CN112999332B - 一种酯酶响应纳米药物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米药物领域，涉及一种酯酶响应纳米药物及其制备方法与应用。两亲性分子，其是由多肽分子C端的羧基与药物的羟基形成酯键而制成的。所述多肽分子为环状抗血管生成肽VGB，所述药物为冬凌草甲素ORI。两亲性分子在中性条件下，可在水相溶液中自组装成纳米药物。该纳米药物能够在肿瘤部位经酶特异酶解释放VGB和ORI。本发明提供的纳米药物制备方法简单，自组装过程中不生成共价健，没有逆反应，生物相容性好，毒副作用低，具有酯酶响应性，在制备纳米药物应用于抗肿瘤中具有较高的应用价值和广阔的应用前景。

Description

一种酯酶响应纳米药物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于纳米药物领域，涉及一种酯酶响应纳米药物及其制备方法与应用。

背景技术

分子自组装是制备纳米材料的重要手段之一。分子自组装作为一种新型的“自下向上”策略，是对传统“自上向上”策略的一种补充。一般来说，分子的自组装可以简单地定义为分子自发聚集成有序排列的纳米结构，这些结构通常是由离子键、疏水相互作用、范德华相互作用和氢键等非共价键共同驱动。分子有序排列的过程一旦开始，将自动进行到某个终点，尽管自组装中涉及的非共价相互作用的能量比共价键低得多，但它足以产生高度组织化和稳定的纳米结构。利用自组装技术制备纳米药物具有尺寸可控，分散性好；纯度高，产物较稳定，不易发生团聚现象；操作仪器简单，不产生共价键，没有复杂的化学反应等优势。

在自组装材料中，多肽作为生物材料是最具有吸引力的选择之一，其主要原因是：多肽通常利用传统的固相合成方法合成，制备方法简单，并且允许在合成时对分子水平进行序列特异修饰；通过对多肽自组装构筑单元的设计可以设计出复杂多变、多功能和特定的超分子结构。一类以疏水尾亲水头结构为特征的两亲性分子得到了快速的发展。这类分子以疏水-疏水相互作用力为主要驱动力，在中性条件下，可在水相溶液中进行自组装，形成特定的纳米结构，在抗肿瘤等多个领域具有广泛的应用价值。

恶性肿瘤是一种由多种诱因共同作用引起的，严重威胁人类健康的常见病，占所有疾病死亡率的第二位。其中，食管鳞状细胞癌(ESCC)是一种高度恶性的消化道肿瘤，最新全球癌症统计鳞状细胞癌的发病率为3.2％，死亡率为5.3％。目前，手术治疗仍是临床上首选的治疗方法。但食管鳞状细胞癌预后较差，有复发的风险，其中手术后残留的肿瘤细胞和新生的血管是导致原位复发和远端转移的重要原因之一。残余的肿瘤细胞会分泌大量的促血管新生因子如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β(TGF-β)等，促进局部血管的新生，新生的血管除了提供肿瘤细胞所需的营养物质，还会将循环肿瘤细胞运送到身体的其他部位，只要条件适宜，就会形成新的转移灶，导致远端转移的发生。化疗是临床推荐食管鳞状细胞癌术后复发的治疗策略之一。然而，传统化疗药物靶向性差，毒副作用不容忽视，难以达到满意的治疗效果。

因此，在抑制肿瘤组织局部血管生成的同时，发挥化疗药物的作用有望达到协同增强抑制食管癌术后复发的治疗效果。利用这一策略，设计和开发一种同时具有这两项功能的纳米药物为治疗食管癌术后复发提供一种新思路。

发明内容

本发明提供一种纳米药物，能够在肿瘤部位经酶特异酶解释放，安全高效、适用范围广泛，具有较高医学应用价值。

本发明首先提供一种两亲性分子，是由多肽分子C端的羧基与药物的羟基形成酯键而制成的。

具体地，所述多肽分子为环状抗血管生成肽VGB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具体地，所述药物为冬凌草甲素ORI。

具体地，所述两亲性分子的结构式如下：

本发明还提供上述两亲性分子的制备方法，包括：

1)将环状抗血管生成肽VGB、2,4,6-三氯苯甲酰氯、4-二甲氨基吡啶、三乙胺溶于二甲基甲酰胺中，避光反应，得到均相溶液；

2)将冬凌草甲素ORI溶解于二甲基甲酰胺中，加入所述均相溶液中进行酯化反应；

3)向反应体系中加入过量的***，静置，抽滤，得到黄色粗品；

4)用异丙醇将上述黄色粗品溶解，重结晶，得到两亲性分子(ORI-VGB)。

进一步地，上述两亲性分子的制备方法中，环状抗血管生成肽VGB与冬凌草甲素ORI的摩尔比为1:1-1:4，例如1:1、1:2、1:3、1:4。实验表明，在该比例范围内可使环状抗血管生成肽VGB连接更多的冬凌草甲素ORI。

上述两亲性分子的制备方法中，4-二甲氨基吡啶、三乙胺的主要作用是作为催化剂，起到催化的目的。

具体地，环状抗血管生成肽VGB、2,4,6-三氯苯甲酰氯、4-二甲氨基吡啶、三乙胺的摩尔比为1:1:4:4-1:4:4:4，可选为1:2:4:4。

具体地，1)中所述避光反应的时间一般为20-60分钟，优选为30分钟。

具体地，2)所述中酯化反应的时间为12-17小时，优选15小时。可采用TLC跟踪监测，反应结束。

具体地，3)中所述***的用量优选为2)所得反应体系体积的2-4倍，优选3倍

具体地，3)中所述静置时间优选30分钟。

本发明还提供一种纳米药物，是由上述两亲性分子自组装而成，形成功能化纳米药物。具体地，在中性条件下，上述两亲性分子主要通过疏水-疏水相互作用力，自组装形成纳米药物。

本发明还提供上述纳米药物的制备方法，是采用反溶剂沉淀法制备的。具体包括：将上述两亲性分子(ORI-VGB)溶于二甲基亚砜中，然后在超声条件下将所得溶液分散于水相中，静置，得到粒径均一的纳米药物。

具体地，上述纳米药物可表示为：ORI-VGB-NPs。

具体地，所述超声的功率为100-200W。

具体地，所述水相为去离子水或磷酸盐缓冲液PBS

具体地，将溶有上述两亲性分子(ORI-VGB)的二甲基亚砜溶液加入水相中后，继续超声30-60分钟。通常可在室温下静置1-2小时。

具体地，所制备的纳米药物粒径在50-80nm之间。

上述两亲性分子(ORI-VGB)在水相中自组装形成纳米药物，这种自组装过程中不生成共价健，没有逆反应。

具体地，所述纳米药物中环状抗血管生成肽VGB与冬凌草甲素ORI的摩尔比为1:2。

具体地，所述纳米药物中环状抗血管生成肽VGB与冬凌草甲素ORI不需要连接臂偶联，而是直接通过环状抗血管生成肽VGB的羧基与冬凌草甲素ORI的羟基通过酯健偶联形成两亲性分子。

具体地，所述纳米药物中含有环状抗血管生成肽VGB，冬凌草甲素ORI。所述纳米药物中还含有酯键。所述酯键能够在酯酶的作用下断裂，并迅速释放冬凌草甲素ORI和环状抗血管生成肽VGB发挥杀伤肿瘤细胞和抗血管生成的作用，用于增强抗肿瘤疗效。

本发明提供的纳米药物，制备过程简单。自组装过程中不生成共价健，没有逆反应，且不需要高分子材料作为载体。本发明中纳米药物是由在酯酶高表达的环境刺激下具有发生酶解能力的两亲性分子自组装而成。本发明所述纳米药物可为治疗食管癌术后复发提供新策略。

本发明还提供上述纳米药物制备抗肿瘤药物上的应用；可选地，所述药物用于真核生物。

本发明还提供上述纳米药物在真核生物中，杀伤肿瘤细胞的同时还具有抗局部血管新生抑制肿瘤术后复发的潜能。

具体地，所述真核生物为哺乳动物。

具体地，所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞包括乳腺癌细胞、肝癌细胞、黑色素癌细胞、食管癌细胞等。

具体地，所述肿瘤包括乳腺癌、肝癌、食管癌等。

与现有技术相比，本发明提供的纳米药物的显著优点在于：

1)制备的纳米药物具有肿瘤部位特异性响应，在酯酶作用下，化疗药与多肽之间的酯键被切断而释放出游离药物，进而发挥其细胞毒性作用，有效提高抗肿瘤药物的生物利用度，是一种生物安全、理想的纳米药物；

2)本发明所制备的纳米药物，可明显抑制血管生成和提高冬凌草甲素药物的体内抗肿瘤疗效，具有良好的临床应用价值；

3)本发明提供的制备方法简单，自组装过程中不生成共价健，没有逆反应，生物相容性好，毒副作用低，具有酯酶响应性，在制备抗肿瘤纳米药物中具有广阔的应用前景和较高的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例制备的ORI-VGB两亲性分子的质谱图。

图2为本发明实施例制备的纳米药物ORI-VGB-NPs的透射电镜图

图3为本发明实施例制备的纳米药物ORI-VGB-NPs的粒径分布图。

图4为本发明实施例制备的纳米药物ORI-VGB-NPs酯酶处理1小时后纳米药物的透射电镜图。

图5为本发明实施例制备的纳米药物ORI-VGB-NPs经酯酶处理后纳米药物的粒径分布和电位图。

图6为不同制剂处理下肿瘤细胞的细胞存活率结果图。

图7表示本发明实施例制备的纳米药物ORI-VGB-NPs体外抗杀伤肿瘤细胞的作用机制。

图8表示不同制剂处理对血管内皮细胞成小管行为的影响。

图9表示各治疗组小鼠在治疗周期内的肿瘤生长曲线。

图10表示治疗周期结束后各组的肿瘤形态图片。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明进行的具体限制。

本发明提供了一种抑制血管新生的环状多肽VGB(从氨基末端开始的序列为：Cys-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Cys-Asn-Asp-Glu)作为亲水性抗血管治疗多肽。本肽段可市购获得，或者可采用本领域公知的Fmoc固相合成法制备得到。

本发明实施例提供一种环状多肽VGB具体的制备方法，本领域技术人员可以理解，该方法并不用于限定本发明，如下制备方法中涉及到的原料可市购获得，例如购自吉尔生化上海有限公司、西格玛奥德里奇公司。

利用二氯三苯甲基氯树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)、和Fmoc保护的L-氨基酸(Fmoc-Cys-OH,Fmoc-Ile(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Pro-OH，Fmoc-His-OH，Fmoc-Gln(tBu)-OH，Fmoc-Gly(tBu)-OH，Fmoc-Gln(tBu)-OH,Fmoc-His-OH,Fmoc-Ile(Boc)-OH,Fmoc-Cys-OH,Fmoc-Asn-OH，Fmoc-Asp-OH,Fmoc-Glu(tBu)-OH.购自吉尔生化(上海)有限公司)为原料，在各种耦合、裂解试剂存在的条件下，通过固相合成法在树脂上制备多聚氨基酸的聚合物。再经过简单的裂解反应，将多肽从树脂上分离下来，经后续的沉淀、洗涤、干燥处理后制得纯白色多肽粉末。具体的实验过程如下：首先，取1.01克二氯三苯甲基氯树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)至多肽合成装置(购自西格玛奥德里奇公司)，加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺(购自西格玛奥德里奇公司)浸泡树脂半小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂N,N-二甲基甲酰胺。称取0.2克Fmoc-Gly-OH用5毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入2毫升催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温下让Fmoc-Gly-OH与树脂相互作用约1.5小时，使其充分固定在树脂上。用N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，加入甲醇搅拌30分钟，封闭树脂上未反应的活性位点，并再次用N,N-二甲基甲酰胺溶胀树脂。然后用体积比为1:4的哌啶(购自西格玛奥德里奇公司):N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)进行保护基的脱除，反应3次，前两次各持续3分钟，第三次持续20分钟。之后再用5mL的N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤树脂5次，每次持续1分钟，直到N,N-二甲基甲酰胺洗液的pH显中性。称取0.92克Fmoc-Ile(tBu)-OH，0.72克2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(购自吉尔生化(上海)有限公司)，0.27克1-羟基苯并***(购自吉尔生化(上海)有限公司)，用10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到多肽合成装置中，再加入2毫升催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温下让Fmoc-Gly(tBu)-OH与树脂相互作用约2小时，使其充分连接到上一个氨基酸上，N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，取少许树脂加入10％茚三酮的无水甲醇(购自国药集团化学试剂北京有限公司)中加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂颜色无明显变化，则说明第二个氨基酸已完全同上一个氨基酸偶联，若树脂变蓝甚至发黑，则说明第二个氨基酸没有与前一个氨基酸完全反应，需重复连接。重复以上步骤分别缩合(Fmoc-Cys-OH,Fmoc-Ile(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Pro-OH，Fmoc-His-OH，Fmoc-Gln(tBu)-OH，Fmoc-Gly(tBu)-OH，Fmoc-Gln(tBu)-OH,Fmoc-His-OH,Fmoc-Ile(Boc)-OH,Fmoc-Cys-OH,Fmoc-Asn-OH，Fmoc-Asp-OH,Fmoc-Glu(tBu)-OH)。用体积比为1:4的哌啶:N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)进行保护基的脱除之后，加入0.21g无水乙酸(购自国药集团化学试剂北京有限公司)/4mL吡啶(购自西格玛奥德里奇公司)的混合液，反应两次、每次2小时。做完茚三酮测试，确保无水乙酸已经完全封闭了多肽的N末端，再用5mL的二氯甲烷重复洗涤树脂5次，每次持续1分钟。最后，将多肽从树脂上裂解下来，具体过程如下：首先配制裂解液：9.5mL三氟乙酸(购自西格玛奥德里奇公司)+0.85mL1,2-乙二硫醇(购自西格玛奥德里奇公司)+0.5mL茴香硫醚(购自西格玛奥德里奇公司)+0.5mL去离子水。将树脂放入上述混合液中进行裂解反应3小时，之后过滤掉树脂，在收集到的液体中加入***(购自国药集团化学试剂北京有限公司)，立即出现白色沉淀。然后，离心分离上述悬浊液，转速为5000rpm、离心时间5分钟，除去上清液，进行冷冻干燥，收集白色多肽粉末，制得多肽分子，命名为VGB多肽。

实施例1

在本实施例中，通过以下方法制备纳米药物：

酯化反应：(1)将VGB多肽(20mg)、2,4,6-三氯苯甲酰氯(60ul)、4-二甲氨基吡啶、三乙胺溶于1ml二甲基甲酰胺中，避光反应30分钟，得到均相溶液；

(2)将冬凌草甲素ORI8.8mg溶解在1ml的二甲基甲酰胺中，加入上述(1)中的均相溶液中，在室温下反应过夜(时间15小时)，TLC跟踪监测，反应结束。

纯化：(1)加入过量的***，静置30分钟，抽滤，得到黄色粗品；

(2)用异丙醇将上述(1)中的黄色固体溶解，重结晶纯化得到ORI-VGB两亲性分子。该ORI-VGB两亲性分子的质谱图如图1所示，可以看出两亲性分子被成功构建。图1横坐标表示相对分子质量，纵坐标表示强度。

将ORI-VGB两亲性分子溶解于10μL的二甲基亚砜中，在100W超声条件下将溶有两亲性分子的二甲基亚砜溶液缓慢分散于1mL去离子水中，超声30分钟，室温下静置1小时，利用透射电镜(TEM,HT7700)和激光粒度仪(英国Malvern,Zetasizer Nano ZS90)对得到的纳米药物(ORI-VGB-NPs)进行形貌以及粒径表征，结果如图2和图3所示。图2为该纳米药物体系的透射电镜图；从图2中可以看出，制备得到的纳米药物呈球形，颗粒大小较均一。图3为该纳米药物的粒径分布图，所得纳米药物的粒径分布为50-80nm，平均粒径约为60nm，与电镜图所测得的结果相符合。图3横坐标表示粒径大小，纵坐标数量百分比。

实施例2

本实施例目的在于测定纳米药物在酯酶溶液中的形貌、粒径和电位的变化。

将实施例1中得到的纳米药物溶解在1ml的猪肝酯酶(100U/ml,PBS缓冲液)原液中。在指定的时间间隔内，将20μL的孵育液与180μL的乙腈混合，终止酯酶反应，6000rpm离心5min，最后观察形貌、粒径和电位的变化。结果如图4和图5所示。图4为酯酶处理1小时后纳米药物的透射电镜图；从图4中可以看出，经酯酶处理后纳米药物无明显的纳米球形结构；图5为粒径电位分布图，经酯酶处理后纳米药物的粒径分布迅速从60.1nm变化到8.0nm，zeta电位迅速从-26.8mV变化到1.0mV。图5横坐标表示时间(分钟)，左纵坐标表示粒径，右纵坐标表示电位。以上结果表明，纳米药物可以在缓冲液中被脂酶特异性切割，释放出小分子药物和多肽，进而发挥各自的作用

实施例3

本实施例目的在于验证对实施例1制备的纳米药物体外抗肿瘤作用。

以VGB多肽打乱顺序的无功能VGC多肽(CHDQIHNKEQCPGI)为对照肽，同时参照实施例1方法将ORI与VGC多肽连接作为对照样品(简记为ORI-VGC-NPs)。其中，VGC多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其制备方法参见上文VGB的制备。

首先将肿瘤细胞EC109以每孔6×10³的密度接种到96孔板中，并让其附着过夜。然后用连续稀释的实验样品处理细胞24小时。使用CCK-8试剂盒评估细胞活力，结果如图6所示。VGB组对肿瘤没有明显的杀伤作用，ORI和ORI-VGC-NPs处理组的IC₅₀分别为67.392uM和16.707μM，而ORI-VGB-NPs I处理组的IC₅₀为6.0μM，具有最大的细胞毒性，这表明我们设计制备的纳米药物具有良好的体外杀伤肿瘤细胞的效果。接下来，进一步通过Western Blot试验验证纳米药物处理后杀伤肿瘤细胞可能的作用机制，通过检测相关凋亡蛋白的表达，结果如图7所示，与对照组相比ORI-VGB-NPs处理后的抑制凋亡蛋白Bcl-2明显下调，Cleaved-caspase-9，Cleaved-PARP蛋白明显上调，这与细胞杀伤实验结果一致，表明纳米药物通过调节这些相关蛋白的表达实现对肿瘤细胞的杀伤。综上，这些试验结果表明，实施例1纳米药物具有良好的体外抗肿瘤作用。

实施例4

本实施例目的在于验证对实施例1制备的纳米药物体外抗血管新生情况。

首先将Matrigel基底膜基质胶(60μL/孔；BD Bioscience，美国)涂在96孔培养板中，然后在37℃下聚合30min。将人脐静脉内皮细胞接种于Matrigel表面，加入实施例1制备的纳米药物孵育5h。采用明场显微镜对小管结构进行成像。结果如图8所示，ORI和ORI-VGC-NPs(制备方法同实施例3)组不能抑制小管的生成，VGB组能够轻微抑制小管的生成，ORI-VGB-NPs组能够明显抑制小管的生成，(小管生成抑制率ORI:2.19％、ORI-VGC-NPs:5.75％、VGB:35.43％、ORI-VGB-NPs:74.73％。)这表明，实施例1制备的纳米药物能够通过抑制血管内皮细胞的成小管行为抑制血管新生。

实施例5

本实施例的目的在于测试实施例1制备的纳米药物对体内食管鳞癌术后复发模型的抑制效果。

首先在BALB/c雌性裸鼠右后肢皮下注射肿瘤细胞EC109，建立食管鳞癌的移植瘤模型。当肿瘤体积达到200mm³时，手术切除肿瘤。随后将小鼠随机分为5组：1)生理盐水组；2)VGB组；3)ORI组；4)ORI-VGC-NPs(制备方法同实施例3)组；5)ORI-VGB-NPs组。这些荷瘤小鼠被静脉注射生理盐水或不同的纳米制剂，每两天一次，总共七次。ORI和VGB的给药剂量分别为5mg kg^-1和10.88mg kg^-1。在整个治疗实验过程中，每隔2天监测一次小鼠的肿瘤体积变化，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm³)＝0.5×宽度²(mm²)×长度(mm)如图9所示，ORI-VGB-NPs组在治疗结束后肿瘤体积为235.91mm³，显著低于其他对照组(如VGB：1024.51mm³、ORI：713.34mm³、ORI-VGC-NPs：403.91mm³)，与其他组相比具有明显的统计学差异。在治疗周期结束后，给予小鼠安乐死处理，解刨小鼠并取出肿瘤拍照，如图10所示，与体外测量结果一致，经ORI-VGB-NPs纳米药物治疗的小鼠肿瘤再生长极小(平均瘤重：0.198g)，VGB组的肿瘤生长迅速(平均瘤重：0.748g)，经游离的ORI治疗的小鼠肿瘤生长抑制不明显(平均瘤重：0.572)。这些说明纳米药物ORI-VGB-NPs能够有效抑制食管鳞癌的术后复发。侧面也反映了注射单独的ORI和VGB，由于ORI，VGB在体内循环时不稳定而造成药物利用率低，本发明的酯酶响应纳米药物很好地克服了此缺陷，具有很好的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 一种酯酶响应纳米药物及其制备方法与应用

<130> KHP201119363.6

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Cys Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Cys Asn Asp Glu

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys His Asp Gln Ile His Asn Lys Glu Gln Cys Pro Gly Ile

1 5 10

Claims (12)

1.一种两亲性分子，其特征在于，所述两亲性分子的结构式如下：

2.权利要求1所述两亲性分子的制备方法，其特征在于，包括：

1)将环状抗血管生成肽VGB、2,4,6-三氯苯甲酰氯、4-二甲氨基吡啶、三乙胺溶于二甲基甲酰胺中，避光反应，得到均相溶液；

2)将冬凌草甲素ORI溶解于二甲基甲酰胺中，加入所述均相溶液中进行酯化反应；

3)向反应体系中加入过量的***，静置，抽滤，得到黄色粗品；

4)用异丙醇将所述黄色粗品溶解，重结晶，得到两亲性分子。

3.根据权利要求2所述两亲性分子的制备方法，其特征在于，环状抗血管生成肽VGB与冬凌草甲素ORI的摩尔比为1:1-1:4。

4.根据权利要求2或3所述两亲性分子的制备方法，其特征在于，

1)中所述避光反应的时间为20-60分钟；和/或，

2)中所述酯化反应的时间为12-17小时；和/或，

3)中所述***的用量为2)所得反应体系体积的2-4倍；和/或，

3)中所述静置的时间为30分钟。

5.根据权利要求2或3所述两亲性分子的制备方法，其特征在于，

1)中所述避光反应的时间为30分钟；和/或，

2)中所述酯化反应的时间为15小时；和/或，

3)中所述***的用量为2)所得反应体系体积的3倍。

6.一种纳米药物，其特征在于，是由权利要求1所述两亲性分子自组装而成。

7.根据权利要求6所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物的粒径为50-80nm。

8.一种纳米药物的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述两亲性分子溶于二甲基甲酰胺中，然后在超声条件下分散于去离子水中，静置，得到粒径均一的纳米药物。

9.权利要求8所述方法制备的纳米药物。

10.根据权利要求9所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物的粒径为50-80nm。

11.权利要求6、7、9、10任一所述纳米药物在制备抗肿瘤药物上的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述药物用于真核生物。

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