受试者响应癌症治疗的可能性。
应当理解，在这种情况下，上述方法中使用的生物标记物可以限定用于癌症治疗响应性的生物标记物谱，其包括最少数量的生物标记物(例如，至少一种生物标记物)，同时保持足够的性能，以允许将生物标志物谱用于作出临床相关决定。最小化使用的生物标志物数量，可以最小化与进行诊断或预后测试相关的成本，并且在多肽生物标志物的情况下，允许待进行的测试利用相对直接的技术，如定量RT-PCR和/或免疫荧光，并允许待进行的测试在临床环境中快速速进行。就这一点而言，本文所述方法提供的指示可以是指标值的图形或字母数字表示。然而，或者，该指示可以是指标值与预定阈值或范围的比较的结果，或替换地可以是受试者对癌症治疗的可能响应性的指示。
此外，产生单个指标值允许由临床医生或其他医学实践者容易地解释测试结果，使得测试可以用于临床环境中的可靠诊断。
仅通过举例说明，确定指标的方法合适地包括确定至少一个生物标志物值，其中该生物标志物值是针对受试者的至少一种癌症治疗生物标志物测量的或推导的值，并且至少部分地指示取自受试者的样品中癌症治疗生物标志物的浓度或丰度，并且其中至少一种癌症治疗生物标志物包括MAP1LC3B的表达产物。在一些实施方案中，癌症治疗生物标志物谱还包括EHMT2的表达产物作为癌症治疗生物标志物。在另外的实施方案中，通过测量EHMT1的表达产物的水平或含量间接确定EHMT2的表达产物的水平或含量。在一些实施方案中，癌症治疗生物标志物谱还包括EHMT2的表达产物作为癌症治疗生物标志物。在可替换的实施方案中，至少一种癌症治疗生物标志物包括MAP1LC3B的表达产物、血清LDH和BRAF/NRAS突变状态。
然后，通过使用推导的生物标志物值作为指标值，或者通过进行其他处理，如将推导的生物标志物值与参照等进行比较，如本领域通常已知的并且在下面更详细地描述的那样，或与另一个生物标志物值进行比较，将推导的生物标志物值用于指标，所述指标用于确定受试者响应癌症治疗的可能性。在一些实施方案中，指标指示MAP1LC3B表达产物的水平、浓度或丰度。在其他实施方案中，指标指示MAP1LC3B的表达产物的水平或丰度以及EHMT2的表达产物的水平、浓度或丰度。在一个特定的实施方案中，指标指示MAP1LC3B的表达产物的丰度或浓度与EHMT2的表达产物的丰度或浓度的比率。在进一步的实施方案中，指标指示MAP1LC3B的表达产物的水平或丰度、血清LDH的水平或丰度以及BRAF和NRAS中突变的存在或不存在。
可以使用诸如加成模型；线性模型；支持向量机；神经网络模型；随机森林模型；回归模型；遗传算法；退火算法；加权总和；最近邻居模型；和概率模型的组合函数来组合推导的生物标志物值。在一些实施方案中，将指标与指标参照进行比较，根据比较结果确定响应癌症的可能性。指标参照可以从针对参照人群中的多个个体确定的指标推导。参照人群通常包括具有不同特征的个体，如多个不同性别的个体；和/或种族，基于不同的特征限定不同的组，并将受试者的指标与源自具有相似特征的个体的指标参照进行比较。参照人群可包括已知响应(包括完全响应和/或部分响应)癌症治疗，并且特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗的多个个体；或已知对癌症治疗无响应的多个个体，并且特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗。
在特定实施方案中，使用至少一个电子处理设备(如适当编程的计算机***等等)来进行本发明的指标确定方法。在这种情况下，电子处理设备通常获得至少一个测量的生物标志物值，通过从测量或其他量化设备接收这个值，或者通过从数据库获得这些值，等等。然后，处理设备通过任何合适的方式来确定指标，例如，通过计算指示MAP1LC3B的表达产物的浓度或含量与EHMT2的表达产物的浓度或含量之比的值。在一个方面中，本发明涵盖一种包括这样的电子处理设备的装置。
处理设备然后可以生成指标的表示，例如通过生成指标的符号或字母数字指示，指标与一个或多个指标参照的比较的图形指示或受试者可能响应癌症治疗的字母数字指示。
本发明的指标确定方法通常包括从已经被诊断出患有癌症的受试者获得样品，其中所述样品包括一种或多种癌症治疗生物标志物(例如，MAP1LC3B和/或EHMT2的表达产物)，并量化或以其他方式评估样品中的至少一种生物标志物来确定生物标志物的值。如上所述，这可以使用任何合适的技术来实现，并将取决于生物标记的性质。合适地，单独测量的或生物标志物值对应于癌症治疗生物标志物的水平、丰度或浓度，或对应于应用于该水平或含量的函数。例如，如果在本发明的使用多种癌症治疗生物标志物的指标确定方法的一些实施方案中的指标是基于两种多核苷酸或两种多肽的浓度之比，则该过程通常将包括通过本领域已知的任何方式，包括定量RT-PCR或免疫荧光，或通过功能测定，定量多核苷酸或多肽。
在一些实施方案中，通过确定一个或多个癌症治疗生物标志物值来建立受试者响应癌症的可能性，其中单独的癌症治疗生物标志物值指示针对受试者中或获自受试者的样品中的癌症治疗生物标志物测量或推导的值。这些生物标志物在本文中被称为“样品癌症治疗生物标志物”。与本发明相一致，样品癌症治疗生物标志物将对应于参照癌症治疗生物标志物(在本文中也称为“相应的癌症治疗生物标志物”)。“相应的癌症治疗生物标志物”表示结构上和/或功能上与参照癌症治疗生物标志物相似的癌症治疗生物标志物，如例如SEQID NO:1和2(MAP1LC3B转录物和MAP1LC3B蛋白)；SEQ ID NO:3-12(EHMT2转录物和EHMT2蛋白)；以及DEQ ID NO:27和28(LDH蛋白；分别为亚基A和B)中列出的。代表性的相应的癌症治疗生物标志物包括参照癌症治疗生物标志物基因的等位基因变体(相同的基因座)、同系物(不同的基因座)和直系同源物(不同的生物体)的表达产物。参照癌症治疗生物标志物基因的核酸变体以及编码的癌症治疗生物标志物多肽可以含有核苷酸置换、缺失、颠倒和/或***。变化可以发生在编码和非编码区中的任一个中或两者中。变化可以产生保守性和非保守性氨基酸置换(如在编码的产物中比较)。对于核苷酸序列，保守性变体包括由于遗传密码简并产生的编码参照癌症治疗多肽的氨基酸序列的那些序列。
相应的癌症治疗生物标志物包括显示出与参照癌症治疗生物标志物多肽的氨基酸序列实质性的序列相似性或同一性的氨基酸序列。通常，对应于参照氨基酸序列的氨基酸序列将显示出与选自如表3中总结的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、27和28的参照氨基酸序列至少约80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或甚至高达100％的序列相似性或同一性。相应的癌症治疗生物标志物还包括显示出与参照癌症治疗生物标志物多核苷酸的核酸序列实质性的序列相似性或同一性的核酸序列。通常，对应于参照核酸序列的核酸序列将显示出与选自如表3中总结的SEQ ID NO:3、5、7、9、11和13的参照核酸序列至少约70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85。86，97，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或甚至高达100％序列相似性或同一性。
在一些实施方案中，如下进行序列之间的序列相似性或序列同一性的计算：
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的，对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸中的一个或两个中引入缺口，并且为了比较目的可以不考虑用于最佳比对的非同源序列)。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的参照序列的长度为参照序列长度的至少30％，通常至少40％，更通常至少50％，60％，甚至更通常至少70％，80％，90％，100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。第一序列中的一个位置被第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。对于氨基酸序列比较，第一序列中的一个位置被第二序列中相应位置的相同或相似氨基酸残基(即保守取代)占据时，则分子在该位置是相似的。
考虑到为了两个序列的最佳比对需要引入的缺口的数量和每个缺口的长度，两个序列之间的百分比同一性是该序列在各个位置共享的相同氨基酸残基数量的函数。相比之下，考虑到为了两个序列的最佳比对需要引入的缺口的数量和每个缺口的长度，两个序列之间的相似性百分比是该序列在各个位置共享的相同和相似氨基酸残基数量的函数。为了本文的目的，mRNA转录物的cDNA的序列和mRNA本身的序列被认为具有100％的序列同一性，尽管应当理解，一个分子是DNA分子，并且因此包含“T”，而另一个是RNA分子并且其包含“U”。
序列的比较和序列之间百分比同一性或百分比相似性的确定可以使用数学算法来完成。在某些实施方案中，使用Needleman和Wünsch,(1970，J.Mol.Biol.48：444-453)算法来确定氨基酸序列之间的百分比同一性或相似性，该算法已被并入GCG软件包中的GAP程序中(可从http://www.gcg.com获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，且缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在特定实施方案中，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，使用GCG软件包中的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)，来确定核苷酸序列之间的同一性百分比。一组非限制性参数(除非另有说明，否则应使用该参数)包括缺口罚分12，缺口延伸罚分4和移码缺口罚分5的Blossum 62评分矩阵。
在一些实施方案中，可以使用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller(1989，Cabios,4:11-17)来确定氨基酸或核苷酸序列之间的同一性或相似性百分比，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分12和缺口罚分4。
本文所述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等(1990，J.Mol.Biol.，215：403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行这样的搜索。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的53010核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等(1997，NucleicAcids Res.25：3389-3402)中所述的，使用缺口BLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
相应的癌症治疗生物标志物多核苷酸还包括在下述严格条件下与参照癌症治疗生物标志物多核苷酸或其补体杂交的核酸序列。如本文使用的，术语“在低严格性、中严格性、高严格性或非常高严格性条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。本文使用“杂交”来表示互补核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA杂合体或DNA-RNA杂合体。互补碱基序列是那些与碱基配对规则相关的序列。在DNA中，A与T配对，且C与G配对。在RNA中，U与A配对，且C与G配对。就这点而言，本文所用的术语“匹配”和“错配”是指互补核酸链中成对核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸高效杂交，如上述经典的A-T和G-C碱基对。错配是不能有效杂交的其他核苷酸组合。
用于进行杂交反应的指导可以在Ausubel等，(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6节中找到。在该参考文献中描述了水性和非水性方法，并且可以使用任一种。本文中提到的低严格条件包括并涵盖至少约1％v/v至至少约15％v/v的甲酰胺和至少约1M至至少约2M的盐，以在42℃下杂交，以及至少约1M至至少约2M盐，用于在42℃下洗涤。低严格条件还可以包括1％的牛血清白蛋白(BSA)，1mM EDTA，0.5M的NaHPO4(pH 7.2)，7％的SDS，用于在65℃下杂交，以及(i)2×SSC，0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM NaHPO4(pH 7.2)，5％SDS，用于在室温下洗涤。低严格条件的一个实施方案包括在约45℃的6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后至少在50℃下在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次(对于低严格条件，洗涤的温度可提高至55℃)。中严格条件包括并涵盖至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和至少约0.5M至至少约0.9M盐，用于在42℃下杂交，以及至少约0.1M到至少约0.2M的盐，用于在55℃下洗涤。中严格条件还可以包括1％的牛血清白蛋白(BSA)，1mM EDTA，0.5M的NaHPO4(pH 7.2)，7％的SDS，用于在65℃下杂交，以及(i)2×SSC，0.1％SDS；(ii)0.5％BSA，1mMEDTA，40mM NaHPO4(pH 7.2)，5％SDS，用于在60-65℃下洗涤。中严格条件的一个实施方案包括在约45℃下在6×SSC中杂交，然后在60℃下在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。高严格条件包括并涵盖至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和约0.01M至约0.15M的盐，用于在42℃下杂交，以及约0.01M到0.02M的盐，用于在55℃下洗涤。高严格条件还可以包括1％BSA，1mM EDTA，0.5M NaHPO4(pH 7.2)，7％SDS，用于在65℃下杂交，以及(i)0.2×SSC，0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM NaHPO4(pH 7.2)，1％SDS，用于在超过65℃的温度下洗涤。高严格条件的一个实施方案包括在约45℃下在6×SSC中杂交，然后在65℃下在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。
在某些实施方案中，相应的癌症治疗生物标志物多核苷酸是在非常高严格条件下与公开的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中任何一个)杂交的多核苷酸。非常高严格条件的一个实施方案包括在65℃下在0.5M磷酸钠，7％SDS中杂交，接着在65℃下在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。
其他严格条件是本领域公知的并且本领域技术人员将认识到可以操纵各种因素来优化杂交的特异性。最终洗涤的严格性的优化可以用于确保高度杂交。对于详细的实例，参见Ausubel等，上文，第2.10.1至2.10.16页和Sambrook等(1989，上文)，第1.101至1.104节。
3.生物标志物检测试剂盒、组合物和支持物
用于检测和定量本发明的癌症治疗生物标志物所需的所有必需试剂可以在试剂盒中组装在一起。在一些实施方案中，试剂盒包含可以定量至少一种癌症治疗生物标志物的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含：(i)至少一种可以定量(例如，确定丰度、浓度或水平)生物样品中MAP1LC3B的表达产物的试剂，和任选地(ii)使用至少一种试剂的说明。在一些实施方案中，试剂盒还包含(iii)至少一种可以定量生物样品中EHMT2或EHMT1的多核苷酸或多肽表达产物的试剂；(iv)至少一种可以定量生物样品中血清LDH的试剂；和/或至少一种可以检测NRAS或BRAF突变的试剂。
在本发明的内容中，将理解“试剂盒”表示含有用于进行本发明的方法所需的不同试剂的产品，所述试剂是包装的，使得它们可以运输和储存。适用于包装试剂盒组分的材料包括水晶、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶子、小瓶、纸、信封等。另外，本发明的试剂盒可以包含用于同时、顺序或分开使用试剂盒中所含不同组分的说明。说明可以是印刷材料的形式或是能够存储说明的电子支持物的形式，使得受试者可以读取，如电子存储媒介(磁盘、磁带等)，光学媒介(CD-ROM，DVD)等。替代地或另外地，该媒介可以含有提供说明的互联网地址。
可以定量癌症治疗生物标志物的试剂包括可以定量生物标志物的化合物或材料，或化合物或材料的组。在特定实施方案中，化合物、材料或化合物或材料的组可以测定多肽或多核苷酸的水平或丰度(即，从MAP1LC3B、EHMT2或EHMT1表达的转录物或蛋白质或血清LDH)。
试剂盒还可以任选包括合适的用于检测标记的试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微滴定平板、稀释缓冲液等。例如，基于蛋白质的检测试剂盒可以包括(i)至少一种癌症治疗生物标志物多肽(例如，MAP1LC3B多肽和任选的EHMT2或EHMT1多肽，或LDH，其可以用作阳性对照)；和(ii)特异性地结合癌症治疗生物标志物多肽的抗体。或者，基于核酸的检测试剂盒可以包括(i)癌症治疗生物标志物多核苷酸(例如，MAP1LC3B多核苷酸和任选EHMT2或EHMT1多核苷酸，其可以用作阳性对照)；和(ii)与癌症治疗生物标志物多核苷酸特异性地杂交的引物或探针(例如，MAPLC3B、EHMT2或EHMT1转录物的cDNA或转录物本身)。还可以包括适用于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(逆转录酶、Taq、SequenaseTM、DNA连接酶等，取决于所用的核酸扩增技术)，脱氧核糖核苷酸和缓冲液，以提供扩增所需的反应混合物。此类试剂盒通常还将以合适的方式包含用于每种单独的试剂和酶以及每种引物或探针的不同容器。
试剂盒还可以具有用于进行本文所述测定之一的各种装置(例如，一种或多种)和试剂(例如，一种或多种)；和/或印刷的用于使用该试剂盒定量癌症治疗生物标志物基因表达的说明。
本文描述的试剂，其可以任选地与可检测标记相关联，可以以适于与实施例或下文中描述的测定一起使用的微流体卡、芯片或腔室、微阵列或试剂盒的形式存在，例如本文所述的RT-PCR或Q PCR技术。
还提供了用于确定评估癌症受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的组合物和固体支持物。组合物和固体支持物可以与其中癌症治疗生物标志物是多肽或多核苷酸的应用相关。
在一个实施方案中，组合物含有MAP1LC3B转录物或其cDNA和至少一种与MAP1LC3B转录物或cDNA杂交的寡核苷酸引物或探针；和任选EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA和至少一种与EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA杂交的寡核苷酸引物或探针。如所知的，组合物中的转录物或cDNA的水平反映了了从其采样并获得样品的受试者中的转录物的水平，并且因此可以用于本发明的方法中，来评估受试者响应癌症治疗的可能性。
或者，组合物可以包含MAP1LC3B的多肽表达产物和结合MAP1LC3B的多肽表达产物的检测剂；以及任选EHMT2或EHMT1的多肽表达产物和结合EHMT2或EHMT1的多肽表达产物的检测剂。在特定实施方案中，组合物含有肿瘤细胞，所述肿瘤细胞包含MAP1LC3B的多肽表达产物和任选的EHMT2或EHMT1的多肽表达产物。通常，检测剂分别是EHMT2或EHMT1的多肽表达产物或MAP1LC3B的多肽表达产物的特异性的抗体或其抗原结合片段。
本发明的固体支持物包括固定了至少一种与MAP1LC3B转录物或其cDNA杂交的寡核苷酸引物或探针和任选的至少一种与EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA杂交的寡核苷酸引物或探针的那些。在一些实施方案中，MAP1LC3B转录物或其cDNA和任选的EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA与其各自的寡核苷酸或探针杂交。
4.诊断和治疗方法
使用本发明的方法确定的指标可以用于评估受试者响应癌症治疗的可能性，并且特别是包括免疫检查点抑制剂的治疗。免疫检查点抑制剂包括，例如，靶向CTLA-4并且因此阻断或抑制CTLA-4与CD80/CD86之间的相互作用的那些(即，CTLA-4抑制剂，如伊匹单抗(ipilimuman)或曲美木单抗(tremelimumab))、靶向PD-1并且因此阻断或抑制PD-1与PD-L1之间的相互作用的那些(即，PD-1抑制剂，如派姆单抗(pembrolizumab)、pidilizumab、纳武单抗(nivolumab)、REGN2810、CT-001、AMP-224、BMS-936558、MK-3475、MEDI0680和PDR001)和靶向PD-L1并且因此阻断和抑制PD-1与PD-L1之间的相互作用的那些(即，PD-L1抑制剂，如阿特珠单抗(atezolizumab)、杜鲁伐单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、BMS-936559和MEDI4736)。在一些实例中，免疫检查点抑制剂的组合构成了癌症疗法。
如以下实施例中建立的，MAP1LC3B的表达产物的水平、丰度或浓度可以用于预测受试者是否可能响应癌症治疗。例如，MAP1LC3B的表达水平通常对应于对治疗的响应性，由此具有较高MAP1LC3B表达的受试者通常可能响应癌症治疗，而具有较低MAP1LC3B表达的受试者通常不可能性响应癌症治疗(例如，可能不响应癌症治疗)。例如，基于他们MAP1LC3B表达的相对水平，可以将受试者分成两组：MAP1LC3B-高和MAP1LC3B-低，由此MAP1LC3B-高的受试者比MAP1LC3B-低的受试者更可能响应使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗。
因此，本文提供了一种用于确定评估癌症受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的方法，所述方法包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：(1)确定来自受试者的样品中的至少一种癌症治疗生物标志物的生物标志物值，其中所述癌症治疗生物标志物或之一是MAP1LC3B的表达产物；和(2)使用生物标志物值确定指标，其中所述指标至少部分指示响应癌症治疗的可能性；其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
如本文证明的，在MAP1LC3B的表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度增加了，或与与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度大致相同的情况中，指标可以确定为至少部分指示对治疗的阳性响应，并且因此可以将受试者评估为可能呈现出对治疗的阳性响应。相反，在MAP1LC3B的表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度降低了，或与与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度大致相同的的情况中，指标可以确定为至少部分指示对治疗的阴性响应，并且因此可以将受试者评估未可能呈现出对治疗的阴性响应(例如，无响应)。
如以下实施例中建立的，EHMT2的表达产物的水平、丰度或浓度可以用于预测受试者是否可能响应癌症治疗。通常，EHMT2的表达水平与对治疗的响应性逆相关，由此具有较低EHMT2表达的受试者通常可能响应癌症治疗，而具有较高EHMT2表达的受试者通常不可能性响应癌症治疗(或可能对癌症治疗物无响应)。例如，基于他们EHMT2表达的相对水平，可以将受试者分成两组：EHMT2-低和EHMT2-高，由此EHMT2-低的受试者比EHMT2-高的受试者更可能响应使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗。
因此，在一些实施方案中，在EHMT2的表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度增加了，或与与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度大致相同的情况中，指标可以确定为至少部分指示对治疗的阴性响应，并且因此可以将受试者评估为可能呈现出对治疗的阴性响应(例如，无响应)。在其他实施方案中，在EHMT2的表达产物的丰度或浓度与与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度大致相同，或相对于与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度降低了的情况中，指标可以确定为至少部分指示对治疗的阳性响应，并且因此可以将受试者评估为可能呈现出对治疗的阳性响应。
值得注意的是，MAP1LC3B表达与EHMT2表达的比例作为指标或用于推导指标特别有用，所述指标用于评估癌症受试者响应癌症治疗的可能性中。如实施例6中证明的，证明了对使用免疫检查点抑制剂的治疗是阳性响应(包括完全或部分响应)的受试者的MAP1LC3B表达与EHMT2表达的比例高于没有响应治疗的受试者中观察到的比例。因此，在一些实施方案中，在比例相对于与阴性治疗响应相关的比例较高，或与与阳性治疗响应相关的比例大致相同的情况中，指标可以确定为至少部分指示对治疗的阳性响应，并且因此可以将受试者评估为可能呈现出对治疗的阳性响应。相反，在比例相对于与阳性治疗响应相关的比例较低，或与与阴性治疗响应相关的比例大致相同的情况中，指标可以确定为至少部分指示对治疗的阴性响应，并且因此可以将受试者评估为不太可能呈现出对治疗的阳性响应(或，可能呈现出对治疗的阴性响应，例如，无响应)。
此外，并且也如下文证明的，对使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗呈现出完全响应的受试者的MAP1LC3B表达与EHMT2表达的比例高于对治疗仅呈现出部分响应的受试者中观察到的比例。因此还可以进行亚分类，将受试者亚分类成对使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗的部分-或完全-响应者。因此，在一些实施方案中，在比例相对于与部分治疗响应相关的比例较高，或与与完全治疗响应相关的比例大致相同的情况中，指标可以确定为至少部分指示对癌症治疗的完全响应，并且因此可以将受试者评估为可能呈现出对癌症治疗的完全响应。相反，在比例相对于与完全治疗响应相关的比例较低，或与与部分治疗响应相关的比例大致相同时，指标可以确定为至少部分指示对治疗的部分响应，并且因此可以将受试者评估为可能呈现出对治疗的部分响应。作为延伸，在比例相对于与部分治疗响应相关的比例较低，或与与阴性治疗响应相关的比例大致相同的情况中，指标可以确定为至少部分指示对治疗的阴性响应，并且因此可以将受试者评估为可能呈现出对治疗的阴性响应。
因此，在一些实例中，可以基于MAP1LC3B表达与EHMT2表达的比例将受试者分为三组：高、中和低，其中对使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗，高比例的受试者可能呈现出完全响应，中比例的受试者可能呈现出部分响应，而低比例的受试者可能呈现出无响应。在一些实施方案中，高比例表示约1.65至约2.00的比例，如或约1.65、1.70、1.75、1.80、1.85、1.90、1.95或2.00；中比例表示约1.30至约1.60的比例，如或约1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55或1.60；或和/或低比例表示约0.50至约0.90的比例，如或约0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90。
还如以下实施例中建立的，血清LDH的水平、丰度或浓度以及BRAF和NRAS的突变状态也可以结合MAP1LC3B的表达产品的水平、丰度或浓度使用，以预测受试者是否可能响应癌症治疗。通常，具有较低MAP1LC3B表达的受试者通常不太可能响应治疗或可能仅部分响应治疗，与其LDH水平和BRAF/NRAS突变状态无关。相反，具有较高MAP1LC3B表达的受试者通常可能响应治疗，除非他们相对于“正常”或“健康”水平具有提高的LDH水平，并且具有BRAF/NRAS突变，其这种情况中，他们不太可能响应癌症治疗。在这个方面的特定实施方案中，通过测定LCB3表达阳性的样品中的肿瘤细胞的百分比来评估MAP1LC3B的表达。在更多实例中，低于，或等于或低于特定参照值或截留值的百分比表示受试者通常不可能响应癌症治疗，而等于或高于，或高于特定参照值或截留值的百分比表示受试者通常可能响应癌症治疗，除非他们相对于“正常”或“健康水平具有提高的LDH水平，并且具有BRAF/NRAS突变。这样的参照值或截留值可以通过本领域技术人员按照经验来确定。这样的截留值的非限制性实例包括群体中10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5和25％的LC3B+细胞。
还如本文证明的，癌细胞中EHMT2的抑制导致提高的MAP1LC3B表达和自噬作用介导的细胞死亡。需要注意的以及如以上和本文描述的，MAP1LC3B表达水平与对癌症治疗的阳性响应相关，并且特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗，而EHMT2表达水平与对癌症治疗的阳性响应逆相关，并且特别是使用免疫检查点抑制剂的治疗。因此，不可能响应，或可能只是部分响应使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗的受试者可以是用于对该癌症治疗进行敏化的候选者，如通过施用提高MAP1LC3B表达水平和/或提高LC3B水平的治疗剂来敏化。例如，可以将LC3B多肽或编码LC3B的多核苷酸施用于受试者。在其他实例中，治疗剂是EHMT2抑制剂。不受理论的束缚，提出了EHMT2抑制剂将通过降低组蛋白H3K9甲基化来诱导或提高MAP1LC3B表达，由此导致提高的对癌症治疗的响应性。此外，因为EHMT2与EHMT1形成杂二聚复合物，来催化二甲基化，因此EHMT1抑制剂可以替代EHMT2抑制剂来使用，或除了EHMT2抑制剂以外，还可以使用EHMT1抑制剂，通过降低组蛋白H3K9甲基化导致相同的诱导或提高MAP1LC3B表达的作用。
因此，本文提供了用于评估癌症受试者是否是对使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗进行敏化的候选者的方法，其中根据本文所述的方法，当受试者已经被评估为不可能性响应癌症治疗或可能仅部分响应癌症治疗时，认为受试者是对使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗进行敏化的候选者。在特定实例中，受试者具有以下生物标志物谱之一时，认为受试者是对使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗进行敏化的候选者：(i)MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平是降低的，血清LDH的丰度或浓度与健康受试者的相关，且BRAF/NRAS突变状态是阴性；(ii)MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平是增加的，血清LDH的丰度或浓度相对于健康受试者的是增加的，且BRAF/NRAS突变状态是阳性；(iii)MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平是增加的，血清LDH的丰度或浓度相对于健康受试者的是增加的，且BRAF/NRAS突变状态是阳性；(iv)MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平是降低的，血清LDH的丰度或浓度相对于健康受试者的是增加的，且BRAF/NRAS突变状态是阴性或阳性；和(v)MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平是降低的，血清LDH的丰度或浓度与健康受试者的相关，且BRAF/NRAS突变状态是阳性。
还提供了通过施用提高MAP1LC3B表达水平和/或提高LC3B水平的治疗剂，使受试者对使用免疫检查点抑制剂的治疗敏感的方法，其中根据本文所述的方法，受试者已经被评估为对使用免疫检查点抑制剂的癌症治疗进行敏化的候选者，和/或已经被评估为不可能响应癌症治疗或可能仅部分响应癌症治疗。
EHMT2抑制剂是本领域公知的并且包括任何部分或完全抑制或降低EHMT2表达水平或EHMT2活性。EHMT2抑制剂可以是EHMT2特异性的，或者也可以作用于其他分子，如其他组蛋白甲基转移酶(例如，EHMT1)，以抑制其表达和/或活性。EHMT2抑制剂的实例包括小分子、抗体及其抗原结合片段、多核苷酸，如反义和抑制RNA(例如，siRNA和shRNA)分子，以及其他分子，如锌指核酸酶。在一些实施方案中，抑制剂是小分子或抗体或其抗原结合片段，其结合EHMT2多肽，诸如具有SEQ ID NO:4、6、8、10或12中任一个所示序列的多肽，或与其具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。在其他实施方案中，抑制剂是多核苷酸，其互补于并杂交至EHMT2多核苷酸，诸如具有SEQ ID NO:3、5、7、9和11任一个所示序列的多核苷酸；其互补序列；或与其具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸。在某些实施方案中，抑制剂将EHMT2的表达水平或生物活性降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
EHMT1抑制剂也是本领域公知的并且包括任何部分或完全抑制或降低EHMT1表达水平或EHMT1活性。EHMT1抑制剂可以是EHMT1特异性的，或者也可以作用于其他分子，如其他组蛋白甲基转移酶(例如，EHMT2)，以抑制其表达和/或活性。EHMT1抑制剂的实例包括小分子、抗体及其抗原结合片段、多核苷酸，如反义和抑制性RNA(例如，siRNA和shRNA)分子。在一些实施方案中，抑制剂是小分子或抗体或其抗原结合片段，其结合EHMT1多肽，诸如具有SEQ ID NO:26所示序列的多肽，或与其具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。在其他实施方案中，抑制剂是多核苷酸，其互补于并杂交至EHMT1多核苷酸，诸如具有SEQ ID NO:25所示序列的多核苷酸；其互补序列；或与其具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸。在某些实施方案中，抑制剂将EHMT1的表达水平或生物活性降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
用于评估抑制剂对EHMT2或EHMT1的表达水平或活性抑制的方法是本领域公知的，并且可以用于鉴定或选择根据本发明使用的合适抑制剂。例如，可以使用本领域公知的方法，包括上述和本文实施例中描述的方法，在转录物或蛋白质水平上评估细胞暴露于抑制剂之前和之后的EHMT2或EHMT1的表达水平。EHMT2或EHMT1甲基化H3K9的能力也可以使用本领域公知的方法来评估，如WO2018005799、WO2017181177、WO2017142947、WO2015200329、WO2015192981、WO2014066435和美国专利公开No.2015274660中所述的那些方法。例如，可以使用H3K9me2特异性的抗体评估细胞暴露于EHMT2或EHMT1抑制剂后细胞中H3K9me2的水平。在其他实施方案中，如下所述的评估EHMT2或EHMT1抑制剂诱导或提高MAP1LC3B表达的能力。
在特定实施方案中，EHMT2抑制剂是小分子，如抑制EHMT2活性的小分子。示例性的EHMT2的小分子抑制剂包括，但不限于，A-366(Pappano等(2015)PLoS ONE 10(7):e0131716)、BIX01294(Kubicek等(2007)Mol Cell 25:473-481)、BRD4770(Yuan等(2012)ASC Chem Biol 7:1152-1157)、CM-272(Jose-Eneriz等(2017)Nat Comm 8:15424)、E72(Chang等(2010)J.Mol.Biol.400:1-7)、UNC0224(Liu等(2009)J.Med.Chem.52:7950)、UNC0321(Liu等(2010)J.Med.Chem.53:5844-5857)、UNC0631(Liu等(2011)J Med Chem.54:6139-50)、UNC0638(Vedadi等(2011)Nat Chem Biol.2011年7月10日；7(8):566-574)、UNC0642(Liu等(2013)J.Med.Chem.56:8931)、UNC0646(Liu等(2011))、verticillin A(Paschall等(2015)J Immunol.195:1868-1882)、西奈芬净(sinefungin)类似物(Devkota等(2014)ACS Med Chem Lett.5(4):293-297)，以及在国际专利公开No.WO2018005799、WO2017181177、WO2017142947、WO2015200329、WO2015192981、WO2014066435和美国专利公开No.2015274660中描述的任何EHMT2抑制剂，其全部内容通过引用并入本文中。
在其他实施方案中，EHMT2抑制剂是降低EHMT2 mRNA和/或EHMT2蛋白水平的分子，如通过抑制EHMT2表达水平。示例性的此类分子是抑制性核酸，包括，但不限于，反义寡核苷酸(ASO，包括未修饰或修饰的形式，如含有一个或多个磷酸连接修饰的那些(例如，磷酸二酯和/或氨基磷酸酯修饰)、糖修饰(例如锁核酸(LNA)、2'-O-甲基(2OMe)、S-约束-乙基(cEt)、2'-O-甲氧基-乙基(MOE)、三环DNA(Tc-DNA)和/或2'-氟)和非核糖修饰(例如，肽核酸(PNA)和/或吗啉代二氨基磷酸酯寡聚体(phosphorodiamidate morpholino oligomer)PMO)、RNAi分子(如siRNA和shRNA)(包括双功能shRNA)、miRNA和antagomir(或blockmirs)。反义或抑制性核酸分子包括与目标基因的RNA转录物的至少一部分互补的序列，在这种情况中，为EHMT2转录物(例如，SEQ ID NO:3、5、7、9和11中所示的任何序列)。与靶标杂交的能力将取决于互补程度和反义核酸的长度。通常，杂交核酸越大，与其可能容纳的RNA错配的碱基越多，并且仍会形成稳定的双链体(或视情况而定可能为三链体)。本领域技术人员可以通过使用标准程序确定杂交复合物的熔点来确定可容许的错配程度。与信使5'端互补的多核苷酸，例如直至并包括AUG起始密码子的5'非翻译序列，通常在抑制翻译中最有效。然而，与mRNA的3'非翻译序列互补的序列也已显示出有效抑制mRNA的翻译(通常参见Wagner，R.，(1994)Nature 372：333-335)。因此，与基因的5'-或3'-非翻译，非编码区互补的寡核苷酸可用于反义方法中，以抑制内源性EHMT2 mRNA的翻译。与mRNA的5'非翻译区互补的多核苷酸应当包括AUG起始密码子的补体。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸通常是效率较低的翻译抑制剂，但是也可以与本发明相符地使用。无论设计成与mRNA的5'-、3'-或编码区杂交，反义核酸的长度应当至少为六个核苷酸，并且优选为长度为6至约50个核苷酸的寡核苷酸。在特定方面中，寡核苷酸为至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。在一些实施方案中，使用抑制EHMT2表达的siRNA或shRNA分子，如以下实施例中使用的。这样的分子是公知的，可商购的，并且可以由熟练的技术人员容易地产生。可以充当EHMT2抑制剂的其他分子包括靶向EHMT2基因的miRNA，如miR-217(参见例如Thienpont等(2016)J Clin Invest 127(1)：335-348)。
用于本发明中的EHMT1抑制剂包括小分子，如已知EHMT1活性的小分子。示例性的EHMT1小分子抑制剂包括，但不限于，A-366(Pappano等(2015)PLoS ONE 10(7):e0131716)、BIX01294(Kubicek等(2007)Mol Cell 25:473-481)、BRD4770(Yuan等(2012)ASC ChemBiol 7:1152-1157)、CM-272(Jose-Eneriz等(2017)Nat Comm 8:15424)、E72(Chang等(2010)J.Mol.Biol.400:1-7)、UNC0224(Liu等(2009)J.Med.Chem.52:7950)、UNC0321(Liu等(2010)J.Med.Chem.53:5844-5857)、UNC0631(Liu等(2011)J Med Chem.54:6139-50)、UNC0638(Vedadi等(2011)Nat Chem Biol.2011年7月10日；7(8):566-574)、UNC0642(Liu等(2013)J.Med.Chem.56:8931)、UNC0646(Liu等(2011))、verticillin A(Paschall等(2015)J Immunol.195:1868-1882)，以及在国际专利公开No.WO2017181177、WO2017142947中描述的任何EHMT1抑制剂，其全部内容通过引用并入本文中。
在其他实施方案中，EHMT1抑制剂是降低EHMT1 mRNA和/或EHMT1蛋白水平的分子，如通过抑制EHMT1表达水平。示例性的此类分子是抑制性核酸，包括，但不限于，反义寡核苷酸(ASO，包括未修饰或修饰的形式，如含有一个或多个磷酸连接修饰的那些(例如，磷酸二酯和/或氨基磷酸酯修饰)、糖修饰(例如锁核酸(LNA)、2'-O-甲基(2OMe)、S-约束-乙基(cEt)、2'-O-甲氧基-乙基(MOE)、三环DNA(Tc-DNA)和/或2'-氟)和非核糖修饰(例如，肽核酸(PNA)和/或吗啉代二氨基磷酸酯寡聚体PMO)、RNAi分子(如siRNA和shRNA)(包括双功能shRNA)、miRNA和antagomir(或blockmirs)。在一个实例中，EHMT1抑制剂是反义或抑制性RNA，如siRNA或shRNA分子。抑制EHMT1表达的siRNA或shRNA分子，如以下实施例中所用的，是公知的，是可商购的并且可以由熟练的技术人员容易地产生。可以充当EHMT1抑制剂的其他分子包括靶向EHMT1基因的miRNA，如miR-217(参见例如Thienpont等(2016)J ClinInvest 127(1)：335-348)。
本发明的方法还扩展到用癌症疗法治疗受试者。因此，还提供了一种用于治疗受试者癌症的方法，该方法包括进行上述和本文所述的方法、由进行上述和本文所述的方法组成或基本上由进行上述和本文所述的方法组成，所述方法用于确定评估癌症受试者响应癌症治疗可能性中使用的指标；并且基于所述指标至少部分地指示对癌症治疗的阳性响应，使受试者暴露于癌症治疗，其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。在其他实施方案中，如上所述，在受试者随后暴露于癌症治疗之前，该指标至少部分指示对癌症疗法的阴性响应，并且该受试者暴露于EHMT2或EHMT1抑制剂以使该受试者对癌症疗法敏感。因此，还提供了一种用于治疗癌症受试者的方法，该方法包括进行上述和本文所述的方法、由进行上述和本文所述的方法组成或基本上由进行上述和本文所述的方法组成，所述方法用于确定评估癌症受试者响应癌症治疗可能性中使用的指标；基于所述指标至少部分指示对癌症治疗的阴性响应，向所述受试者施用EHMT2或EHMT1抑制剂，从而使所述受试者对癌症治疗敏感；并将受试者暴露于癌症治疗，其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
癌症治疗包括使用至少一种免疫检查点抑制剂的和任选两种或多种免疫检查点抑制剂的治疗。用于包括在癌症治疗中的免疫检查点抑制剂包括，例如，靶向CTLA-4并且因此阻断或抑制CTLA-4与CD80/CD86之间的相互作用的那些(即，CTLA-4抑制剂，如伊匹单抗(ipilimuman)或曲美木单抗(tremelimumab))、靶向PD-1并且因此阻断或抑制PD-1与PD-L1之间的相互作用的那些(即，PD-1抑制剂，如派姆单抗(pembrolizumab)、pidilizumab、纳武单抗(nivolumab)、REGN2810、CT-001、AMP-224、BMS-936558、MK-3475、MEDI0680和PDR001)和靶向PD-L1并且因此阻断或抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的那些(即，PD-L1抑制剂，如阿特珠单抗(atezolizumab)、杜鲁伐单抗(durvalumab)、奥维单抗(avelumab)、BMS-936559和MEDI4736)。
受试者暴露的癌症治疗可以是癌症治疗的组合，其包括受试者暴露于一种或多种治疗(例如，放疗)或化疗剂。
放疗包括引起DNA损伤的放射线和电波，例如γ射线、X射线、UV辐射、微波、电子发射、放射性同位素等。可以通过用上述形式的辐射照射局部肿瘤部位来实现治疗。所有这些因素很可能会影响DNA的广泛损伤，包括DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维护。
X射线的剂量范围为长期(3至4周)每天50至200伦琴的剂量至2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围差异很大，且取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
放疗的非限制性实例包括适形外束放疗(conformal external beamradiotherapy,50-100Gray，在4-8周内分部分给予)，单次或分次，高剂量率近距离放射治疗，永久性间质近距离放射治疗，全身放射性同位素(例如，锶89)。在一些实施方案中，放疗可以与放射增敏剂组合施用。放射增敏剂的说明性实例包括但不限于乙丙昔罗、依他硝唑、fluosol、米索尼唑(misonidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、替莫泊芬(temoporfin)和替拉帕明(temoporfin)。
化疗剂可以是细胞抑制性的或细胞毒性的。根据本发明的方法使用的化疗剂的非限制性实例包括以下类别中的任何一种或多种：
(i)在医学肿瘤学中使用的抗增殖/抗肿瘤药及其组合，如烷化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲)；抗代谢物(例如抗叶酸药物，如氟吡啶类，如5-吡啶尿嘧啶和氟草嘧啶、雷地曲塞、甲氨蝶呤、胞嘧啶***糖苷和羟基脲；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类，如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、表柔霉素、伊达比星、丝裂霉素-C、放线菌素，和光神霉素)；抗有丝***剂(例如，长春花生物碱类，如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨，以及紫杉烷类，如紫杉醇和多西紫杉醇；和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素，如依托泊苷和替尼泊苷、氨茶碱、托泊替康和喜树碱)；
(ii)细胞抑制剂，如抗***(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和伊多昔芬)、***受体下调剂(例如氟维司汀)、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)、UH拮抗剂或LHR H激动剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林和布塞林)、孕激素(例如，醋酸孕甾酮)、芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑、来曲唑、伏洛唑和依西美坦)和5′-还原酶的抑制剂，如非那雄胺；
(iii)抑制癌细胞侵袭的药剂(例如金属蛋白酶抑制剂，如马立马司他，以及尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能抑制剂)；
(iv)生长因子功能抑制剂，例如此类抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗erbb2抗体曲妥珠单抗[HerceptinTM]和抗erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法呢基转移酶抑制剂、MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的其他抑制剂(例如其他EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-n-4-胺(CI 1033))，例如血小板衍生的生长因子家族的抑制剂，以及例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；
(v)抗血管生成剂，如抑制血管内皮生长因子作用的那些，(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[AvastinTM]，如国际专利申请WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的那些化合物)和通过其他机制起作用的化合物(例如linomide，整联蛋白αvβ3功能抑制剂和血管抑制素)；
(vi)血管破坏剂，如Combretastatin A4和国际专利申请WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中公开的化合物；
(vii)反义疗法，例如针对上述目标的那些，如ISIS 2503，一种抗ras反义疗法；和
(viii)基因治疗方法，包括例如替换异常基因(如异常的p53或异常的GDEPT)的方法(基因指导的酶前药治疗)，如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌氮还原酶的方法，以及提高患者对化疗或放疗耐受性的方法，如多重药物耐药基因疗法。
(ix)免疫治疗方法，包括例如离体和体内方法来提高患者肿瘤细胞的免疫原性，如用细胞因子转染，所述细胞因子如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，降低T细胞无反应性的方法，使用转染的免疫细胞(如细胞因子转染的树突状细胞)的方法，使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法以及使用抗独特型抗体的方法。这些方法通常依赖于使用免疫效应细胞以及靶向和破坏癌细胞的分子。免疫效应子可以是例如对恶性细胞表面上的某些标志物特异性的抗体。单独的抗体可以用作治疗的效应子，或者可以募集其他细胞以实际上促进细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，且仅用作靶向剂。或者，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子直接或间接地与恶性细胞靶相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
通常，本文所述的治疗剂，包括癌症治疗中包括的那些(例如，免疫检查点抑制剂、其他化学治疗剂和EHMT2抑制剂)，将药物(或兽医学)组合物中与药学上可接受的载体一起给药并以有效量给药以实现其预期目的。给予受试者的活性化合物的剂量应足以随着时间的推移在受试者中实现有益的反应，如减少肿瘤负荷等。待施用的药物活性化合物的量可以取决于待治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重和总体健康状况。在这一点上，用于给药的活性化合物的精确量将取决于从业者的判断。在确定癌症治疗中待给药的活性化合物的有效量时，执业医生或兽医可以评估与癌症的存在有关的任何症状或临床体征的严重程度。在任何情况下，本领域技术人员都可以容易地确定治疗剂的合适剂量和合适的治疗方案，而无需进行过多的实验。
本发明的方法与患有癌症的受试者的评估有关。在一些实施方案中，所述受试者患有为实体肿瘤的癌症。在其他实施方案中，癌症是血液肿瘤(即，不是实体肿瘤)。癌症的示例性类型包括但不限于，如原发癌，转移癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，肺癌，口咽癌，下咽癌，食道癌，胃癌，胰腺癌，肝癌，胆囊癌，胆管癌，小肠癌，泌尿道癌，肾癌，膀胱癌，尿路上皮癌，女性生殖道癌，子***，子宫癌，卵巢癌，绒毛膜癌，妊娠滋养细胞性疾病，男性生殖道癌，***癌，精囊泡癌，睾丸癌，生殖细胞瘤，内分泌腺肿瘤，甲状腺癌，肾上腺癌，垂体腺癌，皮肤癌，血管瘤，黑素瘤，骨骼和软组织引起的肉瘤，卡波济肉瘤，脑癌，神经癌，眼癌，脑膜癌，星形细胞瘤，神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，神经瘤，神经母细胞瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，造血***恶性肿瘤引起的实体瘤，白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，转移性黑色素瘤，复发性或持续性卵巢上皮癌，输卵管癌，原发性腹膜癌，上皮性卵巢癌，原发性腹膜浆液性癌，非小细胞肺癌，胃肠道间质瘤，结直肠癌，小细胞肺癌，黑素瘤，多形性胶质母细胞瘤，非鳞状非小细胞肺癌，恶性神经胶质瘤，原发性腹膜浆液性癌，转移性肝癌，神经内分泌癌，难治性恶性肿瘤，三阴性乳腺癌，HER2扩增乳腺癌，鳞状细胞癌，鼻咽癌，口腔癌，胆道，肝细胞癌，头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)，非髓样甲状腺癌，1型神经纤维瘤病，CNS癌，脂肪肉瘤，平滑肌肉瘤，唾液腺癌，粘膜黑色素瘤，口/大黑色素瘤，副神经节瘤；嗜铬细胞瘤，晚期转移癌，实体肿瘤，鳞状细胞癌，肉瘤，黑素瘤，子宫内膜癌，头颈癌，横纹肌肉瘤，多发性骨髓瘤，胃肠道间质瘤，套细胞淋巴瘤，胶质肉瘤，骨肉瘤，难治性恶性肿瘤，晚期转移性癌，实体肿瘤，转移性黑色素瘤，***癌，实体肿瘤，复发或持续性卵巢上皮癌，输卵管癌，肺癌和原发性腹膜癌中的一种或多种。
为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例描述特定的优选实施方案。
实施例
实施例1
G9A(EHMT2)抑制剂遏制黑素瘤细胞存活
已在不同癌症中观察到EHMT2(G9a)的过表达，并与较差的预后相关。先前已经显示，G9a通过抑制与肿瘤抑制功能有关的基因的表达而在乳腺癌中发挥致癌作用(Casciello等(2017)Proc Natl Acad Sci U S A 114，7077-7082)。为了确定G9a在黑色素瘤细胞增殖和存活中的作用，使用了具有不同分子特征的黑素瘤细胞系(表1)。使用各种不同的皮肤/隐匿型原发性黑素瘤细胞系，包括BRAF p.V600E突变体(D05、D14和D20)、两个NRAS p.Q61L突变体(C006和C013)、两个NF1空突变体(C008，c.586+1G>A和D22(p.R440X))和两个三重野生型(A04和C092)细胞系，以使用免疫印迹法来评估G9a的水平。
表1.黑素瘤细胞系的特征
Figure BDA0003052083820000691
Figure BDA0003052083820000701
与正常黑素细胞相比，几乎所有测试的黑素瘤细胞系都表达更高水平的G9a蛋白(图1)。
然后，使用可用的G9a小分子抑制剂UNC0642在体外评估G9a在细胞存活和增殖中的作用(Liu等(2013)Journal of Medicinal Chemistry 56，8931-894)。在黑素瘤细胞系中，UNC0642处理显著降低了细胞存活，而正常黑色素细胞培养物的存活则不受影响(图2)。
然后选择四个细胞系用于进一步分析。这些是C006(NRAS mt)，C092(三重wt)，C008(NF1 mt)和D05(BRAF mt)。这四个系代表4种皮肤黑素瘤基因组亚型，并且包括对抑制剂非常敏感的2个系(C008和D05)以及敏感性较低的2个系(C006和C092)。在存在或不存在5μM UNC0642下，使细胞生长48小时，使用IncuCyte Zoom通过实时细胞成像评估这些系的增殖。与介质对照相比，G9a抑制作用在敏感系(D05和C008)中导致增殖显著降低(数据未显示)。在处理48小时后，细胞数量已显著减少，表明G9a抑制作用正积极地引起细胞死亡(图3A)。与图2所示的增殖数据一致，与介质相比，C006和C092细胞系受UNC0642处理的影响要小得多。一致地，使用UNC0642处理可观察到总体H3K9me2的减少，最早可在8小时内观察到，并在D05和C008细胞系中持续到24小时(图3B)。
为了进一步研究G9a的作用，通过在D05细胞系中G9a的短发夹介导的敲减来降低蛋白质表达。这导致了与使用UNC0642处理的D05细胞类似的增殖减少(使用细胞活力测定和IncuCyte Zoom进行测量(图4A和B))。UNC0642对G9a的抑制作用导致G1和G2/M期的细胞减少，但在诱导细胞死亡方面观察到了更显著的影响，如preG1期的细胞增加了4倍以上(数据未显示)。与图1B-D中的细胞存活数据一致(数据未显示)，G9a抑制剂处理后C092(对G9a抑制剂的响应性较小)细胞系中不存在preG1群体的这种增加。这些数据共同表明，组蛋白甲基转移酶的损失直接影响细胞存活，并表明G9a在维持所测试的黑素瘤细胞系中的细胞增殖和存活中具有重要作用。
材料和方法
试剂和细胞培养物
UNC0642购自Sigma Aldrich。表1中显示了源自皮肤黑素瘤的人黑素瘤细胞系的组，并且先前已经对所有细胞进行了描述。将细胞维持在添加了10％胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640中，在含5％CO2的加湿空气中，37℃下维持。正常黑素细胞在添加了CaCl2，佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human fibroblast growthfactor basic,rhFGF-B)，重组人胰岛素(rh-胰岛素)，氢化可的松，牛垂体提取物(BPE)，FBS和GA-1000(30μg/ml庆大霉素和15ng/ml两性霉素)的CloneticsTMMGMTM-4黑素细胞生长培养基-4(Lonza)中生长。
逆转录病毒转导
如先前所述使用表达G9a短发夹RNA(shG9a)或非沉默对照(shNS)的逆转录病毒构建体(Casciello等(2017)Proc Natl Acad Sci U S A 114，7077-7082)。pBABE-puromCherry-EGFP-LC3B获自Addgene(质粒#22418)(N'Diaye等，(2009)EMBO report 10，173-179)。通过使用Superfect转染试剂(Qiagen)将构建体与pUMVC3和pVSV-G共转染到HEK293T细胞中来制备病毒上清液。收集上清液并用于感染培养基中的细胞，所述培养基含有8μg/ml聚乙烯。24h后更换细胞培养基并添加新鲜的生长培养基。72h后收获细胞，或使用1μg/ml硫酸嘌呤霉素进行选择。
IncuCyte实时成像和细胞活力测定
为了进行增殖研究，将细胞(5×103)接种于96位孔中并使其粘附过夜，并在G9a抑制剂UNC0642(Sigma Aldrich)或介质对照DMSO(Sigma Aldrich)存在下在新鲜的生长培养基中孵育。通过使用IncuCyte Zoom(Essen BioScience)的实时成像和/或通过进行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定来评估增殖。监测细胞后，加入20μL MTT(5mg/mL；Sigma-Aldrich)。将平板在37℃下孵育3h，然后除去上清液，并向每个孔中加入100μL异丙醇。测量每个孔在570nm的吸光值(光密度)。
免疫印迹分析
为了进行免疫印迹，使用含有20mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，10％甘油，含1％Nonidet P-40的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA裂解缓冲液制备蛋白质全细胞裂解物。使用补充了1mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物的标准高盐提取缓冲液(20mM HEPES(pH7.9)，0.32M NaCl，1mM EDTA和1mM EGTA)获取核提取物。使用蛋白质测定试剂盒(BioRad)，根据Bradford方法进行了蛋白质测定。使用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离了20μg变性蛋白，并将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜在溶于含Tween 20的Tris缓冲盐水(TBST；10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween 20)中的5％脱脂牛奶中封闭1小时。使用抗G9a(#3306，Cell Signlalling)，H3K9me2(ab 1220，Abcam)，H3(ab1791，Abcam)或微管蛋白(ab6046，Abcam)的一抗进行免疫印迹，并用偶联HRP的抗兔抗体(#7074，Cell Signaling Technology)或偶联HRP的抗小鼠抗体(#7076，Cell SignalingTechnology)进行检测。应用ECL检测试剂(GE Healthcare)后，使用X射线胶片(Fujifilm)将蛋白条带可视化。
实施例2
G9A抑制诱导自噬介导的细胞死亡
已经确定G9a抑制在体外可有效诱导黑素瘤细胞死亡，然后研究了这种作用的分子基础。首先，检查用UNC0642处理的细胞得到其对作为细胞凋亡的测量的PARP切割状况的影响。在用UNC0642处理的任何细胞系中均未检测到可观察到的PARP切割(数据未显示)。在检查UNC0642对细胞周期的影响时，发现了如通过流式细胞术分析所确定的，在UNC0642处理后，D05和C092均未显示出细胞周期状态的任何变化(数据未显示)。
由于在所检查的细胞系中G9a水平与对G9a抑制剂的敏感性不相关，因此研究了自噬蛋白的水平是否可以用作G9a活性的替代标志物以及因此研究对G9a抑制剂的敏感性。因此，在这项研究中使用的黑色素瘤细胞系中检查了重要的自噬相关蛋白的基础水平。已经显示了抑制G9a可以引起自噬相关基因5(ATG5)，Beclin-1(也称为ATG6)的诱导以及微管相关蛋白1轻链3β(MAP1LC3B或缩写为LC3B)I(17KDa)通过蛋白水解切割和脂化作用转化成LCB3 II(15KDa)(de Narvajas等(2013)和Li等(2015))。这些变化被认为是哺乳动物自噬的标志。细胞进行自噬时，则可以通过蛋白质印迹或免疫荧光检测细胞质LC3B I的一部分转化为自噬膜形式LC3B II。这种转化与自噬活性相关(Kabeya等(2000)Embo J19，5720-5728)，因此LC3B II的水平可以被认为是自噬的可靠标记。值得注意的是，在对G9a抑制响应更强的D05和C008细胞系中，LC3B II和ATG5的基础水平明显较低，这表明自噬的基础水平可能决定了对G9a抑制剂的敏感性(图5A)。为了评估降低C092无响应性细胞系中的LC3B水平是否会增加对G9a抑制剂治疗的敏感性，评估了G9a抑制剂处理后C092的细胞活力。观察到G9a抑制剂处理后，用LC3B敲减的细胞活力显著降低，并且LC3B的敲减导致更低水平的LC3BII(数据未显示)。
为了进一步检查G9a抑制对自噬的影响，使用了pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B构建体。EGFP-LC3B的分布显示在D05和C092细胞系两者中用UNC0642处理后点状模式增加，LC3B聚集在自噬体上(数据未显示)，这与免疫印迹结果一致。用自噬抑制剂巴氟霉素(Bafilomycin)A1(Baf.A1)处理的细胞用作点状染色的对照。LC3B I和II水平是在两个细胞系中响应于G9a抑制剂UNC0642以5μM处理8小时(图6)。经过G9a抑制剂处理后，D05和C008细胞系中的LC3B II蛋白水平急剧增加。使用短发夹介导的敲减在2种皮肤/隐匿型黑素瘤细胞系(C092三重wt和D05 BRAF mt)中，瞬时降低了G9a蛋白水平，并且与使用UNC0642抑制甲基转移酶活性的细胞进行比较。一致地，在D05细胞系中G9a敲低后，LC3B II水平增加，但在C092细胞系中则没有(图7)。
总之，这些结果证明了G9a抑制剂引发黑素瘤细胞中自噬诱导的能力。
材料和方法
免疫印迹分析
如上所述进行了免疫印迹分析，但还利用了抗-LC3B一抗(ab48394，Abcam)。
逆转录病毒转导
如上所述进行了逆转录病毒转导。
免疫荧光分析
将表达EGFP-LC38构建体的稳定细胞用DMSO、UNC0642在5μM或20nM巴氟霉素A1(Sigma Aldrich)下处理8小时。使用EVOS FL自动荧光显微镜(Invitrogen)获取图像，并使用ImageJ软件进行定量。
实施例3
MAP1LC3B调控的分子分析
为了进一步检查G9a对自噬过程的影响，使用各种分子技术检查了MAP1LC3B表达的水平。四种黑素瘤细胞系的实时定量PCR分析表明了在UNC0642处理时，所有细胞系中MAP1LC3B基因的表达都有不同程度的改变(图8)。在非常敏感的系(D05和C008)中，UNC0642处理时，MAP1LC3B表达存在统计学上的显著增加，与介质对照相比，诱导程度几乎为2倍(P<0.05)。相比之下，UNC0642后MAP1LC3B表达的诱导在不太敏感的细胞(C006和C092)中是最小的，与介质处理相比，没有统计学上的显著差异(图8)。还评估了另外两个重要的自噬相关基因BECLIN1和BNIP3L(数据未显示)，并显示了用UNC0642处理时，表达也有类似的显著增加。
为了确定G9a的抑制是否直接影响MAP1LC3B表达，对MAP1LC3B启动子进行了染色质免疫沉淀(ChIP)。在介质或UNC0642处理的细胞之间比较了组蛋白H3K9二甲基化(H3K9me2)和乙酰化(H3K9Ac)的变化，以及RNA Pol II的募集(图9)。与图8中观察到的基因表达增加一致，在UNC0642处理后，H3K9me2降低了4倍多，伴有MAP1LC3B启动子上的RNA PolII募集增加。观察到H3K9me2无变化，或RNA Pol II募集到无关区域(MAP1LC3B启动子的5kb上游)，表明G9a对MAP1LC3B的特异性调控。总之，这些结果证明G9a抑制作用通过阻断自噬通量以及经由在启动子区域直接将H3K9去甲基化来诱导其基因表达，从而在黑素瘤细胞系中引起LC3B II的积累。
材料和方法
定量实时RT-PCR和染色质免疫沉淀(ChIP)测定。
如先前所述的进行了定量RT-PCR和ChIP测定(Lee等(2010)Mol Cell 39，71-85)。简而言之，使用Trizol(Invitrogen)从肿瘤细胞或异种移植物分离总RNA，并使用Superscript III cDNA合成***(Invitrogen)从2μg总RNA中进行逆转录。用SYBR GreenMaster Mix(Life Technologies)通过ABI VIIA7***检测mRNA的丰度。设计引物对以扩增90-150bp mRNA特异性片段，并通过熔解曲线分析确认为独特产物。引物的序列提供于表2中。使用ΔΔCt方法计算mRNA的量并归一化至HPRT。所有反应均一式三份进行。
实施例4
G1A抑制对体内黑素瘤生长的作用
为了确定抑制G9a对肿瘤生长的作用，向6-8周龄的SCID小鼠皮下注射D20BRAF突变皮肤黑素瘤细胞。在两周内每两天以5mg/kg施用UNC0642前，使可触及的肿瘤得以建立(约10天)。将D20细胞系用于皮下模型中，因为之前已证明其在体内具有致瘤性，并且在体外对药物也敏感。与UNC0642降低黑素瘤细胞活力的体外数据相一致，与使用介质对照的处理相比，UNC0642给药导致肿瘤生长(图10A；P<0.05)和肿瘤重量(图10B；P<0.01)在统计学上显著降低。
从UNC0642治疗的小鼠的肿瘤中提取的RNA的定量实时PCR分析还显示出与介质处理组相比，MAP1LC3B基因的表达在统计学上显著增加(图10C；P<0.01)。切除的肿瘤中MAP1LC3B的免疫组织化学分析显示，与介质相比，UNC0642显著提高了MAP1LC3B的水平(图10D)。这些体内结果证明G9a甲基转移酶活性在调节肿瘤生长中具有关键作用，并且体外结果在体内得到大致重现。
材料和方法
体内肿瘤生长分析
每个治疗组8只SCID小鼠的组用于异种移植研究，以确保有足够的能力检测生物学差异。所有实验均由QIMR Berghofer医学研究所动物伦理委员会批准。将D20黑色素瘤细胞(2×106)与生长因子降低的基质胶(BD Biosciences)按1：1比例混合，并以100μL体积(第0天)皮下注射到6-8周龄小鼠的腹侧面，并如附图说明中所示，给予DMSO或5mg/kgUNC0642的处理。使用数字卡尺测量肿瘤体积(宽度2×长度/2)，并表示为平均±SD。同时处死所有动物，并解剖肿瘤以进一步分析。
免疫组织化学分析
将肿瘤切片固定在4％多聚甲醛中。使用的抗体是1:300稀释的G9a兔单克隆抗体(Cell Signaling Technology，3306S)和1:300稀释的MAP1LC3B山羊多克隆抗体(SantaCruz Biotechnology，SC-16756)。将通用二抗方案和DAB(Biocare Medical)用于检测和放大信号。将Aperio ImageScope软件用于对5个不重叠的肿瘤区域进行成像和定量，并评估每个区域中每单位面积的阳性像素数。手动将空白区域排除在定量之外。
定量RT-PCR
如上所述进行了定量RT-PCR。
实施例5
TCGA黑素瘤数据集中的MAP1LC3B和G9A表达
接下来研究了TCGA黑素瘤RNA-seq数据集中G9a(EHMT2)和LC3B(MAP1LC3B)两者的mRNA表达。发现了它们的表达是反向相关的(图11A)，并且根据这两个基因的组合表达，这些患者的总体生存率和无复发生存率显著分层。如图11B所示，具有高(hi)EHMT2表达但低(lo)MAP1LC3B表达(EHMT2hi/MAP1LC3Blo)的患者的总体生存比所有其他组都更差。这与用G9a抑制剂处理小鼠或细胞时的反向结局(失活的G9a和高LC3B)保持一致。对于无复发(总体)生存(图11C)，与EHMT2lo/MAP1LC3Blo患者相比，EHMT2hi/MAP1LC3Blo患者的生存更差(HR4.39，对数秩P＝0.001)，且与EHMT2lo/MAP1LC3Bhi患者相比，EHMT2hi/MAP1LC3Bhi患者的生存更差(HR 2.04，对数秩P＝0.036)。这些数据表明，低G9a表达的患者比具有高水平G9a的患者表现更好。
值得注意的是，基于G9a和MAP1LC3B的表达模式的四个组在其驱动突变亚型状态方面无显著差异(图11C)。EHMT2 mRNA的表达与NRAS或NF1突变无关，但在BRAF野生型中比在BRAF突变情况中更高(t-检验P＝0.0002，数据未显示)。MAP1LC3B mRNA的表达与BRAF、NRAS或NF1突变状态无关(数据未显示)。单独或结合使用G9a或MAP1LC3B mRNA表达与其他参数(包括疾病分期、性别和突变状态)比较，进行了多变量生存分析。单独的G9a表达能够将患者分为总体和无复发生存的不同预后组，而单独的MAP1LC3B表达则没有(数据未显示)。就整体生存而言，与使用单独的G9a相比，组合使用G9a和MAP1LC3B表现出更好的预后指标；然而，使用疾病分期并不能获得更好的预后指标。
材料和方法
黑素瘤全局基因表达的计算机分析
基于EHMT(G9a)和/或MAP1LC3B的表达，将TCGA数据集中的黑素瘤病例分配到四个四分位之一，并比较这些患者的生存。将具有最低表达的肿瘤之间的黑素瘤患者(底部25％，四分位1)的总生存和无复发生存与其余肿瘤进行比较。使用GraphPad Prism(GraphPad Software)构建生存曲线，并使用对数秩(Mantel-Cox)检验进行生存曲线的统计学比较。
实施例6
G9A和LC3B作为黑素瘤中的治疗响应标记
为了确定LC3B作为黑素瘤中响应免疫治疗的标志物的价值，进行了基因表达数据(转录组和RNA-seq)的计算机分析，其中在抗PD-1治疗(派姆单抗和纳武单抗)前从转移性黑素瘤患者的肿瘤分离RNA(Hugo等(2016)Cell 165,35-44)(图12A)。使用MAP1LC3B的表达生成了Kaplan Meyer生存曲线。值得注意的是，与低表达患者(MAP1LC3B低，黑色)相比，较高MAP1LC3B表达的患者具有统计学上显著更长的生存(MAP1LC3B高，红色)(图12B；P＝0.0095)。在MAP1LC3B高患者组中，两年后存活的患者超过66％，而在MAP1LC3B低患者组中则为22％。对抗PD-1治疗响应良好的患者具有较低的MAP1LC3B表达水平，但EHMT2(G9a)的表达水平较高(图12B)。
为了评估G9a和LC3B的蛋白质水平表达作为临床响应的预测因子，在含有40种黑素瘤样品的组织微阵列(TMA)上，使用G9a和LC3B特异性抗体进行IHC，所述样品在接受抗CTLA4或抗PD-1治疗前从患者收集(图12D)。将这个队列分为“响应者”(R；n＝28)或“无响应者”(NR；n＝12)组。在响应组中的LC3B的水平比无响应组更高(IHC数据未显示)。还研究了表达LC3B的细胞的数量和平均强度，且显示出这些在响应组中也显著更高(图12E)。
为了测试LC3B阳性细胞的百分比(％LC3B+细胞)和绝对LC3B染色强度(LC3B表达)与患者预后的关系，使用接收者操作特征曲线(ROC曲线)评估了最佳截留值。基于这些截留值(图13；LC3B阳性细胞百分比：≤18.5；绝对LC3B染色：≤753.31)，发现了高百分比的LC3B+细胞与更好的存活显著相关，这是由于更高的响应和较低频率的疾病进展(图14A)。LC3B+细胞的百分比越高，获得性耐药性明显越低(初始响应后的PD)。LC3B染色强度显示出相似的趋势，但未达到对记录的终点分层的统计学显著性(图14B)。对LC3B和队列中可用的所有其他变量进行了单变量和多变量分析，包括年龄(>65vs≤65)、性别(女性vs男性)、分期(M1cvs其他)、LDH(阳性vs阴性)、BRAF(mut vs wt)、NRAS(mut vs wt)和BRAF/NRAS突变状态(mut vs wt)，其中LDH阳性(或LDH+)表示LDH水平与“正常”水平相比增加了，而LDH阴性(或LDH-)表示LDH水平在“正常”范围内；且其中BRAF/NRAS wt表示没有检测到与基因产物功能改变相关的突变，而BRAF/NRAS mut表示存在至少一种检测到的与基因产物功能的改变相关的突变。在单变量分析中，仅LC3B+细胞的百分比与总体存活显著相关，而在多变量分析中，其接近显著性(P＝0.056)(表2)。对于对免疫疗法的初始响应，LC3B+细胞的百分比和突变状态在单变量分析中均是显著的。在多变量分析中，仅LC3B+细胞的百分比和LC3B强度与初始响应显著相关，表明它们是独立的预后因子(表2B)。相似地，基于针对疾病进展(表2C)和获得性耐药性(表2D)的多变量分析，LC3B+细胞的百分比和LC3B强度是独立的预后因子。
表2.免疫疗法治疗的转移性黑素瘤中LC3B表达的单因素和多因素生存分析。
Figure BDA0003052083820000811
Figure BDA0003052083820000821
Figure BDA0003052083820000831
然后，使用来自IV期转移性黑素瘤患者的侵入性较小的液体活检(即外周血)样品评估G9a和LC3B作为对检查点抑制剂治疗响应的标志物的效用。为此，从患者血液样本中分离出循环肿瘤细胞(CTC)，并使用与诊断相关的IHC染色方法检查了G9a和LC3B的水平。在从接受抗PD-1治疗(纳武单抗)治疗的IV期转移性黑素瘤患者分离的CTC中评估了G9a和LC3B的水平。所有病例的CTC采集均来自已经开始抗CTLA4(两个周期的单药治疗；伊匹单抗)接着抗PD-1治疗(一个周期；纳武单抗)至少3个月的转移性黑素瘤患者。
按照RECIST 1.1(n＝12个患者样本，每组4名患者)，黑素瘤患者的队列包括三组：1)完全响应(CR)；2)部分响应(CR)和3)稳定疾病(SD)。在这些细胞上针对ABCB5的表达进行了免疫荧光显微镜检查，以确认它们的源自黑素瘤的CTC状态。ABCB5蛋白被从所有患者样品中分离的CTC表达(数据未显示)。对这些CTC上的G9a和LC3B蛋白表达的分析表明了LC3B与G9a的较高比例与对抗PD-1治疗的CR在统计学上显著相关(P<0.0001；图15B)。相反，LC3B与G9a的最低比例在统计学上与SD显著相关(P<0.0001；图15B)。一致地，LC3B与G9a的中间比例与对抗PD-1治疗的部分响应(PR)相关(图15B)，表明G9a和LC3B表达可用作转移性黑素瘤患者的检查点抑制剂治疗的响应标志物。总之，分析表明G9a和LC3B蛋白和转录物水平可以用作黑素瘤患者的检查点抑制剂治疗的潜在预测和响应标志物。
总之，已将G9a和LC3B鉴定为预后标志物，其中具有较低G9a和较高LC3B蛋白水平的患者组对检查点抑制剂治疗的响应更好。G9a表达较低且MAP1LC3B转录物水平高的患者与更好的生存相关。也许更重要的是，在抗PD-1治疗之前转移性黑素瘤患者中的MAP1LC3B基因表达预测生存这一事实不仅强调了MAP1LC3B基因表达作为抗PD-1响应的预测标志物的价值，而且还具有通过靶向G9a调节MAP1LC3B表达的治疗潜能。此外，G9a抑制剂可以用作检查点抑制剂治疗的佐剂，以增强疗效或扩大响应这种治疗的患者的比例。这至少部分是通过减少或消除G9a对MAP1LC3B表达的抑制来实现的。G9a抑制剂可以降低组蛋白H3K9甲基化，从而启动MAP1LC3B的重新表达并提高自噬作用，并更好地响应检查点抑制剂的阻断(图16)。
材料和方法
组织微阵列分析
按照之前所述的(Gide等Cancer Cell，2019.35(2)：p.238-255.e6)，将含有来自49位黑素瘤患者的黑素瘤肿瘤活检样品的组织微阵列(TMA)用抗G9a(abcam#ab40542 1：8000稀释)和LC3B(Cell Signaling#38681：14000稀释)的抗体染色，所述样品在基于抗PD-1的免疫治疗之前(派姆单抗或纳武单抗，伴有或不伴有伊匹单抗)采集，并被分类为响应者或无响应者。使用循环染色方法，使用Perkin Elmer Opal七色酪酰胺试剂盒(PerkinElmer#NEL797B1001KT)进行所有多重酪氨酰胺标记(multiplex tyramidelabelling)。简而言之，将含有TMA的载玻片在二甲苯中脱蜡并在水中再水合。内源性过氧化物酶被淬灭，并在微波中进行抗原修复。在应用一抗之前，阻断非特异性抗体的结合。将HRP缀合的二抗用于一抗检测，并用Opal酪酰胺产生信号。然后对TMA进行微波处理，以剥离一抗/二抗复合物，然后再对组中剩余的抗体重复染色循环。在对组中最后一个抗体进行微波处理后，将TMA用DAPI复染并用Dako荧光固定培养基(Dako#S3023)固定。染色完成后，使用Vectra 3.0光谱成像***(PerkinElmer)使用荧光协议以10nmλ从420nm至720nm扫描TMA载玻片，以提取荧光强度信息。还使用InForm 4.2.1图像分析软件(PerkinElmer)进行了细胞分割，并使用FCS express 6软件(De Novo软件)进行了进一步分析，以确定每个单独的患者样本中表达细胞的数量和强度。使用
Figure BDA0003052083820000851
(版本12.7)构建了所有终点的接收者操作特征(ROC)曲线，并使用DeLong等的方法(DeLong等，Biometrics，1988.44(3)：p.837-45)建立了敏感性/特异性的截留标准。由于随访数据不足，排除了九个样本。
循环肿瘤细胞分离和成像
按照之前的报道(Boulding等，Sci Rep，2018.8(1)：p。73)，从转移性黑素瘤液体活检样品(伦理编号ETH.5.16.073)中分离出循环肿瘤细胞(CTC)，采用RosetteSepTM人CD45耗竭试剂盒(Stemcell Technologies#15162)以除去CD45+细胞，使用SepMateTM-50(IVD)密度梯度管(Stemcell Technologies#85450)和LymphoprepTM密度梯度培养基(StemcellTechnologies#07861)进行密度梯度离心。为了检查具有化学抗药性的，茎状的CTC标志物ABCB5的G9a和LC3B的动力学，将CTC与1％Triton X-100孵育20分钟以使其通透化，并用兔抗LC3B，小鼠抗G9a和山羊抗ABCB5探测，并使用驴子抗兔Alexa Fluor 488(LifeTechnologies#A21206)，抗鼠568(Life Technologies#A10042)和抗山羊633(LifeTechnologies#A21082)进行可视化。用ProLong Diamond抗褪色试剂(Life Technologies#P36965)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白质靶标进行定位。使用运行LAX软件的100×油浸透镜，使用Leica DMI8显微镜获得单个0.5μm切片。最终图像是通过对同一切片的四个连续图像取平均而获得的。最终图像是通过对同一切片的四个连续图像取平均而获得的。使用ImageJ软件分析数字图像，以确定总核荧光强度(TNFI)、总胞质荧光强度(TCFI)或总荧光强度(TFI)。
实施例7
用于黑素瘤的治疗响应标志物的其他组合
使用实施例6中描述的相同数据集，对标志物的其他特定组合的预后价值进行了进一步分析，包括LC3B+细胞百分比(即，其中“LC3B+”表示LC3B阳性细胞的％>18.5％和LCB-表示LC3B阳性细胞的％≤18.5％)和BRAF/NRAS突变状态(Mut vs WT)的组合(图17A)或LC3B+细胞的百分比和LDH的组合(图17B)。基于这个分析，患者可分为3组：第1组：LC3B+/LDH-/WT；LC3B+/LDH+/WT或LC3B+/LDH-/Mut；第2组：LC3B-/LDH-/WT；和第3组：LC3B+/LDH+/WT；LC3B-/LDH+/Mut；LC3B-/LDH+/WT和LC3B-/LDH-/Mut(图17C)。第3组中的那些患者可能仅部分响应检查点抑制剂疗法，以及第3组中的患者不太可能响应检查点抑制剂疗法(图17D)。这些患者是LCB-(即LC3B+细胞百分比较低)或LC3B+LDH+/Mut。提出可以向这类患者施用增加LC3B表达的治疗剂，如G9a抑制剂，从而使患者对检查点抑制剂治疗敏感。相反，第1组的患者可能响应检查点抑制剂疗法(图17D)，且因此不太可能需要进一步的辅助治疗(例如G9a抑制剂治疗)。
实施例8
G9A抑制对免疫检查点分子的作用
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在介导针对免疫检查点抑制剂的免疫疗法的抗癌作用中起着核心作用。为了评估G9a抑制对TIL的作用，将来自AT3肿瘤的TIL暴露于G9a抑制剂，然后评估细胞的免疫状态。如图18中所示，G9a抑制导致CD8+T细胞中PD-L1和PD-1的下调。这是一个重要发现，因为肿瘤内CD8+T细胞PD-1表达决定了对抗PD-1治疗的响应(Ngiow SF等，(2015)Cancer research 75(18)：3800-3811)。这些结果表明靶向G9a(EHMT2)可能调节免疫检查点抑制剂分子，以进一步增强免疫疗法的功效。
材料和方法
小鼠
C57BL/6小鼠购自ARC动物资源中心，并在6至16周龄之间使用。每个实验使用3至8只小鼠的组进行实验分析，以确保有足够的能力检测生物学差异。所有实验均由QIMRBerghofer医学研究所动物伦理委员会批准。
肿瘤细胞系
按照之前所述的(Casciello等，PNAS 2017)，维持了C57BL/6 AT3乳腺腺癌(于2009年从Dr.Trina Stewart，Peter MacCallum癌症中心，墨尔本，澳大利亚获得)。测试了AT3细胞系是支原体阴性。对于体内实验，将1×106个细胞以100μL的体积皮下注射到小鼠体内。
抗体和试剂
纯化的抗小鼠CD40 mAb(FGK4.5；100mg，除非另有说明)，PD1mAb(RMP1-14；250mg)，CD73(TY/23；250mg)和对照Ig(2A3；250mg；cIg)购自BioXCell(West Lebanon)。所有抗体和试剂均按所示剂量(腹膜内)使用，治疗后48至72小时(除非另有说明)收获肿瘤组织用于流式细胞术分析。
体内治疗
使用数字卡尺测量了AT3肿瘤的生长，并将肿瘤体积表示为平均±SEM。为了对肿瘤内免疫细胞进行流式细胞术分析，对荷有已建立的AT3肿瘤(第14-19天)的小鼠用所示的抗体或试剂进行治疗，并在治疗后48至72小时分离出免疫细胞。
流式细胞术分析
从已经用mAb或其他治疗过的小鼠中收获肿瘤组织，并处理用于流式细胞术分析。对于表面染色，用eFluor780抗CD45.2(104；eBioscience)、eFluor450或Brilliant Violet605抗CD4(RM4-5；eBioscience和Biolegend)、PE-Cy7或Brilliant Violet 421抗CD8a(53-6.7；eBioscience和Biolegend)、FITC或PE抗TCRb(H57-597；eBioscience)、PE-Cy7-抗CD11b(M1/70；eBioscience)、eFluor450-抗-Gr1(RB6-8C5；eBioscience)、FITC-或PE-抗PD1(J43；eBioscience和BD Pharmingen)、APC-抗PDL1(10F.9G2；Biolegend)、PE-抗CD27(LG.3A10；BD Pharmingen)、PE-抗CD86(GL1；BD Pharmingen)、APC抗-CD80(16-10A1；eBioscience)、PE-抗CD70(FR70；BD Pharmingen)、FITC-抗CD40(HM40-3；BD Pharmingen)、生物素-缀合的抗CD28(37.51；Biolegend)、PE-Cy7-或PC缀合的链菌亲和素(eBioscience)、Alexa Fluor 488-抗CD25(PC61.5；eBioscience)、Brilliant Violet605-抗CD127(A7R34；Biolegend)、PE-Cy7-抗-CD278(ICOS；7E.17G9；eBioscience)、APC-抗-CD223(Lag3；C9B7W；Biolegend)、PE抗-CD366(Tim3；RMT3-23；Biolegend)、APC抗TIGIT(1G9；Biolegend)、PE-Cy7抗CD39(24DMS1；eBioscience)、PE抗CD73(TY/23；BDPharmingen)、APC-抗CD44(IM7；Biolegend)、FITC-抗CD62L(MEL-14；Biolegend)和相应的同种型抗体在存在抗CD16/32(2.4G2)的情况下对肿瘤浸润性白细胞(TIL)进行染色。使用7AAD(Biolegend)或Zombie Aqua Fixable Viability Kit(Biolegend)排除死细胞。对于胞内转录因子染色，根据制造商的实验方案，使用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience)固定并打孔表面染色的细胞，并使用eFluor450-抗-Foxp3(FJK-16s，eBioscience)、FITC-抗-Tbet(4B10；Biolegend)、APC-抗-CTLA4(UC10-4B9，eBioscience)、Alexa Fluor 647-抗-Ki67(B56)、eFluor660-抗-Eomes(Dan11mag；eBioscience)和相应的同种型抗体进行染色。对于IFNg/TNF或IL12p40的胞内染色，在存在GolgiPlug(BDBiosciences)的情况下，分别用50ng/mL PMA(Sigma Aldrich)和1mg/mL离子霉素(SigmaAldrich)，或100ng/mL LPS在体外刺激细胞4小时，然后如上所述进行表面染色。然后根据制造商的实验方案，使用BD Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)固定并打孔表面染色的细胞，并用PE-抗-IL12p40(C15.6；BD Pharmingen)、PE-抗-IFNg(XMG1.2；Bioscience)、Alexa Fluor 647-抗颗粒酶B(GB11；BD Pharmingen)和Brilliant Violet 605-抗TNF(MP6-XT22；Biolegend)，以及各自的同种型抗体进行染色。在BD FACSCANTO II和LSR(BDBiosciences)上采集细胞，并使用FlowJo(Tree Star)进行分析。
统计分析
使用Graph Pad Prism软件进行统计分析。肿瘤生长的显著差异通过未配对的t检验确定。细胞子集的显著差异是通过未配对的t检验确定的。P<0.05的值被认为具有统计学显著性。
表3.序列
Figure BDA0003052083820000891
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Claims (52)

1.一种用于确定评估癌症受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的方法，所述方法包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：
(1)确定来自受试者的样品中至少一种癌症治疗生物标志物的生物标志物值，其中所述癌症治疗生物标志物或所述癌症治疗生物标志物之一是MAP1LC3B的表达产物；以及
(2)使用所述生物标志物值确定所述指标，其中所述指标至少部分指示响应癌症治疗的可能性；
其中所述癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
2.根据权利要求1所述的方法，其中MAP1LC3B的表达产物是多核苷酸，且MAP1LC3B的生物标志物值表示样品中多核苷酸的丰度或浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其中多核苷酸表达产物包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其中MAP1LC3B的表达产物是多肽，且MAP1LC3B的生物标志物值表示样品中多肽的丰度或浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其中多肽表达产物包含与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求2至5任一项所述的方法，其中：
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度大致相同，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应；或
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度降低了，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应。
7.根据权利要求2至5任一项所述的方法，其中：
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度增加了，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阳性响应；
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度大致相同，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阳性响应。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中至少一种癌症治疗生物标志物之一是EHMT2的表达产物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中EHMT2的表达产物是多核苷酸，且EHMT2的生物标志物值表示样品中多核苷酸的丰度或浓度。
10.根据权利要求9所述的方法，其中多核苷酸表达产物包含与SEQ ID NO:3、5、7、9和11任一个中所示序列具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列。
11.根据权利要求8所述的方法，其中EHMT2的表达产物是多肽，且EHMT2的生物标志物值表示样品中多肽的丰度或浓度。
12.根据权利要求11所述的方法，其中多肽表达产物包含与SEQ ID NO:4、6、8、10和12任一个中所示序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求9至12任一项所述的方法，其中：
EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度增加了，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应；
EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度大致相同，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应；
EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阴性响应相关的丰度或浓度降低了，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阳性响应；或
EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度大致相同，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阳性响应。
14.根据权利要求13所述的方法，其中：
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度降低了；
EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于与癌症治疗的阳性响应相关的丰度或浓度增加了；和
则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应。
15.根据权利要求7至14任一项所述的方法，其中对治疗的阳性响应是对治疗的完全或部分响应。
16.根据权利要求8至15任一项所述的方法，其中所述指标由MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度与EHMT2的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度的比例得到。
17.根据权利要求16所述的方法，其中：
所述比例相对于与治疗的阴性响应相关的比例更高，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阳性响应；
所述比例与与治疗的阳性响应相关的比例大致相同，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阳性响应；
所述比例相对于与治疗的阳性响应相关的比例更低，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应；或
所述比例相对于与治疗的阴性响应相关的比例大致相同，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应。
18.根据权利要求17所述的方法，其中对治疗的阳性响应是对治疗的完全或部分响应。
19.根据权利要求18所述的方法，其中：
所述比例相对于与治疗的部分响应相关的比例更高，则由此确定所述指标至少部分指示对癌症治疗的完全响应；
所述比例与与治疗的完全响应相关的比例大致相同，则由此确定所述指标至少部分指示对癌症治疗的完全响应；
所述比例相对于与治疗的完全响应相关的比例更低，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的部分响应；
所述比例与与治疗的部分响应相关的比例大致相同，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的部分响应；
所述比例相对于与治疗的部分响应相关的比例更低，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应；或
所述比例与与治疗的阴性响应相关的比例大致相同，则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应。
20.根据权利要求8至19任一项所述的方法，其中通过测量EHMT1的表达产物的丰度或浓度来确定EHMT2的表达产物的生物标志物值。
21.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中至少一种癌症治疗生物标志物包括LDH、BRAF和NRAS。
22.根据权利要求21所述的方法，其中通过测量血清LDH的丰度、水平或浓度来确定血清LDH的生物标志物值。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中BRAF和NRAS的生物标志物值是BRAF/NRAS突变状态，其中通过检测BRAF和NRAS中存在或不存在突变来确定BRAF/NRAS突变状态，由此BRAF和NRAS中检测到一个或多个突变是阳性BRAF/NRAS突变状态，而BRAF和NRAS中检测到无突变是阳性BRAF/NRAS突变状态。
24.根据权利要求21至23任一项所述的方法，其中：
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平增加了；血清LDH的丰度或浓度与健康受试者的相关；BRAF/NRAS突变状态是阴性或阳性；则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的完全响应；或
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平增加了；血清LDH的丰度或浓度相对于健康受试者的增加了；BRAF/NRAS突变状态是阴性；则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的完全响应。
25.根据权利要求21至23任一项所述的方法，其中：
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平降低了；血清LDH的丰度或浓度与健康受试者的相关；BRAF/NRAS突变状态是阴性；则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的部分响应。
26.根据权利要求21至23任一项所述的方法，其中：
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平增加了；血清LDH的丰度或浓度相对于健康受试者的增加了；BRAF/NRAS突变状态是阳性；则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应；
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平降低了；血清LDH的丰度或浓度相对于健康受试者的增加了；BRAF/NRAS突变状态是阴性或阳性；则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应；或
MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的丰度或浓度相对于参照水平降低了；血清LDH的丰度或浓度与健康受试者的相关；BRAF/NRAS突变状态是阳性；则由此确定所述指标至少部分指示对治疗的阴性响应。
27.根据权利要求1至26任一项所述的方法，其中使用核酸扩增技术、测序平台、阵列和杂交平台、显微镜检查、免疫组织化学、流式细胞术、免疫测定、质谱或其组合来测量所述生物标志物值。
28.根据权利要求27所述的方法，其中使用定量RT-PCR来测量生物标志物值。
29.根据权利要求1至28任一项所述的方法，其中样品包含癌症或肿瘤细胞。
30.一种用于治疗受试者癌症的方法，所述方法包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：
进行根据权利要求1至29任一项所述的方法；以及
基于指标至少部分指示对癌症治疗的阳性响应、对癌症治疗的完全响应、和/或对癌症治疗的部分响应，使受试者暴露于癌症治疗；
其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
31.一种使癌症受试者对癌症治疗敏感的方法，所述方法包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：
进行根据权利要求1至29任一项所述的方法；以及
基于指标至少部分指示对癌症治疗的阴性响应或对癌症治疗的部分响应，将EHMT2或EHMT1抑制剂施用于受试者；
其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
32.根据权利要求23所述的方法，其中EHMT2或EHMT1抑制剂选自小分子、特异性的抗体或抗原结合片段、适体和核酸分子。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中EHMT2抑制剂选自A-366、BIX01294、BRD4770、CM-272、E72、UNC0224、UNC0321、UNC0638、UNC0642、UNC0646和轮枝孢菌素A之中。
34.根据权利要求31至33任一项所述的方法，进一步包括使受试者暴露于癌症治疗。
35.根据权利要求1至34任一项所述的方法，其中免疫检查点抑制剂选自CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂或其组合之中。
36.根据权利要求35所述的方法，其中CTLA-4抑制剂是伊匹单抗或曲美木单抗。
37.根据权利要求35所述的方法，其中PD-1抑制剂选自派姆单抗、pidilizumab、纳武单抗、REGN2810、CT-001、AMP-224、BMS-936558、MK-3475、MEDI0680和PDR001之中。
38.根据权利要求35所述的方法，其中PDL-L1抑制剂选自阿特珠单抗、杜鲁伐单抗、奥维单抗、BMS-936559和MEDI4736之中。
39.权利要求30或34任一项所述的方法，其中癌症治疗包括进一步的化疗和/或放疗。
40.根据权利要求1至39任一项所述的方法，其中癌症是实体肿瘤。
41.根据权利要求40所述的方法，其中实体肿瘤是黑素瘤。
42.根据权利要求41所述的方法，其中黑素瘤是转移性黑素瘤。
43.根据权利要求1至39任一项所述的方法，其中癌症是血液肿瘤。
44.一种用于确定评估癌症受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的组合物，所述组合物或固体支持物包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：MAP1LC3B转录物或其cDNA和至少一种与MAP1LC3B转录物或其cDNA杂交的寡核苷酸引物或探针，以及EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA和至少一种与EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA杂交的寡核苷酸引物或探针，其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
45.一种用于确定评估癌症受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的固体支持物，所述固体支持物包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：至少一种固定于固体支持物的第一寡核苷酸引物或探针，其中至少一种第一寡核苷酸引物或探针与MAP1LC3B转录物或cDNA杂交；和至少一种固定于固体支持物的第二寡核苷酸引物或探针，其中至少一种第二寡核苷酸引物或探针与EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA杂交，其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
46.根据权利要求45所述的固体支持物，进一步包括与至少一种第一寡核苷酸引物或探针杂交的MAP1LC3B转录物或其cDNA；以及与至少一种第二寡核苷酸引物或探针杂交的EHMT2或EHMT1转录物或其cDNA。
47.根据权利要求44所述的组合物或权利要求45或46的固体支持物，其中cDNA对应于源自细胞或细胞群的mRNA。
48.根据权利要求47所述的组合物或固体支持物，其中细胞或细胞群是肿瘤细胞或肿瘤细胞群。
49.一种用于确定评估癌症受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的组合物，所述组合物包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：肿瘤细胞、结合MAP1LC3B的多肽表达产物的检测剂和结合EHMT2或EHMT1的多肽表达产物的检测剂，其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中检测剂是抗体或其抗原结合片段。
51.一种用于确定评估癌症受试者响应癌症治疗的可能性中使用的指标的试剂盒，所述试剂盒包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：(a)至少一种可以定量生物样品中MAP1LC3B的多核苷酸或多肽表达产物的试剂；和任选(b)使用至少一种试剂的说明；其中癌症治疗包括使用免疫检查点抑制剂的治疗。
52.根据权利要求51所述的试剂盒，进一步包括至少一种可以定量生物样品中EHMT2或EHMT1的多核苷酸或多肽表达产物的试剂；和/或至少一种可以定量血清LDH的试剂。
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