CN112972321B - 一种用于化妆品的天然抗氧化剂及其制备方法 - Google Patents

一种用于化妆品的天然抗氧化剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于化妆品的天然抗氧化剂及其制备方法，主要组分为红三叶提取物，成分为黄酮、多糖及其复配物。不同成分在活性、水溶性和成本核算具有不同的特点，综合活性、溶解度和成本等因素，可以采用多种成分的复配方案，特别是多糖与异黄酮质量比在1：2时，两种成分之间协同效果最好，活性最高。红三叶作为豆科牧草，在全世界广为分布，来源丰富，其异黄酮成分具有保健功能。该产品制备容易，过程安全环保，成本不高，且配方多样化可以适合不同用途、剂型等的需要，作为植物源抗氧化剂在化妆品中应用范围非常广。

Description

一种用于化妆品的天然抗氧化剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品产业技术领域，具体为一种用于化妆品的天然抗氧化剂及其制备方法。
背景技术
皮肤是作为人体最外层的组织器官，起着保护人体不受外部刺激或伤害的作用，也是最早能反映机体衰老的组织。造成皮肤衰老的因素有很多，除遗传因素外，来自外界环境如紫外线、雾霾等，加之身体内部的精神压力、生活作息不规律等，都会产生大量自由基，干扰细胞信号传导，加快细胞凋亡，加速皮肤老化，具体表现为皮肤干燥、松弛、起屑、黑色素增加甚至出现色斑等，甚至导致皮肤癌的发生，影响人们的身体健康和生活质量。
抗氧化剂作为一种“外源性抗氧化物”，能有效消除氧自由基，使皮肤达到抗老化、美白、防晒和保湿等目的。随着国民生活质量的不断提高，人们对身体的保养越来越重视，化妆品也不再只是年轻女士的专利了，需求量大，而且对产品的要求也趋于多元化。
抗氧化剂是指在一定浓度下通过清除自由基来阻止或者抑制氧化损伤的一类物质。目前，人工合成的抗氧化剂中，叔丁基对羟基茴香醚(BHA)和二丁基羟基甲苯(BHT)使用较为广泛。但在雄性幼鼠腹膜内注射BHA、BHT及其代谢物的实验中，发现鼠肺细胞数量增生，现在美国，欧盟等国家已逐渐禁止使用此类合成抗氧化剂。
用天然抗氧化剂取代人工合成抗氧化剂是未来发展趋势。化妆品是与人皮肤长时间连续接触的物质，必须是缓和、安全、无毒、无副作用的产品。因此高效、低毒、价廉的天然抗氧化剂是安全、健康的化妆品必不可少的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于化妆品的天然抗氧化剂及其制备方法，本发明从该植物提取制备的抗氧化成分活性优于异黄酮成分，且水溶性更好，适应范围更广，具有非常好的开发应用前景，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于化妆品的天然抗氧化剂，主要组分为红三叶提取物的萃取物，成分分别为粗多糖、粗异黄酮、精制多糖和精制异黄酮及精制多糖和精制异黄酮的复配物。
进一步地，精制多糖和精制异黄酮的复配物质量比1：10-15：1配制。
本发明提供另一种技术方案：一种用于化妆品的天然抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：红三叶提取物的制备
将采集到的红三叶叶片105℃杀青2-60min，65℃下干燥1-160h，粉碎，用少量石油醚脱脂1-10次，挥去溶剂晾干，称取一定质量脱脂红三叶粉末，用10-50倍10-100％乙醇30-70℃超声辅助提取10-90min，过滤收集上清液，样品残渣再加5-120倍溶剂提取10-90min，合并两次提取液；
S2：粗多糖和粗异黄酮的制备
粗多糖：将提取液在15-90℃下用真空旋转仪浓缩，至八分之一体积时，向浓缩液中边搅拌边缓缓加入2-20倍体积无水乙醇，放入4℃冰箱静置过夜，4800rpm离心2-20min，离心后褐色沉淀为粗多糖部分，沉淀部分用无水乙醇反复洗涤1-10次，洗去醇溶性杂质，最后用乙醇洗出沉淀倒入培养皿，待溶剂挥发，得到褐色红三叶粗多糖；
上清为异黄酮部分，并对上清液减压浓缩，得到红三叶粗异黄酮；
S3：红三叶异黄酮的精制
将经过预处理的树脂用蒸馏水浸泡10-90h以上，湿法装柱树脂高度在3-50cm，将粗异黄酮1-30g用水溶解，上完样等待吸附0.5-24h后，分别用蒸馏水、30％、50％乙醇各洗脱1-5BV，然后用70％乙醇洗脱1-5BV，最后用100％乙醇洗脱1-10BV，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩，得精制异黄酮；
S4：红三叶多糖的精制
除蛋白：将红三叶粗多糖用蒸馏水配置成1-10mg/mL溶液，加入1/4体积的sevage溶液，振荡1-30min，转移至分液漏斗静置1-120min，放掉下层溶液和中层的蛋白质，如此操作反复1-6次至下层有机溶剂中不再出现蛋白质；
透析：将去除蛋白质的多糖溶液，低温减压浓缩后，装入预处理的透析袋，放入大容量烧杯中，加满蒸馏水静置透析，每1-16h换一次水，透析1-72h，用1％的AgNO3检查NaCl、KCl等残留情况，最终得到纯化的多糖。
进一步地，针对步骤S3中，树脂预处理：将树脂用20-100％乙醇浸泡1-72h，过滤，用去离子水反复冲洗至无醇味，且冲洗液无白色浑浊，再用1-30％NaOH浸泡1-72h，过滤，用去离子水反复冲洗树脂至pH呈现中性，再用1-30％HCl溶液浸泡1-72h，过滤冲洗树脂至中性，20-90℃烘干备用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明从该植物提取制备的抗氧化成分活性高，水溶性好，适应范围广，绿色安全，兼具保健功能。另外红三叶植物资源丰富，开发成本低，具有非常好的市场前景。
具体实施方式
以下将详细说明本发明实施例，然而，本发明实施例并不以此为限。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于化妆品的天然抗氧化剂，包括红三叶粗多糖和粗异黄酮，其中：
红三叶粗多糖和粗异黄酮的原料配比如下：红三叶叶片50g，石油醚脱脂0.2g，40％乙醇5g，无水乙醇4g。
基于上述的用于化妆品的天然抗氧化剂，本实施例提出一种用于化妆品的天然抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：
S101：将采集到的红三叶叶片105℃杀青10min，65℃下干燥72h，粉碎，用少量石油醚脱脂4次，挥去溶剂晾干；
S102：称取2g脱脂红三叶粉末，用25倍40％乙醇50℃超声辅助提取30min，过滤收集上清液；
S103：样品残渣再加20倍溶剂提取30min，合并两次提取液；
S104：将提取液在45℃下用真空旋转仪浓缩，至八分之一体积时，向浓缩液中边搅拌边缓缓加入4倍体积无水乙醇，使溶液乙醇浓度达到80％，放入4℃冰箱静置过夜，4800rpm离心10min，离心后褐色沉淀为粗多糖部分，上清为异黄酮部分；
S105：将沉淀部分用无水乙醇反复洗涤3次，洗去醇溶性杂质，最后用乙醇洗出沉淀倒入培养皿，待溶剂挥发，得到褐色红三叶粗多糖45.2mg，提取率2.26％，上清液减压浓缩，得到红三叶粗异黄酮320.62mg，提取率16.3％。
实施例2
红三叶粗异黄酮样品中含有单糖、寡糖、无机盐，需要进一步精制。
红三叶粗异黄酮精制包括如下步骤：
AB-8大孔吸附树脂预处理：将树脂用95％乙醇浸泡24h，过滤，用去离子水反复冲洗至无醇味，且冲洗液无白色浑浊，再用5％NaOH浸泡24h，过滤，用去离子水反复冲洗树脂至pH呈现中性，再用5％HCl溶液浸泡24h，过滤冲洗树脂至中性，60℃烘干备用；
精制：将经过预处理的树脂用蒸馏水浸泡48h以上，湿法装柱，树脂高度在13cm，将粗异黄酮10g用水溶解，上完样等待吸附2h后，分别用蒸馏水、30％、50％乙醇各洗脱1BV，然后用70％乙醇洗脱2BV，最后用100％乙醇洗脱1BV，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩，得精制异黄酮1.73g，异黄酮含量为42％。
实施例3
红三叶粗多糖样品含有的蛋白质、单糖、寡糖、无机盐，需要进一步精制。
红三叶粗多糖精制包括如下步骤：
除蛋白：将红三叶粗多糖用蒸馏水配置成2mg/mL溶液，加入1/4体积的sevage溶液(正丁醇：氯仿为1：4)，振荡20min，转移至分液漏斗静置20min，放掉下层溶液和中层的蛋白质，如此操作反复3次至下层有机溶剂中不再出现蛋白质；
透析：将去除蛋白质的多糖溶液，低温减压浓缩后，装入预处理的透析袋(规格MD34，截留分子量为3500Da)，放入大容量烧杯中，加满蒸馏水静置透析，每8h换一次水，透析24h。用1％AgNO3检查NaCl、KCl等残留情况；
取94.6g红三叶粉末，按实施例1提取，用实施例4方法除蛋白，透析，最终得到纯化的多糖0.83g，提取率为0.877％。
实施例4
DPPH·属于人工合成的一类稳定性自由基，在可见光区有特征吸收，测定方法简便，快速且重现性良好。
将实施例1-3所制备的黄酮类和黄酮与多糖混合样品均由70％乙醇配制，多糖样品、阳性对照维生素C(Vc)和维生素E(Ve)用蒸馏水配制，将每个待测物质配制1.280mg/mL的原液，再稀释到7个浓度梯度待用。
在96孔酶标板上精确加入各浓度待测液75μL，再加入0.1mM DPPH 70％乙醇溶液150μL，每个浓度的反应孔都设置空白对照，空白对照为75μL待测液和150μL 70％乙醇，反应总体积为225μL，充分摇匀，在黑暗中室温放置30min后，测定波长为519nm处的吸光值。吸光度的下降表示自由基清除活性的增加。每个样品每个浓度进行3次重复。
清除率＝[A0-(A1-A2)]/A0
A0为DPPH溶液加浓度为零待测液的吸光值，A 1为待测液与DPPH反应后的吸光值，A2为空白对照，即各待测液与空白溶剂的吸光值。
表1 DPPH抗氧化活性
Figure BDA0002320779930000061
Figure BDA0002320779930000071
注：P表示精制红三叶多糖，IF表示精制红三叶异黄酮，两者按照质量比混合。小写字母表示显著性差异(P<0.05)。
从表1可知，红三叶的精制多糖活性与精制异黄酮相当。在两者混合质量比为1：2时活性最高，显著优于每个单品。随着多糖含量的升高，DPPH活性显著下降。
实施例5
超氧阴离子抗氧化活性测定
O2-·是机体内寿命较长的一类自由基。在自由基链式反应中，O2-·作为引发剂促使其他自由基的生成，对机体造成进一步的危害，与多种疾病密切相关。因此，通常将样品清除O2-·的能力作为抗氧化物质活性的重要指标。
将实施例1-3所制备的黄酮类和黄酮与多糖混合样品均由70％乙醇配制，多糖样品、阳性对照维生素C(Vc)和维生素E(Ve)用蒸馏水配制，将每个待测物质配制1.280mg/mL的原液，再稀释到7个浓度梯度待用。
用PMS-NADH-NBT体系法测定清除超氧阴离子(O2-·)活性，其原理是，以还原型辅酶Ⅰ(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH)还原吩嗪硫酸甲酯(PMS)产生超氧阴离子，O2-·和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)反应生成蓝色产物，在560nm有强吸收峰，当抗氧化物质加入到PMS-NADH-NBT体系后，抑制了O2-·与NBT反应，通过测定吸光度可以计算出抗氧化物质的清除自由基能力。在96孔酶标板上依次加入30μL NBT(144μmol/L)，100μL待测液(2.50-125.0μg/mL，用溶剂代替样液为空白)，30μL NADH(0.68mmol/L，用磷酸缓冲液配制)，30μL新配制的PMS(60μmol/L)30μL pH 7.4磷酸缓冲液。空白管为120μL缓冲液和100μL待测液，振荡30s，5min后测定溶液在560nm处的吸光值。
表2超氧阴离子抗氧化活性
Figure BDA0002320779930000081
注：P表示精制红三叶多糖，IF表示精制红三叶异黄酮，两者按照质量比混合。小写字母表示显著性差异(P<0.05)。
从表2可知，红三叶的异黄酮的活性与Vc、Ve相当，而红三叶多糖活性显著高于Vc和Ve，特别是精制多糖活性高于阳性对照100多倍。3种复配物活性与精制多糖相当，随着多糖含量的提高，活性略有增强。
实施例6
利用判断两类组分抗氧化活性之间的关系方法—联合指数(CI,combinationindex)对红三叶异黄酮和多糖的联合抗氧化作用的效果进行评价。我们这里采用Talady和Chou的中效原理联合作用指数CI。
CI＝D1/DX1+D2/DX2
D1和D2是黄酮和多糖联合作用抑制率为50％时的作用浓度。Dx1和Dx2是黄酮和多糖单独作用时的作用抑制率为50％时的作用浓度。
根据Talady和Chou的理论，如果CI＝1，表明药物1和药物2是联合作用效果是具有叠加作用的；若CI>1时，表明药物1和药物2联合作用效果是具有拮抗作用的；若CI<1，表明药物1和药物2联合作用是具有协同作用的。
表3联合抗氧化作用指数CI
Figure BDA0002320779930000091
注：小写字母表示显著性差异(P<0.05)。
由表3可知，多糖与异黄酮两者混合质量比为1：2时两种成分是相互协同，其中对于超氧阴离子的协同作用更强。但是随着多糖含量增加，对于DPPH活性，两种成分出现一定程度的拮抗作用。
实施例7
水溶性测定方法：准确称取各测定样品，每份5.0mg，在25℃室温环境下，在加有1mL蒸馏水的透明离心管中，依次加入5.0mg，直至出现沉淀。重复操作若加入后不能完全溶解时停止添加，可以用涡旋振荡器加速溶解，然后记录1mL蒸馏水中各样品添加量，观察估算未溶解部分的质量，得出1mL蒸馏水中的实际溶解量。
表4不同制备成分在水中的溶解范围
Figure BDA0002320779930000092
由表4可知，多糖在水中的溶解性强于异黄酮，精制后的样品溶解度均会提高。特别是精制红三叶多糖(大于25g/L)，其溶解性是精制异黄酮和粗多糖的5倍。
本发明以红三叶为原料，所制备的不同类型天然抗氧化成分其功能和适用范围均有所差别，这为多方面和多用途在化妆品研发和生产中应用提供条件，市场前景广阔。其中，精制红三叶多糖具有活性高、水溶性好的优点，首先被考虑采用。其次，如果需要制备脂溶性组分，可以考虑采用粗红三叶多糖或红三叶异黄酮。两类成分在活性方面有不同侧重，粗红三叶多糖对超氧阴离子抗氧化活性高，而异黄酮的DPPH活性更好一些。再次，如果考虑到成本，综合活性和溶解度等因素，可以采用两者成分进行复配方案，特别是多糖与异黄酮质量比在1：2时，两种成分之间协同效果最好，活性最高。
此外，红三叶本身是一种优良牧草，其异黄酮也作为保健品畅销海内外，所以利用该植物制备的化妆品不仅绿色环保，对人体非常安全，而且资源丰富。
综上所述：本发明的红三叶是豆科多年生牧草，在全球范围内广泛种植，资源丰富。据报道，该植物中富含异黄酮类化合物，具有较好的抗氧化能力。然而，本发明从该植物提取制备的抗氧化成分活性优于异黄酮成分，且水溶性更好，适应范围更广，具有非常好的开发应用前景。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种用于化妆品的天然抗氧化剂，其特征在于，主要组分为红三叶提取物的萃取物，成分为精制多糖和精制异黄酮的复配物，精制多糖和精制异黄酮的复配物质量比1：10-15：1配制。
2.一种如权利要求1所述的用于化妆品的天然抗氧化剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：红三叶提取物的制备
将采集到的红三叶叶片105℃杀青2-60min，65℃下干燥1-160h，粉碎，用少量石油醚脱脂1-10次，挥去溶剂晾干，称取一定质量脱脂红三叶粉末，用10-50倍10-100％乙醇30-70℃超声辅助提取10-90min，过滤收集上清液，样品残渣再加5-120倍溶剂提取10-90min，合并两次提取液；
S2：粗多糖和粗异黄酮的制备
粗多糖：将提取液在15-90℃下用真空旋转仪浓缩，至八分之一体积时，向浓缩液中边搅拌边缓缓加入2-20倍体积无水乙醇，放入4℃冰箱静置过夜，4800rpm离心2-20min，离心后褐色沉淀为粗多糖部分，沉淀部分用无水乙醇反复洗涤1-10次，洗去醇溶性杂质，最后用乙醇洗出沉淀倒入培养皿，待溶剂挥发，得到褐色红三叶粗多糖；
上清为异黄酮部分，并对上清液减压浓缩，得到红三叶粗异黄酮；
S3：红三叶异黄酮的精制
将经过预处理的树脂用蒸馏水浸泡10-90h以上，湿法装柱树脂高度在3-50cm，将粗异黄酮1-30g用水溶解，上完样等待吸附0.5-24h后，分别用蒸馏水、30％、50％乙醇各洗脱1-5BV，然后用70％乙醇洗脱1-5BV，最后用100％乙醇洗脱1-10BV，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩，得精制异黄酮；
S4：红三叶多糖的精制
除蛋白：将红三叶粗多糖用蒸馏水配置成1-10mg/mL溶液，加入1/4体积的sevage溶液，振荡1-30min，转移至分液漏斗静置1-120min，放掉下层溶液和中层的蛋白质，如此操作反复1-6次至下层有机溶剂中不再出现蛋白质；
透析：将去除蛋白质的多糖溶液，低温减压浓缩后，装入预处理的透析袋，放入大容量烧杯中，加满蒸馏水静置透析，每1-16h换一次水，透析1-72h，用1％的AgNO3检查NaCl、KCl等残留情况，最终得到纯化的多糖。
3.如权利要求2所述的用于化妆品的天然抗氧化剂的制备方法，其特征在于，针对步骤S3中，树脂预处理：将树脂用20-100％乙醇浸泡1-72h，过滤，用去离子水反复冲洗至无醇味，且冲洗液无白色浑浊，再用1-30％NaOH浸泡1-72h，过滤，用去离子水反复冲洗树脂至pH呈现中性，再用1-30％HCl溶液浸泡1-72h，过滤冲洗树脂至中性，20-90℃烘干备用。
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