CN113030489A - 一种胱抑素c兔多抗-胶乳粒子的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种胱抑素C兔多抗‑胶乳粒子的制备方法，包括下述步骤：(1)将微球加入到水和缓冲液中，室温振荡混匀；(2)加入偶联剂，室温搅拌1小时；(3)升高反应器温度，添加抗体溶液；(4)离心分离微球与未标记蛋白，采用封闭液重悬微球，室温搅拌1小时；(5)离心分离微球与多余的封闭剂，采用储存液重悬微球；(6)超声分散，用储存液稀释至一定浓度后，室温振荡混匀，即得。本发明的制备方法可有效规避Cys‑C检测时的非特异反应，提高Cys‑C检测的特异性和灵敏度。

Description

一种胱抑素C兔多抗-胶乳粒子的制备方法
技术领域
本发明涉及免疫学测定分析领域，具体涉及一种胱抑素C多抗胶乳增强比浊试剂的制备方法。
背景技术
胱抑素C(Cystatin C，Cys-C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成员之一，是一种由122个氨基酸残基组成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，为管家基因在真核细胞上恒定表达的产物。研究表明，Cys-C作为内源性标志物检测肾小球滤过率(GFR)，较尿素(Urea)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)以及β2微球蛋白(β2-MG)和视黄醇结合蛋白(REP)等低分子量蛋白而言，具有更好的敏感性和特异性，能够作为评估肾功能的新指标，特别是早期肾功能损坏的指标。
类风湿因子(RF)是一种多株系自身抗体，并不只在类风湿关节炎患者血清中存在，在其他自身免疫性疾病中也有发现，包括***性红斑狼疮、硬皮病、慢性活动性肝炎，并且在约5％的正常人群中也以低浓度水平存在。经过长期观察研究，我们发现某些RF浓度较高的患者，经临床排除实质性器官病变的可能，血清检测其他肾功指标均正常，唯独CYS-C异常增高，而反应肾脏早期损伤的另一个指标β2微球蛋白(β2-MG)也并没有增高。那么CYS-C增高可能假性增高，可能导致肾功能损伤的错误诊断和不当治疗，只有保证排除了RF的假性干扰，血清中CYS-C的测定结果肾功能损伤才有密切联系。(参考文献：陈素芸王瑜伟血清高类风湿因子对胱抑素C检测的干扰[期刊]中国社区医师2017年03期)
因此，针对现有技术中比浊试剂制备中的不足，本发明提出了一种胱抑素C兔多抗-胶乳粒子的制备方法，可有效规避Cys-C检测时的非特异反应，提高Cys-C检测的特异性和灵敏度。
发明内容
本发明一方面提供了一种胱抑素C兔多抗-胶乳粒子的制备方法，包括下述步骤：
(1)将微球加入到水和缓冲液中，室温振荡混匀；
(2)加入偶联剂，室温搅拌1小时；
(3)升高反应器温度，添加抗体溶液；
(4)离心分离微球与未标记蛋白，采用封闭液重悬微球，室温搅拌1小时；
(5)离心分离微球与多余的封闭剂，采用储存液重悬微球；
(6)超声分散，用储存液稀释至一定浓度后，室温振荡混匀，即得。
本发明的优选实施方案中，步骤(1)中，缓冲液选自HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液中的一种或其组合。
本发明的优选实施方案中，步骤(1)中，缓冲液浓度10-100mM，优选40-60mM，更优选50mM。
本发明的优选实施方案中，步骤(1)中，微球为聚苯乙烯羧基微球。
本发明的优选实施方案中，步骤(1)中，微球浓度0.05-1％，优选0.1-0.5％，更优选0.1-0.3％。
本发明的优选实施方案中，步骤(2)中，偶联剂为EDC/NHS。
本发明的优选实施方案中，步骤(2)中，EDC的含量为微球含量的12.5-80μg/mg-Ltx，NHS的含量为微球含量的12.5-40μg/mg-Ltx。
本发明的优选实施方案中，步骤(3)中，反应器温度10-70℃，优选20-60℃，更优选25-55℃。
本发明的优选实施方案中，步骤(3)中，抗体加入量为微球的25～80ug/mg-Ltx。
本发明的优选实施方案中，步骤(4)中，封闭液为50mM HEPES，2％BSA，pH7.5。
本发明的优选实施方案中，步骤(5)中，储存液为50mM HEPES，0.1％BSA，2％NaCl，0.05％Proclin950。
本发明的优选实施方案中，步骤(6)中，稀释后聚苯羧基微球浓度为0.1％-0.8％，优选为0.1％-0.5％，更优选为0.15％。
本发明另一方面提供了上述方法制备得到的胱抑素C兔多抗-胶乳粒子在制备用于检测胱抑素C的试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的方法有效减少了胱抑素C抗体胶乳制备过程中的非特异性反应，获得的产品质量均一稳定，且有效降低了胶乳的生产成本，为提高Cys-C检测的特异性和灵敏度奠定了基础。
具体实施方式
以下通过实施例的形式说明具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例1
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子：
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球，HEPES缓冲液使用浓度：50mM，聚苯羧基微球浓度0.1％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀10分钟；
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的15μg/mg-Ltx，向步骤(1)的体系中加入EDC；再加入NHS，为聚苯乙烯羧基微球含量的15μg/mg-Ltx，边加边搅拌；室温搅拌1小时；
(3)升高反应器温度至25℃，用温度计检测溶液温度达标后，向(2)中添加抗体溶液，添加量为微球的25ug/mg-Ltx，继续搅拌1小时；
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离，用封闭液重悬微球，所述封闭液为50mMHEPES，2％BSA，pH 7.5，室温下搅拌1小时，所述％为质量百分比；
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离，用储存液重悬微球，储存液成分：50mMHEPES，0.1％BSA，2％NaCl，0.05％Proclin950；
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀；
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀30分钟，即得。
实施例2
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子：
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球，HEPES缓冲液使用浓度：50mM，聚苯羧基微球浓度0.2％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀10分钟；
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的20μg/mg-Ltx，向步骤(1)的体系中加入EDC；再加入NHS，为聚苯乙烯羧基微球含量的20μg/mg-Ltx，边加边搅拌；室温搅拌1小时；
(3)升高反应器温度至37℃，用温度计检测溶液温度达标后，向(2)中添加抗体溶液，添加量为微球的30ug/mg-Ltx，继续搅拌1小时；
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离，用封闭液重悬微球，所述封闭液为50mMHEPES，2％BSA，pH 7.5，室温下搅拌1小时，所述％为质量百分比；
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离，用储存液重悬微球，储存液成分：50mMHEPES，0.1％BSA，2％NaCl，0.05％Proclin950；
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀；
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀30分钟，即得。
实施例3
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子：
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球，HEPES缓冲液使用浓度：50mM，聚苯羧基微球浓度0.2％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀10分钟；
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的50μg/mg-Ltx，向步骤(1)的体系中加入EDC；再加入NHS，为聚苯乙烯羧基微球含量的50μg/mg-Ltx，边加边搅拌；室温搅拌1小时；
(3)升高反应器温度至42℃，用温度计检测溶液温度达标后，向(2)中添加抗体溶液，添加量为微球的45ug/mg-Ltx，继续搅拌1小时；
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离，用封闭液重悬微球，所述封闭液为50mMHEPES，2％BSA，pH 7.5，室温下搅拌1小时，所述％为质量百分比；
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离，用储存液重悬微球，储存液成分：50mMHEPES，0.1％BSA，2％NaCl，0.05％Proclin950；
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀；
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀30分钟，即得。
实施例4
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子：
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球，HEPES缓冲液使用浓度：50mM，聚苯羧基微球浓度0.3％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀10分钟；
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的60μg/mg-Ltx，向步骤(1)的体系中加入EDC；再加入NHS，为聚苯乙烯羧基微球含量的65μg/mg-Ltx，边加边搅拌；室温搅拌1小时；
(3)升高反应器温度至48℃，用温度计检测溶液温度达标后，向(2)中添加抗体溶液，添加量为微球的60ug/mg-Ltx，继续搅拌1小时；
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离，用封闭液重悬微球，所述封闭液为50mMHEPES，2％BSA，pH 7.5，室温下搅拌1小时，所述％为质量百分比；
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离，用储存液重悬微球，储存液成分：50mMHEPES，0.1％BSA，2％NaCl，0.05％Proclin950；
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀；
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀30分钟，即得。
实施例5
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子：
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球，HEPES缓冲液使用浓度：50mM，聚苯羧基微球浓度0.3％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀10分钟；
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的80μg/mg-Ltx，向步骤(1)的体系中加入EDC；再加入NHS，为聚苯乙烯羧基微球含量的80μg/mg-Ltx，边加边搅拌；室温搅拌1小时；
(3)升高反应器温度至55℃，用温度计检测溶液温度达标后，向(2)中添加抗体溶液，添加量为微球的80ug/mg-Ltx，继续搅拌1小时；
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离，用封闭液重悬微球，所述封闭液为50mMHEPES，2％BSA，pH 7.5，室温下搅拌1小时，所述％为质量百分比；
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离，用储存液重悬微球，储存液成分：50mMHEPES，0.1％BSA，2％NaCl，0.05％Proclin950；
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀；
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15％，所述％为质量百分比，室温下振荡混匀30分钟，即得。
实施例6
RF样本的具体检测方法如下：
检测原理：通过在混合血清中加入干扰物RF plus(Sysmex；货号：79181),使类风湿因子(RF)浓度为0、250、500。试剂定标后，采用实施例1制备的胱抑素C兔多抗-胶乳粒子检测该血清样本。
(1)RF plus冻干粉溶解(两种组分)：
①RF:加纯水1.0mL,RF终浓度：1000IU/mL
②RF Blank:加纯水1.0mL,RF浓度：0IU/mL
(2)血清样本处理：
样本1#：CysC测值：8mg/L
Figure BDA0003003853060000081
样本2#：CysC测值：2mg/L
Figure BDA0003003853060000082
(3)RF血清样本检测：
样本1#：CysC浓度：4.0mg/L
Figure BDA0003003853060000083
Figure BDA0003003853060000091
样本2#：CysC浓度：1.0mg/L
Figure BDA0003003853060000092
由上表可以看出，交联温度分别选择25度、37度、42度、48度、55度时，随着交联温度升高，样本非特异反应降低。交联温度为48度&55度时，样本非特异反应降至最低。由此可见，本发明的制备方法可以显著改善胱抑素C试剂检测RF样本的非特异反应。

Claims (10)

1.一种胱抑素C兔多抗-胶乳粒子的制备方法，包括下述步骤：
(1)将微球加入到水和缓冲液中，室温振荡混匀；
(2)加入偶联剂，室温搅拌1小时；
(3)升高反应器温度，添加抗体溶液；
(4)离心分离微球与未标记蛋白，采用封闭液重悬微球，室温搅拌1小时；
(5)离心分离微球与多余的封闭剂，采用储存液重悬微球；
(6)超声分散，用储存液稀释至一定浓度后，室温振荡混匀，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，缓冲液选自HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液中的一种或其组合；缓冲液浓度为10-100mM，优选40-60mM，更优选50mM。
3.如权利要求1-2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，微球为聚苯乙烯羧基微球；微球浓度0.05-1％，优选0.1-0.5％，更优选0.1-0.3％。
4.如权利要求1-3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，偶联剂为EDC/NHS；EDC的含量为微球含量的12.5-80μg/mg-Ltx，NHS的含量为微球含量的12.5-40μg/mg-Ltx。
5.如权利要求1-4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，反应器温度10-70℃，优选20-60℃，更优选25-55℃。
6.如权利要求1-5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，抗体加入量为微球的25～80ug/mg-Ltx。
7.如权利要求1-6所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，封闭液为50mMHEPES，2％BSA，pH 7.5。
8.如权利要求1-7所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，储存液为50mMHEPES，0.1％BSA，2％NaCl，0.05％Proclin950。
9.如权利要求1-8所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，稀释后聚苯羧基微球浓度为0.1％-0.8％，优选为0.1％-0.5％，更优选为0.15％。
10.如权利要求1-9任一项所述方法制备得到的胱抑素C兔多抗-胶乳粒子在制备用于检测胱抑素C的试剂盒中的应用。
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