CN113009023A - 一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,属于中成药含量测定技术领域,检测中药中含量悬殊的成分,准确测定同一中药样品中高含量成分与低含量成分含量,判断所述中药的质量变化;所述中药为双黄连注射液。针对中药复杂体系中含量悬殊成分同时测定的问题,本方法构建倍比稀释法,制备低稀释比例的供试品溶液以检测低含量成分(新绿原酸等21种成分),制备高稀释比例的供试品溶液检测高含量成分(黄芩苷),通过不同稀释方法实现对样品中含量悬殊成分的快速检测。供试品溶液的稀释倍数和稀释次数可根据待检测样品中检测成分含量悬殊程度决定,该方法有效解决了含量悬殊成分的检测问题。
Description
技术领域
本发明涉及中成药含量测定技术领域,具体涉及一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法。
背景技术
中成药及其饮片,是一个由多成分组成的复杂体系,而且经常存在化学成分含量悬殊的情况,测定单一成分或含量较高成分的含量不能完全反映其质量变化,因此,发展一种简单、有效的测定样品中含量悬殊成分的方法尤为重要。
双黄连注射液由金银花、连翘、黄芩经过一系列现代制药工艺制备而成的水针剂,具有清热解毒、清宣肺热的作用,临床上常用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛,适用于病毒及细菌引起的上呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等。双黄连注射液中含有有机酸、黄酮、环烯醚萜苷、木脂素类等化合物。双黄连注射液现行标准的含量测定研究主要通过黄芩苷、绿原酸、咖啡酸、连翘苷的含量测定控制制剂质量,但无法实现双黄连注射剂中其它成分的质量分析;且制剂中黄芩苷含量很高,与样品中其它化合物含量悬殊,其它成分信号易被黄芩苷掩盖,不易准确测量。
现有阶段的检测方法,检测不够全面,检测结果不够准确。例如,授权公告号为CN100457139C的专利提供了一种双黄连注射液的制备方法,其先分别对黄芩、金银花和连翘进行提取,然后再进行注射液的制备。同时还提供了双黄连注射液的成分检测方法,该成分检测方法只对三种物质的含量进行检测。授权公告号为CN103308615B的专利公开了一种中药制剂注射用双黄连中多种成分含量测定方法,它涉及一种中药制剂注射用双黄连中多种成分含量测定方法。该发明要解决现有注射用双黄连含量测定方法,样品处理复杂,双黄连的检测费时、占用大量的人员和检验设备,检验周期长的问题。该发明提供一种注射用双黄连中同时测定连翘苷、连翘酯苷A、咖啡酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、黄芩素、千层纸素-7-O-葡糖醛酸苷等10多种成分的含量,检测不够全面。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,能够有效测定中药组合物中含量悬殊成分,实现更加准确、***的反映中药组合物,尤其是双黄连注射液的质量。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:
通过对照品比对法确定双黄连注射液中的22种成分,具体包括:新绿原酸(Nea)、连翘酯苷E(FoE)、绿原酸(Cha)、隐绿原酸(Cra)、咖啡酸(Caa)、断马钱子酸(Sea)、幼枝含断氧化马钱子苷(Seg)、异连翘酯苷A(Iso)、金丝桃苷(Hyp)、野黄芩苷(Scu)、连翘酯苷A(FoA)、异绿原酸B(IaB)、异绿原酸A(IaA)、异绿原酸C(IaC)、连翘苷(Pil)、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(Chg)、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(Org)、汉黄芩苷(Oro)、黄芩素(Bai)、汉黄芩素(Won)、千层纸素(OrA)、黄芩苷(Bac)。采用UPLC多波长切换法定量分析双黄连注射液中22种成分的含量。
所述方法包括以下步骤:
1、取双黄连注射液稀释25倍制备低稀释倍数的供试品溶液,进样,采用UPLC-PDA多波长切换方法分析,经对照品比对,确定了双黄连注射液中22种化学成分。
2、双黄连注射液供试品溶液的制备方法,具体步骤如下:精密量取双黄连注射液1mL,置于25mL容量瓶中,用10%甲醇定容至刻度,摇匀,即得双黄连注射液稀释25倍的低稀释倍数供试品溶液。
取上述的双黄连注射液稀释25倍的供试品溶液1mL,精密量取,置于10mL容量瓶,用10%甲醇定容至刻度,摇匀,即得双黄连注射液稀释250倍的高稀释倍数供试品溶液。
3、混合对照品溶液的制备,取22种对照品适量,精密称定,分别置于10mL容量瓶中,加体积分数为10–100%甲醇溶液溶解并定容,摇匀,制成已知浓度的对照品储备液。分别精密量取21种对照品储备液(黄芩苷除外)适量,置25mL容量瓶中,加10%甲醇定容至刻度,摇匀,制成含新绿原酸32.77μg/mL、连翘酯苷E 100μg/mL、绿原酸38.96μg/mL、隐绿原酸37.73μg/mL、咖啡酸6.048μg/mL、断马钱子酸32.00μg/mL、幼枝断氧化马钱子苷18.00μg/mL、异连翘酯苷A 74.66μg/mL、金丝桃苷6.636μg/mL、野黄芩苷11.60μg/mL、连翘酯苷A77.40μg/mL、异绿原酸B 16.72μg/mL、异绿原酸A 6.000μg/mL、异绿原酸C 16.83μg/mL、连翘苷27.81μg/mL、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷22.04μg/mL、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷56.00μg/mL、汉黄芩苷4.624μg/mL、黄芩素10.12μg/mL、汉黄芩素0.9744μg/mL、千层纸素0.8260μg/mL的混合对照品储备液。混合对照品储备液采用10%的甲醇溶液1:1(v:v)逐级稀释2、4、8、16、32、64倍获得一系列浓度的混合对照品溶液。
精密吸取黄芩苷对照品储备液0.5mL,置25mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,制成含0.12mg/mL的黄芩苷对照品储备液,黄芩苷对照品储备液采用10%的甲醇溶液1:1(v:v)逐级稀释2、4、8、16、32、64倍获得一系列浓度的黄芩苷对照品溶液。
本发明的有益效果是:
针对中药复杂体系中含量悬殊成分同时测定的问题,本方法构建倍比稀释法,制备低稀释比例的供试品溶液以检测低含量成分(新绿原酸等21种成分),制备高稀释比例的供试品溶液检测高含量成分(黄芩苷),通过不同稀释方法实现对样品中含量悬殊成分的快速检测。供试品溶液的稀释倍数和稀释次数可根据待检测样品中检测成分含量悬殊程度决定,该方法有效解决了含量悬殊成分的检测问题。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
图1是本发明供试品溶液多波长切换色谱图(A、双黄连注射液,B、除黄芩苷外的混合对照品溶液,C、黄芩苷对照品溶液)。
图2是本发明双黄连注射液供试品溶液中11★号色谱峰、12号色谱峰,混合对照品溶液中木犀草苷(11号峰)、连翘酯苷A(12号色谱峰)的吸收曲线色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例的附图1-2,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
双黄连注射液主要由金银花、连翘、黄芩3味中药按照1:2:1比例经现代制药工艺制备而成。双黄连注射液中黄芩苷含量与双黄连注射液中其它成分含量差别悬殊,在检测过程中黄芩苷信号很高,掩盖且不易准确测量其它成分含量。在制剂的质量控制中只测定一种化学成分的含量或几种较高成分含量无法完全反映制剂的质量,无法保证制剂的临床疗效及安全性。特别是对中药注射液中的多成分进行质量分析,才能够更加全面的、整体性的控制中药注射液的质量。
本发明通过构建UPLC-PDA(超高效液相色谱)多波长切换方法,结合供试品制备的倍比稀释法测定了双黄连注射液中22种化学成分的含量,双黄连注射液色谱图如图1,对照品溶液色谱图如图2所示。
图1中,1、新绿原酸;2、连翘酯苷E;3、绿原酸;4、隐绿原酸;5、咖啡酸;6、断马钱子酸;7、幼枝含断氧化马钱子苷;8、异连翘酯苷A;9、金丝桃苷;10、野黄芩苷;11、木犀草苷(11★木犀草苷和其它化合物的混合峰)、12、连翘酯苷A;13、异绿原酸B;14、异绿原酸A;15、异绿原酸C;16、黄芩苷;17、连翘苷;18、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷;19、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷;20、汉黄芩苷;21、黄芩素;22、汉黄芩素;23、千层纸素
采用UPLC-PDA检测时,双黄连注射液供试品溶液中11★号色谱峰与对照品木犀草苷保留时间一致,但其吸收曲线与12号峰的连翘酯苷A基本一致,如图2所示,推测在UPLC-PDA双黄连注射液色谱中11★号色谱峰为木犀草苷和连翘酯苷A同系物的共流出物,因此11★号色谱峰化合物不作为后续双黄连注射液的质量研究的指标成分。
实施例
1仪器与试药
1.1仪器
超高效液相色谱仪:ACQUITY I Class(美国沃特世公司);XS 205型十万分之一电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司),AL 204型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司);Eppendorf 5424R小型台式高速冷冻离心机(德国艾本德公司);Milli-Q型超纯水***(美国Millipore公司)。
1.2试药
对照品:绿原酸(110753-201817,纯度>96.80%)、咖啡酸(110885-201703,纯度>99.70%)、野黄芩苷(110842-201709,纯度>91.70%)、连翘酯苷A(111810-201707,纯度>97.20%)、连翘苷(110821-201816,纯度>95.10%)、黄芩素(111595-201808,纯度>97.90%)、汉黄芩苷(112002-201702)、汉黄芩素(111514-201706,纯度>97.00%),均购自中国食品药品检定研究院;幼枝含断氧化马钱子苷(DST190803-111)购自成都德斯特生物技术有限公司;新绿原酸(P27A10L87091)、连翘酯苷E(P23N7F25442)、隐绿原酸(P30A9L69104)、断马钱子酸(T21A10Z95757)、异连翘酯苷A(Y14M6H1)、金丝桃苷(Y20J7X9353)、木犀草苷(Y26A9H59973)、异绿原酸B(P15M10L88488)、异绿原酸A(Z05M10X87215)、异绿原酸C(P25J9L66496)、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(Y06S10H97162)、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(Y19D5J1)、千层纸素A(Y29D6Y17716)、黄芩苷(P20A9F59353),均购自上海源叶生物科技有限公司,纯度均大于98%;双黄连注射液由河南福森制药有限公司提供,批号分别为:1801253、1802051、1803051、1804281、1805111、1806293、1807161、1808031、1809031、1810023、1901021、1902051、1903091、1904051、1905081、1906061、1907022、1908011、1910052、1911023。
甲醇、乙腈(色谱纯,赛默飞世尔科技公司),甲酸(色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),DMSO(美国Meridian Medical Technologies公司),超纯水为实验室自制。
2色谱条件
色谱柱:ACQUITYHSS T3(2.1×100mm,1.8μm);进样量2μL;多波长切换检测,定时波长切换序列如表1所示;柱温50℃;流速0.3mL/min,以乙腈(B)–0.1%甲酸水(A)为流动相,梯度洗脱条件见表2。
表1化合物定时波长切换表
“–”表示无检测化合物
“木犀草苷★”表示注射液供试品溶液色谱图中色谱峰是木犀草苷与其它化合物的混合物峰
表2流动相梯度洗脱条件
3供试品溶液的制备
精密量取双黄连注射液1mL,置于25mL容量瓶中,用10%甲醇定容至刻度,摇匀,即得双黄连注射液稀释25倍的供试品溶液。
取上述的稀释25倍供试品溶液1mL,精密量取,置于10mL容量瓶,用10%甲醇定容至刻度,摇匀,即得双黄连注射液稀释250倍供试品溶液。
4对照品溶液配制
取23种对照品适量,精密称定,分别置于10mL容量瓶中,加体积分数为10–100%甲醇溶液溶解并定容,摇匀,制成对照品溶液,浓度分别为黄芩苷6.000mg/mL(DMSO助溶)、新绿原酸1.024mg/mL、连翘酯苷E1.000mg/mL、绿原酸0.974mg/mL、隐绿原酸1.048mg/mL、咖啡酸1.008mg/mL、断马钱子酸1.000mg/mL、幼枝含断氧化马钱子苷1.000mg/mL、异连翘酯苷A1.037mg/mL、金丝桃苷1.106mg/mL、野黄芩苷0.967mg/mL、木犀草苷1.051mg/mL、连翘酯苷A 0.774mg/mL、异绿原酸B1.045mg/mL、异绿原酸A1.000mg/mL、异绿原酸C1.052mg/mL、连翘苷0.927mg/mL、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸1.102mg/mL、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸1.000mg/mL、汉黄芩苷1.156mg/mL、黄芩素1.012mg/mL、汉黄芩素0.9778mg/mL、千层纸素A1.320mg/mL。
分别精密量取22种对照品溶液(黄芩苷除外)适量,置25mL容量瓶中,加10%甲醇水定容至刻度,摇匀,配制成含新绿原酸32.77μg/mL、连翘酯苷E 100.0μg/mL、绿原酸38.96μg/mL、隐绿原酸37.73μg/mL、咖啡酸6.048μg/mL、断马钱子酸32.00μg/mL、幼枝含断氧化马钱子苷18.00μg/mL、异连翘酯苷A 74.66μg/mL、金丝桃苷6.636μg/mL、野黄芩苷11.60μg/mL、木犀草苷33.63μg/mL、连翘酯苷A 77.40μg/mL、异绿原酸B 16.72μg/mL、异绿原酸A6.000μg/mL、异绿原酸C 16.83μg/mL、连翘苷27.81μg/mL、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸22.04μg/mL、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸56.00μg/mL、汉黄芩苷4.624μg/mL、黄芩素10.12μg/mL、汉黄芩素0.9744μg/mL、千层纸素A 0.8260μg/mL的混合对照品储备液。混合对照品储备液采用10%的甲醇溶液1:1(v:v)逐级稀释2、4、8、16、32、64倍获得一系列的混合对照溶液。
精密吸取黄芩苷对照品储备液0.5mL,置25mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,制成浓度为0.12mg/mL的黄芩苷对照品溶液,黄芩苷对照品溶液采用10%的甲醇水溶液1:1(v:v)逐级稀释2、4、8、16、32、64倍获得一系列的黄芩苷对照品溶液。
5方法学考察
研究过程中共绘制了23个化合物的标准曲线,但由于木犀草苷和其它化合物共流出(11★号色谱峰),因此在后续方法学研究的数据处理过程中只保留了22个化合物的计算结果。
5.1线性关系考察、定量限检测限
按“2”项下色谱条件测定“4”项下制备的系列混合对照品溶液;以对照品浓度x(μg/mL)为横坐标,以各对照品化合物的峰面积y为纵坐标,绘制标准曲线;以信噪比S/N=3时的化合物浓度为检测限(LOD)和S/N=10时的化合物浓度为定量限(LOQ),结果如表3所示。双黄连注射液中22种化学成分在相应浓度范围内线性关系良好,其相关系数r均大于0.999。
表3双黄连注射液22种化合物线性回归方程、线性范围、检测限和定量限
5.2精密度考察
5.2.1日内精密度
按照“3”项下制备不同稀释比例的双黄连注射液供试品溶液,采用“2”项下色谱条件,分别测定不同稀释比例的供试品溶液,分别进样6次,测得各化合物色谱峰峰面积,计算RSD值,结果如表4所示。各化合物RSD均小于1.0%,表明日内精密度良好。
表4双黄连注射液多成分测定的日内精密度试验结果(n=6)
5.2.3日间精密度
按照“3”项下方法制备一份不同稀释比例的双黄连注射液供试品溶液,采用“2”项下色谱条件,同一份样品不同稀释比例的供试品溶液分别进样6次,重复三天。测得三天各化合物色谱峰峰面积,计算三天各化合物色谱峰峰面积的RSD值,结果如表5所示。各化合物RSD均小于3.5%,表明日内精密度良好。
表5双黄连注射液多成分测定的日间精密度试验结果(n=3)
5.3稳定性考察
按照“3”项下方法制备一份不同稀释比例的双黄连注射液供试品溶液,置于自动进样器中,按照“2”下色谱条件,依次进样不同稀释比例的供试品溶液,于0、2、4、6、8、10、12h进样,测得各化合物色谱峰峰面积,计算各相应色谱峰峰面积的RSD值,结果如表6所示。各化合物稳定性试验RSD均小于2.7%,表明10℃下的双黄连注射液样品在12h内稳定性良好。
表6双黄连注射液多成分测定的稳定性试验结果
5.4重复性考察
按“3”项下方法制备各6份不同稀释比例的双黄连注射液供试品溶液,采用“2”项下色谱条件分别进样,每份样品平行测定2次,测得各化合物色谱峰峰面积,计算6份样品中22个化合物含量测定的重复性试验结果,结果如表7所示。各化合物RSD均小于1.5%,表明构建的方法重复性良好。
表7双黄连注射液多成分测定的重复性试验结果(n=6)
5.5加样回收率试验
精密量取0.5mL的双黄连注射液6份,加入黄芩苷0.5mL(6.400mg/mL,DMSO助溶)其他混合对照品溶液3mL(新绿原酸36.84μg/mL、连翘酯苷E 80.00μg/mL、绿原酸35.06μg/mL、隐绿原酸37.73μg/mL、咖啡酸12.10μg/mL、断马钱子酸60.00μg/mL、幼枝含断氧化马钱子苷16.00μg/mL、异连翘酯苷A 78.81μg/mL、金丝桃苷13.27μg/mL、野黄芩苷13.01μg/mL、连翘酯苷A 67.20μg/mL、异绿原酸B 16.72μg/mL、异绿原酸A 7.200μg/mL、异绿原酸C 16.83μg/mL、连翘苷29.66μg/mL、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸26.12μg/mL、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸60.00μg/mL、汉黄芩苷3.237μg/mL、黄芩素20.24μg/mL、汉黄芩素1.095μg/mL、千层纸素A 1.156μg/mL),按“3”项下方法制备不同稀释比例的供试品溶液,采用“2”项下色谱条件分别进样,每个样品平行测定2次,测得各化合物色谱峰峰面积,计算样品中各化合物含量,计算加样回收率。结果如表8所示,6份样品中22个化合物平均加样回收率在95.06~109.3%之间,RSD均小于3.0%,表明双黄连注射液中22种含量悬殊的化合物加样回收率良好,方法准确可行。
表8双黄连注射液多成分加样回收率试验结果(n=6)
以上方法学试验结果可知,双黄连注射液中含量悬殊的22种成分线性关系良好;上述的22个化合物的检测灵敏度高;精密度、稳定性、重复性均良好,加样回收率为95.06-109.3%。结果表明该检测方法基本符合含量测定的要求,可用于双黄连注射液中含量悬殊的22个化合物成分的含量测定。
5.6双黄连注射液20批次中多成分的含量测定
采用已构建的方法,测定20批次双黄连注射液中各成分含量。取20批次的双黄连注射液,按“3”项下方法制备不同稀释比例的双黄连注射液供试品溶液,采用“2”项下色谱条件测定各批次中22个化合物的含量,测定结果如表9所示。
表9 20批次双黄连注射液多成分含量测定试验结果(n=2,μg/mL)
续表9
由结果可知,本发明构建的倍比稀释法可应用于双黄连注射液含量悬殊成分的测定,该方法稳定可行,灵敏度高,重复性良好,能快速有效的测定双黄连注射液中22种化学成分,可较全面有效的表征双黄连注射液中含量悬殊的化学成分含量,从而控制双黄连注射液质量。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:检测中药中含量悬殊的成分,准确测定同一中药样品中高含量成分与低含量成分含量,判断所述中药的质量变化;所述中药为双黄连注射液。
2.如权利要求1所述的一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:其具体步骤如下:
步骤a、精密量取双黄连注射液,加10%的甲醇稀释25倍,即得双黄连注射液稀释25倍的低稀释比例的供试品溶液;
取部分上述稀释25倍的供试品,加10%甲醇稀释10倍,即得双黄连注射液稀释250倍的高稀释比例的供试品溶液;
步骤b、取黄芩苷(DMSO助溶)、新绿原酸、连翘酯苷E、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、断马钱子酸、幼枝含断氧化马钱子苷、异连翘酯苷A、金丝桃苷、野黄芩苷、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、连翘苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A对照品适量,精密称定,加体积分数为10–100%甲醇溶液溶解,摇匀,制成对照品溶液;
步骤c、分别精密量取21种对照品溶液(黄芩苷除外)适量,置25 mL容量瓶中,加10%甲醇定容至刻度,摇匀,配制成混合对照品储备液,混合对照品储备液采用10%的甲醇溶液1:1(v:v)逐级稀释2、4、8、16、32、64倍获得一系列的混合对照溶液;精密吸取芩苷对照品储备液置25 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,采用10%的甲醇溶液1:1(v:v)逐级稀释2、4、8、16、32、64倍获得一系列的黄芩苷对照品溶液。
3. 如权利要求2所述的一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:所述步骤a中精密量取双黄连注射液1 mL,置于25 mL容量瓶中,用10%甲醇定容至刻度,摇匀,即得双黄连注射液稀释25倍的低稀释比例的供试品溶液,取上述的稀释25倍供试品溶液1 mL,精密量取,置于10 mL容量瓶,用10%甲醇定容至刻度,摇匀,即得双黄连注射液稀释250倍的高稀释比例的供试品溶液。
4.如权利要求1或2所述的一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:所述高含量成分包括黄芩苷,所述低含量成分包括新绿原酸、连翘酯苷E、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、断马钱子酸、幼枝含断氧化马钱子苷、异连翘酯苷A、金丝桃苷、野黄芩苷、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、连翘苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A。
5.如权利要求3所述的一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:检测双黄连注射液中高含量成分和低含量成分含量的方法为超高效液相色谱法,所述超高效液相色谱法的色谱条件为:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱;
多波长切换检测:
流动相A为0.1 ~ 0.2%甲酸水溶液(v/v),流动相B为乙腈,梯度洗脱程序为:0 ~ 7min,流动相A 3% ~ 13%;7 ~ 18 min,流动相A 13% ~ 27%;18 ~ 20 min,流动相A 27% ~48%;20 ~ 21 min,流动相A 48% ~ 90%;
流速:0.3 ~ 0.5 mL/min;
柱温:30 ~ 90 ℃。
6.如权利要求5所述的一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:甲酸水溶液的体积百分比为0.1%。
7. 如权利要求5所述的一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:所述流速为0.3 mL/min;和/或所述柱温为50 ℃。
8. 如权利要求4所述的一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:多波长切换时间为:0.00 ~ 5.00 min,检测波长327 nm;5.00 ~ 5.60 min,检测波长280nm;5.60 ~ 6.15 min,检测波长325 nm;6.12 ~ 8.50 min,检测波长240 nm;8.50 ~ 9.50min,235 nm;9.50 ~ 9.80 min,检测波长240 nm;9.80 ~ 10.00 min,检测波长250 nm;10.00 ~ 14.00 min,检测波长327 nm;14.00 ~ 14.50 min,检测波长254 nm;14.50 ~17.65 min,检测波长276 nm;17.65 ~ 25.00 min,检测波长270 nm。
9. 如权利要求2所述的一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:步骤b中取22种对照品适量,精密称定,分别置于10 mL容量瓶中,加体积分数为10–100%甲醇溶液溶解并定容,摇匀,制成对照品储备液,浓度分别为黄芩苷6 mg/mL(DMSO助溶)、新绿原酸1 mg/mL、连翘酯苷E 1 mg/mL、绿原酸1 mg/mL、隐绿原酸1 mg/mL、咖啡酸1 mg/mL、断马钱子酸1mg/mL、幼枝含断氧化马钱子苷1mg/mL、异连翘酯苷A 1 mg/mL、金丝桃苷1 mg/mL、野黄芩苷1 mg/mL、连翘酯苷A 0.8 mg/mL、异绿原酸B 1 mg/mL、异绿原酸A 1 mg/mL、异绿原酸C 1mg/mL、连翘苷1 mg/mL、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷1 mg/mL、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷1 mg/mL、汉黄芩苷1 mg/mL、黄芩素1 mg/mL、汉黄芩素1 mg/mL、千层纸素A 1.3 mg/mL。
10. 如权利要求2所述的一种中药复方制剂中化学成分含量的测定方法,其特征在于:步骤c中精密量取21种对照品溶液(黄芩苷除外)适量,分别置25 mL容量瓶中,加10%甲醇定容至刻度,摇匀,配制成含新绿原酸33μg/mL、连翘酯苷E 100 μg/mL、绿原酸39 μg/mL、隐绿原酸38 μg/mL、咖啡酸6 μg/mL、断马钱子酸32 μg/mL、幼枝含断氧化马钱子苷18 μg/mL、异连翘酯苷A 75 μg/mL、金丝桃苷7 μg/mL、野黄芩苷12 μg/mL、连翘酯苷A 77 μg/mL、异绿原酸B 17 μg/mL、异绿原酸A 6 μg/mL、异绿原酸C 17 μg/mL、连翘苷28 μg/mL、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷22 μg/mL、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷56 μg/mL、汉黄芩苷5 μg/mL、黄芩素10μg/mL、汉黄芩素1 μg/mL、千层纸素A 0.8 μg/mL的混合对照品储备液,混合对照品储备液采用10%的甲醇溶液1:1(v:v)逐级稀释2、4、8、16、32、64倍获得一系列的混合对照溶液;精密吸取黄芩苷对照品储备液0.5 mL,置25 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,制成每mL含0.12 mg的黄芩苷对照品储备液,黄芩苷对照品储备液采用10%的甲醇溶液1:1(v:v)逐级稀释2、4、8、16、32、64倍获得一系列的黄芩苷对照品溶液。
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