CN112986565A - 一种快速检测外周t细胞淋巴瘤的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫学检测领域，涉及试剂盒，特别是指一种快速检测外周T细胞淋巴瘤的试剂盒及其使用方法。其中试剂盒包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，试剂Ⅰ包括两组单抗混合物，其中第一组单抗混合物组份为：TRBC1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD16、CD56、CD57和CD45；第二组单抗混合物组份为：TRBC1、TCR‑γδ、CD3、CD8、CD4、CD7和CD45；试剂Ⅱ为溶血素。本发明的提供的试剂盒实现了对外周T细胞淋巴瘤（PTCL）快速准确检测，简单方便，极大程度降低对样本量的要求，减少了患者负担。

Description

一种快速检测外周T细胞淋巴瘤的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于免疫学检测领域，涉及试剂盒，特别是指一种快速检测外周T细胞淋巴瘤的试剂盒及其使用方法。
背景技术
目前T细胞淋巴瘤的免疫表型诊断依赖于其T细胞表面抗原的丢失或异常，而T细胞性淋巴瘤种类繁多，分类复杂，病理诊断较难。这些变化往往十分微弱，某些T细胞性淋巴瘤的诊断单凭 HE 和免疫组化染色很难明确性质；而流式细胞术虽然可检测T细胞抗原表达的缺失、异常增高或降低来辅助T细胞淋巴瘤诊断，但某些T细胞淋巴瘤没有明显的表型异常或者感染时活化的反应性T细胞和自身免疫性疾病时T细胞也可有表型异常，因此需要进一步检测T细胞克隆性。
现有诊断T细胞克隆性的检测手段有TCR基因重排检测、流式TCR-Vβ检测。临床常用PCR扩增法进行TCR基因重排分析，由于TCR基因重排的有限多样性、高水平的背景噪音扩增以及缺乏克隆定量或免疫表型特征等原因影响其准确性，且国内无统一规范的TCR重排检测技术，检测时间过长，费用高。
传统流式TCR-Vβ检测需要分8管检测，所需样本量大，大部分患者在做完FCM初筛时发现可疑T细胞亚群，此时所剩样本量往往不够加做8管，需通知临床再抽样本，若样本为骨髓及患者不配合复抽样本，只得用外周血替代骨髓检测，但外周血和骨髓的差异可能会影响结果；而在检测方法上使用24个抗体、8管样本检测，抗体成本高、操作复杂性高、分析时间长，不利于临床及时对病情急迫的患者进行诊疗。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提出一种快速检测外周T细胞淋巴瘤的试剂盒及其使用方法，解决了现有试剂盒所需样本量大、步骤复杂、检测效率低的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种快速检测外周T细胞淋巴瘤的试剂盒，包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，试剂Ⅰ包括两组单抗混合物，其中第一组单抗混合物组份为：TRBC1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD16、CD56、CD57和CD45；第二组单抗混合物组份为：TRBC1、TCR-γδ、CD3、CD8、CD4、CD7和CD45；试剂Ⅱ为溶血素。
所述试剂Ⅱ为溶血素，包括氯化铵、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸及超纯水。
所述第一组单抗混合物的具体含量为：5μL TRBC1、5μL CD2、5μL CD3、5μL CD5、5μL CD7、5μL CD16、5μL CD56、5μL CD57和5μL CD45；第二组单抗混合物的具体含量为：5μLTRBC1、5μL TCR-γδ、5μL CD3、5μL CD8、5μL CD4、5μL CD7和5μL CD45。
所述溶血素中各组份的质量比为：氯化铵0.821%，碳酸氢钾0.0991%，乙二胺四乙酸0.00367%，余量为超纯水。
上述的试剂盒的使用方法，步骤如下：
（1）向检测容器中加入待测样本，然后加入一定体积的试剂Ⅱ，振荡均匀后，室温避光孵育10-20min，然后离心去除细胞碎片及非细胞成分；
（2）向经过步骤（1）处理的待测样本中加入鞘液，经细胞计数达后再加入一定体积的试剂Ⅰ，室温孵育15min，加入2mL鞘液再次离心后，再加入500μL鞘液重悬，置于流式细胞仪进行检测；
（3）根据步骤（2）的检测结果筛查待测样本的T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是否呈现单型性表达，从而实现快速诊断。
所述步骤（1）中待测样本与试剂Ⅱ的体积比为1:20；离心的速度为1700r/min。
所述步骤（2）中鞘液为BD 342003；细胞计数的标准为每管含有（0.8-1.2）×106个细胞。
所述步骤（2）中试剂Ⅰ的加入量为20μL。
所述步骤（3）中若T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是呈单型性表达，则为外周T细胞淋巴瘤细胞；若T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是呈多型性表达，则为正常细胞。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请通过对TRBC1抗体的组合构建试剂盒，基于T细胞淋巴瘤（PTCL）受体β链恒定区呈单型性表达测定T细胞亚群、反应性淋巴细胞中TRBC1的表达情况，从而快速区分检测外周T细胞淋巴瘤（PTCL）；本申请减少试剂盒单克隆抗体的种类，仅使用9种抗体，实现了对成熟T细胞淋巴瘤T细胞克隆性的精准检测，并增强其特异性识别能力，从而实现对外周T细胞淋巴瘤（PTCL）的快速准确检测；本申请的试剂盒可大大减少所需样本的数量，降低对患者身心的双重伤害。
2、本申请的试剂盒通过常规操作完成检验，毫无复杂步骤，缩短检测周期，降低检测成本，通过常规操作降低对医务检测人员的技术要求，从而进行快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为异常成熟T淋巴细胞TRBC1呈单型性表达。
图2为正常成熟T淋巴细胞TRBC1呈多型性表达。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种快速检测外周T细胞淋巴瘤的试剂盒，包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，试剂Ⅰ包括两组单抗混合物，其中第一组单抗混合物组份为：TRBC1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD16、CD56、CD57和CD45；第二组单抗混合物组份为：TRBC1、TCR-γδ、CD3、CD8、CD4、CD7和CD45；试剂Ⅱ为溶血素。
进一步，所述试剂Ⅱ为溶血素，包括氯化铵、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸及超纯水。
进一步，所述第一组单抗混合物的具体含量为：5μL TRBC1、5μL CD2、5μL CD3、5μLCD5、5μL CD7、5μL CD16、5μL CD56、5μL CD57和5μL CD45；第二组单抗混合物的具体含量为：5μL RBC1、5μL TCR-γδ、5μL CD3、5μL CD8、5μL CD4、5μL CD7和5μL CD45。
进一步，所述溶血素中各组份的质量比为：氯化铵0.821%，碳酸氢钾0.0991%，乙二胺四乙酸0.00367%，余量为超纯水。
上述的试剂盒的使用方法， 步骤如下：
（1）向检测容器中加入待测样本，然后加入一定体积的试剂Ⅱ，振荡均匀后，室温避光孵育10-20min，然后离心去除细胞碎片及非细胞成分；
（2）向经过步骤（1）处理的待测样本中加入鞘液，经细胞计数达标后再加入一定体积的试剂Ⅰ，室温孵育15min，加入2mL 鞘液再次离心后，再加入500μL鞘液重悬，置于流式细胞仪进行检测；
（3）根据步骤（2）的检测结果筛查待测样本的T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是否呈现单型性表达，从而实现快速诊断。
进一步，所述步骤（1）中待测样本与试剂Ⅱ的体积比为1:20；离心的速度为1700r/min。
进一步，所述步骤（2）中鞘液为BD 342003；细胞计数的标准为每管含有（0.8-1.2）×106个细胞。
进一步，所述步骤（2）中试剂Ⅰ的加入量为20μL。
进一步，所述步骤（3）中若T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是呈单型性表达，则为外周T细胞淋巴瘤细胞；若T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是呈多型性表达，则为正常细胞。
实施例1
利用本申请的试剂盒，对一例已有明确临床诊断如图1的临床样本进行检测。本实施例采用流式细胞仪。测试的操作步骤如下：
100μL样本加入体积当量约1:20的溶血素室温避光孵育10分钟后除去细胞碎片或非细胞成分，重复操作共制得两份样本，加入少量鞘液稀释后，将两组单克隆抗体混合物室温一对一分别添加20μL到两份样本中避光孵育15分钟，加入500μL的PBS溶液室温避光孵育5分钟，离心再用适量鞘液稀释即可上机检测。
实验得到检测数据，如图1所示。肿瘤性T细胞TCRβ呈单型性表达，TRBC1可高敏感的鉴定T细胞亚群的克隆性，因此可以将肿瘤性T细胞与非肿瘤性T细胞区分开。
实施例2
利用本申请的试剂盒，检测一例正常的临床样本，采用的流式细胞仪，其具体操作步骤为：分别取100μL样本，加入体积当量约1:20的溶血素，于室温避光孵育15min后经两次离心除去细胞碎片和非细胞成分，后加入少量的鞘液，将两组单克隆抗体混合液一对一加入20μL，室温孵育15min，加入2mL 鞘液再次离心，后加入500μL鞘液上机进行两次检测。
最终测试结果如图2所示，TRBC1抗体检测结果在正常样本中呈现部分表达。
结果表明本专利所用TRBC1抗体试剂盒能够实现对PTCL患者的灵敏诊断，简单准确筛查T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是否呈现单型性表达，从而实现快速诊断，为后续治疗提供依据。
实施例3
利用本申请的试剂盒，同时对25例侵犯骨髓的成熟T细胞淋巴瘤样本进行检测。
本实施例采用流式细胞仪，每一次测试的操作步骤如下：
取20μL单克隆抗体混合物和100μL样本室温避光孵育15分钟，加入体积当量约1:20的溶血素室温避光孵育10分钟，加入500μL的PBS溶液室温避光孵育5分钟，即可上机检测。重复上述步骤，得到25组检测数据；
如表2所示：
表2 实施例3所得到的25组数据
Figure 555309DEST_PATH_IMAGE001
通常认为TRBC1表达少于15％或大于85％细胞为TCRβ呈单型性表达。在针对25例样本测试最终结果表明，患有T细胞淋巴瘤样本检测结果TRBC1表达都呈单型性表达，如样本23-25所示，检测TRBC1含量均大于90%，实现快速准确诊断。数据结果表明TRBC1可高敏感的鉴定T细胞亚群的克隆性，该类试剂盒对样本具有普遍适用性且检测精准。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种快速检测外周T细胞淋巴瘤的试剂盒，其特征在于，包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，试剂Ⅰ包括两组单抗混合物，其中第一组单抗混合物组份为：TRBC1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD16、CD56、CD57和CD45；第二组单抗混合物组份为：TRBC1、TCR-γδ、CD3、CD8、CD4、CD7和CD45；试剂Ⅱ为溶血素。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂Ⅱ为溶血素，包括氯化铵、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸及超纯水。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组单抗混合物的具体含量为：5μL TRBC1、5μL CD2、5μL CD3、5μL CD5、5μL CD7、5μL CD16、5μL CD56、5μL CD57和5μLCD45；第二组单抗混合物的具体含量为：5μL TRBC1、5μL TCR-γδ、5μL CD3、5μL CD8、5μLCD4、5μL CD7和5μL CD45。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述溶血素中各组份的质量比为：氯化铵0.821%，碳酸氢钾0.0991%，乙二胺四乙酸0.00367%，余量为超纯水。
5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：
（1）向检测容器中加入待测样本，然后加入一定体积的试剂Ⅱ，振荡均匀后，室温避光孵育10-20min，然后离心去除细胞碎片及非细胞成分；
（2）向经过步骤（1）处理的待测样本中加入鞘液，经细胞计数达标后再加入一定体积的试剂Ⅰ，室温孵育15min，加入2mL 鞘液再次离心后，再加入500μL鞘液重悬，置于流式细胞仪进行检测；
（3）根据步骤（2）的检测结果筛查待测样本的T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是否呈现单型性表达，从而实现快速诊断。
6. 根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（1）中待测样本与试剂Ⅱ的体积比为1:20；离心的速度为1700r/min 。
7. 根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（2）中鞘液为BD 342003；细胞计数的标准为每管含有（0.8-1.2）×106个细胞。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（2）中试剂Ⅰ的加入量为20μL。
9.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（3）中若T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是呈单型性表达，则为外周T细胞淋巴瘤细胞；若T细胞亚群、反应性淋巴细胞TCRβ是呈多型性表达，则为正常细胞。
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