CN113005134B - 一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法 - Google Patents

一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113005134B
CN113005134B CN202110266990.3A CN202110266990A CN113005134B CN 113005134 B CN113005134 B CN 113005134B CN 202110266990 A CN202110266990 A CN 202110266990A CN 113005134 B CN113005134 B CN 113005134B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gfap
pgex
opt
enzyme digestion
ompa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110266990.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113005134A (zh
Inventor
徐玉艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen Baotai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Xiamen Baotai Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen Baotai Biotechnology Co ltd filed Critical Xiamen Baotai Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110266990.3A priority Critical patent/CN113005134B/zh
Publication of CN113005134A publication Critical patent/CN113005134A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113005134B publication Critical patent/CN113005134B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法。本发明通过对胶质纤维酸性蛋白碱基序列的密码子进行优化，优化后的序列信息如SEQ ID NO.2所示，并进一步对pGEX‑4T‑2载体进行改造，增加了ompa信号肽，信号肽序列信息如SEQ ID NO.4所示。通过本发明提供的方法，使胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中的分泌增加，改善胶质纤维酸性蛋白包涵体形式的表达。

Description

一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法。
背景技术
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是中枢神经***所独有的特异性细胞骨架蛋白，是星形胶质细胞唯一表达的一种标志性蛋白，广泛分布于中枢神经***各个部位，约占正常成年人脑细胞总数的40％。GFAP则是星形胶质细胞和星形胶质细胞源性肿瘤的标志蛋白，对神经元起支撑和营养作用，参与星形胶质细胞的许多生物学功能，包括细胞的增殖与***、维护血脑屏障的正常生理功能、自噬、维持神经递质的平衡等。GFAP是星形胶质细胞特有的中间丝蛋白，是胶质瘤的标志蛋白。在正常情况下，细胞胞质内的GFAP循环降解，血液中GFAP水平较稳定；而病理条件下，如病人的中枢神经***受到损伤，其星形胶质细胞遭受破伤或坏死时，GFAP从胶质细胞中流出，穿过血脑屏障进入血液中，使GFAP浓度上调，因此GFAP在恶性胶质瘤中表现出异常过度表达。GFAP表达水平异常与多种遗传病和精神病相关，如亚历山大病、唐氏综合征、精神***症、情感型双极性疾患和抑郁症。目前，GFAP表达水平已经作为中风、脑外损伤、星型细胞源性胶质瘤等多种疾病的诊断标志之一。另外GFAP主要用于星型胶质瘤，包括星型细胞瘤，星型母细胞瘤，混合胶质瘤，多形性胶质母细胞瘤和非星型细胞瘤，包括部分少数胶质细胞瘤，多数室管膜瘤等中枢神经***肿瘤的诊断和鉴别诊断。
在胶质纤维酸性蛋白抗原的制备过程中，采取pGEX-4T-2载体对其全长基因进行表达，发现其原序列在大肠杆菌中不好表达，为此我们提供了一种经过密码子优化的序列用于表达。此外表达的蛋白都以包涵体形式存在。一方面增加纯化成本，另一方面纯化过程可能造成蛋白失活。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法。通过本发明提供的方法，使胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中的分泌增加，改善胶质纤维酸性蛋白包涵体形式的表达，为后续的纯化带来很大的便利。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法，包括如下步骤：
S1、用软件OptimumGeneTM分析编码GFAP蛋白的基因序列，进行密码子优化，获得优化后的GFAP基因序列；
S2、将步骤S1所得优化后的GFAP基因序列导入pGEX-4T-2质粒中，经测序验证序列信息，即可获得构建成功的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt；
S3、向步骤S2获得的构建成功的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt上添加ompa信号肽，进一步酶切测序验证，得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒；
S4、将步骤S3得到的pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒转化至宿主菌BL21感受态细胞中，进行蛋白表达，验证，即可。
优选地，步骤S1所述的优化后的GFAP基因序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，步骤S3所述的ompa信号肽序列信息如SEQ ID NO.3所示，编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，用引物ompa进行扩增。
优选地，所述引物ompa的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，所述引物ompa的下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，步骤S3的具体过程如下：
(1)将pGEX-4T-2-GFAP-opt用限制性内切酶BamHI和EcoRⅠ进行双酶切，获得线性化的pGEX-4T-2-GFAP-opt作为***载体，然后将酶切产物进行纯化，获得纯化的线性化pGEX-4T-2-GFAP-opt载体；
(2)用T4 DNA连接酶将ompa DNA片段与步骤(1)所得纯化的线性化pGEX-4T-2-GFAP-opt载体连接，并进一步酶切验证、测序，即可得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组表达质粒。
优选地，步骤(1)中的双酶切过程为，配制20μl的酶切体系：10×酶切Buffer 2μl，pGEX-4T-2-GFAP-opt质粒1μg，EcoRI 1μl，BamHⅠ1μl，补水至20μl；将上述酶切体系置于37℃下酶切1h即可。
优选地，步骤(1)所述的酶切产物纯化过程为：用TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，将酶切产物进行电泳，120V，1h；称重空1.5mL Ep管，于紫外灯下切下含目的DNA酶切片段的凝胶置入Ep管中；切碎胶块，分析天平称胶块的质量，按100mg＝100μL进行计算胶块的体积；加入至少1倍等体积的Binding Buffer；把混合物置于60℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；转移700μl冷却的DNA-琼脂糖溶液到一个Spin ColumnsCB2 DNA柱子，25℃下，12,000×g离心1min，弃去液体；将柱子重新套回收集管中，加入600μL漂洗液PW至Spin Columns CB2 DNA柱子中，25℃下，12,000×g离心1分钟，弃去滤出液；重复洗涤一次，将空柱子重新套回收集管中，12,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体；把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30～50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，12,000×g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，测定DNA浓度并保存于-20℃备用，即可。
优选地，步骤(2)所述的连接具体过程如下：按下述配方配制连接体系：10×T4DNA Ligase Buffer 1μL，线性化的pGEX-4T-2-GFAP-opt 1μl，ompa DNA片段7μL，T4 DNALigase 1μL，混匀，16℃放置16h，然后将连接物转化至DH5α感受态细胞，提取质粒。
优选地，步骤(2)中的酶切测序验证过程为：用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt质粒，验证用酶切体系为：质粒1μL，BamHI 0.3μL，XhoI 0.3μL，10×H buffer 1μL，加入双蒸水至10μL；回收用酶切体系为：质粒DNA 16μL，BamHI 1μl，XhoI 1μL，10×Hbuffer 2μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，进一步测序即可。
优选地，步骤S4所述的蛋白表达过程具体包括如下步骤：
(1)取1μl溶解的质量浓度为0.2μg/μL的重组质粒加入到制备好的30μl的BL21细菌感受态细胞中，冰上放置30min，获得混合液I；
(2)将步骤(1)所得混合液I置于42℃下水浴中热击45s，再放在冰上2min，得混合液II；
(3)向步骤(2)所得混合液II中加入700μL不含抗生素的LB液体培养基，置于37℃、200rpm恒温培养振荡器中培养1h，得培养好的混合液；
(4)取步骤(3)所得培养好的混合液200μL涂布于含50μg/mL氨苄霉素抗性LB固体平板培养基上，于37℃恒温培养箱内正置培养30min后，倒置平板培养12-16h；
(5)挑取阳性单克隆菌落，接种于5ml含50mg/L氨苄抗性的试管LB液体培养基中，37℃培养过夜后将此培养液接种于200ml含有50mg/L氨苄抗性的三角瓶LB液体培养基中扩培，37℃，200rpm/min培养至菌液OD值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃继续培6h，离心收集菌体并进行超声破碎，对破碎后的菌体成分分析即可。
本发明是基于大肠杆菌来源优化密码子的胶质纤维酸性蛋白基因在大肠杆菌中表达的平台，通过改造信号肽实现胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中高效表达，以期能够提高胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中的分泌能力。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明提供的方法针对大肠杆菌，对GFAP碱基序列进行密码子优化，具有很强的表达活性，能实现外源基因在大肠杆菌中的高表达；
(2)本发明通过融合信号肽，可以使GFAP的分泌量增加，改善GFAP抗原制备过程中包涵体的问题，为后续的纯化带来很大的便利。
附图说明
图1为pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt质粒构建流程图；
图2为pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt质粒双酶切验证结果图；
图3为质粒蛋白表达结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市面购买获得的常规产品。
本发明中，涉及到的基因序列、引物序列及测序过程均由上海生工生物工程有限公司完成；本发明所述的酶切位点BamHI、EcoR1及XhoI均来源于NEW ENGLAND BioLabs(北京)；本发明所述的DH5α感受态细胞、宿主菌BL21来源于天根生化科技有限公司；pGEX-4T-2质粒来源于优宝生物科技有限公司本发明所述LB液体培养基及LB固体培养基均可购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
实施例一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法
所述促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法，包括如下步骤：
S1、用软件OptimumGeneTM分析编码GFAP蛋白的基因序列，进行密码子优化，获得优化后的GFAP基因序列；
S2、将步骤S1所得优化后的GFAP基因序列导入pGEX-4T-2质粒中，经测序验证序列信息，即可获得构建成功的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt；
用软件OptimumGeneTM分析编码GFAP蛋白的基因序列SEQ ID NO.1，找出其密码子使用偏好以及大肠杆菌使用偏好不同的位点。对于使用偏好不同的密码子位点，用大肠杆菌偏好的密码子替代，设计出密码子优化的GFAP蛋白基因序列SEQ ID NO.2上述密码子优化的基因序列所编码的蛋白氨基酸序列与原有的氨基酸序列一致。上述密码子优化的基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，装入载体pGEX-4T-2，构建成重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt。经测序证实合成的序列正确。
为了明确显示进行密码子优化的位点，现将密码子优化后的核酸序列GFAP-opt与密码子优化前的核酸序列GFAP进行对比。比较结果如下(*为终止密码子)
优化前：ATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCGCTGCTCGCCGCTCCTACGTCTCCTCAGGGGAGATGATGGTGGGGGGCCTGGCTCCTGGCCGCCGTCTGGGTCCTGGCACCCGCCTCTCCCTGGCTCGAATGCCCCCTCCACTCCCGACCCGGGTGGATTTCTCCCTGGCTGGGGCACTCAATGCTGGCTTCAAGGAGACCCGGGCCAGTGAGCGGGCAGAGATGATGGAGCTCAATGACCGCTTTGCCAGCTACATCGAGAAGGTTCGCTTCCTGGAACAGCAAAACAAGGCGCTGGCTGCTGAGCTGAACCAGCTGCGGGCCAAGGAGCCCACCAAGCTGGCAGACGTCTACCAGGCTGAGCTGCGAGAGCTGCGGCTGCGGCTCGATCAACTCACCGCCAACAGCGCCCGGCTGGAGGTTGAGAGGGACAATCTGGCACAGGACCTGGCCACTGTGAGGCAGAAGCTCCAGGATGAAACCAACCTGAGGCTGGAAGCCGAGAACAACCTGGCTGCCTATAGACAGGAAGCAGATGAAGCCACCCTGGCCCGTCTGGATCTGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGGAGGAGGAGATCCGGTTCTTGAGGAAGATCCACGAGGAGGAGGTTCGGGAACTCCAGGAGCAGCTGGCCCGACAGCAGGTCCATGTGGAGCTTGACGTGGCCAAGCCAGACCTCACCGCAGCCCTGAAAGAGATCCGCACGCAGTATGAGGCAATGGCGTCCAGCAACATGCATGAAGCCGAAGAGTGGTACCGCTCCAAGTTTGCAGACCTGACAGACGCTGCTGCCCGCAACGCGGAGCTGCTCCGCCAGGCCAAGCACGAAGCCAACGACTACCGGCGCCAGTTGCAGTCCTTGACCTGCGACCTGGAGTCTCTGCGCGGCACGAACGAGTCCCTGGAGAGGCAGATGCGCGAGCAGGAGGAGCGGCACGTGCGGGAGGCGGCCAGTTATCAGGAGGCGCTGGCGCGGCTGGAGGAAGAGGGGCAGAGCCTCAAGGACGAGATGGCCCGCCACTTGCAGGAGTACCAGGACCTGCTCAATGTCAAGCTGGCCCTGGACATCGAGATCGCCACCTACAGGAAGCTGCTAGAGGGCGAGGAGAACCGGATCACCATTCCCGTGCAGACCTTCTCCAACCTGCAGATTCGAGAAACCAGCCTGGACACCAAGTCTGTGTCAGAAGGCCACCTCAAGAGGAACATCGTGGTGAAGACCGTGGAGATGCGGGATGGAGAGGTCATTAAGGAGTCCAAGCAGGAGCACAAGGATGTGATGTGA(SEQ ID NO.1)；
优化后：ATGGAACGTCGTCGTATCACCTCCGCTGCGCGTCGTAGCTACGTTTCCAGCGGTGAAATGATGGTTGGTGGCCTGGCGCCGGGTCGTCGTCTGGGTCCGGGCACCCGTCTGAGCCTGGCGCGTATGCCGCCGCCGCTGCCGACCCGCGTTGATTTCTCTCTGGCCGGCGCGCTGAACGCTGGCTTCAAAGAAACCCGTGCTTCTGAACGTGCGGAAATGATGGAACTGAACGATCGTTTCGCAAGCTATATCGAAAAAGTTCGTTTCCTGGAACAGCAGAACAAAGCCCTGGCGGCCGAACTGAACCAGCTGCGTGCAAAAGAACCGACCAAACTGGCAGACGTT
TACCAGGCGGAACTGCGCGAACTGCGTCTGCGTCTGGACCAGCTGACCGCAAACAGTGCGCGCCTGGAAGTTGAACGTGATAACCTGGCGCAAGATCTGGCGACTGTTCGTCAGAAACTGCAGGACGAAACTAACCTGCGTCTGGAAGCGGAAAACAACCTGGCGGCGTACCGCCAGGAAGCTGACGAAGCCACTCTGGCGCGCCTGGATCTGGAACGTAAAATCGAAAGCCTGGAAGAAGAAATCCGTTTCCTGCGTAAAATCCACGAAGAAGAAGTGCGTGAACTGCAGGAACAGCTGGCCCGTCAGCAGGTTCACGTTGAACTGGATGTAGCTAAACCGGATCTGACCGCGGCTCTGAAAGAAATCCGTACCCAGTATGAAGCGATGGCATCCAGCAACATGCACGAAGCGGAAGAATGGTATCGCTCTAAATTCGCGGACCTGACTGATGCGGCTGCGCGTAACGCGGAACTGCTGCGCCAGGCGAAACACGAAGCGAACGATTACCGTCGTCAGCTGCAGTCTCTGACCTGCGATCTGGAATCTCTGCGTGGTACCAACGAATCCCTGGAACGTCAGATGCGTGAACAAGAAGAACGTCACGTTCGTGAAGCAGCGTCCTACCAGGAAGCGCTGGCGCGTCTGGAAGAAGAAGGTCAGAGCCTGAAAGATGAAATGGCGCGTCACCTGCAGGAATACCAGGATCTGCTGAACGTTAAACTGGCGCTGGATATTGAAATCGCGACCTACCGTAAACTGCTGGAAGGTGAAGAAAACCGTATCACCATCCCGGTTCAGACCTTCAGCAACCTGCAGATCCGCGAAACCTCCCTGGATACCAAAAGCGTTTCTGAAGGCCACCTGAAACGTAACATCGTAGTTAAAACCGTTGAAATGCGTGACGGTGAAGTTATCAAAGAATCTAAACAGGAACACAAAGATGTGATGTAA(SEQ ID NO.2)；
氨基酸：MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVSEGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVM*(SEQ IDNO.3)；
本发明在对GFAP的序列优化后，直接由合成优化序列的公司(生工)连接至载体；后续的测序是针对GFAP序列前后200个bp左右的碱基进行测序，是直接测质粒。
注意：优化前及优化后的基因序列中，最后三位为终止密码子，上述密码子优化的GFAP蛋白基因序列与野生型序列比较密码子偏好性发生了改变。与野生型基因序列相比，密码子优化的基因中大肠杆菌偏好的密码子出现频率增加，但是它们所编码的氨基酸序列不变，从而使GFAP蛋白更适于在大肠杆菌中的蛋白表达。
S3、向步骤S2获得的合成的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt上添加ompa信号肽，进一步酶切、测序验证，得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒；
本发明提供的ompa信号肽序列：MKKTAIAIAVALAGFVTVAQA(SEQ DI NO.4)，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCAGGTTTCGTCACCGTCGCTCAGGCT(SEQID NO.5)；
用引物ompa经过退火合成DNA片段，引物中，加下划线的碱基为相应的酶切位点，加粗的碱基为保护的碱基，上游引物为ompa-F，序列信息如SEQ ID NO.6所示，下游引物为ompa-R，具体序列信息如SEQ ID NO.7所示；
GATCCATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCAGGTTTCGTCACCGTCGCTCAGGCTGG(SEQ ID NO.6)；
AATTCCAGCCTGAGCGACGGTGACGAAACCTGCCAGTGCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATG(SEQ ID NO.7)。
酶切过程：将pGEX-4T-2-GFAP-opt用限制性内切酶BamHI和EcoR1进行双酶切，获得线性化的pGEX-4T-2-GFAP-opt线性片段作为***载体。酶切反应体系为：10×酶切Buffer 2μl，pGEX-4T-2-GFAP-opt质粒1μg，EcoRI 1μl，BamHⅠ1μl，补水至20μl，37℃，1h。
酶切产物的纯化：TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，酶切产物进行电泳，120V，1h；称重空1.5mlEp管，紫外灯下切下含目的DNA的凝胶置入Ep管；切碎胶块，分析天平称胶块的质量，按100mg＝100μL进行计算胶块的体积；加入至少1倍等体积的Binding Buffer；把混合物置于60℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；转移700μl冷却的DNA-琼脂糖溶液到一个Spin Columns CB2 DNA柱子，室温下，12,000×g离心1min，弃去液体；将柱子重新套回收集管中，加入600μl漂洗液PW至Spin Columns CB2 DNA柱子中，室温下，12,000×g离心1分钟，弃滤出液；重复洗涤一次，将空柱子重新套回收集管中，12,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体；把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30～50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，12,000×g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，测定DNA浓度并保存于-20℃。
连接反应：用T4 DNA连接酶将ompa DNA片段与pGEX-4T-2-GFAP-opt酶切片段连接，得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组表达质粒。连接反应体系为：10×T4 DNA LigaseBuffer 1μl，线性化的pGEX-4T-2-GFAP-opt 1μl，退火相关目的片段7μl，T4 DNA Ligase 1μl，混匀，4℃放置16h。将连接物转化至DH5α感受态细胞，提取质粒。
酶切验证，用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt质粒，验证用酶切体系为：质粒1μl，BamHI 0.3μl，XhoI 0.3μl，10×H buffer 1μl，加入双蒸水至10μl；进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。酶切验证结果如图2所示，酶切成功的序列由上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果正确，从而得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒。具体连接过程如图1所示。pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt质粒双酶切验证结果如图2所示。
S3、将步骤S2得到的pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒转化至宿主菌BL21感受态细胞中，进行蛋白表达，验证，即可。
S4、将步骤S3得到的pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒转化至宿主菌BL21感受态细胞中，进行蛋白表达，验证，即可。
分别取测序正确的重组质粒转化至宿主菌BL21感受态细胞中转化制备pGEX-4T-2-GFAP、pGEX-4T-2-GFAP-opt、pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt表达菌并保种。
具体步骤如下：1.将1μL溶解的0.2μg/μL的重组质粒加入制备好30μl的BL21细菌感受态细胞中，冰上放置30min；2.将此混合液于42℃水浴中热击45s；3.再放在冰上2min；4.往此混合液中加入700μL不含抗生素的LB培养基；5.将混合液置于37℃、200rpm恒温培养振荡器中培养1h；6.取培养好的混合液200μL涂布于50μg/mL氨苄霉素抗性LB固体平板培养基上，37℃恒温培养箱正置培养30min后，倒置平板培养12-16h。)挑取阳性单克隆菌落，接种于5ml含50mg/L氨苄抗性的试管LB培养基中，37℃培养过夜后将此培养液接种于200mL含有50mg/L氨苄抗性的三角瓶LB培养基中扩培，37℃，200rpm/min培养至菌液OD值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃，120rpm/min继续培养16h，离心收集菌体并进行超声破碎。
图3为GFAP蛋白表达鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳图：图3中，pGEX-4T-2-GFAP为GFAP原始序列；pGEX-4T-2-GFAP-opt为GFAP优化后的序列；pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt在优化了GFAP序列之后加入ompa信号肽。由图3可知，GFAP基因序列经过密码子优化后为GPAP-opt，构建的pGEX-4T-2-GPAP-opt蛋白可以成功被诱导出来，菌体破碎后主要在包涵体中，于是在添加GFAP-opt序列后，加入ompa信号肽构建pGEX-4T-2-ompa-GPAP-opt表达载体，GFAP蛋白成功诱导表达，并且存在菌体破碎后的上清中，有利于后续的纯化。
最后应当说明的是，上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 厦门宝太生物科技有限公司
<120> 一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法
<130> 2021.3.5
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1299
<212> DNA
<213> GFAP优化前序列(GFAP optimized pre-sequence)
<400> 1
atggagagga gacgcatcac ctccgctgct cgccgctcct acgtctcctc aggggagatg 60
atggtggggg gcctggctcc tggccgccgt ctgggtcctg gcacccgcct ctccctggct 120
cgaatgcccc ctccactccc gacccgggtg gatttctccc tggctggggc actcaatgct 180
ggcttcaagg agacccgggc cagtgagcgg gcagagatga tggagctcaa tgaccgcttt 240
gccagctaca tcgagaaggt tcgcttcctg gaacagcaaa acaaggcgct ggctgctgag 300
ctgaaccagc tgcgggccaa ggagcccacc aagctggcag acgtctacca ggctgagctg 360
cgagagctgc ggctgcggct cgatcaactc accgccaaca gcgcccggct ggaggttgag 420
agggacaatc tggcacagga cctggccact gtgaggcaga agctccagga tgaaaccaac 480
ctgaggctgg aagccgagaa caacctggct gcctatagac aggaagcaga tgaagccacc 540
ctggcccgtc tggatctgga gaggaagatt gagtcgctgg aggaggagat ccggttcttg 600
aggaagatcc acgaggagga ggttcgggaa ctccaggagc agctggcccg acagcaggtc 660
catgtggagc ttgacgtggc caagccagac ctcaccgcag ccctgaaaga gatccgcacg 720
cagtatgagg caatggcgtc cagcaacatg catgaagccg aagagtggta ccgctccaag 780
tttgcagacc tgacagacgc tgctgcccgc aacgcggagc tgctccgcca ggccaagcac 840
gaagccaacg actaccggcg ccagttgcag tccttgacct gcgacctgga gtctctgcgc 900
ggcacgaacg agtccctgga gaggcagatg cgcgagcagg aggagcggca cgtgcgggag 960
gcggccagtt atcaggaggc gctggcgcgg ctggaggaag aggggcagag cctcaaggac 1020
gagatggccc gccacttgca ggagtaccag gacctgctca atgtcaagct ggccctggac 1080
atcgagatcg ccacctacag gaagctgcta gagggcgagg agaaccggat caccattccc 1140
gtgcagacct tctccaacct gcagattcga gaaaccagcc tggacaccaa gtctgtgtca 1200
gaaggccacc tcaagaggaa catcgtggtg aagaccgtgg agatgcggga tggagaggtc 1260
attaaggagt ccaagcagga gcacaaggat gtgatgtga 1299
<210> 2
<211> 1299
<212> DNA
<213> GFAP优化后序列(GFAP optimized sequence)
<400> 2
atggaacgtc gtcgtatcac ctccgctgcg cgtcgtagct acgtttccag cggtgaaatg 60
atggttggtg gcctggcgcc gggtcgtcgt ctgggtccgg gcacccgtct gagcctggcg 120
cgtatgccgc cgccgctgcc gacccgcgtt gatttctctc tggccggcgc gctgaacgct 180
ggcttcaaag aaacccgtgc ttctgaacgt gcggaaatga tggaactgaa cgatcgtttc 240
gcaagctata tcgaaaaagt tcgtttcctg gaacagcaga acaaagccct ggcggccgaa 300
ctgaaccagc tgcgtgcaaa agaaccgacc aaactggcag acgtttacca ggcggaactg 360
cgcgaactgc gtctgcgtct ggaccagctg accgcaaaca gtgcgcgcct ggaagttgaa 420
cgtgataacc tggcgcaaga tctggcgact gttcgtcaga aactgcagga cgaaactaac 480
ctgcgtctgg aagcggaaaa caacctggcg gcgtaccgcc aggaagctga cgaagccact 540
ctggcgcgcc tggatctgga acgtaaaatc gaaagcctgg aagaagaaat ccgtttcctg 600
cgtaaaatcc acgaagaaga agtgcgtgaa ctgcaggaac agctggcccg tcagcaggtt 660
cacgttgaac tggatgtagc taaaccggat ctgaccgcgg ctctgaaaga aatccgtacc 720
cagtatgaag cgatggcatc cagcaacatg cacgaagcgg aagaatggta tcgctctaaa 780
ttcgcggacc tgactgatgc ggctgcgcgt aacgcggaac tgctgcgcca ggcgaaacac 840
gaagcgaacg attaccgtcg tcagctgcag tctctgacct gcgatctgga atctctgcgt 900
ggtaccaacg aatccctgga acgtcagatg cgtgaacaag aagaacgtca cgttcgtgaa 960
gcagcgtcct accaggaagc gctggcgcgt ctggaagaag aaggtcagag cctgaaagat 1020
gaaatggcgc gtcacctgca ggaataccag gatctgctga acgttaaact ggcgctggat 1080
attgaaatcg cgacctaccg taaactgctg gaaggtgaag aaaaccgtat caccatcccg 1140
gttcagacct tcagcaacct gcagatccgc gaaacctccc tggataccaa aagcgtttct 1200
gaaggccacc tgaaacgtaa catcgtagtt aaaaccgttg aaatgcgtga cggtgaagtt 1260
atcaaagaat ctaaacagga acacaaagat gtgatgtaa 1299
<210> 3
<211> 432
<212> PRT
<213> GFAP对应的氨基酸序列(Amino acid sequence corresponding to GFAP)
<400> 3
Met Glu Arg Arg Arg Ile Thr Ser Ala Ala Arg Arg Ser Tyr Val Ser
1 5 10 15
Ser Gly Glu Met Met Val Gly Gly Leu Ala Pro Gly Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Thr Arg Leu Ser Leu Ala Arg Met Pro Pro Pro Leu Pro Thr
35 40 45
Arg Val Asp Phe Ser Leu Ala Gly Ala Leu Asn Ala Gly Phe Lys Glu
50 55 60
Thr Arg Ala Ser Glu Arg Ala Glu Met Met Glu Leu Asn Asp Arg Phe
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Ile Glu Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys Ala
85 90 95
Leu Ala Ala Glu Leu Asn Gln Leu Arg Ala Lys Glu Pro Thr Lys Leu
100 105 110
Ala Asp Val Tyr Gln Ala Glu Leu Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu Asp
115 120 125
Gln Leu Thr Ala Asn Ser Ala Arg Leu Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu
130 135 140
Ala Gln Asp Leu Ala Thr Val Arg Gln Lys Leu Gln Asp Glu Thr Asn
145 150 155 160
Leu Arg Leu Glu Ala Glu Asn Asn Leu Ala Ala Tyr Arg Gln Glu Ala
165 170 175
Asp Glu Ala Thr Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Ile Glu Ser
180 185 190
Leu Glu Glu Glu Ile Arg Phe Leu Arg Lys Ile His Glu Glu Glu Val
195 200 205
Arg Glu Leu Gln Glu Gln Leu Ala Arg Gln Gln Val His Val Glu Leu
210 215 220
Asp Val Ala Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Lys Glu Ile Arg Thr
225 230 235 240
Gln Tyr Glu Ala Met Ala Ser Ser Asn Met His Glu Ala Glu Glu Trp
245 250 255
Tyr Arg Ser Lys Phe Ala Asp Leu Thr Asp Ala Ala Ala Arg Asn Ala
260 265 270
Glu Leu Leu Arg Gln Ala Lys His Glu Ala Asn Asp Tyr Arg Arg Gln
275 280 285
Leu Gln Ser Leu Thr Cys Asp Leu Glu Ser Leu Arg Gly Thr Asn Glu
290 295 300
Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Gln Glu Glu Arg His Val Arg Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ser Tyr Gln Glu Ala Leu Ala Arg Leu Glu Glu Glu Gly Gln
325 330 335
Ser Leu Lys Asp Glu Met Ala Arg His Leu Gln Glu Tyr Gln Asp Leu
340 345 350
Leu Asn Val Lys Leu Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys
355 360 365
Leu Leu Glu Gly Glu Glu Asn Arg Ile Thr Ile Pro Val Gln Thr Phe
370 375 380
Ser Asn Leu Gln Ile Arg Glu Thr Ser Leu Asp Thr Lys Ser Val Ser
385 390 395 400
Glu Gly His Leu Lys Arg Asn Ile Val Val Lys Thr Val Glu Met Arg
405 410 415
Asp Gly Glu Val Ile Lys Glu Ser Lys Gln Glu His Lys Asp Val Met
420 425 430
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> ompa信号肽序列(ompa signal peptide sequence)
<400> 4
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Val
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala
20
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> ompa对应的核苷酸序列(Nucleotide sequence corresponding to ompa)
<400> 5
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggcag gtttcgtcac cgtcgctcag 60
gct 63
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> ompa-F
<400> 6
gatccatgaa aaagacagct atcgcgattg cagtggcact ggcaggtttc gtcaccgtcg 60
ctcaggctgg 70
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> ompa-R
<400> 7
aattccagcc tgagcgacgg tgacgaaacc tgccagtgcc actgcaatcg cgatagctgt 60
ctttttcatg 70

Claims (6)

1.一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、用软件OptimumGeneTM分析编码GFAP蛋白的基因序列，进行密码子优化，获得优化后的GFAP基因序列；
S2、将步骤S1所得优化后的GFAP基因序列***pGEX-4T-2质粒中，经测序验证序列信息，即可获得构建成功的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt；
S3、向步骤S2获得的构建成功的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt上添加ompa信号肽，进一步酶切测序验证，得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒；
S4、将步骤S3得到的pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒转化至宿主菌BL21感受态细胞中，进行蛋白表达，验证，即可；步骤S1所述的优化后的GFAP基因序列如SEQ ID NO.2所示；步骤S3所述的ompa信号肽序列信息如SEQ ID NO.4所示，编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，用引物扩增ompa信号肽序列；所述引物的上游引物序列如SEQID NO.6所示，所述引物的下游引物序列如SEQ ID NO .7所示；
步骤S3的具体过程如下：
(1)将pGEX-4T-2-GFAP-opt用限制性内切酶BamHI和EcoR1进行双酶切，获得线性化的pGEX-4T-2-GFAP-opt作为***载体，然后将酶切产物进行纯化，获得纯化的线性化pGEX-4T-2-GFAP-opt载体；
(2)用T4 DNA连接酶将ompa DNA片段与步骤(1)所得纯化的线性化pGEX-4T-2-GFAP-opt载体连接，并进一步酶切测序，即可得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组表达质粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的双酶切过程为，配制20μL的酶切体系：10×酶切Buffer 2μl，pGEX-4T-2-GFAP-opt质粒1μg，EcoRI1μL，BamHⅠ1μl，补水至20μl；将上述酶切体系置于37℃下酶切1h即可。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的酶切产物纯化过程为：用TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，将酶切产物进行电泳，120V，1h；称重空1.5mL Ep管，于紫外灯下切下含目的DNA酶切片段的凝胶置入Ep管中；切碎胶块，分析天平称胶块的质量，按100mg＝100μL进行计算胶块的体积；加入至少1倍等体积的Binding Buffer；把混合物置于60℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；转移700μL冷却的DNA-琼脂糖溶液到一个Spin Columns CB2 DNA柱子，室温下，12 ,000×g离心1min，弃去液体；将柱子重新套回收集管中，加入600μL漂洗液PW至Spin Columns CB2 DNA柱子中，室温下，12 ,000×g离心1分钟，弃去滤出液；重复洗涤一次，将空柱子重新套回收集管中，12 ,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体；把柱子装在一个干净的1 .5mL离心管上，加入30～50μL洗脱液或灭菌水上柱子膜上，12 ,000×g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，测定DNA浓度并保存于-20℃备用，即可。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的连接具体过程如下：按下述配方配制连接体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，线性化的pGEX-4T-2-GFAP-opt 1μL，ompa DNA片段7μL，T4 DNA Ligase 1μL，混匀，4℃放置16h，然后将连接物转化至DH5α感受态细胞，提取质粒。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的酶切测序验证过程为：用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt质粒，验证用酶切体系为：质粒1μL，BamHI 0.3μL，XhoI 0.3μL，10×H buffer 1μL，加入双蒸水至10μl；回收用酶切体系为：质粒DNA 16μL，BamHI 1μL，XhoI 1μL，10×Hbuffer 2μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，进一步测序即可。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4所述的蛋白表达过程具体包括如下步骤：
(1)取1μL溶解的质量浓度为0.2μg/μL的重组质粒加入到制备好的30μL的BL21细菌感受态细胞中，冰上放置30min，获得混合液I；
(2)将步骤(1)所得混合液I置于42℃下水浴中热击45s，再放在冰上2min，得混合液II；
(3)向步骤 (2)所得混合液II中加入700μl不含抗生素的LB液体培养基，置于37℃、
200rpm恒温培养振荡器中培养1h，得培养好的混合液；
(4)取步骤(3)所得培养好的混合液200μl涂布于含50μg/ml氨苄霉素抗性LB固体平板培养基上，于37℃恒温培养箱内正置培养30min后，倒置平板培养12-16h；
(5)挑取阳性单克隆菌落，接种于5ml含50mg/L氨苄抗性的试管LB液体培养基中，37℃培养过夜后将此培养液接种于200mL含有50mg/L氨苄抗性的三角瓶LB液体培养基中扩培，37℃，200rpm/min培养至菌液OD值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃，120rpm下继续培养16h，离心收集菌体并进行超声破碎，对破碎后的菌体成分分析即可。
CN202110266990.3A 2021-03-12 2021-03-12 一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法 Active CN113005134B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110266990.3A CN113005134B (zh) 2021-03-12 2021-03-12 一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110266990.3A CN113005134B (zh) 2021-03-12 2021-03-12 一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113005134A CN113005134A (zh) 2021-06-22
CN113005134B true CN113005134B (zh) 2022-06-03

Family

ID=76405509

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110266990.3A Active CN113005134B (zh) 2021-03-12 2021-03-12 一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113005134B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113416734A (zh) * 2021-06-01 2021-09-21 苏州顺友芯智能科技有限公司 一种提高gfap蛋白表达量的基因及其可溶性表达方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101228271A (zh) * 2005-07-22 2008-07-23 上海高科联合生物技术研发有限公司 一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法
CN110257375A (zh) * 2019-06-25 2019-09-20 南宁新科健生物技术有限公司 一种表达***及其制备方法和应用
CN110592121A (zh) * 2019-10-22 2019-12-20 怀化学院 一种高表达的纤维素内切酶基因及其重组载体和蛋白
CN110770340A (zh) * 2017-05-31 2020-02-07 B.R.A.I.N.生物技术研究和信息网络公司 在宿主细胞中丝氨酸蛋白酶的表达的优化
CN111569056A (zh) * 2020-05-26 2020-08-25 山东信得科技股份有限公司 一种猪轮状病毒疫苗、制备该疫苗的抗原及其编码序列
CN112239760A (zh) * 2020-09-18 2021-01-19 深圳科兴药业有限公司 高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110713545B (zh) * 2019-09-11 2021-10-22 潍坊医学院 一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1及其生产方法和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101228271A (zh) * 2005-07-22 2008-07-23 上海高科联合生物技术研发有限公司 一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法
CN110770340A (zh) * 2017-05-31 2020-02-07 B.R.A.I.N.生物技术研究和信息网络公司 在宿主细胞中丝氨酸蛋白酶的表达的优化
CN110257375A (zh) * 2019-06-25 2019-09-20 南宁新科健生物技术有限公司 一种表达***及其制备方法和应用
CN110592121A (zh) * 2019-10-22 2019-12-20 怀化学院 一种高表达的纤维素内切酶基因及其重组载体和蛋白
CN111569056A (zh) * 2020-05-26 2020-08-25 山东信得科技股份有限公司 一种猪轮状病毒疫苗、制备该疫苗的抗原及其编码序列
CN112239760A (zh) * 2020-09-18 2021-01-19 深圳科兴药业有限公司 高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cloning and expression of rat GFAP cDNA in Escherichia coli;Chekhonin, VP等;《BULLETIN OF EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE》;20070131;第143卷(第1期);第68-71页 *
构建胶质原纤维酸性蛋白原核表达载体及蛋白表达鉴定;曹鹏等;《中国组织工程研究与临床康复》;20090409;第13卷(第15期);第2923-2926页 *
胶质纤维酸性蛋白的原核表达、纯化及鉴定;吕立权等;《中国临床神经外科杂志》;20091025;第14卷(第10期);第606-609页，参见第606页摘要部分、第607页第1栏倒数第2-3段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113005134A (zh) 2021-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0020147B1 (en) A dna transfer vector for human pre-growth hormone, a microorganism transformed thereby, and a method of cloning therefor
CN110128521A (zh) 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法
US9914758B2 (en) Methods and compositions comprising human recombinant growth and differentiation factor-5 (rhGDF-5)
CN116813749B (zh) 一种重组人源化iii型胶原蛋白及其制备方法和应用
JP6915908B2 (ja) Ｂｉｐ断片を含む組換えベクターおよび前記ベクターを利用した組換えタンパク質の製造方法
CN113248574B (zh) 一种表达a型塞内卡病毒结构蛋白的方法
CN113005134B (zh) 一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法
KR870000501B1 (ko) 사람의 프로인슐린의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법
CN114262697B (zh) 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌
RU2354702C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHINS11, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК-ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHINS11, ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHINS11 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
US9631003B2 (en) Host cell lines expressing human recombinant growth and differentiation factor-5 (rhGDF-5)
CN116716329A (zh) 一种无标签野生型bkv vp1蛋白质的制备方法
CN107746432B (zh) 一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法
CN113528415B (zh) 一种nampt酶生产菌及其应用
CN108300725B (zh) 可溶性单链抗体超抗原融合基因及蛋白和其制备与应用
JP2021531784A (ja) 新規細菌ｌｐｐ突然変異体及び組換えタンパク質の分泌産生のためのその使用
CN108840945A (zh) 猪白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种猪长效干扰素
CN114107176A (zh) 一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用
CN113416734A (zh) 一种提高gfap蛋白表达量的基因及其可溶性表达方法
CN106749605B (zh) 一种人神经生长因子类似物及其制备方法
WO2008138229A1 (fr) Système d&#39;expression de protéine recombinante à rendement et immunogénicité améliorés
CN115232804B (zh) 一种重组羧肽酶g2突变体及其基因、制备方法和应用
CN114933642B (zh) Art v 1重组蛋白及其应用
AU768595B2 (en) Novel constructs for controlled expression of recombinant proteins in prokaryotic cells
CN1920015B (zh) 在毕赤酵母细胞器中表达的重组酪氨酸激酶及其基因、衍生融合蛋白和制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 361026 3rd floor, 188 Pingcheng South Road, Haicang street, Haicang District, Xiamen City, Fujian Province

Applicant after: Xiamen Baotai Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: No. 188, Pingcheng South Road, Haicang street, Haicang District, Xiamen City, Fujian Province 361026

Applicant before: XIAMEN BIOTIME BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210928

Address after: 361026 3rd floor, 188 Pingcheng South Road, Haicang street, Haicang District, Xiamen City, Fujian Province

Applicant after: Xiamen Baotai Biotechnology Co.,Ltd.

Applicant after: Shenzhen wangrui Investment Co.,Ltd.

Address before: 361026 3rd floor, 188 Pingcheng South Road, Haicang street, Haicang District, Xiamen City, Fujian Province

Applicant before: Xiamen Baotai Biotechnology Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220418

Address after: 361026 No. 188, Pingcheng South Road, Haicang street, Haicang District, Xiamen City, Fujian Province (third floor)

Applicant after: Xiamen Baotai Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 361026 3rd floor, 188 Pingcheng South Road, Haicang street, Haicang District, Xiamen City, Fujian Province

Applicant before: Xiamen Baotai Biotechnology Co.,Ltd.

Applicant before: Shenzhen wangrui Investment Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant