CN113030215A - 一种用于3d心肌细胞胞外电位检测的高通量微腔电位传感器及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于3D心肌细胞胞外电位检测的高通量微腔电位传感器及检测方法。本发明首先利用微加工技术设计制造了高通量3D微腔电位传感器，该传感器以4英寸硅片为基底材料，在硅基底上热氧化形成SiO2薄膜，利用掩膜版光刻形成mask，利用湿法刻蚀Si形成15个正方形微腔结构，并在微腔的四面侧壁上溅射Au形成金属层，再利用PECVD沉积Si3N4覆盖导线作为绝缘层，在加工好的微腔芯片上封装PMMA材质的腔体形成3D微腔传感器。利用悬滴法将HL‑1心肌细胞培养成3D心肌细胞微球，然后用移液枪将3D心肌细胞微球接种至高通量微腔电位传感器芯片的微腔结构内，并连接信号检测***进行胞外电信号检测。

Description

一种用于3D心肌细胞胞外电位检测的高通量微腔电位传感器 及检测方法

技术领域

本发明涉及一种细胞电位检测方法，尤其涉及一种用于3D心肌细胞胞外电位信号检测的高通量微腔电位传感器及检测方法。

背景技术

心脏是人体最重要的器官之一，其主要功能是为血液流动提供动力，把血液运行至身体各个部分从而为人体各项机理活动供能。构成心脏的基本单位是心肌细胞，其一般分为工作细胞和起搏细胞两类，其中工作细胞具有兴奋性、导电性和收缩性，在心脏跳动中起关键作用。在药物开发领域，对候选药物进行心脏毒性评价是必不可缺少的一个环节，而其中对于心脏电生理活动的毒副作用评价是一大重要内容。目前标准的心肌细胞电生理信号检测方法是膜片钳，这种方法具有低通量、高成本和倾入式检测的缺点，而目前市场上商用的微电极阵列(MEA)传感器检测方法是将心肌细胞平面二维培养在传感器芯片表面，无法真实反应细胞在体内的三维微环境，检测结果通常具有不准确性。目前国际上越来越多地使用三维培养的细胞用以药物筛选和评价，因此在心脏电生理信号检测领域，急需一种可以动态实时高通量检测3D心肌细胞电生理信号的装置和方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于3D心肌细胞胞外电位信号检测的高通量微腔电位传感器及检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明公开了一种用于3D心肌细胞胞外电位检测的高通量微腔电位传感器，其包括微腔电极芯片、封装在微腔电极芯片上的培养腔和PCB转接板；所述的微腔电极芯片包括硅基底、电极、金属接触盘和绝缘层；所述的硅基底上设有若干微腔结构；每个微腔结构的壁面上均布置有所述电极，所述的电极通过导线连接布置在微腔电极芯片边缘的金属接触盘；所述的绝缘层覆盖基底上方除电极和金属接触盘的区域；所述芯片上的金属接触盘与PCB转接板上的金属焊盘电气连接。

作为本发明的优选方案，所述的微腔电极芯片的微腔结构顶面为方形，剖面为倒梯形；所述微腔电极芯片上设有若干不同尺寸的微腔结构以适应不同尺寸大小的3D心肌细胞微球；每个微腔结构的四个壁面上均设置有一个所述电极，每个电极通过独立的导线连接一个独立的金属接触盘；所述的电极为Au电极。

作为本发明的优选方案，所述的培养腔为空心圆柱形微腔，其材质为PMMA。

作为本发明的优选方案，所述微腔结构的尺寸范围为300 800μm。

本发明还提供了一种所述高通量微腔电位传感器的制作方法，其包括如下步骤：

1)清洗硅基底；

2)采用热氧化工艺在步骤1)的基底上形成SiO₂薄膜；

3)在经过步骤2)处理后的基底上涂抹正性光刻胶，根据SiO₂蚀刻工艺，利用HF缓冲溶液将掩膜版上的空腔结构转移到SiO₂薄膜上；

4)采用湿法蚀刻技术，在步骤3)所获的基底上刻蚀形成倒梯形微腔结构；

5)将步骤4)所得的基底重新进行热氧化形成SiO₂层；

6)在步骤5)所得的基底上再次涂抹光刻胶并显影，将电极和导线形状转移到SiO₂掩膜上；

7)利用磁控溅射技术，在步骤6)所获的基底上溅射一层Ti或者Cr，作为粘附层，再溅射Au；

8)采用Lift-off剥离工艺，在步骤7)所得的基底上形成金属层；

9)利用PECVD技术在步骤8)所获的基底上沉积500-700nm的Si3N4作为绝缘层；

10)在步骤9)所得的基底上再次涂抹光刻胶，将掩膜版上的绝缘层图案转移到基底上，只暴露出需要保留的电极和金属接触盘位置图案；

11)采用反应离子刻蚀技术，刻蚀步骤10)所得基底的电极和引线部位的Si3N4，暴露出电极和金属接触盘；

12)清洗步骤11)所得的基底，并进行划片得到微腔电极芯片；

13)将划片后的微腔电极芯片用UV胶粘附于PCB转接板上，并利用金线将芯片上的金属接触盘与PCB转接板上的金属焊盘电气连接；

14)将内部为空心的圆柱培养腔使用环氧树脂胶封装在芯片上，最终得到用于检测3D心肌细胞胞外电位的高通量微腔电位传感器。

本发明进一步提供了一种基于所述高通量微腔电位传感器的3D心肌细胞胞外电位检测方法，其包括如下步骤：

S1.采用悬滴法将心肌细胞培养成直径300-800um的3D球体细胞；

所述步骤S1具体包括：

S1.1使用胰酶消化细胞培养瓶中的心肌细胞，形成细胞密度为1×10⁶个/毫升的细胞悬液；

S1.2在细胞悬液中等体积加入质量分数为0.5％的甲基纤维素溶液，增加细胞的聚合粘附能力；

S1.3吸取混合后的细胞悬液滴加到培养皿盖子上，保证每个液滴中至少有10000个细胞；

S1.4将滴满了细胞液滴的盖子翻过来扣在培养皿上形成细胞悬滴，在培养箱中培养24小时；

S2.3D心肌细胞胞外电信号的检测：将悬滴法培养24小时之后形成的3D心肌细胞团用移液枪吸出，转移到微腔电位传感器芯片的微腔结构中，等待检测。

作为本发明的优选方案，所述步骤S2具体包括：

S2.1将包含有3D心肌细胞团的高通量微腔电位传感器安装在传感器转接板上，并将整个转接板放置于培养箱中；

S2.2将传感器转接板通过信号转接线与后置信号放大和处理模块相连；

S2.3待传感器在培养箱中静置设定时间后，记录信号放大和处理模块输出的3D心肌细胞团的胞外电信号。

本发明的有益效果为：本发明采用微纳加工技术，制作了一种具有15个方形微腔结构的高通量微腔电位传感器，微腔剖面为倒梯形，每个微腔侧壁上有4个金属电极，总共60个信号通道，微腔大小有300μm，500μm，800μm等多种尺寸，可以用于实时动态高通量地检测不同大小的3D心肌细胞微球的胞外电信号。

附图说明

图1是本发明高通量微腔电位传感器示意图

图2是微腔电极芯片放大示意图；

图3是本发明微腔电极芯片加工工艺流程图；

图4是3D心肌细胞团在微腔电位传感器中的示意图和显微镜下真实形态图；

图5是本发明高通量微腔电位传感器检测到的3D心肌细胞胞外电位典型信号图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实例对本发明作详细描述，但并不限制本发明。具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

如图1所示，本发明公开了一种用于3D心肌细胞胞外电位信号检测的高通量微腔电位传感器，其包括微腔电极芯片、封装在微腔电极芯片上的培养腔和PCB转接板；所述的微腔电极芯片包括硅基底、电极、金属接触盘和绝缘层；所述的硅基底上设有若干微腔结构；每个微腔结构的壁面上均布置有所述电极，所述的电极通过导线连接布置在微腔电极芯片边缘的金属接触盘；所述的绝缘层覆盖基底上方除电极和金属接触盘的区域。

具体的，该传感器以4英寸硅片为基底材料，在硅基底上热氧化形成SiO₂薄膜，利用掩膜版光刻形成mask，利用湿法刻蚀Si形成15个正方形微腔结构，并在微腔的四面侧壁上溅射Au形成金属层，再利用PECVD沉积Si₃N₄覆盖导线作为绝缘层，在加工好的微腔芯片上封装PMMA材质的腔体形成3D微腔传感器，将3D微球培养的心肌细胞团接种到高通量微腔传感器芯片上，用于检测其胞外电信号。

更进一步地，如图2所示，所述微腔电极芯片尺寸为12mm×12mm，所用的Si片基底厚度为0.5mm；所述倒梯形微腔深度为100μm，坡度为57.3°；所述微腔结构大小有300μm，500μm，800μm三种尺寸，微腔个数为15个，每个微腔侧壁上有4个金属电极，总共形成60个信号通道；所述微腔壁上的电极根据微腔大小分别为100μm×50μm，150μm×50μm和200μm×50μm的长方形；所述封装的腔体尺寸为15mm×15mm×10mm，其中内部为直径为8mm的空心圆柱。

如图3所示，在本发明的具体实施例中，具体采用如下方法制作图1所示的传感器：

(1)以厚度为0.5mm的4英寸硅晶圆作为基底，采用标准清洗工艺清洗硅片；

(2)采用热氧化工艺(O₂,1050℃)在步骤(1)的基底上形成SiO₂薄膜；

(3)在经过步骤(2)处理后的基底上涂抹正性光刻胶，根据SiO2蚀刻工艺，利用HF缓冲溶液将铬掩膜版上的空腔结构转移到SiO₂掩膜上，形成边长分别为300μm，500μm和800μm的正方形图案；

(4)采用湿法蚀刻技术，利用质量浓度为40％的KOH溶液在步骤(3)所获的基底上在60℃环境下刻蚀Si形成倒梯形微腔结构，深度为100um，由于Si的晶体取向为100，因此会形成54.7°的斜角；

(5)将步骤(4)所得的基底重新进行热氧化形成1800nm后的SiO₂涂层；

(6)在步骤(5)所得的基底上再次涂抹光刻胶并显影，将电极和导线形状转移到SiO₂掩膜上；

(7)利用磁控溅射技术，在步骤(6)所获的基底上溅射一层10nm厚的Ti或者Cr，作为粘附层，再溅射500nm厚的Au；

(8)采用Lift-off剥离工艺，在步骤(7)所得的基底上形成金属层；

(9)利用PECVD技术在步骤(8)所获的基底上沉积500-700nm的Si₃N₄作为绝缘层；

(10)在步骤(9)所得的基底上再次涂抹光刻胶，将掩膜版上的绝缘层图案转移到基底上，只暴露出需要保留的电极和金属接触盘位置图案；

(11)采用反应离子刻蚀技术，刻蚀步骤(10)所得基底的电极和引线部位的Si₃N₄，暴露出电极和金属接触盘；

(12)采用标准清洗工艺清洗步骤(11)所得的基底，并进行划片得到微腔电极芯片；

(13)将划片后的微腔电极芯片用UV胶粘附于PCB转接板上，并利用金线将芯片上的金属接触盘与PCB转接板上的金属焊盘电气连接；

(14)将内部为空心的圆柱形培养腔使用环氧树脂胶封装在芯片上，最终得到用于检测3D心肌细胞胞外电位的微腔电位传感器。

在一个具体实施例中，基于图1和2所述高通量微腔电位传感器进行3D心肌细胞胞外电位检测，其具体流程为：

(1)3D心肌细胞团的培养：采用悬滴法将HL-1心肌细胞培养成直径300-800um的3D球体细胞，具体如下：使用HL-1细胞专用胰酶T3924消化细胞融合度为100％的HL-1细胞，形成细胞密度为1×10⁶个/毫升的细胞悬液；在细胞悬液中等体积加入质量分数为0.5％的甲基纤维素溶液，以增加细胞的聚合粘附能力；用枪头吸取20μL混合后的细胞悬液滴加到培养皿盖子上，保证每个液滴中至少有10000个细胞；将滴满了细胞液滴的盖子翻过来扣在培养皿上形成细胞悬滴，在培养箱中培养24小时；

(2)3D心肌细胞胞外电信号的检测：如图3所示，将悬滴法培养24小时之后形成的3D心肌细胞团用移液枪吸出，转移到微腔电位传感器芯片的微腔结构中，3D心肌细胞团会与微腔侧壁上的Au电极接触，由于HL-1心肌细胞具有自发放电位活动特性，因此会引起Au电极附近电势的改变，通过外接信号放大器和处理模块，并与电脑相连，通过专用软件可实时记录获取高通量微腔传感器中3D心肌细胞团的胞外电信号。记录得到的电信号使用MATLAB软件进行滤波降噪等处理，可得到使用本发明的高通量微腔电位传感器测检测到的典型3D细胞胞外电信号，如图5所示。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种用于3D心肌细胞胞外电位检测的高通量微腔电位传感器，其特征在于包括微腔电极芯片、封装在微腔电极芯片上的培养腔和PCB转接板；所述的微腔电极芯片包括硅基底、电极、金属接触盘和绝缘层；所述的硅基底上设有若干微腔结构；每个微腔结构的壁面上均布置有所述电极，所述的电极通过导线连接布置在微腔电极芯片边缘的金属接触盘；所述的绝缘层覆盖基底上方除电极和金属接触盘的区域；所述芯片上的金属接触盘与PCB转接板上的金属焊盘电气连接。

2.根据权利要求1所述的高通量微腔电位传感器，其特征在于，所述的微腔电极芯片的微腔结构顶面为方形，剖面为倒梯形；所述微腔电极芯片上设有若干不同尺寸的微腔结构以适应不同尺寸大小的3D心肌细胞微球；每个微腔结构的四个壁面上均设置有一个所述电极，每个电极通过独立的导线连接一个独立的金属接触盘；所述的电极为Au电极。

3.根据权利要求1所述的高通量微腔电位传感器，其特征在于，所述的培养腔为空心圆柱形微腔，其材质为PMMA。

4.根据权利要求2所述的微腔电极芯片，其特征在于，所述微腔结构的尺寸范围为300800μm。

5.根据权利要求4所述的高通量微腔电位传感器，其特征在于，所述的微腔结构包括尺寸分别为300μm、500μm、800μm的三种微腔结构，微腔深度为100μm，坡度为57.3°。

6.根据权利要求5所述的高通量微腔电位传感器，其特征在于，所述300μm，500μm，800μm三种微腔结构的微腔壁上的电极分别为100μm×50μm，150μm×50μm和200μm×50μm的长方形。

7.一种权利要求1所述高通量微腔电位传感器的制作方法，其特征在于包括如下步骤：

1)清洗硅基底；

2)采用热氧化工艺在步骤1)的基底上形成SiO₂薄膜；

3)在经过步骤2)处理后的基底上涂抹正性光刻胶，根据SiO₂蚀刻工艺，利用HF缓冲溶液将掩膜版上的空腔结构转移到SiO₂薄膜上；

4)采用湿法蚀刻技术，在步骤3)所获的基底上刻蚀形成倒梯形微腔结构；

5)将步骤4)所得的基底重新进行热氧化形成SiO₂层；

6)在步骤5)所得的基底上再次涂抹光刻胶并显影，将电极和导线形状转移到SiO₂掩膜上；

7)利用磁控溅射技术，在步骤6)所获的基底上溅射一层Ti或者Cr，作为粘附层，再溅射Au；

8)采用Lift-off剥离工艺，在步骤7)所得的基底上形成金属层；

9)利用PECVD技术在步骤8)所获的基底上沉积500-700nm的Si3N4作为绝缘层；

10)在步骤9)所得的基底上再次涂抹光刻胶，将掩膜版上的绝缘层图案转移到基底上，只暴露出需要保留的电极和金属接触盘位置图案；

11)采用反应离子刻蚀技术，刻蚀步骤10)所得基底的电极和引线部位的Si3N4，暴露出电极和金属接触盘；

12)清洗步骤11)所得的基底，并进行划片得到微腔电极芯片；

13)将划片后的微腔电极芯片用UV胶粘附于PCB转接板上，并利用金线将芯片上的金属接触盘与PCB转接板上的金属焊盘电气连接；

14)将内部为空心的圆柱培养腔使用环氧树脂胶封装在芯片上，最终得到用于检测3D心肌细胞胞外电位的高通量微腔电位传感器。

8.一种基于权利要求1所述高通量微腔电位传感器的3D心肌细胞胞外电位检测方法，其特征在于包括如下步骤：

S1.采用悬滴法将心肌细胞培养成直径300-800um的3D球体细胞；

所述步骤S1具体包括：

S1.1使用胰酶消化细胞培养瓶中的心肌细胞，形成细胞密度为1×10⁶个/毫升的细胞悬液；

S1.2在细胞悬液中等体积加入质量分数为0.5％的甲基纤维素溶液，增加细胞的聚合粘附能力；

S1.3吸取混合后的细胞悬液滴加到培养皿盖子上，保证每个液滴中至少有10000个细胞；

S1.4将滴满了细胞液滴的盖子翻过来扣在培养皿上形成细胞悬滴，在培养箱中培养24小时；

S2.3D心肌细胞胞外电信号的检测：将悬滴法培养24小时之后形成的3D心肌细胞团用移液枪吸出，转移到微腔电位传感器芯片的微腔结构中，等待检测。

9.如权利要求8所述高通量微腔电位传感器的3D心肌细胞胞外电位检测方法，其特征在于所述步骤S2具体包括：

S2.1将包含有3D心肌细胞团的高通量微腔电位传感器安装在传感器转接板上，并将整个转接板放置于培养箱中；

S2.2将传感器转接板通过信号转接线与后置信号放大和处理模块相连；

S2.3待传感器在培养箱中静置设定时间后，记录信号放大和处理模块输出的3D心肌细胞团的胞外电信号。

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