CN113024463A - 一种1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种1,8‑萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法及其在硫化氢识别和检测中的应用。本发明的探针以N‑(对苯甲基)‑4‑羟基‑1,8‑萘酰亚胺为荧光母体，2,4‑二硝基苯醚为识别基团，得到具有双识别位点的荧光分子探针，硫化氢通过硫解2,4‑二硝基苯醚使荧光团暴露出羟基，从而实现荧光强度的增强(超过30倍)。本发明所述荧光分子探针具有光化学性质稳定、荧光量子产率高及价格经济便宜等优点，特异性识别硫化氢，不受Na⁺、Ca²⁺、NO₂ ^‑、H₂O₂、ClO^‑、HSO₄ ^‑、CN₂H₄S、HSO₃ ^‑、S₂O₅ ^2‑、S₂O₈ ^2‑等离子的干扰，线性检测范围增加至0‑40μmmol/L，可用于河水、雨水、饮用水、钻井液、沼泽液等高浓度硫化氢的定量检测，具有潜在的实际应用价值。

Description

一种1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备和应用

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种新型1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法及其在硫化氢识别和检测中的应用。

背景技术

作为三大气体分子之一，硫化氢(H₂S)与人体健康、植物生长和环境问题密切相关。就人类健康而言，细胞内H₂S在消化***、神经***、心血管***和泌尿***的调节中起着重要作用，H₂S浓度失衡会导致动脉和肺动脉高压、阿尔茨海默病、骨损伤、肝硬化等疾病。外源性H₂S也被认为是仅次于氰化物的剧毒品，低浓度的H₂S可以调节植物体内渗透压调节因子的含量，维持植物自身的水分平衡。此外，硫化氢还会腐蚀金属设备，加速非金属材料的老化。因此，对硫化氢浓度的检测具有重要意义，探索更为灵敏的检测方法已引起人们的重视。

近年来，人们探索了几种检测硫化氢的方法，如碘量法、亚甲基蓝法、色谱法、荧光分子探针法和电化学分析法。荧光分子探针具有选择性好、灵敏度高、操作方便等优点，为硫化氢检测提供了一种有效的方法。目前，已经合成了几种检测硫化氢的荧光分子探针，其中大多数是基于香豆素、罗丹明、荧光素、萘酰亚胺、硼二吡咯烷染料(BODIPY)和苯并噻唑等著名荧光团。作为典型的D-π-A荧光染料，1,8-萘酰亚胺类化合物得到了广泛的研究。由于其稳定的光化学性质、强烈的荧光、高的荧光量子产率、长的激发和发射波长，被认为是理想的荧光团。以1，8-萘酰亚胺为原料合成了多种荧光分子探针。但它们大多只有一个识别位点，荧光强度与H₂S浓度的线性范围窄(在0-20μmmol/L之间)，限制了其在高浓度H₂S环境中的应用，因此设计新型荧光分子探针、拓宽H₂S的线性检测范围具有重要的意义。

发明内容

针对上述缺点，本发明提供一种1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法及其应用。通过引入更多的受体，制备出具有更宽的线性检测范围的荧光分子探针，可用于钻井液、沼泽液等高浓度硫化氢的定量检测。

为了解决上述技术问题，本发明提出的一种1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针，所述探针为N-((2,4二硝基苯氧基)苯基)-4-(2,4-二硝基苯氧基)-1,8-萘酰亚胺，记为探针NTE-1，结构式如下：

上述探针的制备方法如下：

(1)中间体化合物1a的合成：

氮气保护下，以4-溴-1,8-萘二甲酸酐和4-氨基苯酚为原料，以无水乙醇为溶剂，回流温度下反应8小时；待原料完全转化后，停止加热，降温冷却；抽滤，洗涤，充分干燥后得到N-(4-羟基苯基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺即为化合物1a；

其中，4-溴-1,8-萘二甲酸酐和4-氨基苯酚的摩尔质量比为1：(1～1.5)；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与无水乙醇的重量体积比为(5～6)g：100mL。

(2)中间体化合物1a的合成：

氮气保护下，以化合物1a、无水碳酸钾和碘化钾为原料，以无水甲醇为溶剂，75℃下反应8小时；反应结束后，冷却，旋蒸，洗涤，干燥，得到N-(4-羟基苯基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺即为化合物1b；

其中，化合物1a、无水碳酸钾和碘化钾的摩尔质量比为1：(4～6)：(0.02～0.03)；化合物1a与无水甲醇的重量体积比为(4～5)g：120mL。

(3)中间体化合物1c的合成：

氮气保护下，以中间产物1b和氢碘酸为原料，130℃下反应36小时；反应结束后，降温冷却，调节pH至7，在此过程中有固体析出，抽滤，得到粗产品，柱层析分离纯化后得到N-(4-羟基苯基)-4-羟基-1,8-萘酰亚胺即为化合物1c；

其中，化合物1b和氢碘酸的质量体积比为(2～3)：30mL；氢碘酸优选浓度为57％的氢碘酸。

(4)探针NTE-1的合成：

氮气保护下，以化合物1c、无水碳酸钾、碘化钾和2,4-二硝基溴苯为原料，以无水N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，加入相转移催化剂，100℃下反应5小时；停止加热后，冷却，过滤；萃取，干燥，过滤，除去溶剂得粗产物，柱层析分离得到目标产物N-((2,4二硝基苯氧基)苯基)-4-(2,4-二硝基苯氧基)-1,8-萘酰亚胺，即为探针NTE-1。

其中，以十六烷基三甲基溴化铵为相转移催化剂。

化合物1c、无水碳酸钾、碘化钾、十六烷基三甲基溴化铵和2,4-二硝基溴苯的摩尔质量比为1：(4～6)：(0.02～0.04)：(0.02～0.04)：(2～3)。

2,4-二硝基溴苯溶于无水N,N-二甲基甲酰胺后，缓慢滴加到反应液中，滴加时间约为8～15min。

步骤(3)和步骤(4)分别得到的粗产物使用硅胶柱进行分离纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝(2～4)：1。

本发明的另一个目的是将上述合成的探针用于含有硫化氢的河水、雨水、饮用水、钻井液、沼泽液等中的高浓度硫化氢的识别和检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明以N-(对苯甲基)-4-羟基-1,8-萘酰亚胺为荧光团合成了一种新型双识别位点H₂S荧光探针，H₂S通过硫解2,4-二硝基苯醚使荧光团暴露出羟基，从而实现荧光强度的增强，具有较长的激发和发射波长、光化学性质稳定、荧光量子产率高及价格经济便宜等优点。

(2)本发明所合成H₂S荧光探针NTE-1能选择性检测H₂S，在小分子硫醇L-Cys和GSH存在下，探针并未出现明显的荧光强度的增强，具有更好的专属性，且灵敏度较高。

(3)本发明所合成H₂S荧光探针NTE-1对H₂S的吸收光谱表现出较大的红移(大于100nm)，荧光增强超过30倍，线性检测范围增加至0-40μmmol/L，可用于河水、雨水、饮用水、钻井液、沼泽液等高浓度硫化氢的定量检测。

附图说明

图1为本发明所合成硫化氢荧光分子探针NTE-1的核磁共振氢谱；

图2为本发明所合成硫化氢荧光分子探针NTE-1的核磁共振碳谱；

图3为本发明所合成H₂S荧光分子探针NTE-1(10μmmol/L)加入1mmol/L的硫化钠溶液后的荧光光谱；

图4为本发明所合成H₂S荧光分子探针NTE-1的线性浓度曲线；

图5为本发明所合成H₂S荧光分子探针NTE-1的干扰离子实验与竞争性离子实验；从左到右加入的离子依次为：(1)free,(2)Na⁺,(3)Ca²⁺,(4)NO₂ ^-,(5)H₂O₂,(6)ClO^-,(7)HSO₄ ^-,(8)CN₂H₄S,(9)HSO₃ ^-,(10)S₂O₅ ^2-,(11)S₂O₈ ^2-,(12)L-Cys,(13)GSH；图5中左边的柱状图为探针+干扰离子，图5中右边的柱状图为探针+硫化钠+干扰离子。

具体实施方式

本发明提出的一种萘酰亚胺类H₂S荧光分子探针，所述探针为N-((2,4二硝基苯氧基)苯基)-4-(2,4-二硝基苯氧基)-1,8-萘酰亚胺(NTE-1)，其结构式如下：

所述的1,8-萘酰亚胺类H₂S荧光分子探针，采用N-(对苯甲基)-4-羟基-1,8-萘酰亚胺为荧光母体，以2,4-二硝基苯醚为识别基团，构成双识别位点的荧光分子探针；以4-溴-1,8-萘二甲酸酐为原料，经取代、醚化等一系列反应合成新的荧光分子探针。

上述探针的合成路线如下所示：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：1,8-萘酰亚胺类H₂S荧光分子探针的合成

1、N-(4-羟基苯基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺(中间体化合物1a)的合成：

氮气保护下，将2.77g(10.00mmol)4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于50mL无水乙醇中，室温条件下充分搅拌后，加入1.31g(12.00mmol)4-氨基苯酚，继续搅拌并将反应液升温至80℃，回流反应8小时。TLC监测原料完全转化后(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2：1，V/V)，停止加热，反应液降温冷却，冷却过程中可观察到固体逐步析出。抽滤，洗涤，充分干燥得棕色固体3.34g，收率90.76％。

2、N-(4-羟基苯基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺(中间体化合物1b)的合成：

氮气保护下，将2.15g(5.85mmol)3a溶于60mL无水甲醇中，室温条件下搅拌20分钟。向反应液中加入无水碳酸钾4.04g(29.25mmol)，碘化钾0.02g(0.12mmol)，搅拌下将反应体系升温至75℃，回流反应8小时。TLC监测反应结束后(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：1，V/V)，冷却，旋蒸，将得到的固体用蒸馏水水洗三次，干燥，得黄色固体产品1.42g，收率为76.08％。

3、N-(4-羟基苯基)-4-羟基-1,8-萘酰亚胺(中间体化合物1c)的合成：

氮气保护下，将2.62g(7.30mmol)3b溶于30mL浓度为57％的氢碘酸中，室温条件下搅拌10分钟后，将温度升温至130℃，回流反应36小时。反应结束后，降温冷却，冰浴条件下用20％的氢氧化钠调节pH至7，在此过程中有大量固体析出，抽滤得粗产品。粗产品进一步用柱层析分离纯化(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝4：1，V/V)，最终得黄色固体产品1.60g，收率72.07％。

4、N-((2,4二硝基苯氧基)苯基)-4-(2,4-二硝基苯氧基)-1,8-萘酰亚胺(探针NTE-1)的合成：

氮气保护下，将0.92g(3.00mmol)3c溶于30mL无水DMF中，依次加入无水碳酸钾2.08g(15.00mmol)、碘化钾0.01g(0.06mmol)以及CTMAB 0.02g(0.06mmol)，室温条件下搅拌20分钟。将含有1.85g(7.50mmol)的2,4-二硝基溴苯的5mL无水DMF缓慢滴加至反应液中，滴加时间约为10分钟。滴加完成后，将反应液升温至100℃，继续保温反应5小时。停止加热后，冷却，过滤。向滤液中加入50mL蒸馏水，用二氯甲烷萃取3次，将三次所得的萃取相合并，并用无水硫酸镁干燥数小时。干燥完成后，过滤，滤液旋转除去溶剂得粗产。柱层析分离得目标产物NTE-1(所用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝4：1，V/V)，最终得乳白色固体产物0.59g，收率为30.89％。

实施例1制得的探针NTE-1的结构表征数据如下所示：

熔点m.p.>200℃；

核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.04(d,J＝2.8Hz,1H),8.95(d,J＝2.8Hz,1H),8.69–8.50(m,5H),8.02(t,J＝7.9Hz,1H),7.63–7.53(m,4H),7.50–7.42(d,J＝7.9Hz,2H),7.36–7.30(d,J＝8.1Hz,1H)；图1示出了所合成的硫化氢荧光分子探针NTE-1的核磁共振氢谱。

核磁共振碳谱¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ：164.01,163.39,156.03,154.96,153.99,153.44,143.69,142.21,140.84,140.20,133.95,132.59,132.26,132.00,130.63,130.29,130.00,128.59,128.38,124.16,123.53,122.83,122.71,122.42,120.89,120.26,120.12,115.17；图2示出了所合成的硫化氢荧光分子探针NTE-1的核磁共振碳谱。

高分辨质谱HRMS:[M+Na]⁺calculated for C₃₀H₁₅N₅O₁₂ 660.0609 found660.0592。

实施例2：1,8-萘酰亚胺类H₂S荧光分子探针的应用

由于H₂S在中性环境中多以HS^－形式存在，与硫化钠在中性条件下的离子分布类似，因此，本实施例中以硫化钠溶液代替H₂S进行测试。

称取1mmol的探针NTE-1(0.0064g)溶于10mL无水二甲基亚砜(DMSO)中，配置成1mmol/L的探针母液；然后移取100μL探针母液置于10mL容量瓶中，随即用PBS：乙醇＝1：2(V/V)的溶剂将其定容至10mL，配置成1×10-5mol/L的测试液。取1mL测试液置于四面透的石英比色皿中，加入1mmol/L的硫化钠溶液，测试其荧光光谱，结果如图3所示，探针NTE-1自身无荧光，加入1mmol/L的硫化钠之后，2小时后549nm处荧光强度增加至未加入硫化钠时的30倍。探针NTE-1的线性浓度曲线如图4所示，在硫化钠浓度为0-40μmmol/L之间时，探针NTE-1在549nm处的荧光发射强度与硫化钠浓度呈一次函数关系，适用于高浓度H₂S的定量检测。此外，该分子探针NTE-1不受Na⁺、Ca²⁺、NO₂ ^-、H₂O₂、ClO^-、HSO₄ ^-、CN₂H₄S、HSO₃ ^-、S₂O₅ ^2-、S₂O₈ ^2-等离子的干扰，如图5所示，即使在有干扰离子存在的条件下，探针NTE-1也对H₂S仍有很好的响应，具有较好的特异性，使得该荧光分子探针在生物化学，环境保护科学等分析检测领域能用于H₂S的检测，具有潜在的实际应用价值。

综上，本发明以N-(对苯甲基)-4-羟基-1,8-萘酰亚胺为荧光母体，2,4-二硝基苯醚为识别基团，得到具有双识别位点的荧光分子探针，硫化氢通过硫解2,4-二硝基苯醚使荧光团暴露出羟基，从而实现荧光强度的增强(超过30倍)。本发明所述荧光分子探针具有光化学性质稳定、荧光量子产率高及价格经济便宜等优点，特异性识别硫化氢，不受Na⁺、Ca^{2 +}、NO₂ ^-、H₂O₂、ClO^-、HSO₄ ^-、CN₂H₄S、HSO₃ ^-、S₂O₅ ^2-、S₂O₈ ^2-等离子的干扰，线性检测范围增加至0-40μmmol/L，可用于河水、雨水、饮用水、钻井液、沼泽液等高浓度硫化氢的定量检测，具有潜在的实际应用价值。

尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针，其特征在于，所述探针为N-((2,4二硝基苯氧基)苯基)-4-(2,4-二硝基苯氧基)-1,8-萘酰亚胺，记为探针NTE-1，结构式如下：

2.根据权利要求1所述的1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)中间体化合物1a的合成：

氮气保护下，以4-溴-1,8-萘二甲酸酐和4-氨基苯酚为原料，以无水乙醇为溶剂，回流温度下反应8小时；待原料完全转化后，停止加热，降温冷却；抽滤，洗涤，充分干燥后得到N-(4-羟基苯基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺即为化合物1a；

(2)中间体化合物1a的合成：

氮气保护下，以化合物1a、无水碳酸钾和碘化钾为原料，以无水甲醇为溶剂，75℃下反应8小时；反应结束后，冷却，旋蒸，洗涤，干燥，得到N-(4-羟基苯基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺即为化合物1b；

(3)中间体化合物1c的合成：

氮气保护下，以中间产物1b和氢碘酸为原料，130℃下反应36小时；反应结束后，降温冷却，调节pH至7，在此过程中有固体析出，抽滤，得到粗产品，柱层析分离纯化后得到N-(4-羟基苯基)-4-羟基-1,8-萘酰亚胺即为化合物1c；

(4)探针NTE-1的合成：

氮气保护下，以化合物1c、无水碳酸钾、碘化钾和2,4-二硝基溴苯为原料，以无水N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，加入相转移催化剂，100℃下反应5小时；停止加热后，冷却，过滤；萃取，干燥，过滤，除去溶剂得粗产物，柱层析分离得到目标产物N-((2,4二硝基苯氧基)苯基)-4-(2,4-二硝基苯氧基)-1,8-萘酰亚胺，即为探针NTE-1。

3.根据权利要求2所述的1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，4-溴-1,8-萘二甲酸酐和4-氨基苯酚的摩尔质量比为1：(1～1.5)；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与无水乙醇的重量体积比为(5～6)g：100mL。

4.根据权利要求2所述的1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，化合物1a、无水碳酸钾和碘化钾的摩尔质量比为1：(4～6)：(0.02～0.03)；化合物1a与无水甲醇的重量体积比为(4～5)g：120mL。

5.根据权利要求2所述的1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，化合物1b和氢碘酸的质量体积比为(2～3)：30mL；氢碘酸优选浓度为57％的氢碘酸。

6.根据权利要求2所述的1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，以十六烷基三甲基溴化铵为相转移催化剂。

7.根据权利要求2所述的1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，化合物1c、无水碳酸钾、碘化钾、十六烷基三甲基溴化铵和2,4-二硝基溴苯的摩尔质量比为1：(4～6)：(0.02～0.04)：(0.02～0.04)：(2～3)。

8.根据权利要求2所述的1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，2,4-二硝基溴苯溶于无水N,N-二甲基甲酰胺后，缓慢滴加到反应液中，滴加时间约为8～15min。

9.根据权利要求2所述的1,8-萘酰亚胺类硫化氢荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)分别得到的粗产物使用硅胶柱进行分离纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝(2～4)：1。

10.根据权利要求1所述的探针用于含有硫化氢的液体中的硫化氢的识别和检测。

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