CN112998009A - Nk细胞冻存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Nk细胞冻存液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用，所述NK细胞冻存液由0.9％氯化钠注射液、人血白蛋白、甘油、维生素C和海藻糖组成。以上这几种组分的共同作用可以促进NK细胞的增殖，提高NK细胞的活力，大大提高了NK细胞复苏后的活率；该NK细胞冻存液不含二甲基亚砜和除人体以外的动物源成分，具有高复苏率，成分简单，稳定性好等优点。所述NK细胞冻存液用于冻存NK细胞，经过冻存之后，NK细胞的活率不会发生明显变化，且使用所述NK细胞冻存液冻存之后的NK细胞可以经过融化后直接输入人体，方便快捷高效，无安全风险。

Description

NK细胞冻存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞冻存技术领域，特别是涉及一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用。
背景技术
NK细胞(Natural killer cells)是人体防御肿瘤的第一道防线，在固有免疫***具有重要的作用，不需要提前致敏就可以对肿瘤细胞进行直接杀伤。虽然现在NK细胞已经被用于肿瘤免疫的细胞治疗，并在临床***(如白血病，淋巴瘤和黑色素瘤)有很好的效果；但不论对第三方细胞库，还是对配送和应用临床管理来说，NK细胞的长期有效储存始终是一个问题。
低温贮藏技术是通过在超低温(-198℃的液氮中)冷冻保存活细胞，降低细胞的代谢速度，调节和控制细胞生长代谢的各种酶的活性受到抑制，使细胞内在的生化反应十分缓慢，甚至停止生长，从而保持细胞活性延长细胞保存年限。现有的细胞冻存液基本都是由细胞基础培养基(如DMEM，RPMI1640等)、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)制备的。其中二甲基亚砜DMSO(dimethyl sulfoxide)的作用是作为冷冻保护剂来保护细胞在冷冻和复苏的过程中免受损伤。DMSO属于渗透性保护剂，它能快速渗入细胞内，减少细胞暴露在有害环境的时间。但是DMSO在常温下对细胞有毒性作用。即使在复苏的过程中移除了绝大部分，但微量级的剩余也会对人体产生副作用(神经毒性，心血管衰竭，呼吸停止和致命的心率衰竭)。有文献报道，使用DMSO冻存的NK细胞在复苏后，其活性和功能性杀伤活力有所退化。此外，细胞冻存液中一般要使用胎牛血清或小牛血清作为保护剂，保护细胞膜，提高冻存复苏过程的细胞存活率。但是牛血清中可能含有疯牛病病毒，内毒素，外毒素，还有潜在的未知病毒风险。胎牛血清FBS会增加动物病原污染的机率，这都会给细胞以后的使用增加不确定因素。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用，所要解决的技术问题是如何提供一种NK细胞冻存液，能使NK细胞具有较高的细胞存活率，且易配制，成本低。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种NK细胞冻存液，其由0.9％氯化钠注射液、人血白蛋白、甘油、维生素C和海藻糖组成。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的NK细胞冻存液，其中以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：10-50份0.9％氯化钠注射液、40-88份人血白蛋白、1-20份甘油和1-20份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖10-60mg/mL。
优选的，前述的NK细胞冻存液，其中以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：30-50份0.9％氯化钠注射液、40-60份人血白蛋白、1-10份甘油和1-10份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖30-50mg/mL。
优选的，前述的NK细胞冻存液，其中以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：50份0.9％氯化钠注射液、40份人血白蛋白、6份甘油和4份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖50mg/mL。
优选的，前述的NK细胞冻存液，其中以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：40份0.9％氯化钠注射液、50份人血白蛋白、4份甘油和6份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖20mg/mL。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种NK细胞冻存液的制备方法，其包括：
先将海藻糖溶解于0.9％氯化钠注射液中，并在溶解得到的溶液中加入人血白蛋白、甘油和维生素C，搅拌均匀，得到混合液；
将所述混合液进行除菌，得到NK细胞冻存液；
以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：10-50份0.9％氯化钠注射液、40-88份人血白蛋白、1-20份甘油和1-20份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖10-60mg/mL。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的NK细胞冻存液的制备方法，其中所述除菌采用细菌过滤器，所述细菌过滤器的过滤尺寸为0.2-0.5μm。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的前述任一项所述的NK细胞冻存液在冻存NK细胞中的应用。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的应用，其中用所述的NK细胞冻存液冻存NK细胞的方法，包括以下步骤：
在NK细胞中加入0.9％氯化钠注射液，制成细胞悬液；
对所述细胞悬液进行离心，弃上清，加入所述的NK细胞冻存液，调整细胞浓度，使冻存液中NK细胞的浓度为2×107-4×107个细胞/mL，预冷，移入冻存管中；
将所述的冻存管程序降温至-90℃冻存；
冻存结束后，将所述的冻存管转移至液氮中冷冻保存。
优选的，前述的应用，其中在使用时，将所述的冻存管从液氮中取出，于37-40℃的水浴中融化，直接输入人体内。
借由上述技术方案，本发明提出的NK细胞冻存液及其制备方法和应用至少具有下列优点：
1、本发明提出的NK细胞冻存液由0.9％氯化钠注射液、人血白蛋白、甘油、维生素C和海藻糖组成，该NK细胞冻存液不含二甲基亚砜和除人体以外的动物源成分，具有高复苏率，成分简单，稳定性好等优点。
2、本发明提出的NK细胞冻存液通过人血白蛋白、甘油、维生素C和海藻糖这几种组分的共同作用可以促进细胞的增殖，提高细胞的活力，大大提高了细胞复苏后的活率；所述细胞冻存液经过冻存之后，其活率不会发生明显变化。由实施例的实验结果可见，冻存前、冻存1个月复苏和冻存3个月复苏后，总细胞浓度、活细胞浓度、细胞存活率、平均直径、平均圆度和结团率均没有发生显著变化，表明本实施例的NK细胞冻存液能够在冻存过程中有效保护NK细胞。
3、本发明提出的NK细胞冻存液仅含0.9％氯化钠注射液、人血白蛋白、甘油、维生素C和海藻糖，无需购买昂贵的原料，成本经济；同时这些成分都是能够进入人体组织内的成分，且其含量均控制在人体用量安全范围内，因此，使用所述NK细胞冻存液冻存之后的NK细胞可以经过融化后直接输入人体，而无需像现有技术中冻存后的细胞那样需要经过复杂的离心、清洗等处理之后才能输入人体，既能够避免细胞因离心而造成损伤，又成本经济，方便快捷高效，无安全风险。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明的NK细胞表面标志性抗原流式图；
图2为本发明实施例中NK细胞冻存液1号冻存前的NK细胞图；
图3为本发明实施例中NK细胞冻存液1号冻存1个月复苏后的NK细胞图；
图4为本发明实施例中NK细胞冻存液1号冻存3个月复苏后的NK细胞图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的NK细胞冻存液及其制备方法和应用其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
本发明的一个实施例提出的一种NK细胞冻存液，其包括：0.9％氯化钠注射液、人血白蛋白、甘油、维生素C和海藻糖。
所述NK细胞冻存液一般现配现用或者冷藏保存。
本实施例中，人血白蛋白作为非渗透性冷冻保护剂使用，降低溶液中自由水的含量，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤，大大提高细胞存活率；
甘油作为渗透性冷冻保护剂使用，可在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。
维生素C不仅能有效的抑制细胞氧化，保持细胞的活性，对人体无任何伤害。
海藻糖是由两个葡萄糖分子以a,a,1,1-糖苷键构成非还原性糖，自身性质非常稳定，能够在细胞表面形成保护膜，有效地保护蛋白质分子不变形，并维持生命体的生命过程和生物特征。由于NK细胞冻存液的主体包含大量的人血白蛋白，因此仅需以极少量(1％以下)的海藻糖辅助人自体血清就可以极大地提高细胞冻存后的活率，成本更经济。
以上成分是一整体组合，缺少任何一种成分都达不到很好的冻存NK细胞的效果。
本实施例中的成分均选用医用注射级别，成分明确，可直接输入人体，方便快捷，无安全风险，而且冻存复苏后细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效果好。
在一些实施例中，以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：10-50份0.9％氯化钠注射液、40-88份人血白蛋白、1-20份甘油和1-20份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖10-60mg/mL。
进一步的，以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：30-50份0.9％氯化钠注射液、40-60份人血白蛋白、1-10份甘油和1-10份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖30-50mg/mL。
作为优选，以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：40-50份0.9％氯化钠注射液、40-50份人血白蛋白、6-15份甘油和1-10份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖30-50mg/mL。
作为优选，以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：20-40份0.9％氯化钠注射液、50-70份人血白蛋白、5-15份甘油和5-15份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖40-60mg/mL。
作为优选，以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：20-30份0.9％氯化钠注射液、40-60份人血白蛋白、6-10份甘油和10-20份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖20-40mg/mL。
在一些优选实施例中，以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：50份0.9％氯化钠注射液、40份人血白蛋白、6份甘油和4份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖50mg/mL。
在另一些优选实施例中，以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：40份0.9％氯化钠注射液、50份人血白蛋白、4份甘油和6份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖20mg/mL。
本发明的一个实施例还提出的一种NK细胞冻存液的制备方法，其具体包括以下步骤：
先将海藻糖溶解于0.9％氯化钠注射液中，并在溶解得到的溶液中加入人血白蛋白、甘油和维生素C，搅拌均匀，得到混合液；
将所述混合液进行除菌，得到NK细胞冻存液；以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：10-50份0.9％氯化钠注射液、40-88份人血白蛋白、1-20份甘油和1-20份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖10-60mg/mL。
本步骤中，除了海藻糖是颗粒，其它组分均为液体，因此，需先将海藻糖溶解在0.9％氯化钠注射液中，然后再与人血白蛋白、甘油和维生素C混合。
在一些实施例中，所述除菌采用细菌过滤器，所述细菌过滤器的过滤尺寸为0.22μm。
本发明的另一个实施例还提出前述任一项所述的NK细胞冻存液在冻存NK细胞中的应用。
在一些实施例中，用所述的NK细胞冻存液冻存NK细胞的方法，包括以下步骤：
在NK细胞中加入0.9％氯化钠注射液，制成细胞悬液；
对所述细胞悬液进行离心，弃上清，加入所述的NK细胞冻存液，调整细胞浓度，使冻存液中NK细胞的浓度为2×107-4×107个细胞/mL，预冷，移入冻存管中；
将所述的冻存管程序降温至-90℃冻存；
冻存结束后，将所述的冻存管转移至液氮中冷冻保存。
进一步的，在使用时，将所述的冻存管从液氮中取出，于37-40℃的水浴中融化，直接输入人体内。
本发明提出的NK细胞冻存液仅含0.9％氯化钠注射液、人血白蛋白、甘油、维生素C和海藻糖，无需购买昂贵的原料，成本经济；同时这些成分都是能够进入人体组织内的成分，且其含量均控制在人体用量安全范围内，因此，使用所述NK细胞冻存液冻存之后的NK细胞可以经过融化后直接输入人体，而无需像现有技术中冻存后的细胞那样需要经过复杂的离心、清洗等处理之后才能输入人体，既能够避免细胞因离心而造成损伤，又成本经济，方便快捷高效，因使用成分均为医用注射级别，成分明确，并且符合人体输入剂量，因此，该NK细胞冻存液可直接输入人体，方便快捷，无安全风险。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据上述本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的试剂原料均为市售品，可以通过公开渠道购买获得。
NK细胞的培养过程如下：抽取外周血50ml(武警总院赠予)，并使用无菌PBS稀释(稀释比例1:1)，每支50ml离心管中加入20ml人淋巴细胞分离液(市购)，沿管壁、缓慢加入50ml稀释的外周血，避免破坏分离液的水相，然后在3000转/分钟下离心30分钟。将上层血浆小心吸出至另一个50ml离心管中，56℃灭活20min(主要是在56℃的水浴锅中进行，灭火的目的是为了去除血清中的补体等对热敏感的物质以及对血清中可能存在的支原体具有灭活作用)，待用。将淡黄色的单个核细胞层吸出至15ml离心管中，用无菌PBS(市购)洗涤3次、弃上清，沉淀即为外周血单个核细胞。用40ml NK培养液(市购)重悬单个核细胞，加入已灭活的自体血清和重组人IL-2(市购)，混匀后加入75cm2培养瓶中，置于37℃、5％(v/v)CO2细胞培养箱中静置培养。第3天，补充NK培养液(为补充NK细胞培养的所需营养)和重组人IL-2(主要是活化NK细胞，增强NK细胞的治疗效果)，并把培养瓶中的培养液平均分配到两个大培养袋中继续培养，每3-4天向每个大培养袋中补充100ml NK培养液和重组人IL-2。总共培养约14天，全部操作均在标准GMP实验室进行，并进行质量监测，括细菌及真菌污染检测、细胞内毒素检测、细胞活率、细胞流式检测、细胞杀伤性检测等。
培养14天时对NK细胞进行检测：
1、NK细胞细菌、真菌检测：阴性。
2、NK细胞内毒素检测：＜0.05EU。
3、NK细胞活率检测：96.1％。
4、NK细胞流式检测，主要检测项CD3-/CD16+CD56+NK：92.88％(见图1)。
5、NK细胞杀伤性检测：取NK细胞(密度为1×106个/ml)与靶细胞K562细胞(密度为1×105个/ml)按照效靶比40:1的比例混合，培养于96孔板内，每孔总体积2ml，同时设置效应细胞孔、靶细胞孔、空白对照孔，实验孔为NK细胞孔，置于37℃、5％(v/v)CO2细胞培养箱中培养24h后，加CCK-8试剂20μL，置于细胞培养箱孵育4h后于450nm测定吸光度(A)值。按公式计算NK细胞杀伤性：杀伤率＝[1-9(实验孔A值-效应细胞孔A值)/靶细胞孔A值]×100％。经计算杀伤率：91.5％。
实施例
本实施例提供了一种NK细胞冻存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别量取配方量的0.9％氯化钠注射液、人血白蛋白、甘油、维生素C和海藻糖；
(2)先将海藻糖溶解于0.9％氯化钠注射液中；
(3)向步骤(2)得到的溶液中加入人血白蛋白、甘油和维生素C，搅拌均匀，得到混合液；
(4)将步骤(3)得到的混合液用0.20-0.25μm的细菌过滤器进行除菌，得到NK细胞冻存液；
按照以上制备方法分别制备得到表1所列NK细胞冻存液1-12号；
对本实施例制得的NK细胞冻存液1-12号进行冻存测试：
使用本实施例制得的NK细胞冻存液冻存NK细胞，包括如下步骤：
1)显微镜观察培养好的NK细胞，制成细胞悬液；
2)将细胞悬液加入离心管中，在2000rpm的转速条件下，离心5min；
3)离心后弃上清，加入45mL生理盐水，吸取一滴细胞计数3.5×107个细胞，细胞活率95％，在2000rpm的转速条件下，离心5min；
4)弃生理盐水，加入本实施例制得的NK细胞冻存液1-12号，在4℃条件下预冷，调整细胞浓度为2×107-4×107个细胞/mL冻存液，每支冻存管加细胞液约1.5mL；
5)将冻存管放入程序降温仪，启动预制程序，约1.5小时完成冻存；
6)将冻存管转入液氮中进行冻存，冻存时间分别为1个月和3个月。
7)细胞复苏：冻存至规定的时间后，将冻存管从液氮中取出，迅速放入37-40℃水浴锅中，注意细胞液面一定要完全浸入水面以下，冻存管口高于水面，快速摇晃使细胞在1min内融化，待液体中有米粒大小的冰晶，从水浴锅中取出。复苏后的细胞加入到相应培养基中培养观察。复苏后第二天用显微镜观察细胞，用4X物镜观察细胞，每个视野中细胞形态均一，细胞未见异常形态。
8)复苏后细胞计数：从复苏后的细胞悬液中，吸取20微升，加入配置好的0.08％台盼蓝工作液20微升，轻轻混匀，防止气泡产生，吸20微升，加入到专用记数板中，使用Countstar细胞计数仪进行细胞数量和活率检测，重复两次，实验结果如表2所示。并用显微镜观察细胞，如图2、图3和图4所示，分别为本发明实施例中NK细胞冻存液1号冻存前的NK细胞图、冻存1个月复苏后的NK细胞图和冻存3个月复苏后的NK细胞图。
表1本实施例NK细胞冻存液1-12号配方
Figure BDA0003000822000000101
Figure BDA0003000822000000111
表2本实施例NK细胞冻存液1-12号冻存NK细胞的实验结果
Figure BDA0003000822000000112
Figure BDA0003000822000000121
由表2的实验结果可见，冻存前、冻存1个月复苏和冻存3个月复苏后，总细胞浓度、活细胞浓度、细胞存活率、平均直径、平均圆度和结团率均没有发生显著变化，表明本实施例的NK细胞冻存液能够在冻存过程中有效保护NK细胞，且冻存之后的NK细胞经过融化后可以直接输入人体。
本发明实施例的NK细胞冻存液毒副作用低、成分简单、成本低，同时保持了细胞高复苏活率，不影响细胞的特性和细胞的增殖能力，有助于细胞冻存技术的快速应用和推广。
对比例
按照上述实施例的制备方法分别制备得到表3所列NK细胞冻存液13-17号，与实施例相比，对比例中的13-17号分别减少一种组分；
按照上述实施例的测试方法对比例制得的NK细胞冻存液13-17号进行冻存测试，实验结果如表4所示。
表3对比例的NK细胞冻存液13-17号配方
编号 氯化钠 人血白蛋白 甘油 维生素C 海藻糖
13号 / 90mL 6mL 4mL 5g
14号 90mL / 6mL 4mL 5g
15号 50mL 40mL / 10mL 5g
16号 50mL 40mL 10mL / 5g
17号 50mL 40mL 6mL 4mL /
表4对比例的NK细胞冻存液13-17号冻存NK细胞的实验结果
Figure BDA0003000822000000131
由表4的实验结果可见，冻存前、冻存1个月复苏后，总细胞浓度、活细胞浓度、细胞存活率、平均直径、平均圆度和结团率均比实施例有明显降低，表明本实施例的NK细胞冻存液的组分为一个整体，各组分相辅相成，缺一不可。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种NK细胞冻存液，其特征在于，所述NK细胞冻存液由0.9％氯化钠注射液、人血白蛋白、甘油、维生素C和海藻糖组成。
2.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：10-50份0.9％氯化钠注射液、40-88份人血白蛋白、1-20份甘油和1-20份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖10-60mg/mL。
3.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，
以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：30-50份0.9％氯化钠注射液、40-60份人血白蛋白、1-10份甘油和1-10份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖30-50mg/mL。
4.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，
以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：50份0.9％氯化钠注射液、40份人血白蛋白、6份甘油和4份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖50mg/mL。
5.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，
以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：40份0.9％氯化钠注射液、50份人血白蛋白、4份甘油和6份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖20mg/mL。
6.一种NK细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括：
先将海藻糖溶解于0.9％氯化钠注射液中，并在溶解得到的溶液中加入人血白蛋白、甘油和维生素C，搅拌均匀，得到混合液；
将所述混合液进行除菌，得到NK细胞冻存液；
以体积份计，每100份所述NK细胞冻存液包括：10-50份0.9％氯化钠注射液、40-88份人血白蛋白、1-20份甘油和1-20份维生素C；
所述NK细胞冻存液还包括：海藻糖10-60mg/mL。
7.根据权利要求6所述的NK细胞冻存液的制备方法，其特征在于，
所述除菌采用细菌过滤器，所述细菌过滤器的过滤尺寸为0.22μm。
8.权利要求1-6任一项所述的NK细胞冻存液在冻存NK细胞中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用所述的NK细胞冻存液冻存NK细胞的方法，包括以下步骤：
在NK细胞中加入0.9％氯化钠注射液，制成细胞悬液；
对所述细胞悬液进行离心，弃上清，加入所述的NK细胞冻存液，调整细胞浓度，使冻存液中NK细胞的浓度为2×107-4×107个细胞/mL，预冷，移入冻存管中；
将所述的冻存管程序降温至-90℃冻存；
冻存结束后，将所述的冻存管转移至液氮中冷冻保存。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，
在使用时，将所述的冻存管从液氮中取出，于37-40℃的水浴中融化，直接输入体内。
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