CN113004383B - 玉米基因ZmEREB102在提高玉米产量中的应用 - Google Patents

玉米基因ZmEREB102在提高玉米产量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域,具体涉及玉米基因ZmEREB102在提高玉米产量中的应用,所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。该基因位于玉米第7染色体,控制玉米穗长、每行籽粒数和每穗籽粒数。在近等基因系之间和自然群体中该基因的表达水平与穗长和每行籽粒数负相关。利用CRISPR/Cas9技术敲除该基因、抑制基因表达,能增加干旱胁迫和正常环境下玉米自交系的穗长和每行籽粒数。

Description

玉米基因ZmEREB102在提高玉米产量中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及玉米基因ZmEREB102在干旱胁迫和正常环境下提高玉米产量中的应用,本发明的基因位于玉米第7染色体上,控制玉米雌穗穗长和/或行粒数重要产量性状。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是当今世界重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物,在保障世界粮食安全、经济发展及缓解能源危机等方面发挥着巨大作用。面对一方面土地供给的刚性制约无法柔性协调,另一方面农业供给侧结构性改革面临着巨大的挑战,为满足我国经济持续发展对玉米的需求,进一步提高我国玉米单位面积产量是遗传育种学科的重大课题。
玉米产量是一个复杂的数量性状,由多基因控制。穗长、行粒数、穗行数、穗重和穗轴重是重要的玉米产量组成部分。将玉米的产量性状剖分为不同的产量因子来研究,有利于解析产量性状形成的遗传学基础,有助于育种家更有效的利用基因资源设计育种策略,达到高效育种的目的。在特定种植密度下,玉米单位面积产量由单穗籽粒产量与穗数决定;而单穗籽粒产量又由每穗粒数和百粒重决定,每穗粒数由穗行数和行粒数决定;玉米穗长和穗粗分别与行粒数和穗行数显著相关。参照阿根廷公布的1965-2016年间32种不同玉米品种的产量及相关性状数据,在实验设计时保持了一致的最大可能的种植密度且随机区组三个重复种植。结果显示,在过去50年的育种进程中,玉米产量平均以113kg/ha/year的速度递增,而产量的增加和每穗籽粒数目的增加正相关和单个籽粒重量的改变无关,单穗生物量积累逐年增加而抽雄吐丝间隔期缩短,花期趋于协调一致;但籽粒形成的效率保持不变,所有的性状的渐变趋势均符合预期,表明了每穗籽粒数目增加是导致产量逐年增加的重要原因。解析穗长和行粒数的遗传学基础对于认知玉米产量形成的机理具有重要的意义,也为育种实践提供理论依据。
鉴于此,本研究利用遗传学的方法,分离了一个位于玉米第7染色体上,可控制玉米穗长和行粒数的基因ZmEREB102,该基因编码一个APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR(AP2/ERF)转录因子,参与乙烯信号途径中的信号传导。基于转基因材料的遗传表型和相关分子生物学分析,证实了该基因在控制穗长、行粒数和穗粒数等性状上的生物学功能,ZmEREB102的遗传转化研究可为玉米育种提供基因资源和理论支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供了玉米基因ZmEREB102在提高玉米产量中的应用,所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
为了达到上述目的,本发明采取以下技术措施:
玉米基因ZmEREB102在提高玉米产量中的应用,所述基因编码的氨基酸序列为SEQID NO.2所示;包括利用本领域的常规方式,降低玉米基因ZmEREB102在玉米中的表达量,或是在玉米中不表达从而提高玉米产量。
玉米基因ZmEREB102在增加玉米穗长中的应用,所述基因编码的氨基酸序列为SEQID NO.2所示;包括利用本领域的常规方式,降低玉米基因ZmEREB102在玉米中的表达量,或是在玉米中不表达从而增加玉米穗长,所述的常规方式包括但不限于敲除该基因或是沉默该基因。
玉米基因ZmEREB102在增加玉米行粒数中的应用,所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示;包括利用本领域的常规方式,降低玉米基因ZmEREB102在玉米中的表达量,或是在玉米中不表达从而增加玉米行粒数,所述的常规方式包括但不限于敲除该基因或是沉默该基因。
玉米基因ZmEREB102在增加玉米每穗粒数中的应用,所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示;包括利用本领域的常规方式,降低玉米基因ZmEREB102在玉米中的表达量,或是在玉米中不表达从而增加玉米行粒数,所述的常规方式包括但不限于敲除该基因或是沉默该基因。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明在玉米中克隆并证实了一个控制穗长和行粒数的基因ZmEREB102,证实了穗长和行粒数与ZmEREB102的表达水平的关系,通过降低其表达水平可增加玉米穗长和行粒数。转基因材料和野生型材料之间的穗粒数的差异,是由于该基因编码区发生编辑而引起基因所编码的蛋白水平下降所致。在作用机理上,认为该基因参与植物体内乙烯的信号响应,增加乙烯的响应,进而调节下游基因的表达,最终调控玉米花序分生组织的分化活性,影响玉米的穗长和行粒数等产量性状。因此本发明为玉米产量改良提供了新的基因资源。
附图说明
图1为玉米ZmEREB102基因敲除材料的示意图;
其中:A为玉米ZmEREB102基因敲除材料的表型示意图,从左至右分别为:转基因杂合植株分离得到的野生型家系(control)、两个ZmEREB102基因编辑家系ereb102-cr1和ereb102-cr2;
B为玉米ZmEREB102基因敲除材料的穗长示意图,柱状图从左至右分别为野生型家系(control)、两个ZmEREB102基因编辑家系ereb102-cr1和ereb102-cr2;
C为玉米ZmEREB102基因敲除材料的行粒数示意图,柱状图从左至右分别为野生型家系(control)、两个ZmEREB102基因编辑家系ereb102-cr1和ereb102-cr2。
图2为玉米ZmEREB102基因在B73不同组织中的表达差异示意图;
其中:A:ZmEREB102在~2mm的幼穗中高表达;B:原位杂交结果显示ZmEREB102在2mm幼穗的IM(inflorescencemeristem)和SPM(spikelet pair meristem)中特异性表达。
图3为CPB-ZmUbi-hspCas9载体示意图。
图4为玉米ZmEREB102基因敲除材料与3个自交系杂交F1的示意图;
其中,A为6个杂交F1组合成熟果穗照片,B-E为3个自交系分别与control和ereb102-cr1杂交F1代中穗长、行粒数、穗重和单穗粒重的表型比较分析。
具体实施方式
以下实施实例进一步定义本发明,根据以下的描述和实例,本领域技术人员可以确定本发明的基本特征,并且在不偏离本发明精神和范围的情况下,可以对本发明做出适当的完善和修改,以使其适用各种用途和条件。本发明所述技术方案,如未特别说明,均为本领域的常规方案;所述试剂或材料,如未特别说明,均来源于商业渠道,或已公开的材料。
实施例1:
ZmEREB102克隆
提取自交系KN5585(Liu,et al.High-throughput CRISPR/Cas9 mutagenesisstreamlin es trait gene identification in maize.The Plant Cell,2020,32:1397–1413)植株叶片总DNA,根据玉米B73(国家农作物种质中心)基因组参考序列设计引物595-F和595-R,在KN5585材料中对ZmEREB102基因PCR扩增并重测序,获得了ZmEREB102基因完整的核苷酸序列(SEQ ID NO.1),该基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
植株叶片总DNA的提取采用CTAB法,PCR扩增程序为:94℃预变性5min,然后以94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸60s,进行34个循环,最后72℃延伸5min。
PCR扩增体系为:
Figure BDA0003017343820000031
Figure BDA0003017343820000041
表1.本发明使用的引物及其序列
Figure BDA0003017343820000051
实施例2:ZmEREB102在玉米中的遗传转化
ZmEREB102基因敲除的遗传转化是利用转基因受体材料KN5585中ZmEREB102作为应用基因,序列为SEQ ID NO.1所示。利用CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/ crispr/)进行基因靶标设计,最终得到两个Guide RNA(Target1:GCAACCGCGAAGATCTTGCGTGG;Target2:GCAAACCTCGTCGGCTCCGGCGG)。利用基因合成的方式分别合成ZmU6-Target1-SgRNA和ZmU6-Target2-SgRNA片段(ZmU6序列为SEQ ID NO.3所示,SgRNA序列为SEQ ID NO.4所示),并将其分别构建到pEASY-T1商业化载体上。分别利用两对引物pU6F1和gRR0,pU6F2和gRR1(引物序列见表1,引物ID2)将两个片段通过PCR方式扩增,用HindIII单酶切将CPB-ZmUbi-hspCas9载体线性化,电泳切胶回收并检测,通过同源重组的方法将两个Guide RNA连接到目标载体CPB-ZmUbi-hspCas9(载体示意图见图3)。最后用CRISPR载体检测引物(引物序列见表1,引物ID为3)对所得的克隆进行测序,确定目标片段连接到载体上。将正确克隆的质粒通过农杆菌介导转化到玉米自交系KN5585(遗传转化由中国种子集团有限公司生命科学技术中心完成)。由此获得了2个以KN5585为背景的玉米转化事件(图1中A),ereb102-cr1和ereb102-cr2,其中control为转基因杂合植株分离得到的野生型姊妹系。在2020年甘肃考察了玉米穗长和行粒数的表型值,结果显示:ereb102-cr1和ereb102-cr2两个转化事件中,相对于control,ZmEREB102基因功能缺失后,玉米的穗长分别增加了14.6%和14.0%(图1中B),行粒数分别增加10.3%和15.3%(图1中C);基于以上结果证明,降低ZmEREB102基因的表达,减少幼穗中乙烯信号的响应,能提高了玉米的穗长和行粒数。
实施例3:ZmEREB102的表达分析
提取B73苗期的根、茎、叶、2mm和2-3cm幼穗等不同组织,用TRIZOL试剂提取总RNA,反转录合成cDNA。以cDNA为模板,使用基因特异性引物对(表1,引物ID为4)进行定量PCR分析。ZmEREB102基因在苗期的根部表达量最高,同时也高表达于2mm的幼穗,而在2-3cm幼穗中ZmEREB102基因的表达量显著下调(图2中A);同时我们利用RNA in situ hybridization验证了ZmEREB102在2mm幼穗中特异的表达模式(图2中B,引物序列见表1,引物ID为5);推测该基因主要在玉米幼穗的前期高表达,进而影响玉米的穗长和行粒数等性状。
实施例4:ZmEREB102在提高玉米产量中的效应分析
利用ZmEREB102的敲除材料ereb102-cr1及其对应的姊妹系control分别与自交系B73、Chang7-2(昌7-2)和HSZ(黄早四)杂交,组配F1杂交组合(图4中A)。在2020年湖北襄阳考察了玉米穗长、行粒数、穗重和单穗籽粒重的表型数据,结果显示:相比于“inbred line×control”的F1杂交组合,“inbred line×ereb102-cr1”的F1杂交组合穗长增加3.5-7.2%(图4中B),行粒数增加4.0-7.1%(图4中C),穗重增加5.5-15.5%(图4中D),每穗粒重增加8.2-10.9%(图4中E)。基于以上结果证明,降低ZmEREB102基因的表达,能有效提高玉米杂交种的穗长、行粒数、穗重和每穗粒数,从而应用于玉米的遗传改良。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 玉米基因ZmEREB102在提高玉米产量中的应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcccaagtcc cacccccact ccctcgctca ccagaggaac tagcggccag gcaaagccga 60
gccgcaaccg cgaagatctt gcgtggcctc cttttcccag ctcgtcactg tgccgctcgt 120
gtccttcact cccggtccgc ccaaccaata atccatcgat ccatccacca ccaccacccc 180
gctgcggcga tgtgcggcgg cgccatcctc tcgggtttca tcccgccgtc cggggtggcg 240
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<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Cys Gly Gly Ala Ile Leu Ser Gly Phe Ile Pro Pro Ser Gly Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys Gln Gln Gln Arg Cys
20 25 30
Arg Val Thr Ala Asp Leu Leu Trp Pro Gly Pro Gly Ser Lys Gly Ala
35 40 45
Pro Gln Asp Lys Glu Glu Asp Phe Glu Ala Asp Phe Arg Glu Phe Glu
50 55 60
Arg Gly Leu Gly Glu Asp Asp Val Asp Ser Ala Gly Glu Gly Gly Asp
65 70 75 80
Pro Glu Val Gln Glu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Thr Arg Phe Ala Phe
85 90 95
Ala Thr Ala Ala Lys Ala Ala Val Asp Gly Val Met Thr Thr Thr Pro
100 105 110
Lys Asp Val Gln Gly Asp Arg Ala Val Lys Lys Arg Gly Arg Lys Asn
115 120 125
Gln Tyr Arg Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu
130 135 140
Ile Arg Asp Pro Asn Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Asn
145 150 155 160
Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Glu Ala Arg Lys Ile
165 170 175
Arg Gly Lys Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asp Asp Asp Ala Thr Gly
180 185 190
Thr Arg His Arg Pro Thr Asn Ala Ala Asn Ala Ala Arg Leu Val Ala
195 200 205
Pro Pro Pro Pro Pro Lys Ala Cys Ala Asp Glu Met Phe Asn Asn Leu
210 215 220
Lys Asn Asp Asp Gly Asp Asn Asn Asn Asn Asp Asp Leu Phe Ala Met
225 230 235 240
Phe Ala Phe Gly Asp Asn Lys Lys Lys Val Pro Ala Ala Lys Pro Ala
245 250 255
Ala Asp Glu Val Gly Ser Gly Ser Gly Ser Phe Leu Val Pro Ala Pro
260 265 270
Ala Val Ala Ala Val Pro Gly Asn Lys Arg Arg Ser Ser Ala Thr Asn
275 280 285
Ile Met Leu Ser Val Ser Asp Asp Gln Ser Ser Asn Ser Tyr Gly Ser
290 295 300
Gly Ser Ser Ala Asp Leu Val Gly Ser Trp Ser Trp Asp Asp Asp Asp
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Thr Ser Asp Tyr Thr Ser
325 330 335
Ser Val Leu Ala Pro Ala Ser Tyr Ser Tyr Met Gln Gly Gly Ala Pro
340 345 350
Lys Arg Met Arg Arg Ser Tyr Gly Gly Ala Pro Pro Ser Leu Ala His
355 360 365
Asp Ala Ala Met Pro Gly Phe Gly Leu Asp Lys Val Ser Tyr His Tyr
370 375 380
Gln Pro Leu Pro Leu Pro Pro Tyr Tyr Val Gly Ser Ser Ser Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Asp Ala Ser Val Gly Ser Leu Gly Leu Leu Gln Ala Asp Gly
405 410 415
Ala Pro Gln Asp Gly Ala Ser Ala Gly Asp Ile Trp Ser Leu Asp Glu
420 425 430
Leu Leu Met Leu Ala Ala Ala Gly Ala Tyr
435 440
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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ccaaagaatt tccaggccca gttgtaaaag ctaaaatgct attcgaattt ctactagcag 180
taagtcgtgt ttagaaatta tttttttata tacctttttt ccttctatgt acagtaggac 240
acagtgtcag cgccgcgttg acggagaata tttgcaaaaa agtaaaagag aaagtcatag 300
cggcgtatgt gccaaaaact tcgtcacaga gagggccata agaaacatgg cccacggccc 360
aatacgaagc accgcgacga agcccaaaca gcagtccgta ggtggagcaa agcgctgggt 420
aatacgcaaa cgttttgtcc caccttgact aatcacaaga gtggagcgta ccttataaac 480
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<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcccaagtcc cacccccac 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acagtactag tataagcaca 20
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcactgcac aagctgctgt ttttgttagc cccatcg 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcttttttt aagctgctgt ttttgttagc cccatcg 37
<210> 9
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagccgcaag caccgaattg caaccgcgaa gatcttgcgg ttttagagct agaaatagca 60
agtt 64
<210> 10
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagccgcaag caccgaattg caaacctcgt cggctccggg ttttagagct agaaatagca 60
agtt 64
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctaacaaaa acagcagctt aaaaaaagca ccgac 35
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggccagtgcc aagcttaaaa aaagcaccga ctcg 34
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagctagcgg attgcataca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctacacctcc tcggtcttcg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttgcggttc tcaataagca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtgaatttt cccgatgacg 20
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
taatacgact cactataggg tcaataagca ccagctgctg 40
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcaaccgcga agatcttgcg tgg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcaaacctcg tcggctccgg cgg 23

Claims (2)

1.降低玉米基因ZmEREB102的表达在提高玉米产量中的应用,所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用,所述的提高产量是通过提高玉米穗长、增加玉米行粒数和/或每穗粒数实现的。
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