CN113008861A - 一种用于重金属离子检测的可重复使用sers传感器及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器，包括多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构、荧光标记的重金属离子探针链、和重金属离子反应链，在所述多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的单层石墨烯上表面通过物理吸附固定荧光标记的重金属离子探针链，得到最强荧光分子拉曼信号，所述重金属离子反应链与重金属离子探针链结合后猝灭荧光分子拉曼信号，得到SERS传感器。通过在使用后的所述传感器表面重新添加重金属离子反应链使所述SERS传感器可以多次使用。其优点在于，增强效果明显、检测信号稳定、检测选择性好、多次重复使用和成本低的特点。
Description
技术领域
本技术属于生化传感技术领域，尤其涉及一种用于重金属离子检测的SERS传感器及制备方法。
背景技术
目前，用于检测重金属离子的传统方法有：原子吸收谱、原子发射谱、质谱法和紫外光谱法等，然而这些方法不仅需要对检测样品进行预处理，而且需要专业的设备和操作技术人员。伴随着纳米制造技术的应用，许多新型的Pb2+检测技术也得到发展。例如：荧光法、电化学方法、电化学发光法、比色法、表面增强拉曼散射(SERS)等。在这些方法中，SERS检测技术因其无损检测、指纹特性、操作简单等特点备受科学家的青睐。SERS检测技术的关键在于构建一种拉曼散射信号增强的基底环境，目前研究表明SERS有两种增强机制，一种是由粗糙贵金属表面局域等离子体共振引起的电磁增强机制，另外一种是指由电荷转移引起的化学增强机制，其中在金属纳米颗粒表面形成的电磁热点起到主要的增强作用。基底的增强效果直接影响重金属离子检测的灵敏度和检测范围，因此设计一款高效高稳定的SERS检测基底用于对重金属离子的检测是非常有意义的。
在SERS检测中，不同于生物和有机分子，包括Pb2+、Zn2+、Cu2+等在内的重金属并没有可供直接检测的指纹特性谱，而且目前用于检测重金属的SERS传感器大多不具备重复使用性，这不仅降低的检测效率，也造成的成本的消耗。所以制备可重复使用的SERS传感器具有重大实际意义的。
发明内容
基于上述问题，本发明提供一种灵敏度高、特异性好、可重复使用的用于重金属离子检测的SERS传感器，并实现对Pb2+、Zn2+、Cu2+、Na+等多种的重金属的灵敏检测。其技术方案为，
一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器，包括多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构、荧光标记的重金属离子探针链、和重金属离子反应链，在所述多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的单层石墨烯上表面通过物理吸附固定荧光标记的重金属离子探针链，得到最强荧光分子拉曼信号，所述重金属离子反应链与重金属离子探针链结合后猝灭荧光分子拉曼信号，得到SERS传感器；所述的SERS传感器利用荧光分子拉曼标记物与多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的距离改变而产生的信号强度变化实现间接检测不具有拉曼指纹特性的重金属离子；重金属离子检测后，通过在所述SERS传感器上表面添加新的重金属离子反应链使其可以多次使用。
进一步的，所述的多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构包括多孔氮化镓，所述多孔氮化镓上表面依次设置银纳米层和金纳米层，所述金纳米层上表面设置单层石墨烯。
进一步的，所述单层石墨烯可以为单层石墨烯单晶或单层石墨烯纳米颗粒。
进一步的，所述银纳米层厚度10-50nm，金纳米层厚度5-15nm。
一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备多孔氮化镓，并使其表面具有纳米间隙结构；
S2.在多孔氮化镓片表面依次设置银纳米层和金纳米层，得到多孔氮化镓/银/金多层复合结构；
S3.在上述多孔氮化镓/银/金多层复合结构上表面制备单层石墨烯，得到多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构；
S4.将荧光标记的重金属离子探针链固定到多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的单层石墨烯上表面，布满石墨烯上表面后，冲洗掉多余荧光标记的重金属离子探针链；
S5.通过酶联反应将重金属离子反应链和重金属离子探针链结合后，冲洗掉多余重金属离子反应链，得到SERS传感器；
S6.通过在使用过的SERS传感器上表面重新反复固定重金属离子反应链，使SERS传感器可多次重复使用。
进一步生物，步骤S2具体步骤为，所述多孔氮化镓制备方法可为常温电化学腐蚀法、高温生长法、高温化学腐蚀法和纳米压印法的任何一种。
进一步的，步骤S2具体步骤为，所述银纳米层厚度10-50nm，金纳米层厚度5-15nm，制备方法可为热蒸发、电子束蒸发、电镀和光电化学镀膜中的任何一种。
进一步的，所述重金属离子探针链固定条件为，在20-40℃下反应10-24小时。
进一步的，所述重金属离子反应链固定的条件为：在20-30℃下与重金属离子探针链反应30-150min后，用磷酸缓冲溶液浸泡清洗掉多余未连接上的重金属离子反应链。
进一步的，所述步骤S6具体步骤为，使用过的SERS传感器先进行冲洗后重新在20-30℃下使用重金属反应链与多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构表面的重金属探针链反应30-150min，然后用磷酸缓冲溶液浸泡清洗掉多余未连接上的反应链，恢复SERS传感器原有特征，使SERS传感器可多次重复使用。
有益效果
(1)本发明采用氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构，由金属纳米颗粒金/银沉积在多孔氮化镓上形成纳米间隙结构，而产生电磁场的局域等离子体共振增强，形成所谓的“热点”电磁增强效果；石墨烯作为一种新型的二维蜂窝状晶体材料，其与探测分子之间的电荷转移，对SERS信号实现化学增强，同时石墨烯厚度形成的纳米间隙对增强效果有影响，研究表明单层石墨烯作为亚纳米间隙具有较好的增强效果。
(2)采用石墨烯对单链核酸吸附，酶链反应和重金属离子辅助下探针链催化剪切反应链的原理，通过检测拉曼标记物Cy3信号强弱实现对重金属离子的定量检测。
(3)检测后反应链可重新与探针链结合。通过探针链与反应链的多次重复解离与再生实现传感器的重复使用。
附图说明
图1为本发明的重金属离子检测的SERS传感器结构图；
图2为可重复利用重金属离子检测SERS传感器的原理图；
图3为Cy3的1586cm-1信号峰强度随Pb2+浓度关系曲线图；
图4为Cy3的1586cm-1信号峰强度比率随Pb2+浓度关系图；
图5为在各种金属离子存在下，SERS传感器对应Pb2+在1586cm-1信号峰的强度对比图；
图6为SERS传感器对应Pb2+在10-7M Pb2+的检测中循环三次，对应的1586cm-1拉曼强度图。
其中1-多孔氮化镓，2-银纳米层，3-金纳米层，4-单层石墨烯，5-重金属离子探针链，6-重金属离子反应链，7-拉曼标记物Cy3。
具体实施方式
下面结合附图1-6和具体实施例对技术作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
如图1所示，一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器，包括多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构、荧光标记的重金属离子探针链5、和重金属离子反应链6，在所述多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的单层石墨烯上表面通过物理吸附固定荧光标记的重金属离子探针链5，得到最强荧光分子拉曼信号，所述重金属离子反应链6与重金属离子探针链7结合后猝灭荧光分子拉曼信号，得到SERS传感器。
所述的SERS传感器利用荧光分子拉曼标记物与多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的距离改变而产生的信号强度变化实现间接检测不具有拉曼指纹特性的重金属离子；重金属离子检测后，通过重新孵化所述SERS传感器表面的重金属反应链6使传感器可以多次使用。
所述多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构包括多孔氮化镓1，所述多孔氮化镓1上表面依次设置银纳米层2和金纳米层3，所述金纳米层3上表面设置单层石墨烯4。
由金属纳米颗粒金/银沉积在多孔氮化镓上表面形成的纳米间隙，而产生电磁场的局域等离子体共振增强，形成所谓的“热点”电磁增强效果；石墨烯作为一种新型的二维蜂窝状晶体材料，其与探测分子之间的电荷转移，对SERS信号实现化学增强，同时石墨烯厚度形成的纳米间隙对增强效果有影响，研究表明单层石墨烯作为亚纳米间隙具有较好的增强效果。本申请石墨烯材料的重点并不在于其多孔结构，而是具有电荷转移的化学增强效果，同时石墨烯对于DNA链具有一定的吸附作用，两者之间有π-π键的吸附作用。本发明中石墨烯/金/银/多孔氮化镓基底结合了贵金属的电磁增强和单层石墨烯的化学增强，相比于仅使用单一增强作用的基底更具优势。
纳米银的SERS活性很强，增强效果更好，但是其增强稳定性较差，同时银易与空气氧化，化学性质不稳定，金的SERS活性更加稳定。在多孔氮化镓表面先镀银再镀金，有利于形成一种具有稳定大面积均匀SERS增强的效果，同时较薄的金层可以减少银与空气的接触，保持银的化学稳定性。
一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备多孔氮化镓，并使其表面具有均匀纳米间隙结构；所述多孔氮化镓制备方法可为常温电化学腐蚀法、高温生长法、高温化学腐蚀法和纳米压印法的任何一种，以常温电化学腐蚀法为例，具体步骤为，
S11.将掺杂浓度为10-18-10-19cm-1的0.5cm2氮化镓片依次使用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗,然后用氮气流吹干；
S12.用电化学刻蚀的方法在氮化镓上刻蚀出多孔的纳米结构，使用0.3-0.5M的草酸溶液作为电解质，将清洗过的氮化镓和铂分别连接到直流电源的正负两极上，控制直流电源的电压为10-20V，刻蚀时间为30-80min。将蚀刻完的多孔氮化镓片用去离子水洗涤两至三次，并用氮气流吹干，得到表面均匀纳米间隙结构的多孔氮化镓。
S2.用热蒸发、电子束蒸发、电镀和光电化学镀膜中的任何一种方式在多孔氮化镓片表面制备贵金属纳米颗粒层，先蒸镀30nm的银层，再沉积10nm的金层，即得到多孔氮化镓/银/金多层复合结构；
S3.制备多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构；
石墨烯的转移方法有机械剥离法，湿法转移和干法转移等，为了保证单层石墨烯的质量，主要采用湿法转移。具体工艺描述如下：
S31.以甲烷为碳源，通过化学气相沉积法在厚度为25μm的高纯度(99.999％)铜箔表面生长单层石墨烯，然后将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)旋涂在石墨烯表面，并在110℃下固化15min，即可得到PMMA/石墨烯/铜的薄片；
S32.将该薄片以铜为接触面浸泡在FeCl3溶液中以刻蚀掉铜，然后用去离子水彻底清洗剩余的PMMA/石墨烯膜；
S33.用步骤(2)制得的多孔氮化镓/银/金多层复合结构从去离子水中吸附取出PMMA/石墨烯膜，再用异丙醇浸没清洗的方法来排除SERS基底与石墨烯之间多余的去离子水；
S34.静置片刻后，通过浸泡丙酮溶液来溶解掉PMMA，最后用无水乙醇和去离子水冲洗两到三次，得到多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构；
S4.将荧光标记的重金属离子探针链固定到多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的单层石墨烯上表面，布满石墨烯上表面后，在30℃下反应12h，用磷酸缓冲溶液浸泡清冲洗掉多余荧光标记的重金属离子探针链；
S5.通过酶联反应将重金属离子反应链和重金属离子探针链结合后，在25℃下孵育100min后，用磷酸缓冲溶液冲洗掉多余重金属离子反应链，得到SERS传感器；
S6.通过在使用过的SERS传感器上表面重新固定重金属离子反应链，使SERS传感器可多次重复使用。
所述重金属离子探针链不带巯基，重金属离子探针链长度为20-100个碱基对，不同的重金属离子探针链结合其对应的重金属离子反应链用于检测对应的重金属离子。重金属探针连和反应链碱基序列如下：
Pb2+的探针链：5’-TTT CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG AGT-Cy3-3’；Pb2+的反应链：5’-ACT CAC TAT rAG GAA GAG ATG-3’；
Zn2+的探针链：5’-CAT CCC GCC CAA CCC CAC TCT TCC CCG AGC CGG TCG AAATAG TGA GT-Cy3-3’；Zn2+的反应链：5’-ACT CAC TAT rAG GAA GAG ATG-3’；
Cu2+的探针链：5’-GCT AAG CCT GGG CCT CTT TCT TTT TAA GAA AGA AC-Cy3-3’；Cu2+的反应链：5’-AGC TTC TTT CTA ATA CGG CTT ACC-3’；
Na+的探针链：5’-GCG GCG GCG GAA CCA GGT CAA AGG TGG GTG AGG GGA CGCCAA GAG TCC CCG CGG TTA GGA GAT CGGT-Cy3-3’；Na+的反应链：5’-TCT CAA GGC ACCACC GAT CTC CTA TrA GGA AGT TCC GCC GCC GC-3’；
UO2 2+的探针链：5’-ACA GAC ATC TCT TCT CCG AGC CGG TCG AAA TAG TGA GT-Cy3；UO2 2+的反应链：5’-ACT CAC TAT rA GGA AGA GAT GTC TGT。
以下以检测Pb2+为例进行详细说明，其他Zn2+、Cu2+、Na+、UO2 2+的检测过程与Pb2+相同。
SERS传感器对Pb2+检测过程如下，该传感器具有可重复利用性，其原理如图2所示：
本发明中所有拉曼检测要求控制相同的条件：功率为0.25-1mW，波长为532nm的激光通过50倍长焦物镜聚焦后照射到样品表面，扫描面积为10μm×10μm的100个点，每个点的曝光时间为0.5-1s，数据采集的中心波数为1550cm-1。
(1)首先对新制备的SERS传感器检测背景信号，记录拉曼标记物Cy3位于1586cm-1的特征峰强度。
(2)将40μL一定浓度的Pb2+溶液滴加到SERS传感器上，室温下孵60-90min后测量拉曼信号，再次检测记录Cy3位于1586cm-1的特征峰强度，绘制拉曼信号强度与Pb2+浓度的关系曲线，完成Pb2+的测定；
为了验证本发明对Pb2+的检测具有较高的灵敏度，绘制了SERS信号峰的强度比率与Pb2+浓度的关系曲线图，见图3和图4，该SERS传感器对Pb2+的检测限为10pM。
为了验证本发明对Pb2+的检测具有较好特异性，比较了十种重金属离子在该传感器上的检测结果。
选取了Ni2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Al3+、Zn2+、Mn2+、Cr2+、Co2+、Pb2+十种重金属离子，将浓度为10-6M的上述重金属离子溶液40μL滴加到SERS传感器上孵化70min后，以相同的拉曼检测条件测量Cy3信号峰的强度，绘制了每种重金属离子检测结果对比图。见图5，从图中可以看出检测Pb2+时，SERS信号强度远大于检测其他重金属离子。结果表明该SERS传感器对于Pb2+的检测具有较好的特异性。
将检测过Pb2+的SERS传感器，用pH为7.0-7.4的磷酸缓冲溶液清洗三次以去除解离的核苷酸，然后再次滴加上过量的Pb2+反应链溶液，37℃下孵育10-20h以实现双链结构的再生，从而使得SERS传感器再次具有Pb2+检测的能力。对上述Pb2+检测过程的DNA解离和再生过程重复三次，绘制了Cy3的1586cm-1信号峰在此过程中的强度变化，如图6。经过多次的解离和再生过程，SERS传感器对于Pb2+的检测依然具有相对稳定的灵敏性。
实验验证本发明的重复使用性，所述的SERS传感器重复使用次数不少于三次。将不同的重金属离子探针链结合其对应的重金属离子反应链用于检测对应的重金属离子。
当然，上述说明并非对本技术的限制，本技术也不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也属于本技术的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器，其特征在于，包括多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构、荧光标记的重金属离子探针链、和重金属离子反应链，在所述多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的单层石墨烯上表面通过物理吸附固定荧光标记的重金属离子探针链，得到最强荧光分子拉曼信号，所述重金属离子反应链与重金属离子探针链结合后猝灭荧光分子拉曼信号，得到SERS传感器；所述的SERS传感器利用荧光分子拉曼标记物与多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的距离改变而产生的信号强度变化实现间接检测不具有拉曼指纹特性的重金属离子；重金属离子检测后，通过在所述SERS传感器上表面添加新的重金属离子反应链使其可以多次使用。
2.根据权利要求1所述的一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器，其特征在于，所述的多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构包括多孔氮化镓，所述多孔氮化镓上表面依次设置银纳米层和金纳米层，所述金纳米层上表面设置单层石墨烯。
3.根据权利要求2所述的一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器，其特征在于，所述单层石墨烯可以为单层石墨烯单晶或单层石墨烯纳米颗粒。
4.根据权利要求2所述的一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器，其特征在于，所述银纳米层厚度10-50nm，金纳米层厚度5-15nm。
5.一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备多孔氮化镓，并使其表面具有纳米间隙结构；
S2.在多孔氮化镓片表面依次设置银纳米层和金纳米层，得到多孔氮化镓/银/金多层复合结构；
S3.在上述多孔氮化镓/银/金多层复合结构上表面制备单层石墨烯，得到多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构；
S4.将荧光标记的重金属离子探针链固定到多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构的单层石墨烯上表面，布满石墨烯上表面后，冲洗掉多余荧光标记的重金属离子探针链；
S5.将重金属离子反应链和重金属离子探针链结合后，冲洗掉多余重金属离子反应链，得到SERS传感器；
S6.通过在使用过的SERS传感器上表面重新反复固定重金属离子反应链，使SERS传感器可多次重复使用。
6.根据权利要求5所述的一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤S2具体步骤为，所述多孔氮化镓制备方法可为常温电化学腐蚀法、高温生长法、高温化学腐蚀法和纳米压印法的任何一种。
7.根据权利要求5所述的一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤S2具体步骤为，所述银纳米层厚度10-50nm，金纳米层厚度5-15nm，制备方法可为热蒸发、电子束蒸发、电镀和光电化学镀膜中的任何一种。
8.根据权利要求5所述的一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器的制备方法，其特征在于，所述重金属离子探针链固定条件为，在20-40℃下反应10-24小时。
9.根据权利要求5所述的一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器的制备方法，其特征在于，所述重金属离子反应链固定的条件为：在20-30℃下与重金属离子探针链反应30-150min后，用磷酸缓冲溶液浸泡清洗掉多余未连接上的重金属离子反应链。
10.根据权利要求5所述的一种用于重金属离子检测的可重复使用SERS传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S6具体步骤为，使用过的SERS传感器先进行冲洗后重新在20-30℃下使用重金属反应链与多孔氮化镓/银/金/单层石墨烯多层复合结构表面的重金属探针链反应30-150min，然后用磷酸缓冲溶液浸泡清洗掉多余未连接上的反应链，恢复SERS传感器原有特征，使SERS传感器可多次重复使用。
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