CN112972681A - Mt-nd6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用 - Google Patents

Mt-nd6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

MT‑ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，在2型糖尿病人外周血白细胞以及肥胖小鼠肝脏中MT‑ND6基因的表达显著降低，同时MT‑ND6基因的甲基化水平显著升高，线性相关分析显示MT‑ND6基因的甲基化水平与其mRNA的表达呈负相关，与胰岛素抵抗指数HOMA‑IR、糖化血红蛋白含量以及血清甘油三酯水平呈正相关，敲低MT‑ND6能够引起线粒体功能失常，增加肝脏脂滴积累，同时降低胰岛素敏感性，表明MT‑ND6基因与代谢综合征的发生紧密相关；本发明为临床诊断和治疗代谢综合征及其并发症提供了新的靶点，具有重要的应用价值。

Description

MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用
技术领域
本发明属于生物学及医药学领域，特别涉及MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用。
背景技术
代谢综合征是临床上包括肥胖、糖尿病、血脂紊乱等多种代谢失常症状异常聚集的病理状态，而胰岛素抵抗被认为是代谢综合征的病理基础和核心环节。随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，代谢综合征及其导致的慢性非传染性疾病已严重威胁国人健康和生活质量，阐明其发病机制并寻求更有效的防治靶点是亟待解决的重要问题。
线粒体是细胞内调控糖脂代谢的关键细胞器，生理条件下线粒体的生成、降解、融合、***、分布等维持动态平衡并保持线粒体正常功能的过程称之为线粒体稳态。线粒体作为细胞的能量工厂和自由基的产生来源，其稳态失衡是推动肝脏、骨骼肌等富含线粒体的组织中胰岛素抵抗形成的关键因素。因此，维持线粒体稳态对于改善胰岛素敏感性、防治代谢综合征至关重要。
MT-ND6基因(mitochondrial NADH-dehydrogenase 6)由线粒体DNA所编码，是构成线粒体电子传递链复合物Ⅰ的亚基，在维持复合物Ⅰ的正常活性和调控线粒体稳态中扮演了重要角色。MT-ND6的突变能够造成Leber视神经病变和Leigh综合征等线粒体遗传病的发生。但是目前关于MT-ND6基因能否调控肥胖、糖尿病、高血脂等代谢性疾病的发生尚无报道。
发明内容
为代谢综合征提供一种新型诊治靶点，本发明的目的在于提供MT-ND6 作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，首次提出在2型糖尿病人外周血白细胞以及肥胖小鼠肝脏中MT-ND6基因的表达显著降低，同时 MT-ND6基因的甲基化水平显著升高。
线性相关分析显示，MT-ND6基因的甲基化水平与其mRNA的表达呈线性负相关，与胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、糖化血红蛋白含量以及血清甘油三酯水平呈线性正相关，提示MT-ND6的甲基化修饰可能作为代谢综合征临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物；敲低MT-ND6能够引起线粒体功能失常，增加肝脏脂滴积累，同时降低胰岛素敏感性，上述研究成果表明 MT-ND6基因与代谢综合征的发生紧密相关，靶向该基因(或蛋白)的药物研发有望成为治疗代谢综合征的新策略；本发明为临床诊断和治疗代谢综合征提供了新的靶点，具有重要的应用价值。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：
MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其机理为：外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化修饰水平与HOMA-IR指数以及糖化血红蛋白含量呈线性正相关，MT-ND6基因的甲基化可作为胰岛素抵抗和2 型糖尿病临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物；又由于胰岛素抵抗是代谢综合征的病理基础，MT-ND6基因的甲基化也能够作为代谢综合征临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物。
MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其机理为：外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化修饰水平与血清甘油三酯水平呈线性正相关，MT-ND6基因的甲基化可作为高血脂或高脂血症临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物。
MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其机理为： 2型糖尿病人和肥胖小鼠中MT-ND6基因的表达水平降低，同时MT-ND6基因的甲基化与其mRNA表达呈线性负相关，表明MT-ND6的表达水平可作为高血脂或高脂血症、肥胖、2型糖尿病以及代谢综合征临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物。
MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其机理为：敲低MT-ND6能够增加肝脏脂滴积累，表明MT-ND6基因可作为脂肪肝及其相关肝脏疾病的新型治疗靶点。
MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其机理为： MT-ND6基因能够调控线粒体功能、维持线粒体稳态，在制备改善线粒体功能失常相关疾病的药物中具有良好应用前景。
MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其机理为：敲低MT-ND6能够降低胰岛素敏感性，表明MT-ND6基因可作为胰岛素抵抗、 2型糖尿病以及代谢综合征的新型治疗靶点。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明首次发现外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化修饰及其表达水平能够作为代谢综合征临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物，只需要少量外周血(＜50μL)和常规设备(PCR)就能诊断代谢综合征的发病进程，具有操作简便、安全无创的优点。
本发明首次发现MT-ND6基因是治疗代谢综合征的新型潜在靶点，靶向 MT-ND6基因(或蛋白)的药物研发有望成为治疗代谢综合征的新策略，具有重要的开发价值和良好的应用前景。
靶向该基因(或蛋白)的药物研发有望成为治疗代谢综合征的新策略。
附图说明
图1是2型糖尿病人外周血白细胞以及肥胖小鼠肝脏中MT-ND6基因的甲基化水平显著升高和mRNA表达水平显著降低；图1A是2型糖尿病人外周血白细胞MT-ND6基因甲基化水平；图1B是2型糖尿病人外周血白细胞 MT-ND6基因mRNA表达水平；图1C是肥胖小鼠肝脏MT-ND6基因甲基化水平；图1D是肥胖小鼠肝脏MT-ND6基因mRNA表达水平，Con，正常人对照；T2DM，糖尿病人组；Chow，正常饮食组，HFD，高脂饮食组。
图2是人外周血白细胞中MT-ND6甲基化与MT-ND6 mRNA水平呈负相关，与血清甘油三酯，HOMA-IR以及糖化血红蛋白含量呈正相关；图2A 是MT-ND6基因甲基化水平与MT-ND6mRNA表达的线性相关分析；图2B 是MT-ND6基因甲基化水平与血清甘油三酯含量的线性相关分析；图2C是 MT-ND6基因甲基化水平与HOMA-IR的线性相关分析；图2D是MT-ND6 基因甲基化水平与糖化血红蛋白含量的线性相关分析。
图3是在HepG2细胞中敲低MT-ND6基因引起线粒体功能失常；图3A 是敲低MT-ND6基因后线粒体耗氧曲线图；图3B是敲低MT-ND6基因后线粒体耗氧统计图，NC，阴性对照组；ND6 esiRNA，MT-ND6 siRNA处理组。
图4是敲低MT-ND6基因引起小鼠肝脏脂滴积累增多；图4A是敲低MT-ND6基因后小鼠肝脏HE染色；图4B是敲低MT-ND6基因后小鼠肝脏甘油三酯含量。NC，阴性对照组；ND6siRNA，MT-ND6 siRNA处理组。
图5是敲低MT-ND6基因引起小鼠胰岛素敏感性降低；图5A是敲低 MT-ND6基因后小鼠口服糖耐量(OGTT)；图5B是敲低MT-ND6基因后小鼠肝脏胰岛素信号通路的蛋白表达水平；NC，阴性对照组；ND6 siRNA， MT-ND6 siRNA处理组；NC+INS，阴性对照注射胰岛素组；ND6 siRNA+INS， MT-ND6 siRNA注射胰岛素组。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1.实验材料
β-actin、Insulin Receptorβ(IR)、p-IR(Tyr 1150/1151)、Akt、p-Akt(Ser 473)、GSK3α/β、p-GSK3α/β(Ser 21/9)抗体购买自Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶偶联的针对鼠和兔的二抗购买自杰克逊免疫实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories)；Invivofectamine 3.0 siRNA转染试剂购买自 Thermo-Fisher公司；DNA提取试剂盒购买自Qiagen公司；TRIzol试剂购买自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购买自Takara公司；DNA甲基化试剂盒购买自Zymo Research公司；Western及IP细胞裂解液购买自碧云天生物技术有限公司；甘油三酯检测试剂盒购买自南京建成生物工程研究所；红细胞裂解液购买自天根生化科技有限公司。
2.人群血液样本的收集与处理
45-65岁正常人和2型糖尿病人空腹外周静脉血取自贵州航天医院，基因背景为中国汉族人。血液样本4℃，3000g离心10min，上清即为血浆，沉淀为血细胞。利用红细胞裂解液处理血细胞，得到白细胞后利用DNA提取试剂盒提取DNA，利用TRIzol试剂提取RNA。
3.小鼠肥胖模型的建立与MT-ND6 siRNA处理
(1)小鼠肥胖模型的建立
六周龄雄性C57BL/6J小鼠购买自北京维通利华公司，适应一周后小鼠随机分为两组：正常饮食组(Chow)和高脂饮食组(HFD)。正常饮食组给予10％热量比的正常饮食，高脂饮食组给予60％热量比的高脂肪饮食。经过 8周的饲喂，小鼠禁食过夜后处死，取血清和肝脏冻存至-80℃备用。
(2)小鼠MT-ND6 siRNA处理
小鼠MT-ND6 siRNA序列为5’-GGGUUUGUUGGUUGUUUAATT， 5’-UUAAACAACCAACAAACCCTT，经过3’端胆固醇修饰以及2’端甲氧基修饰以增加体内稳定性。利用Invivofectamine 3.0转染试剂将5mg/kg siRNA 从小鼠尾静脉注射，每4天注射一次，8天后将小鼠禁食过夜并处死。
4.实验方法
(1)小鼠肝脏匀浆制备
利用眼科剪在预冷PBS中剪碎小鼠肝脏，洗净组织残余的血液与血块， 1000g离心10min，弃上清；余下洗净的组织沉淀每管加入1mL的预冷匀浆介质，用匀浆机充分匀浆；4℃，1000g离心10min，上清即为组织匀浆；用BCA方法进行蛋白定量，调平；利用组织匀浆进行甘油三酯的检测。
(2)肝脏形态学检测
利用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE staining)进行组织形态学检测。新鲜肝脏取一部分置于多聚甲醛中固定过夜；乙醇脱水后将肝组织置于透明剂二甲苯中，浸蜡包埋；于切片机上切成薄片(4-5μm厚)，在热水中烫平，贴到载玻片上，置于45℃恒温箱中烘干；切片放入苏木***溶液中染色数分钟，在酸水和氨水中分色数秒钟，流水冲洗1h后入蒸馏水片刻，载入70％及90％乙醇脱水各10min；入乙醇-伊红染色液染色2-3min；染色后的切片经100％乙醇脱水，再经二甲苯透明化后滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固，显微镜下观察染色结果并拍照。
(3)RNA的提取与检测
外周血白细胞或小块的小鼠肝脏在1mL TRIzol试剂中超声破碎，加入 200μL氯仿震荡混匀后室温静置2-3min；4℃，12000g离心15min，缓慢转移上清后加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min；4℃， 12000g离心15min，弃去上清后沉淀用75％预冷乙醇洗涤2次；4℃，12000 g离心10min，沉淀用DEPC水溶解，定量后取1μg RNA利用Takara RT-PCR 试剂盒反转录成cDNA；利用real-time PCR检测MT-ND6 mRNA表达水平。
(4)DNA的提取与甲基化检测
外周血白细胞DNA或小鼠肝脏DNA根据Qiagen公司的DNA抽提试剂盒说明书进行提取；所提取的DNA检测浓度后，将500ng DNA利用Zymo Research公司的EZ DNA甲基化试剂盒进行亚硫酸盐处理；最终得到的DNA 利用甲基化特异性的PCR引物检测MT-ND6的甲基化水平。
(5)蛋白的提取与检测
1)蛋白提取
HepG2细胞样本或已经剪碎的小鼠肝脏样本在预冷PBS中重悬，洗去多余脂肪或血液，1000g离心10min，弃上清；余下洗净的沉淀每管加入300μL 的Western及IP细胞裂解液，超声破碎后置于冰上继续裂解0.5h；4℃，13000 g离心10min，得到上清即为蛋白；用BCA方法进行蛋白定量，调平；加入 5X loading buffer和巯基乙醇，煮沸10min，使蛋白变性，-80℃保存备用。
2)Western blot
利用10％的丙烯酰胺凝胶跑电泳，蛋白上样量为15μg；采用硝酸纤维素膜在300mA电流下转膜100min；利用5％的脱脂牛奶室温封闭1h；利用 5％的脱脂牛奶或1％BSA 1:1000稀释一抗，4℃过夜孵育；利用1×TBST在脱色摇床上洗膜3次，每次10min，清洗一抗；利用5％的脱脂牛奶或1％BSA 1:5000稀释二抗，室温孵育1h；利用1×TBST在脱色摇床上洗膜4次，每次15min，清洗二抗；利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质进行化学发光；WesternBlot X光片结果采用EPSON Perfection V350扫描仪扫描，并利用 Quantity One软件(Bio-Rad公司)对扫描的图像进行灰度分析。
(6)统计分析
利用GraphPad Prism 5软件对实验数据进行统计学分析和统计学作图。所有的数值均表示为平均值±标准误。两组间统计分析采用学生t检验，多组间的差异分析利用One-way ANOVA(LSD post-hoc比较)。将P<0.05作为统计学显著性差异的标准。
实施例一
MT-ND6基因的甲基化可作为以胰岛素抵抗为病理基础的肥胖、2型糖尿病等代谢综合征及其并发症临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物
如图1A和C所示，2型糖尿病人外周血白细胞以及肥胖小鼠肝脏中 MT-ND6基因的甲基化水平显著升高。如图2C和D所示，线性相关分析显示人外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化水平与HOMA-IR和糖化血红蛋白含量呈正相关，提示MT-ND6的甲基化可作为胰岛素抵抗的生物标志物。由于胰岛素抵抗是肥胖、2型糖尿病等多种代谢性疾病的病理基础和核心环节，因此MT-ND6基因的甲基化可作为肥胖、2型糖尿病等代谢综合征及其并发症临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物。
实施例二
MT-ND6基因的甲基化可作为高血脂(或高脂血症)临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物
血清中甘油三酯含量升高是高血脂(或高脂血症)最重要的特征之一，如图2B所示，人外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化修饰水平与血清甘油三酯水平呈线性正相关，提示MT-ND6基因的甲基化可作为高血脂(或高脂血症)临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物。
实施例三
MT-ND6的表达水平可作为高血脂(或高脂血症)、肥胖、2型糖尿病以及代谢综合征及其并发症临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物
如图1B和D所示，2型糖尿病人和肥胖小鼠中MT-ND6基因的mRNA 表达水平降低，同时如图2A所示，人外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化与其mRNA表达呈线性负相关。由于MT-ND6的甲基化水平与血清甘油三酯、HOMA-IR和糖化血红蛋白含量呈线性正相关(图2B-D)，可知MT-ND6 基因的mRNA表达与血清甘油三酯、HOMA-IR和糖化血红蛋白含量呈线性负相关，提示MT-ND6的表达水平(mRNA和蛋白水平)可作为高血脂(或高脂血症)、肥胖、2型糖尿病以及代谢综合征及其并发症临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物。
实施例四
MT-ND6基因能够调控线粒体功能、维持线粒体稳态，在制备改善线粒体功能失常相关疾病的药物中具有良好应用前景。
线粒体稳态失衡是推动代谢综合征发生的关键诱因。MT-ND6基因由线粒体DNA所编码，是构成线粒体电子传递链复合物Ⅰ的亚基，在维持复合物Ⅰ的正常活性和调控线粒体稳态中扮演了重要角色。如图3A和B所示，在人肝细胞HepG2中利用siRNA敲低MT-ND6的表达后，线粒体耗氧能力显著降低，包括线粒体基础呼吸、ATP产生、质子漏、最大呼吸和储备呼吸均有明显降低，表明MT-ND6基因在维持线粒体稳态中起了重要作用。
实施例五
MT-ND6基因可作为脂肪肝及其相关肝脏疾病的新型治疗靶点
肝脏中脂肪堆积过多是脂肪肝的重要病理特征。如图1D所示，肥胖小鼠肝脏中MT-ND6基因的mRNA表达显著降低，提示MT-ND6可能在肥胖相关脂肪肝中扮演了重要角色。进一步在正常小鼠中利用siRNA敲低 MT-ND6基因的表达后能够显著增加肝脏中的脂滴积累(图4A)，同时增加小鼠肝脏中甘油三酯的含量(图4B)。上述结果表明MT-ND6基因可作为脂肪肝及其相关肝脏疾病(如肝纤维化、肝硬化等)的新型治疗靶点，通过外源过表达MT-ND6有望改善脂肪肝及其相关肝脏疾病。
实施例六
MT-ND6基因可作为胰岛素抵抗、2型糖尿病以及代谢综合征及其并发症的新型治疗靶点
如图1B和D所示，2型糖尿病人和肥胖小鼠中MT-ND6基因的mRNA 表达水平降低，提示MT-ND6基因可能在胰岛素抵抗和代谢综合征中扮演重要角色。进一步在正常小鼠中敲低MT-ND6的表达能够明显降低胰岛素敏感性，包括受损的口服糖耐量(图5A)和下调的胰岛素信号通路(图5B)。上述结果表明MT-ND6基因可作为胰岛素抵抗、2型糖尿病以及代谢综合征及其并发症的新型治疗靶点，通过外源过表达MT-ND6有望改善代谢综合征及其并发症。
本发明可进行以下应用：
本发明所述的人外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化水平与 HOMA-IR和糖化血红蛋白含量呈线性正相关，提示MT-ND6的甲基化可作为胰岛素抵抗的生物标志物。进一步的，该基因的甲基化在以胰岛素抵抗为病理基础的代谢性疾病临床早期筛查、诊断及预后中具有良好的应用价值。
本发明所述的人外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化水平与血清甘油三酯含量呈线性正相关，进一步的，该基因的甲基化在高血脂(或高脂血症) 临床早期筛查、诊断及预后中具有良好的应用价值。
本发明所述的人外周血白细胞中MT-ND6基因的mRNA表达与MT-ND6 基因的甲基化水平呈线性负相关，进一步的，该基因的表达水平在高血脂(或高脂血症)、肥胖、2型糖尿病等以胰岛素抵抗为病理基础的代谢性疾病临床早期筛查、诊断及预后中具有良好的应用价值。
本发明所述的MT-ND6基因具有增强线粒体耗氧能力，维持线粒体稳态的调控作用。进一步的，该基因在制备改善线粒体功能失常相关疾病的药物中具有良好应用前景。
本发明所述的MT-ND6基因具有调控肝脏脂质积累的作用，进一步的，该基因是治疗脂肪肝及其相关肝脏疾病(如肝纤维化、肝硬化等)的新型潜在靶点，在制备改善脂肪肝及其相关肝脏疾病的药物中具有良好应用前景。
本发明所述的MT-ND6基因具有调控胰岛素敏感性的关键作用，进一步的，该基因是治疗肥胖、2型糖尿病等以胰岛素抵抗为病理基础的代谢性疾病的新型潜在靶点，靶向MT-ND6基因的药物研发有望成为治疗代谢综合征及其并发症的新策略，具有重要的开发价值和良好的应用前景。
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其特征在于，其机理为：外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化修饰水平与HOMA-IR指数以及糖化血红蛋白含量呈线性正相关，MT-ND6基因的甲基化可作为胰岛素抵抗和2型糖尿病临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物；又由于胰岛素抵抗是代谢综合征的病理基础，MT-ND6基因的甲基化也能够作为代谢综合征临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物。
2.MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其特征在于，其机理为：外周血白细胞中MT-ND6基因的甲基化修饰水平与血清甘油三酯水平呈线性正相关，MT-ND6基因的甲基化可作为高血脂或高脂血症临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物。
3.MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其特征在于，其机理为：2型糖尿病人和肥胖小鼠中MT-ND6基因的表达水平降低，同时MT-ND6基因的甲基化与其mRNA表达呈线性负相关，表明MT-ND6的表达水平可作为高血脂或高脂血症、肥胖、2型糖尿病以及代谢综合征临床早期筛查、诊断及预后的生物标志物。
4.MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其特征在于，其机理为：敲低MT-ND6能够增加肝脏脂滴积累，表明MT-ND6基因可作为脂肪肝及其相关肝脏疾病的新型治疗靶点。
5.MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其特征在于，MT-ND6基因能够调控线粒体功能、维持线粒体稳态。
6.MT-ND6作为新靶点在代谢综合征诊断和治疗药物中的应用，其特征在于，其机理为：敲低MT-ND6能够降低胰岛素敏感性，表明MT-ND6基因可作为胰岛素抵抗、2型糖尿病以及代谢综合征的新型治疗靶点。
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