CN113039210A - 在棒杆菌属宿主细胞中经由工程改造降解标签变体的可控蛋白降解 - Google Patents

在棒杆菌属宿主细胞中经由工程改造降解标签变体的可控蛋白降解 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在宿主细胞内产生控制***，以限制或消除发酵期间某些时间的关键指定产物的降解，并使细胞的代谢通量重转向相同关键指定产物的更高产量。

Description

在棒杆菌属宿主细胞中经由工程改造降解标签变体的可控蛋 白降解
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月19日提交的美国临时专利申请号62/733,521(其内容以其整体通过引用并入本文)的优先权。
发明领域
本发明涉及微生物遗传学和重组DNA技术的领域。本教导提供了可用于在细菌细胞中、特别是在棒杆菌属物种中可控地诱导和调节蛋白降解的多核苷酸序列、多肽序列、载体、微生物和方法。
发明背景
在未修饰的细胞中，存在于细胞生命周期中的不同点的蛋白的量不仅与蛋白合成有关，而且与蛋白降解有关。考虑到这一点，不足为奇的是，细胞内蛋白的半衰期变化很大，从几分钟至几天，并且蛋白降解的不同速率是细胞调节装置的重要方面。例如，调节分子、诸如转录因子被迅速降解，以使细胞对其环境中的变化条件快速响应。其他蛋白响应于特定的代谢信号而迅速降解，为细胞内酶活性的调节提供了另一种机制。另外，错误或受损的蛋白被识别并在细胞内被迅速降解，由此消除或限制在蛋白合成期间造成的错误的后果。
在细菌***中，发生蛋白降解以除去受损和/或错误折叠的蛋白。在该能力中发挥功能的***是ssrA-介导的标记降解***。ssrA标签(一种添加至在翻译期间停滞的蛋白的C-末端的11-aa肽)靶向蛋白以用于被蛋白酶ClpXP和ClpAp降解。ssrA标签与SspB相互作用，所述SspB是ClpX的特异性-增强因子(也称为衔接子蛋白)。SspB和ClpX共同作用以识别ssrA-标记的底物用于蛋白水解。
然而，天然蛋白降解***经常过于有效地工作，因为蛋白水解降解可以仅由ssrA-介导的标记触发。因此，本领域寻求改进的方法，其中可以更好地控制蛋白降解，包括对于特定底物的降解速率和特定代谢阶段中降解的时机的更好控制。
发明概述
本发明涵盖增加由工程改造的微生物生物体产生的期望产物的滴度和/或产率的改进方法。这种增强通过诱导靶酶的降解来实现，其中靶酶或者代谢期望的产物，或者靶酶作为用于产生期望产物的合成途径的负反馈发挥功能。因为靶酶可能是在微生物生物体的生长阶段期间必需的酶，所以至关重要的是，直至细胞生长稳定，靶酶的降解才显著发生。一旦可以减慢或停止微生物生物体的生长，则可以诱导靶酶的降解。本发明通过重组工程改造微生物生物体以表达异源蛋白降解***来实现该目的，所述异源蛋白降解***包括衔接子蛋白和降解标签，其中可以在期望的时间点诱导衔接子蛋白的表达以触发蛋白水解。
因此，在一个方面，本发明提供了微生物生物体，其已经被重组工程改造以表达异源蛋白降解***，所述异源蛋白降解***包括衔接子蛋白和降解标签。在一些实施方案中，所述微生物生物体是棒杆菌属宿主细胞。在某些实施方案中，所述微生物生物体是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。在一些实施方案中，所述异源蛋白降解***包括获得自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的衔接子蛋白或其功能变体。例如，所述衔接子蛋白可以是TrfA衔接子蛋白，其包含与SEQ ID NO. 4具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述异源蛋白降解***包括降解标签，所述降解标签在5'至3'方向上包括衔接子结合区、任选的间隔区和蛋白酶识别区，其中所述衔接子结合区特异性结合所述TrfA衔接子蛋白。所述降解标签的蛋白酶识别区允许由所述降解标签标记的靶蛋白被蛋白酶、诸如ClpCP、ClpXP或ClpAP识别。在优选实施方案中，所述蛋白酶是宿主细胞中天然的蛋白酶。值得注意的是，直到诱导TrfA衔接子蛋白的表达且trfA衔接子蛋白结合降解标签的衔接子结合区，才发生显著的降解。换言之，仅当(1)所述靶蛋白被根据本发明的降解标签标记和(2)相应的衔接子蛋白的表达被诱导时，本发明的异源蛋白降解***才确保发生靶蛋白的显著降解。例如，通过观察到与表达衔接子蛋白之前相比，在诱导衔接子蛋白之后，靶蛋白的量减少至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，可以测量显著的降解。
在各个实施方案中，根据本教导的降解标签是具有SEQ ID NO. 22的氨基酸序列的金黄色葡萄球菌降解标签的变体。更具体地，本降解标签变体包括选自DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS和HPP的氨基酸序列作为其C-末端的最后三个氨基酸。例如，本降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ IDNO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56、SEQ ID NO. 57或SEQ ID NO. 58的氨基酸序列。在某些实施方案中，本降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 30或SEQ ID NO. 32的氨基酸序列。在某些实施方案中，本降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56、SEQ ID NO. 57或SEQ ID NO. 58的氨基酸序列。在某些实施方案中，本降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 24或SEQ ID NO. 26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了微生物生物体，其已经被重组工程改造以表达异源蛋白降解***，所述异源蛋白降解***包括获得自大肠杆菌的衔接子蛋白或其功能变体。例如，所述衔接子蛋白可以是SspB衔接子蛋白，其包含与SEQ ID NO. 2具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述异源蛋白降解***包括降解标签，所述降解标签在5'至3'方向上包括衔接子结合区、任选的间隔区和蛋白酶识别区，其中所述衔接子结合区特异性结合所述SspB衔接子蛋白。所述降解标签的蛋白酶识别区允许由所述降解标签标记的靶蛋白被蛋白酶、诸如ClpCP、ClpXP或ClpAP识别。在优选实施方案中，所述蛋白酶是宿主细胞中天然的蛋白酶。值得注意的是，直到诱导SspB衔接子蛋白的表达且SspB衔接子蛋白结合降解标签的衔接子结合区，才发生显著的降解。例如，通过观察到与表达衔接子蛋白之前相比，在诱导衔接子蛋白之后，靶蛋白的量减少至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，可以测量显著的降解。
在各个实施方案中，根据本教导的降解标签是具有SEQ ID NO. 8的氨基酸序列的大肠杆菌降解标签的变体。更具体地，本降解标签变体包括选自DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS和HPP的氨基酸序列作为其C-末端的最后三个氨基酸。例如，本降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ IDNO. 18、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43、SEQ IDNO. 44、SEQ ID NO. 45或SEQ ID NO. 46的氨基酸序列。在某些实施方案中，本降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 16或SEQ ID NO. 18的氨基酸序列。在某些实施方案中，本降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ IDNO. 37、SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44、SEQ ID NO. 45或SEQ ID NO. 46的氨基酸序列。在某些实施方案中，本降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 10或SEQ ID NO. 12的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了微生物生物体，其已经被重组工程改造以表达两种分开的异源蛋白降解***，具体地，包括第一衔接子蛋白和第一降解标签变体的第一蛋白降解***，以及包括第二衔接子蛋白和第二降解标签变体的第二蛋白降解***。所述第一和第二异源蛋白降解***可以正交地发挥功能，使得各自靶向不同的靶蛋白并且串扰(cross-talk)最小，例如，所述第一衔接子蛋白不靶向由所述第二降解标签变体识别的蛋白酶，或反之亦然。
根据此类实施方案，所述第一衔接子蛋白可以获得自金黄色葡萄球菌，或者可以是其功能变体。例如，所述第一衔接子蛋白可以是TrfA衔接子蛋白，其包含与SEQ ID NO. 4具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一降解标签变体在5'至3'方向上可以包括衔接子结合区、任选的间隔区和蛋白酶识别区，其中所述衔接子结合区特异性结合所述TrfA衔接子蛋白。所述降解标签的蛋白酶识别区允许由所述降解标签标记的靶蛋白被蛋白酶、诸如ClpCP、ClpXP或ClpAP识别。所述第一降解标签可以是具有SEQ ID NO. 22的氨基酸序列的金黄色葡萄球菌降解标签的变体。更具体地，所述第一降解标签变体可以包括选自DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS和HPP的氨基酸序列作为其C-末端的最后三个氨基酸。例如，所述第一降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 30、SEQ IDNO. 32、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ IDNO. 56、SEQ ID NO. 57或SEQ ID NO. 58的氨基酸序列。所述第二衔接子蛋白可以获得自大肠杆菌，或者可以是其功能变体。例如，所述第二衔接子蛋白可以是SspB衔接子蛋白，其包含与SEQ ID NO. 2具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第二降解标签在5'至3'方向上可以包括衔接子结合区、任选的间隔区和蛋白酶识别区，其中所述衔接子结合区特异性结合所述SspB衔接子蛋白。所述降解标签的蛋白酶识别区允许由所述降解标签标记的靶蛋白被蛋白酶、诸如ClpCP、ClpXP或ClpAP识别。所述第二降解标签可以是具有SEQ ID NO. 8的氨基酸序列的大肠杆菌降解标签的变体。更具体地，所述第二降解标签变体可以包括选自DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS和HPP的氨基酸序列作为其C-末端的最后三个氨基酸。例如，所述第二降解标签变体可以包括SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQID NO. 18、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43、SEQID NO. 44、SEQ ID NO. 45或SEQ ID NO. 46的氨基酸序列。
本发明的另一个方面提供了控制微生物生物体、诸如棒杆菌属宿主细胞中的第一靶蛋白的降解的方法，其中所述宿主细胞已经被重组工程改造以表达第一异源蛋白降解***，所述第一异源蛋白降解***包括第一衔接子蛋白和第一降解标签变体，且其中所述宿主细胞也已经被重组工程改造以经由第一异源生物合成途径产生第一产物。所述方法可以包括(i)表达适于标记第一靶蛋白的第一降解标签变体；(ii)使宿主细胞生长，直至达到期望的生长速率；和(iii)诱导第一衔接子蛋白的表达，其中所述第一衔接子蛋白可以是TrfA衔接子蛋白，其包含与SEQ ID NO. 4具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在诱导TrfA衔接子蛋白的表达之后，宿主细胞中存在的第一靶蛋白的量可以减少至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。所述减少可能由通过选自ClpCP、ClpXP和ClpAP的蛋白酶的降解引起。
在各个实施方案中，所述第一靶蛋白可以是宿主细胞生长的必需蛋白。在一些实施方案中，所述第一靶蛋白的存在可以在用于产生第一产物的第一异源生物合成途径中作为负反馈发挥功能。在其他实施方案中，所述第一靶蛋白可以代谢第一产物，由此减少所述第一产物的可收集量。
在各个实施方案中，可以通过温度变化、pH变化、暴露于光和/或通过改变宿主细胞内给定分子的水平来诱导TrfA衔接子蛋白的表达。在各个实施方案中，所述第一降解标签的C-末端的最后三个氨基酸序列可以选自DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS和HPP。
在一些实施方案中，本发明可以涉及宿主细胞，所述宿主细胞已经被进一步重组工程改造以表达第二蛋白降解***，所述第二蛋白降解***包括第二衔接子蛋白和第二降解标签变体，且所述宿主细胞也已经被重组工程改造以经由第二异源生物合成途径产生第二产物。所述方法可以包括(iv)表达适于标记第二靶蛋白的第二降解标签变体；和(v)在宿主细胞已经达到期望的生长速率之后，诱导第二衔接子蛋白的表达，其中所述第二衔接子蛋白可以是SspB衔接子蛋白，其包含与SEQ ID NO. 2具有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在诱导SspB衔接子蛋白的表达之后，宿主细胞中存在的第二靶蛋白的量可以减少至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。所述减少可能由通过选自ClpCP、ClpXP和ClpAP的蛋白酶的降解引起。
在各个实施方案中，所述第二靶蛋白可以是宿主细胞生长的必需蛋白。在一些实施方案中，所述第二靶蛋白的存在可以在用于产生第二产物的第二异源生物合成途径中作为负反馈发挥功能。在其他实施方案中，所述第二靶蛋白可以代谢第二产物，由此减少所述第二产物的可收集量。
在各个实施方案中，可以通过温度变化、pH变化、暴露于光和/或通过改变宿主细胞内给定分子的水平来诱导SspB衔接子蛋白的表达。在各个实施方案中，所述第二降解标签的C-末端的最后三个氨基酸序列可以选自DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS和HPP。
在各个实施方案中，所述第一产物和/或所述第二产物可以是选自甲硫氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、精氨酸和半胱氨酸的氨基酸。在某些实施方案中，所述第一产物和/或所述第二产物可以是选自L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸和L-半胱氨酸的L-氨基酸。
尽管本公开可以具有各种修改和替代形式，但其具体实施方案在附图中通过实例的方式显示，并且将在本文中详细描述。然而，应理解，本文中呈现的附图和详述并非意欲将本公开限制为公开的具体实施方案，但相反，意欲涵盖落在如所附权利要求所定义的本公开的精神和范围内的所有修改、等同形式和替代形式。
在参考附图对本发明的优选实施方案的以下详述中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图简述
图1举例说明降解标签20如何可操作地连接至靶蛋白10。降解标签通常位于靶蛋白的C末端附近。降解标签20包括衔接子结合区202、任选的间隔区204和蛋白酶识别区206。
图2表明ssrA降解标签(野生型大肠杆菌)及其变体(即具有合成衍生的Clp蛋白酶识别序列的变体)如何可以对标记的靶蛋白的降解具有不同的调节作用以及衔接子蛋白SspB(来自野生型大肠杆菌)的表达如何可以诱导并与ssrA降解标签及其变体的使用配对以进一步允许动态控制标记的靶蛋白的降解。具体地，将报告蛋白mCherry用作靶蛋白，并测量其荧光信号以允许定量比较。将用标记的mCherry获得的荧光测量值针对用野生型mCherry获得的那些归一化(左侧的前两个条)。每个数据集都包括无诱导SspB(左)和有诱导SspB(右)的测量值。在图2中，mCherry的基因表达由强启动子(具体地pSOD)驱动。
图3表明ssrA降解标签(野生型大肠杆菌)及其变体(即具有合成衍生的Clp蛋白酶识别序列的变体)如何可以对标记的靶蛋白的降解具有不同的调节作用以及衔接子蛋白SspB(来自野生型大肠杆菌)的表达如何可以诱导并与ssrA降解标签及其变体的使用配对以进一步允许动态控制标记的靶蛋白的降解。具体地，将报告蛋白mCherry用作靶蛋白，并测量其荧光信号以允许定量比较。将用标记的mCherry获得的荧光测量值针对用野生型mCherry获得的那些归一化(左侧的前两个条)。每个数据集都包括无诱导SspB(左)和有诱导SspB(右)的测量值。在图3中，mCherry的基因表达由弱启动子(具体地Min5)驱动。
图4表明trfA降解标签(野生型金黄色葡萄球菌)及其变体(即具有合成衍生的Clp蛋白酶识别序列的变体)如何可以对标记的靶蛋白的降解具有不同的调节作用以及衔接子蛋白TrfA(来自野生型金黄色葡萄球菌)的表达如何可以诱导并与trfA降解标签及其变体的使用配对以进一步允许动态控制标记的靶蛋白的降解。具体地，将报告蛋白mCherry用作靶蛋白，并测量其荧光信号以允许定量比较。将用标记的mCherry获得的荧光测量值针对用野生型mCherry获得的那些归一化(左侧的前两个条)。每个数据集都包括无诱导SspB(左)和有诱导SspB(右)的测量值。在图4中，mCherry的基因表达由强启动子(具体地pSOD)驱动。
图5表明trfA降解标签(野生型金黄色葡萄球菌)及其变体(即具有合成衍生的Clp蛋白酶识别序列的变体)如何可以对标记的靶蛋白的降解具有不同的调节作用以及衔接子蛋白TrfA(来自野生型金黄色葡萄球菌)的表达如何可以诱导并与trfA降解标签及其变体的使用配对以进一步允许动态控制标记的靶蛋白的降解。具体地，将报告蛋白mCherry用作靶蛋白，并测量其荧光信号以允许定量比较。将用标记的mCherry获得的荧光测量值针对用野生型mCherry获得的那些归一化(左侧的前两个条)。每个数据集都包括无诱导SspB(左)和有诱导SspB(右)的测量值。在图4中，mCherry的基因表达由弱启动子(具体地Min5)驱动。
详述
金黄色葡萄球菌trfA. 金黄色葡萄球菌trfA是与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的蛋白水解衔接子蛋白mecA相关的衔接子基因，其编码牵涉于多种作用(尤其是蛋白水解和遗传能力)的衔接子蛋白。其缺失导致甲氧西林敏感或甲氧西林抗性(MRSA)的临床或实验室分离株的糖肽-中间体金黄色葡萄球菌(GISA)衍生物中几乎完全丧失对苯唑西林和糖肽抗生素的抗性。重要地，已经发现TrfA衔接子蛋白与ClpCP相互作用，以帮助控制金黄色葡萄球菌中的蛋白降解。
特异性-增强因子SspB . SspB衔接子蛋白存在于各种各样的生物体中，并指导ssrA-标记的蛋白被细胞蛋白酶(经常是ClpXP或ClpCP蛋白酶复合物)降解。已经显示SspB与ClpXP的相互作用进一步增强蛋白酶复合物的活性。
ClpXP. ClpXP是一种蛋白复合物，其由四个ClpX亚基(其发挥功能以识别和结合非结构化蛋白)和六个ClpP亚基(其作为ATP依赖性蛋白酶发挥功能)组成。ClpXP复合物在革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体间发现，并且是细菌中的蛋白表达的主要质量控制机制之一。
先前的研究已经显示通过将ssrA降解标签添加至靶蛋白的C-末端而在大肠杆菌中的有效的蛋白降解。经由SspB实现控制，如上所述，所述SspB是ssrA标签与ClpXP蛋白酶复合物的有效结合所需的衔接子蛋白，所述ClpXP蛋白酶复合物的表达可以由外源性诱导剂紧密控制。另外，改变ssrA标签的最后三个氨基酸已经被显示调节有和没有SspB衔接子蛋白的靶向蛋白降解的效率和速率。
然而，据发明人所知，文献中还没有成功表明谷氨酸棒杆菌中的可控的、可诱导的异源蛋白降解***的具体报道。此外，发明人已经开发了新型的降解标签变体，其自身不触发通过天然蛋白酶的降解(或仅极少地)，但在诱导表达大肠杆菌SspB和/或金黄色葡萄球菌TrfA后，靶向受靶向底物，用于通过此类天然蛋白酶的显著降解。
由于其在生物素限制下分泌大量氨基酸L-谷氨酸的能力，谷氨酸棒杆菌在1957年在日本分离。在最后几十年内，谷氨酸棒杆菌也已经不仅被修饰成优异的氨基酸的生产平台，而且还被修饰成各种其他代谢物(包括有机酸)的生产平台。此外，棒杆菌的固有特性使其成为大规模商业生产的优异选择。此类内在特征包括其缺乏致病性和其缺乏孢子形成能力(美国生物学评估和研究中心(U.S. Center for Biologics Evaluation andResearch)和美国药物评估和研究中心(U.S. Center for Drug Evaluation andResearch)指南所列出的两种期望性状)，以及其高生长速率，其相对有限的生长需求，不存在某些工业菌株在低生长条件下的自溶作用，棒杆菌基因组本身的相对稳定性以及不存在天然的细胞外蛋白酶分泌使得棒杆菌属成为工业规模蛋白表达的非常好的宿主。
尽管存在这些有希望的属性，但由于缺乏可用的合成生物学工具来可预测地控制基因转录、蛋白降解、翻译和期望途径的整体活性而不损害基本细胞功能，开发棒杆菌作为合成生物学生产的平台受到阻碍。此外，尚未完成开发和完全表征棒杆菌属中各种基因回路的性能的尝试。此外，在大肠杆菌或其他生物体中开发和完善的许多工具并不总是直接转移至棒杆菌属或与棒杆菌属相关，需要大量的‘变通方法(work arounds)’来在作为平台生物体的棒杆菌中开发类似的功能。因此，开发用于调节基因回路(诸如ssrA标签***)的工具对于完全解锁棒杆菌属的代谢能力来生产增值化合物是必要的。
此外，对天然代谢酶水平的可调节控制是工程改造棒杆菌属菌株用于生产异源化合物(诸如生物燃料、生物聚合物和具有治疗特性的分子)的关键方面。在这种情况下，敲除可能导致细胞死亡或无法产生高滴度的期望化合物，而静态敲低可能导致不期望的后果，诸如工程改造的菌株生长不良和/或重组蛋白表达不良，所有这些都可能导致低生产滴度。
根据本发明，发明人已经调整了原核生物ssrA标签***以用于棒杆菌属细胞中。根据本发明的修饰的菌株允许通过向一种或多种靶蛋白添加适当的降解标签而允许它们的可调节降解。可以将不同的标签添加至不同的蛋白靶标，从而在降解的程度以及在单一生物体中使用多种诱导剂用于平行控制***的方面，允许降解的差异控制。在报告***中，可以平衡信号检测和动态分辨的竞争要求，而无需额外的克隆程序。与先前描述的***相比，该***具有几个优点。该降解是可调节的，并且对于多种蛋白靶标可以是差异可调节的。降解标签小，并且不可能干扰经修饰的宿主细胞内的蛋白功能。标签的大小简化了通过PCR扩增或使用标签载体构建标记的基因，并且许多基因可以并行标记。
根据本发明，发明人表明大肠杆菌SspB衔接子蛋白与天然棒杆菌属蛋白酶完全相容，并且首次表明使用ssrA标签***用于该属中的标记蛋白降解。发明人已经验证，基于ssrA标签的几种变体(诸如DAS+4变体)的ssrA-标记的蛋白降解的一般模式在大肠杆菌和棒杆菌属两者之间是一致的。发明人还已经验证在棒杆菌属中使用与TrfA衔接子蛋白偶联的金黄色葡萄球菌trfA标签作为ssrA标签的替代。ssrA和trfA标签的衔接子蛋白结合区差异很大，并且在标签***之间没有串扰，可能允许在生长周期中的不同时间点选择性靶向多种蛋白。最后，发明人已经表明通过对广泛的、合理设计的文库的高通量筛选进化了几种DAS+4 ssrA标签的替代方案。新进化的ssrA标签通过在不存在SspB或TrfA衔接子蛋白的情况下降低蛋白降解的背景水平来表明更好的动态范围，同时在诱导衔接子后仍有效地降解标记的蛋白。
关键特征
本发明的某些关键特征包括使用ssrA和trfA蛋白降解标签。这两种标签均含有两个序列基序。第一，SsrA和TrfA衔接子蛋白的识别基序，其包含在序列的第一部分中。第二，C-末端的3个氨基酸，其含有被细胞蛋白酶(诸如ClpXP)识别的降解基序。三个末端残基的确切氨基酸序列决定了靶蛋白的降解速率。先前，证明DAS+4标签在平衡蛋白降解速率中至关重要。发明人已经鉴定了新型标签，包括QPS、KPS和DQA标签，其具有比DAS+4标签更好的活性。
微生物菌株构建
衔接子蛋白SspB和TrfA被整合至谷氨酸棒杆菌染色体中，作为已知IS元件的替代物。具体选择这些位点用于使任何天然棒杆菌属代谢途径的破坏最小化。将衔接子的基因置于几个整合位点之一处，并测试其对报告蛋白的活性。使用的位点是ISCg2c、ISCg2e和ISCg6c。最终，位点ISCg6c被选择为具有最佳独立调节的位点。测试了两种用于sspB衔接子的启动子，特别是谷氨酸棒杆菌磷酸酯诱导型启动子和谷氨酸棒杆菌优化的大肠杆菌Tac启动子。所述Tac启动子还含有lacI阻遏物的谷氨酸棒杆菌优化版本，其在与sspB衔接子开放阅读框的相反方向上取向。整合trfA衔接子，并在Tac启动子的控制下和ISCg6c染色体基因座中进行测试。如先前所述，使用基于侧接同源性区域的单交换敲入进行基因组整合。经由在卡那霉素上生长选择期望的敲入克隆。使用蔗糖选择迫使第二次单交换事件，并且针对期望突变体的存在筛选所得菌落。最终的谷氨酸棒杆菌菌株没有任何选择标记。
降解标签
为了发现表现更好的降解标签，发明人筛选了被替换至ssrA-DAS+4标签上的潜在c-末端氨基酸文库。该文库包括来自下表2的第1列+第2列+第3列中的每种可能的氨基酸组合。如以下实施例所示，本发明提供了降解标签变体，其允许独立地离散控制棒杆菌属中标记蛋白的初始水平和可诱导降解速率两者。
实施例
方法和材料：
在以下实施例中使用以下菌株：
(1)将谷氨酸棒杆菌ATCC13032用作所有实验的基础棒杆菌属菌株。
(2)谷氨酸棒杆菌-lacI-sspB用密码子优化的大肠杆菌sspB基因序列重组工程改造，所述密码子优化的大肠杆菌sspB基因序列被染色体整合在大肠杆菌pTac启动子的控制下，其中由密码子优化的大肠杆菌lacI(一种lac阻遏物)提供阻遏。
(3)谷氨酸棒杆菌-lacI-trfA用密码子优化的大肠杆菌trfA基因序列重组工程改造，所述密码子优化的大肠杆菌trfA基因序列被染色体整合在大肠杆菌pTac启动子的控制下，其中由密码子优化的大肠杆菌lacI提供阻遏。
(4)将大肠杆菌10G用作标准克隆菌株。
在以下实施例中使用以下质粒：
CgDVK-mCherry表示棒杆菌穿梭载体，其含有在pSOD启动子(强启动子)或Min5启动子(弱启动子)的控制下的报告基因(mCherry)。通过修饰在该质粒骨架上的mCherry报告基因的c-末端来构建所有含有修饰的降解标签的质粒。
转化. 用表达mCherry或mCherry-标签的质粒转化棒杆菌菌株，其中标签序列和名称在下表1中概述。使用标准电穿孔方案进行转化。在Caso-Kan25上选择转化体。
表1. 测试的选择性降解标签的名称和氨基酸序列。将测试的标签添加至报告蛋白的C-末端，并且随后为终止密码子。标签序列以氨基酸格式显示。以斜体显示的序列代表衔接子蛋白(SspB或TrfA)结合区。以粗体显示的序列代表被细胞Clp蛋白酶识别的区域。ssrA-LAA和trfA-VAA的序列代表天然宿主中的WT衔接子/蛋白酶识别序列对。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
使用含有Kan阳性选择和sacB阴性选择标记的***载体，使用标准同源重组技术产生在染色体上含有sspB或trfA衔接子序列的菌株，最终导致无标记的修饰。使用这些工程改造的菌株进行质粒转化和mCherry报告基因测定的方案与使用野生型棒杆菌的方案相同。
DAS+4突变体文库的构建和筛选. 通过从pCBMK- mCherry-DAS+4质粒扩增pSOD-mCherry-ssrA-DAS区域，使用Gibson Assembly产生突变体。将产生文库的突变引入反向引物中。将扩增的区域***pZ8载体中。将Gibson Assembly的产物直接电穿孔至谷氨酸棒杆菌lacI-sspB菌株中。再次在Caso+Kan 25选择上选择所得的菌落。
高通量菌落选择. 在自动液体处理机上经由机器视觉从选择板挑取单个菌落，接种至600μl BHI-Kan25中，并使其在30℃下生长过夜。将过夜培养物进一步稀释至BHI-Kan25或CGXII-Kan25中，并用IPTG诱导，这是衔接子蛋白或报告蛋白合成所需的。测定培养基的选择没有显著影响最终的实验结果，尽管BHI的背景荧光显著高于CGXII的背景荧光。约48小时后，将来自培养物的等分试样1:20稀释至200μl水中，并在585 nm-615 nm的激发-发射波长下测量OD650和mCherry荧光。
从18个产生的文库各自挑取两个96-孔板，并最初在BHI中培养。一旦文库已经生长，将它们接种至有或没有IPTG的CGXII培养基中，以诱导SspB衔接子蛋白的表达。在生长近似48小时后，取每种培养物的荧光和吸光度测量值。未诱导培养物与诱导培养物的荧光比率用于从测定选择初始阳性命中物。
遵循与上述相同的方案，在BioLector微量生物反应器***(m2p-labs GmbH,Germany)中，在48-孔板测定中第二次验证初始命中物，以获得详细的生长曲线和表达模式。从八种表现最好的分离物分离质粒。对编码mCherry和新DAS标签变体的区域进行测序，以确定最终的变化。此外，遵循相同的方案，在更大的培养体积中第二次验证顶级命中物。
结果：
谷氨酸棒杆菌中的SspB功能的验证
选择性降解靶蛋白的能力取决于SspB衔接子蛋白结合ssrA序列并帮助经由细胞Clp蛋白酶复合物引发靶蛋白降解的能力。鉴于SspB/ssrA***从大肠杆菌中分离，所以首先确定其在异源宿主中的功能是至关重要的。
作为结果，SspB被整合至谷氨酸棒杆菌细胞的染色体中，在诱导型启动子的控制下(更准确地，由诱导型lac阻遏物lacI控制的组成型启动子pTac的偶联)，以便具有其活性的开/关控制。将降解标签(野生型ssrA降解标签及其合成变体，其序列提供于表1中)添加至mCherry报告分子并引入宿主中。所得数据显示，大肠杆菌SspB衔接子蛋白维持增加谷氨酸棒杆菌中靶蛋白的选择性降解的活性和能力。
具体地，参考图2，可见当靶蛋白(在该情况下为mCherry)被ssrA (mCherry-LAA)标记并由强启动子(pSOD)驱动时，几乎所有靶蛋白都被蛋白水解。当SspB被诱导(mCherry-LAA + sspB)时，甚至更多的靶蛋白被蛋白水解。在mCherry报告子由弱启动子(Min5)驱动的情况下，降解速率看起来在SspB是否被诱导之间是相当的(图3)。
谷氨酸棒杆菌中的TrfA功能的验证
不同于已经在几种宿主中广泛研究的SspB/ssrA***，已经仅在天然宿主金黄色葡萄球菌中表明了TrfA衔接子蛋白[SEQ ID NO. 4]的活性。此外，关于当使用修饰的Clp识别序列时TrfA-促进的蛋白降解效率的研究很少。在任何应用中使用前，任何宿主中的TrfA活性的广泛验证是必需的。TrfA功能使用SspB/ssrA***作为最低所需活性的指南和基线进行评估。图4和图5表明当使用野生型蛋白酶识别标签trfA [SEQ ID NO. 22]时，与谷氨酸棒杆菌中的SspB***相比，TrfA***以相似的方式表现。由于两种***功能类似，但如下进一步显示，关于蛋白降解动力学的效率具有不同的特性，因此TrfA***和SspB***可以作为两个正交***被整合至同一宿主中，其进而提供了在需要控制至少两种不同必需基因的生物合成生产方法中精细调节蛋白降解的机制。
表现更好的标签变体的筛选
蛋白的C-末端氨基酸组成在所述蛋白是否被细胞蛋白酶识别和降解中发挥重要作用。天然ssrA和trfA蛋白降解标签分别特征在于作为添加至靶蛋白的末端氨基酸的氨基酸LAA和VAA。甚至在不存在衔接子的情况下，这两个序列均导致靶蛋白的快速降解(参见图2-3中的mCherry-LAA和图4-5中的mCherry-VAA)。先前已经探索了几种变体序列，诸如在该工作中测试的DAS和DAS+4序列。然而，如此处所表明，这两个标签对于应用诱导的蛋白降解都不是最佳的，因为添加这些标签中的任一个都大大减少细胞中的靶蛋白的量，甚至在诱导衔接子蛋白前也是如此。如果靶蛋白是细胞生长的必需蛋白，则其与基线存在相比减少超过50%可能对细胞健康非常不利。
因此，下一步是筛选与野生型相比具有改进的蛋白酶识别序列(C-末端区域的最后3个氨基酸)的变体，其显示更好的性能，即，在不存在衔接子蛋白的情况下引起最少蛋白降解、但在诱导表达衔接子蛋白后引起高降解水平的标签。
为此，发明人着手筛选合理设计的Clp蛋白酶识别序列的组合文库。考虑到这是最终的宿主生物体，该筛选直接进行至谷氨酸棒杆菌中。氨基酸和对应的DNA序列显示在下表2和3中。
表2. 并入随机文库中以选择ssrA-DAS+4标签/trfA-DAS+4标签的表现更好的变体的氨基酸组合。位置1、2和3分别对应于DAS标签的氨基酸D、A和S。
Figure 57018DEST_PATH_IMAGE002
表3. 用于选择新型ssrA-标签变体/ trfA-标签变体的每个压缩文库的分解。对于在三个随机位置中的每一个筛选的每个文库，显示核苷酸以及单字母氨基酸的简并IUPAC名称。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
在将文库转化至宿主中之后，针对当不存在SspB/TrfA时的高水平报告蛋白和在SspB/TrfA诱导后的低水平报告蛋白筛选所得的转化体。来自该筛选的结果和顶级命中物显示于表4中。将来自初始筛选的顶部命中物进行择优挑取，并在更大规模下重新证实。最后，在驱动报告基因表达的多种启动子间，将最佳命中物的功能与ssrA和trfA识别序列一起重新筛选。
表4. 如通过对来自筛选的八种选择的质粒进行测序而确定的新标签序列，包括来自筛选的前三种表现最佳的克隆。在表中，“名称”通过板位置标识突变体；“序列”是指通过质粒的测序评价的DAS变体的氨基酸序列；“筛选1比率”是指在初始筛选期间在未诱导/诱导条件下mCherry荧光的比率；“命中挑取比率”是指在将来自筛选1的顶级表现的培养物进行择优挑取并再次筛选以验证其活性后的mCherry荧光的比率。
Figure 36476DEST_PATH_IMAGE004
最终，发现选择的标签中的几种比先前设计的DAS+4标签(尤其是KPS+4和DGA+4标签)给出更好的未诱导/诱导响应曲线(图2-5)。
具体地，显示对SspB***中的蛋白降解的期望的调节作用的变体显示于图2和图3中。这些数据共同提供了证据证明SspB能够促进蛋白降解的效率基于降解标签和驱动靶基因的表达的启动子强度两者而变化。该发现是至关重要的，因为必需蛋白的过早降解可以引起细胞死亡。降解标签和衔接子蛋白的期望配对包括当标记靶蛋白时降解最小并且仅在衔接子蛋白诱导后才发生显著降解的情况。当比较诱导SspB之前和之后靶蛋白信号(在此处呈归一化荧光强度的形式)的比率时，可以看到ssrA-KPS+4标签[SEQ ID NO. 16] (参考mCherry-KPS+4，针对mCherry-KPS+4 + sspB)实现了该目标。更具体地，可以看到在标记的mCherry由强启动子驱动的情况下，在诱导SspB之前存在一些降解(约7%)，但在诱导SspB之后观察到显著的降解(约32%)。参见图2。当标记的mCherry由弱启动子驱动时，效果甚至更加明显。再次，在诱导SspB之前存在一些降解(约7%)，但在SspB诱导之后，降解急剧增加(约93%)。
类似地，KPS+4标签[SEQ ID NO. 30]显示对TrfA***中的蛋白降解的期望的调节作用，而不管标记的mCherry由较强启动子(图4)还是由弱启动子(图5)驱动。
SspB***和TrfA***之间的有限串扰
鉴于以上数据共同显示SspB和TrfA***各自识别不同的信号序列并且都在谷氨酸棒杆菌宿主细胞中均保留活性，发明人进行研究在两种衔接子蛋白之间是否存在串扰。如果两种TrfA和SspB***能够单独地发挥功能，而不引起正交标记的蛋白的降解，则其会允许对多种细胞功能的精确的时间控制。例如，一旦已经使用所述标签中的第一者达到期望的生物量，就可能触发在细胞的适应性中发挥作用的第一种蛋白的降解。随后，一旦已经达到足够量的中间体，就可以在后来的时间点触发第二种靶蛋白的降解。这种时间控制对于真正精细调节用于生物合成期望产物的最佳生产条件是重要的。仅当两种标签真正正交且不与另一个标签的识别序列交叉反应时，这种类型的控制才是可能的。这通过将ssrA-标记的报告子引入含有TrfA衔接子蛋白的菌株中并将trfA-标记的报告子引入含有SspB衔接子蛋白的菌株中进行测试。除了WT trfA和ssrA序列以外，还测试工程改造的序列中的几种。表5中呈现的数据显示两种蛋白降解***之间的串扰不显著，表明可能并行使用两者。
表5. TrfA和SspB特异性。筛选TrfA和SspB衔接子的串扰，并且发现其为正交的。当标签-类型与宿主衔接子匹配时，观察到报告子的更大降解。降解被报告为在衔接子诱导之前的报告子浓度的百分数。标记的报告基因的强表达和弱表达两者的作用是类似的。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
工业实用性/技术领域的声明
本公开在食品、医药和药理学行业中具有实用性。本公开总体涉及用于策略性控制修饰的微生物菌株中的蛋白降解的方法。此类修饰导致目标化合物的生产产率增强，优化化合物在细胞环境中的持续时间延长，同时限制对修饰的细胞宿主的长期损害。
Figure 878530DEST_PATH_IMAGE006
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。
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Claims (22)

1.经重组工程改造以表达第一降解标签的棒杆菌属宿主细胞，其中所述第一降解标签包含衔接子结合区、任选的间隔区和蛋白酶识别区；其中所述第一降解标签的所述衔接子结合区特异性结合TrfA衔接子蛋白，所述TrfA衔接子蛋白包含与SEQ ID NO. 4具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的宿主细胞，其中当所述TrfA衔接子蛋白存在时，所述第一降解标签的所述蛋白酶识别区允许由所述第一降解标签标记的靶蛋白被选自ClpCP、ClpXP和ClpAP的蛋白酶降解。
3.权利要求1的宿主细胞，其中所述第一降解标签包含SEQ ID NO. 30或SEQ ID NO.32的氨基酸序列。
4.权利要求1的宿主细胞，其中所述第一降解标签包含SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56、SEQ ID NO.57或SEQ ID NO. 58的氨基酸序列。
5.权利要求1的宿主细胞，其中所述第一降解标签包含SEQ ID NO. 24或SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
6.权利要求1-5中任一项的宿主细胞，其被进一步重组工程改造以表达第二降解标签，其中所述第二降解标签包含衔接子结合区、任选的间隔区和蛋白酶识别区；其中所述第二降解标签的所述衔接子结合区特异性结合SspB衔接子蛋白，所述SspB衔接子蛋白包含与SEQ ID NO. 2具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求6的宿主细胞，其中当所述SspB衔接子蛋白存在时，所述第二降解标签的所述蛋白酶识别区允许由所述第二降解标签标记的靶蛋白被选自ClpCP、ClpXP和ClpAP的蛋白酶降解。
8.权利要求6的宿主细胞，其中所述第二降解标签包含SEQ ID NO. 16或SEQ ID NO.18的氨基酸序列。
9.权利要求1的宿主细胞，其中所述第一降解标签包含SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 39、SEQID NO. 40、SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44、SEQ ID NO.45或SEQ ID NO. 46的氨基酸序列。
10.权利要求1的宿主细胞，其中所述第一降解标签包含SEQ ID NO. 10或SEQ ID NO.12的氨基酸序列。
11.控制棒杆菌属宿主细胞中的第一靶蛋白的降解的方法，其中所述宿主细胞已经被重组工程改造以表达第一降解标签并经由第一异源生物合成途径产生第一产物，所述方法包括：
表达适于标记所述第一靶蛋白的第一降解标签；
使宿主细胞生长，直至达到期望的生长速率；和
诱导TrfA衔接子蛋白的表达，其中所述TrfA衔接子蛋白包含与SEQ ID NO. 4具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
其中，在诱导所述TrfA衔接子蛋白的表达之后，所述宿主细胞中存在的所述第一靶蛋白的量减少至少约20%，且其中这种减少由通过选自ClpCP、ClpXP和ClpAP的蛋白酶的降解引起。
12.权利要求11的方法，其中所述第一靶蛋白是宿主细胞生长的必需蛋白。
13.权利要求11的方法，其中所述第一靶蛋白的存在在用于产生所述第一产物的所述第一异源生物合成途径中作为负反馈发挥功能。
14.权利要求11的方法，其中所述第一靶蛋白代谢所述第一产物，由此减少所述第一产物的可收集量。
15.权利要求11的方法，其中通过温度变化、pH变化、暴露于光和/或通过改变宿主细胞内给定分子的水平来诱导TrfA衔接子蛋白的表达。
16.权利要求11的方法，其中所述第一降解标签的C-末端的最后三个氨基酸序列选自DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS和HPP。
17.权利要求11-16中任一项的方法，其中所述宿主细胞已经被进一步重组工程改造以表达第二降解标签并经由第二异源生物合成途径产生第二产物，所述方法进一步包括：
表达所述第二降解标签以标记所述第二靶蛋白；
使宿主细胞生长，直至达到期望的生长速率；和
诱导SspB衔接子蛋白的表达，其中所述SspB衔接子蛋白包含与SEQ ID NO. 2具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；
其中，在诱导所述SspB衔接子蛋白的表达之后，所述宿主细胞中存在的所述第二靶蛋白的量减少至少约20%，且其中这种减少由通过选自ClpCP、ClpXP和ClpAP的蛋白酶的降解引起。
18.权利要求17的方法，其中所述第二靶蛋白是宿主细胞生长的必需蛋白。
19.权利要求17的方法，其中所述第二靶蛋白的存在在用于产生所述第二产物的所述第二异源生物合成途径中作为负反馈发挥功能。
20.权利要求17的方法，其中所述第二靶蛋白代谢所述第二产物，由此减少所述第二产物的可收集量。
21.权利要求17的方法，其中通过温度变化、pH变化、暴露于光和/或通过改变宿主细胞内给定分子的水平来诱导SspB衔接子蛋白的表达。
22.权利要求17的方法，其中所述第二降解标签的C-末端的最后三个氨基酸序列选自DQP、KPS、DGA、DGS、DQA、KNP、QPS、MKP、DQS和HPP。
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