CN113030489A - 一种胱抑素c兔多抗-胶乳粒子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胱抑素C兔多抗‑胶乳粒子的制备方法,包括下述步骤:(1)将微球加入到水和缓冲液中,室温振荡混匀;(2)加入偶联剂,室温搅拌1小时;(3)升高反应器温度,添加抗体溶液;(4)离心分离微球与未标记蛋白,采用封闭液重悬微球,室温搅拌1小时;(5)离心分离微球与多余的封闭剂,采用储存液重悬微球;(6)超声分散,用储存液稀释至一定浓度后,室温振荡混匀,即得。本发明的制备方法可有效规避Cys‑C检测时的非特异反应,提高Cys‑C检测的特异性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学测定分析领域,具体涉及一种胱抑素C多抗胶乳增强比浊试剂的制备方法。
背景技术
胱抑素C(Cystatin C,Cys-C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成员之一,是一种由122个氨基酸残基组成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,为管家基因在真核细胞上恒定表达的产物。研究表明,Cys-C作为内源性标志物检测肾小球滤过率(GFR),较尿素(Urea)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)以及β2微球蛋白(β2-MG)和视黄醇结合蛋白(REP)等低分子量蛋白而言,具有更好的敏感性和特异性,能够作为评估肾功能的新指标,特别是早期肾功能损坏的指标。
类风湿因子(RF)是一种多株系自身抗体,并不只在类风湿关节炎患者血清中存在,在其他自身免疫性疾病中也有发现,包括***性红斑狼疮、硬皮病、慢性活动性肝炎,并且在约5%的正常人群中也以低浓度水平存在。经过长期观察研究,我们发现某些RF浓度较高的患者,经临床排除实质性器官病变的可能,血清检测其他肾功指标均正常,唯独CYS-C异常增高,而反应肾脏早期损伤的另一个指标β2微球蛋白(β2-MG)也并没有增高。那么CYS-C增高可能假性增高,可能导致肾功能损伤的错误诊断和不当治疗,只有保证排除了RF的假性干扰,血清中CYS-C的测定结果肾功能损伤才有密切联系。(参考文献:陈素芸王瑜伟血清高类风湿因子对胱抑素C检测的干扰[期刊]中国社区医师2017年03期)
因此,针对现有技术中比浊试剂制备中的不足,本发明提出了一种胱抑素C兔多抗-胶乳粒子的制备方法,可有效规避Cys-C检测时的非特异反应,提高Cys-C检测的特异性和灵敏度。
发明内容
本发明一方面提供了一种胱抑素C兔多抗-胶乳粒子的制备方法,包括下述步骤:
(1)将微球加入到水和缓冲液中,室温振荡混匀;
(2)加入偶联剂,室温搅拌1小时;
(3)升高反应器温度,添加抗体溶液;
(4)离心分离微球与未标记蛋白,采用封闭液重悬微球,室温搅拌1小时;
(5)离心分离微球与多余的封闭剂,采用储存液重悬微球;
(6)超声分散,用储存液稀释至一定浓度后,室温振荡混匀,即得。
本发明的优选实施方案中,步骤(1)中,缓冲液选自HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液中的一种或其组合。
本发明的优选实施方案中,步骤(1)中,缓冲液浓度10-100mM,优选40-60mM,更优选50mM。
本发明的优选实施方案中,步骤(1)中,微球为聚苯乙烯羧基微球。
本发明的优选实施方案中,步骤(1)中,微球浓度0.05-1%,优选0.1-0.5%,更优选0.1-0.3%。
本发明的优选实施方案中,步骤(2)中,偶联剂为EDC/NHS。
本发明的优选实施方案中,步骤(2)中,EDC的含量为微球含量的12.5-80μg/mg-Ltx,NHS的含量为微球含量的12.5-40μg/mg-Ltx。
本发明的优选实施方案中,步骤(3)中,反应器温度10-70℃,优选20-60℃,更优选25-55℃。
本发明的优选实施方案中,步骤(3)中,抗体加入量为微球的25~80ug/mg-Ltx。
本发明的优选实施方案中,步骤(4)中,封闭液为50mM HEPES,2%BSA,pH7.5。
本发明的优选实施方案中,步骤(5)中,储存液为50mM HEPES,0.1%BSA,2%NaCl,0.05%Proclin950。
本发明的优选实施方案中,步骤(6)中,稀释后聚苯羧基微球浓度为0.1%-0.8%,优选为0.1%-0.5%,更优选为0.15%。
本发明另一方面提供了上述方法制备得到的胱抑素C兔多抗-胶乳粒子在制备用于检测胱抑素C的试剂盒中的应用。
与现有技术相比,本发明的方法有效减少了胱抑素C抗体胶乳制备过程中的非特异性反应,获得的产品质量均一稳定,且有效降低了胶乳的生产成本,为提高Cys-C检测的特异性和灵敏度奠定了基础。
具体实施方式
以下通过实施例的形式说明具体实施方式,对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例1
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子:
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球,HEPES缓冲液使用浓度:50mM,聚苯羧基微球浓度0.1%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀10分钟;
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的15μg/mg-Ltx,向步骤(1)的体系中加入EDC;再加入NHS,为聚苯乙烯羧基微球含量的15μg/mg-Ltx,边加边搅拌;室温搅拌1小时;
(3)升高反应器温度至25℃,用温度计检测溶液温度达标后,向(2)中添加抗体溶液,添加量为微球的25ug/mg-Ltx,继续搅拌1小时;
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离,用封闭液重悬微球,所述封闭液为50mMHEPES,2%BSA,pH 7.5,室温下搅拌1小时,所述%为质量百分比;
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离,用储存液重悬微球,储存液成分:50mMHEPES,0.1%BSA,2%NaCl,0.05%Proclin950;
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀;
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀30分钟,即得。
实施例2
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子:
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球,HEPES缓冲液使用浓度:50mM,聚苯羧基微球浓度0.2%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀10分钟;
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的20μg/mg-Ltx,向步骤(1)的体系中加入EDC;再加入NHS,为聚苯乙烯羧基微球含量的20μg/mg-Ltx,边加边搅拌;室温搅拌1小时;
(3)升高反应器温度至37℃,用温度计检测溶液温度达标后,向(2)中添加抗体溶液,添加量为微球的30ug/mg-Ltx,继续搅拌1小时;
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离,用封闭液重悬微球,所述封闭液为50mMHEPES,2%BSA,pH 7.5,室温下搅拌1小时,所述%为质量百分比;
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离,用储存液重悬微球,储存液成分:50mMHEPES,0.1%BSA,2%NaCl,0.05%Proclin950;
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀;
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀30分钟,即得。
实施例3
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子:
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球,HEPES缓冲液使用浓度:50mM,聚苯羧基微球浓度0.2%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀10分钟;
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的50μg/mg-Ltx,向步骤(1)的体系中加入EDC;再加入NHS,为聚苯乙烯羧基微球含量的50μg/mg-Ltx,边加边搅拌;室温搅拌1小时;
(3)升高反应器温度至42℃,用温度计检测溶液温度达标后,向(2)中添加抗体溶液,添加量为微球的45ug/mg-Ltx,继续搅拌1小时;
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离,用封闭液重悬微球,所述封闭液为50mMHEPES,2%BSA,pH 7.5,室温下搅拌1小时,所述%为质量百分比;
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离,用储存液重悬微球,储存液成分:50mMHEPES,0.1%BSA,2%NaCl,0.05%Proclin950;
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀;
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀30分钟,即得。
实施例4
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子:
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球,HEPES缓冲液使用浓度:50mM,聚苯羧基微球浓度0.3%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀10分钟;
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的60μg/mg-Ltx,向步骤(1)的体系中加入EDC;再加入NHS,为聚苯乙烯羧基微球含量的65μg/mg-Ltx,边加边搅拌;室温搅拌1小时;
(3)升高反应器温度至48℃,用温度计检测溶液温度达标后,向(2)中添加抗体溶液,添加量为微球的60ug/mg-Ltx,继续搅拌1小时;
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离,用封闭液重悬微球,所述封闭液为50mMHEPES,2%BSA,pH 7.5,室温下搅拌1小时,所述%为质量百分比;
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离,用储存液重悬微球,储存液成分:50mMHEPES,0.1%BSA,2%NaCl,0.05%Proclin950;
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀;
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀30分钟,即得。
实施例5
采用以下方法制备胱抑素C兔多抗-胶乳粒子:
(1)按顺序依次加入纯水、HEPES缓冲液、聚苯乙烯羧基微球,HEPES缓冲液使用浓度:50mM,聚苯羧基微球浓度0.3%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀10分钟;
(2)加入EDC为聚苯乙烯羧基微球含量的80μg/mg-Ltx,向步骤(1)的体系中加入EDC;再加入NHS,为聚苯乙烯羧基微球含量的80μg/mg-Ltx,边加边搅拌;室温搅拌1小时;
(3)升高反应器温度至55℃,用温度计检测溶液温度达标后,向(2)中添加抗体溶液,添加量为微球的80ug/mg-Ltx,继续搅拌1小时;
(4)用离心机使微球与未标记蛋白分离,用封闭液重悬微球,所述封闭液为50mMHEPES,2%BSA,pH 7.5,室温下搅拌1小时,所述%为质量百分比;
(5)用离心机是微球与多余的封闭剂分离,用储存液重悬微球,储存液成分:50mMHEPES,0.1%BSA,2%NaCl,0.05%Proclin950;
(6)使用超声破碎仪使胶乳溶液分散均匀;
(7)用储存液稀释聚苯羧基微球浓度0.15%,所述%为质量百分比,室温下振荡混匀30分钟,即得。
实施例6
RF样本的具体检测方法如下:
检测原理:通过在混合血清中加入干扰物RF plus(Sysmex;货号:79181),使类风湿因子(RF)浓度为0、250、500。试剂定标后,采用实施例1制备的胱抑素C兔多抗-胶乳粒子检测该血清样本。
(1)RF plus冻干粉溶解(两种组分):
①RF:加纯水1.0mL,RF终浓度:1000IU/mL
②RF Blank:加纯水1.0mL,RF浓度:0IU/mL
(2)血清样本处理:
样本1#:CysC测值:8mg/L
样本2#:CysC测值:2mg/L
(3)RF血清样本检测:
样本1#:CysC浓度:4.0mg/L
样本2#:CysC浓度:1.0mg/L
由上表可以看出,交联温度分别选择25度、37度、42度、48度、55度时,随着交联温度升高,样本非特异反应降低。交联温度为48度&55度时,样本非特异反应降至最低。由此可见,本发明的制备方法可以显著改善胱抑素C试剂检测RF样本的非特异反应。
Claims (10)
1.一种胱抑素C兔多抗-胶乳粒子的制备方法,包括下述步骤:
(1)将微球加入到水和缓冲液中,室温振荡混匀;
(2)加入偶联剂,室温搅拌1小时;
(3)升高反应器温度,添加抗体溶液;
(4)离心分离微球与未标记蛋白,采用封闭液重悬微球,室温搅拌1小时;
(5)离心分离微球与多余的封闭剂,采用储存液重悬微球;
(6)超声分散,用储存液稀释至一定浓度后,室温振荡混匀,即得。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,缓冲液选自HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液中的一种或其组合;缓冲液浓度为10-100mM,优选40-60mM,更优选50mM。
3.如权利要求1-2所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,微球为聚苯乙烯羧基微球;微球浓度0.05-1%,优选0.1-0.5%,更优选0.1-0.3%。
4.如权利要求1-3所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,偶联剂为EDC/NHS;EDC的含量为微球含量的12.5-80μg/mg-Ltx,NHS的含量为微球含量的12.5-40μg/mg-Ltx。
5.如权利要求1-4所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,反应器温度10-70℃,优选20-60℃,更优选25-55℃。
6.如权利要求1-5所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,抗体加入量为微球的25~80ug/mg-Ltx。
7.如权利要求1-6所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,封闭液为50mMHEPES,2%BSA,pH 7.5。
8.如权利要求1-7所述的方法,其特征在于,步骤(5)中,储存液为50mMHEPES,0.1%BSA,2%NaCl,0.05%Proclin950。
9.如权利要求1-8所述的方法,其特征在于,步骤(6)中,稀释后聚苯羧基微球浓度为0.1%-0.8%,优选为0.1%-0.5%,更优选为0.15%。
10.如权利要求1-9任一项所述方法制备得到的胱抑素C兔多抗-胶乳粒子在制备用于检测胱抑素C的试剂盒中的应用。
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