CN112970092A - 高速调制样本成像设备和方法 - Google Patents

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亚历山大·洛博达
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Abstract

本公开涉及用于高速调制样本成像的***和方法。本文公开了用于进行成像质量细胞计数的***和方法，包括通过元素(例如原子)质谱分析标记原子。各方面包括具有飞秒(fs)激光器和/或激光扫描的采样***和使用飞秒(fs)激光器和/或激光扫描的方法。可替代地或附加地，各方面包括用于将其他成像模式与成像质量细胞计数共配准的***和方法。

Description

高速调制样本成像设备和方法
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求于2018年9月10日提交的美国临时专利申请号62/729,241以及于2019年4月2日提交的美国临时专利申请号62/828,251的优先权，其全部内容出于所有目的通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及在激光消融之后使用成像质谱法(IMS)对样本进行成像，以及通过成像质量细胞计数(IMCTM)对生物样本进行成像。
背景技术
LA-ICP-MS(IMS的一种形式，其中样本通过激光进行消融，然后在电感耦合等离子体中将消融的材料电离，然后通过质谱检测离子)已用于各种物质的分析，诸如作为地质样本的矿物分析、考古样本的分析和生物物质的成像[i]。
以前已经报道过通过IMC对生物样本进行成像，可以在细胞分辨率下进行成像[ii、iii、iv]。最近还报道了亚细胞分辨率下的详细成像[v]。
这些由IMS和IMC产生图像的方法的特征在于支撑样本的载物台的移动，以使激光辐射能够消融样本的不同位置以产生像素。然而，对样本台移动的依赖导致相对低的像素采集速率，因此就可以在单位时间内研究的样本面积而言，产出量相对低。存在能够在X和Y轴上移动的快速载物台，最大速度在100mm/s范围内。然而，由于载物台惯性，这些载物台仍然具有缺点，这意味着在成像方法中花费时间使载物台加速到其最大速度。载物台惯性还意味着载物台移动不能用于快速创建任意扫描图案。
本发明的方面的目的是提供进一步的和改进的用于样本成像的设备和技术。
发明内容
本文公开了用于进行成像质量细胞计数的***和方法，包括通过元素(例如原子)质谱而标记原子的分析。方面包括具有使用飞秒(fs)激光和/或激光扫描的采样***及其方法。可替代地或附加地，方面包括用于将其他成像模式与成像质量细胞计数共配准的***和方法。
在某些实施例中，本文公开的分析仪设备包含两个用于执行成像元素质谱分析的广泛表征的***。
第一个是采样和电离***。该***包含样本室，该样本室是在对样本进行分析时放置样本的组件。样本室包含载物台，其保持样本(通常将样本放在样本载体上，诸如显微镜载玻片，例如组织切片、单层细胞或单个细胞，诸如细胞涂片，其中细胞悬液已被滴到显微镜载玻片上，并将载玻片放置在载物台上)。采样和电离***用于从样本室中的样本中去除材料(去除的材料在本文中称为样本材料)，然后将其转换成离子，或者作为导致从样本中去除材料的过程的一部分，或者经由采样***下游的单独电离***。为了产生元素离子，使用了硬电离技术。
然后，通过第二个***(即检测器***)对电离的材料进行分析。检测器***可以采用不同的形式，这取决于所确定的电离样本材料的特定特性，例如，基于质谱的分析仪设备中的质量检测器。
本发明的一个方面通过在采样和电离***中应用激光扫描***来提供对当前IMS和IMC设备和方法的改进。激光扫描***将激光辐射引导到要消融的样本上。由于激光扫描仪因其惯性低得多或没有惯性而移动速度比样本台更快(即具有更快的响应时间)，因此可以更快地在样本上进行离散斑点的消融，从而使每单位时间被消融的面积显著增大，而不会损失分辨率。此外，激光辐射所导向的斑点的快速变化允许消融随机图案，例如，使得通过快速连续的激光辐射的脉冲/发射的群来消融形状不均匀的整个细胞，使用激光扫描仪***将激光辐射的脉冲/发射的群对准样本上的位置，然后将样本电离并检测为单一的材料云，从而实现单细胞分析。这些位置通常是相邻位置，或彼此靠近。在使用解吸以从样本载体中去除样本材料的方法中，也可以采用类似的快速群技术，即细胞LIFTing(激光诱导前向转移)。作为连续事件一起分析样本的羽状物的相邻位置，可以来自单个受关注特征(诸如特定细胞)内。
因此，在操作中，将样本放入设备中，使用激光扫描***采样以产生电离的材料(采样可能会产生气态/特殊材料，该材料随后被电离***电离)，并且样本材料中的离子被传递到检测器***。尽管检测器***可以检测许多离子，但其中大多数将是自然构成样本的原子离子。在某些应用中，例如在地质或考古应用中进行矿物分析，这可能就足够了。
在一些情况下，例如在分析生物样本时，样本的天然元素组成可能无法提供适当的信息。这是因为通常所有蛋白质和核酸都由相同的主要组成原子组成，因此尽管可以从不含蛋白质或核酸物质的区域中分辨出包含此类蛋白质/核酸的区域，但是无法将特定蛋白质与所有其他蛋白质区分开。然而，通过在正常条件下用不存在于被分析材料中的原子或至少不大量存在的原子(例如某些过渡金属原子，诸如稀土金属；有关更多详细信息，请参见下面的标记部分)来标记样本，可以确定样本的特定特性。与IHC和FISH一样，可检测的标记可以附着到样本上或样本中的特定靶标上(诸如载玻片上的固定细胞或组织样本)，特别是通过使用特定结合伙伴(SBP)(诸如抗体、核酸或凝集素)来靶向样本上或样本中的分子。为了检测电离的标记，使用了检测器***，因为它将检测来自样本中自然存在的原子的离子。通过将检测到的信号链接到产生这些信号的样本采样的已知位置，可以产生存在于每个位置的原子的图像，包括天然元素组成和任何标记原子(例如，参见参考文献2、3、4、5)。在检测之前样本的天然元素组成被耗尽的方面，图像可能仅具有标记原子。该技术允许并行分析许多标记(也称为多路复用)，这在生物样本分析中具有很大优点，由于在本文中公开的设备和方法中应用了激光扫描***，因此具有提高的速度。
因此，本发明的各方面提供了用于分析诸如生物样本的样本的设备，该设备包含：
(i)采样和电离***，用于从样本中移除材料并使材料电离以形成元素离子，该***包含激光源、激光扫描***和样本台；
(ii)检测器，从采样和电离***接收元素离子并检测元素离子。
在一些实施例中，采样和电离***包含采样***和电离***，其中，采样***包含激光源、激光扫描***和样本台，并且其中该电离***适于接收由采样***从样本中移除的材料，并且电离该材料以形成元素离子。
激光扫描***通过使用一个或多个***(例如，两个***)在不平行并且在一些实施例中是正交的一个或多个轴(例如，Y轴和X轴)上相对于样本台，赋予由激光源发射的激光束方向的相对移动。如下所述，***可以采用基于镜的***(诸如检流计镜、多边形扫描仪、MEMS镜、压电器件镜)和/或固态***(诸如AOD或EOD)的形式。样本台也可以移动，以便在样本台上产生样本相对于激光辐射束的相对移动。样本台通常可以在x和y轴上移动样本，也可以在z轴上移动样本，其移动可以通过控制器模块与激光扫描***中***的移动进行协调。例如，载物台可以沿第一方向移动样本，并且该位置可以沿第二(即，不平行的，诸如基本上正交的)方向将相对移动引入到激光束中。如上所述，已经以亚细胞分辨率实现了IMS和IMC，并且可以以这样的分辨率使用激光扫描***。因此，可以以直径小于10μm、小于5μm、小于2μm、约1μm或小于1μm的斑点尺寸进行消融。例如，可以通过使用ICP、激光解吸/电离(LDI)和/或通过激光产生等离子体，以及通过使用TOF质谱仪进行检测，来实现样本材料的电离以产生元素离子。
在某些方面，***可以***作以扫描诸如单个细胞或单个细胞的一部分(诸如细胞核、细胞质、细胞膜或细胞器)的特征。可以在单个消融羽状物中获取特征。特征可能没有规则的边界(例如，可能不是正方形或圆形)。例如，组织中的许多细胞不符合规则的形状。由此，光学检查方法可以识别要通过激光扫描和通过ICP-MS分析而获取的特征。在某些方面，样本中质量标签分布的初始采样可以告知受关注区域，然后使用光学检查(例如光学显微术)来识别特征(诸如细胞)，以通过与ICP-MS耦合的激光扫描进行采集。
激光扫描***还启用了操作IMS/IMC设备的新模式，涉及更复杂的采样方法。这些模式中的许多模式允许使用激光脉冲的群消融受关注区域/特征，诸如其中将在受关注区域/特征内的多个已知位置发射激光脉冲的群而产生的羽状物，可以作为连续事件进行分析。因此，如下所述，在一些实施例中，该设备包括相机，以帮助定位包含受关注区域/特征的位置。
因此，本发明的方面提供了一种分析样本的方法，该方法包含：
(i)在样本台上进行样本的激光消融，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本上，并且其中在多个已知位置进行消融以形成多个羽状物；以及
(ii)对羽状物进行电离和质谱分析，从而检测羽状物中的原子允许构建样本的图像。
本发明的方面还提供了一种对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，该方法包含：
(i)用一个或多个不同的标记原子来标记样本中的多个不同的目标分子，以提供标记的样本；
(ii)在样本台上进行样本的激光消融，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本上，并且其中在多个位置进行消融以形成多个羽状物；以及
(iii)对羽状物进行电离和质谱分析，从而检测羽状物中的原子允许构建样本的图像，可选地其中多个位置是多个已知位置。
在某些方面，例如，当从单个特征产生单个羽状物并通过质谱分析时，作为连续事件获取该特征。
有时，该方法还构建样本的图像。
本发明的方面还提供了一种分析样本的方法，该方法包含：
(i)使用激光辐射解吸样本材料块，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本台上的样本上；以及
(ii)电离样本材料块，并通过质谱法检测块中的原子。
本发明的方面提供的另一种方法是一种对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，该方法包含：
(i)用一个或多个不同的标记原子来标记样本中的多个不同的目标分子，以提供标记的样本；
(ii)使用激光辐射解吸样本材料块，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本台上的样本上；以及
(iii)电离样本材料块，并通过质谱法检测块中的原子。
一种方法可以包括配准图像的方法，该方法包括以下步骤：通过除成像质量细胞计数之外的成像方式，从组织样本的第一组织切片获得第一图像，通过成像质量细胞计数获得组织样本的第二组织切片的第二图像，并配准第一图像和第二图像。在某些方面，第一图像、或第一图像和第二图像两者都可以由第三方提供。可以通过LA-ICP-MS，可选地使用飞秒激光和/或激光扫描***，来进行成像质量细胞计数。
成像质量细胞计数的方法可包括通过光学显微镜识别样本中的特征、扫描穿过该特征的辐射以产生材料羽状物、以及将材料羽状物输送至质量分析仪。该特征可以是单细胞。样本可以包括带质量标签的SBP。该方法可以包括每秒分析超过100个单细胞。辐射可以是激光辐射。该方法可以进一步包含通过ICP使材料电离。质量分析仪可以包括TOF检测器。本文还描述了用于执行此类方法的***。
附图说明
图1是现有设备配置的光学器件的示意图。
图2是本发明各方面的示例性实施例的光学布置的示意图。
图3是本发明的各方面的另一示例性实施例的光学布置的示意图。
图4是本发明的各方面的另一示例性实施例的光学布置的示意图。
图5是本发明的各方面的另一示例性实施例的光学布置的示意图，其示出了通过引导激光辐射通过样本载体来进行采样。
图6示出了使用一致的斑点尺寸对样本成像时提供的分辨率差异。随着斑点尺寸变大，来自不同细胞的信号开始相互渗出。该图用于证明本发明的各方面所体现的一项进步的重要性，其中可以使用模式的快速任意扫描，以消融单个细胞或通过LIFTing解吸整个细胞，来从单个细胞中获取信号。
图7示出了使用包含至少一个本文所述的***的激光扫描***将载物台的移动与光束的相对移动相结合的激光路径。激光扫描仪***移动允许某些细胞消融，这是通过当载物台在X轴上移动时通过在Y轴上扫描来引导激光辐射束(包括通过扫描***对载物台在X轴上的移动进行校正)。仅当存在希望由设备的使用者消融的细胞时，扫描仪才将光束从载物台的路径偏转。
图8示出了可替代的扫描操作模式，由此扫描仪***以使得激光束能够在大区域上定向的方式进行移动。仅当激光扫描仪***处于将激光束的焦点对准要消融的受关注区域(例如特定细胞)的方向时，才向样本发射激光脉冲。
图9a和图9b描绘了激光扫描仪***在非谐振(图8a)和谐振(图8b)轨迹中的路径移动。
图10是本发明的各方面的方法的模拟图示，该方法用于从样本载体上的样本中解吸材料块，该材料块包含单个细胞。在该方法中，在图像(A)中受关注位置处识别出受关注细胞。在图像(B)中，通过消融清除受关注细胞周围的区域，这不仅去除了受关注细胞附近的细胞物质，还将去除样本载体上存在的所有解吸膜。如本文所公开的，可以使用激光扫描仪***快速清除围绕受关注细胞的各种消融斑点，因为激光扫描仪***允许将激光辐射束快速偏转到任意位置，从而能够消融追踪细胞的细胞膜的位置的复杂图案，而不会从样本载体上解吸受关注细胞本身。图像(C)中显示了具有清除区域的受关注细胞。清除后，使用一系列导向样本的激光辐射斑点从样本中解吸受关注细胞。在该图像中所示的示例性方法中，将激光导向到用于向内传递螺旋状辐射图案的激光辐射脉冲的输送位置，以从样本载体(D)中释放出样本材料块。激光辐射的脉冲可以直接或通过样本载体(以图5所示的操作模式)直接作用于样本。
图11是激光消融质量细胞计数的示例性示意图，其包括激光消融源，该激光消融源可以连接到进样器(诸如管)，并安装用于将样本输送到电感耦合等离子体(ICP)源(也称为ICP炬)中。ICP炬的等离子体可以蒸发并电离样本，以形成离子，这些离子可以由质量分析仪(诸如飞行时间或扇形磁质谱仪)接收。
图12是可以集成到本文所述***的高NA光学器件的示意图。
图13是明尼苏达大学生物科学学院(University of Minnesota College ofBiological Sciences)在线发布的胶原组织的二次谐波发生(SHG)图像。
图14显示了乳腺癌组织的非线性显微镜图像。
图15示出了根据本发明的实施例的集成了非线性显微镜的***。
具体实施方式
因此，可以在实践本公开中使用包含激光扫描仪***的各种类型的分析仪设备，下面将详细讨论其中的多种。
基于质量检测的分析仪设备
1.采样和电离***
a.激光消融采样和电离***
基于激光消融的分析仪通常包含三个组件。第一个是激光消融采样***，用于从待分析样本中产生气态和颗粒状物质的羽状物。在被检测器***–质谱仪组件(MS组件；第三个组件)检测到被消融的样本材料的羽状物中的原子(包括如下所述的任何可检测的标记原子)之前，必须将样本电离(并雾化)。因此，该设备包含第二个组件，该组件是一个电离***，可将原子电离形成元素离子，从而使它们能够根据质荷比被MS组件检测(样本材料的某些电离可能发生在消融点，但是空间电荷效应会导致电荷几乎立即中和)。激光消融采样***通过输送导管连接到电离***。
激光消融采样***
简而言之，激光消融采样***的组件包括激光源，该激光源发射被引导到样本上的激光辐射束。将样本放置在激光消融采样***的腔室(样本室)内的一个载物台上。该载物台通常是平移载物台，因此样本可以相对于激光辐射束移动，从而可以对样本上的不同位置进行采样以进行分析(例如，由于在激光束中的相对移动，彼此之间的距离远比可以消融的位置更易被本文所述的激光扫描***诱导)。如以下更详细讨论的那样，气体流过样本室，并且气流带走了激光源消融样本时产生的雾化材料羽状物，用于基于其元素的组成(包括标记原子，诸如来自元素标签的标记原子)分析和构建图像。如下面进一步解释的，在一种可替代的作用方式中，激光消融采样***的激光***也可以用于从样本中解吸材料。
特别是对于生物样本(细胞、组织切片等)，样本通常是异质的(尽管异质样本在本公开的其他应用领域中是已知的，即非生物性质的样本)。异质样本是包含由不同材料组成的区域的样本，因此在给定的波长下，样本的某些区域可以以比其他区域更低的阈值能量密度进行消融。影响消融阈值的因素是材料的吸收系数和材料的机械强度。对于生物组织，吸光度系数将起主要作用，因为它会随激光辐射波长变化几个数量级。例如，在生物样本中，当使用纳秒激光脉冲时，含有蛋白质物质的区域将在200-230nm波长范围内更容易吸收，而主要包含DNA的区域将在260-280nm波长范围内更容易吸收。
可以以接近样本材料的消融阈值的能量密度进行激光消融。以这种方式消融通常可以改善气溶胶的形成，进而有助于改善分析后的数据质量。通常为了获得最小的坑(crater)，以使所得图像的分辨率最大化，采用了高斯光束。高斯光束的横截面记录了具有高斯分布的能量密度曲线。在这种情况下，光束的能量密度会随着距中心的距离而变化。结果，消融斑点尺寸的直径是两个参数的函数：(i)高斯光束腰(1/e2)，以及(ii)施加的能量密度和阈值能量密度之间的比率。
因此，为了确保用每个消融激光脉冲一致地去除可再现量的材料，从而最大程度地提高成像数据的质量，保持一致的消融直径是有用的，这又意味着调节激光脉冲对目标提供的能量与被消融材料的消融阈值能量的比率。当消融异质样本时，其中阈值消融能量在整个样本中变化，诸如DNA和蛋白质材料的比率变化的生物组织，或在地质样本中，其随样本区域中的特定矿物组成而变化，此要求代表了一个问题。为了解决这个问题，可以将一个以上波长的激光辐射聚焦到样本上的相同消融位置上，以基于该位置处的样本组成更有效地消融样本。
激光消融采样***的激光***
可以将激光***设置为产生单个或多个(即两个以上)波长的激光辐射。通常，所讨论的激光辐射的波长是指具有最高强度的波长(“峰值”波长)。如果***产生不同的波长，则它们可用于不同的目的，例如，靶向样本中的不同材料(此处的靶向是指所选波长是被材料良好吸收的波长)。
在使用多个波长的情况下，激光辐射的两个以上波长中的至少两个可以是离散波长。因此，当第一激光源发射出与第二辐射波长离散的第一辐射波长时，这意味着第一激光源不会在第一波长的脉冲中产生第二波长的辐射，或仅产生非常低水平的第二波长的辐射，例如，小于第一波长处的强度的10％，诸如小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。通常，当通过谐波产生或其他非线性频率转换过程产生不同波长的激光辐射时，则当在本文中提及特定波长时，本领域技术人员将理解，关于在激光产生的光谱中的特定波长将存在一定程度的变化。例如，对X nm的参考包括产生在X±10nm范围内(诸如X±5nm，例如X±3nm)的光谱的激光。
激光扫描***
本发明通过在采样和电离***中应用激光扫描***来提供对当前IMS和IMC设备和方法的改进。激光扫描***将激光辐射引导到要消融的样本上。与相对于固定激光束移动样本台相比，激光扫描仪能够更快地重新指向样本上的激光聚焦位置(由于扫描***的操作组件惯性低得多或没有惯性)，因此样本上离散斑点的消融能够更快地进行。这种更快的速度可以使更大的面积被消融并记录为单个像素，或激光斑点移动的速度可以简单地被转化为例如像素获取率的增加、或两者的结合。此外，激光辐射的脉冲所指向的斑点位置的快速变化允许消融随机图案，例如，使得通过快速连续的激光辐射的脉冲/发射的猝发来消融形状不均匀的整个细胞，使用激光扫描仪***将激光辐射的脉冲/发射的猝发对准样本上的位置，然后将样本电离并检测为单一的材料云，从而实现单细胞分析(参见从第28页起“激光消融采样***的样本室”部分)。在使用解吸以从样本载体中去除样本材料的方法中，也可以采用类似的快速猝发技术，即细胞LIFTing(激光诱导前向转移)，如从第55页起有关设备和方法的详细讨论。
在现有的成像质量细胞计数***中，可以移动载物台以允许消融不同的像素(消融斑点)。使用本文所述的***的激光扫描(可选地与样本台的平移一起)可允许获取任意形状和大小的像素，诸如快速获取特征或特征的一部分。可以将像素检测为由瞬时消融羽状物提供的连续信号。
因此，本发明的各方面提供了一种用于分析诸如生物样本的样本的设备，该设备包含：
(i)采样和电离***，用于从样本中去除材料并使该材料电离以形成元素离子，该***包含激光扫描***和样本台；
(ii)检测器，从采样和电离***接收元素离子并检测该元素离子。
与其他用于增加样本成像速率的策略相比，使用扫描***提高采集速率具有许多优势。例如，可以使用适当适配的设备通过单个激光脉冲消融100μm×100μm的区域。然而，此类消融导致许多问题。用单个激光脉冲一次消融大面积的样本会导致消融的材料破碎成大块，最初以接近声速的速度飞散，而不是小颗粒，也不是使材料迅速远离载气流中的样本(下面将更详细描述)，大块可能比小块花费更长的时间被夹带(延长样本室的冲洗时间)、无法被夹带或只是随机飞离样本或样本的另一部分。如果大块物质飞离样本，则该块物质中任何可检测原子(诸如标记原子)形式的信息都会丢失。如果大块材料落在样本的另一部分上，则信息将从消融区域中丢失，此外，大块材料中的任何可检测到的原子现在都依赖并可能干扰将从另一部分样本中获取的信号。由于消融斑点中生物材料的差异(例如，软骨材料与肌肉之间的差异)也会影响产品的分解方式，因此较大的消融斑点尺寸也会使样本的分离更加复杂，某些材料会夹带在气流中的程度要比其他的低。此外，如此处所述，在许多应用中，更优选小的斑点尺寸，为微米级，而不是微米的几百倍，并且在激光斑点尺寸之间切换多个数量级(例如100μm与1μm)也会带来技术挑战。例如，能够消融斑点尺寸为1μm的激光，可能没有能量在单个激光脉冲中消融斑点尺寸为100μm的区域，因此需要复杂的光学器件以促进1μm和100μm之间的过渡，激光束能量没有显著损失，消融斑点的锐度也没有损失。
因此，除了消融100μm2的单个斑点外，还可以使用100×100(即10000)个直径为1μm的斑点对整个区域进行栅格化，以消融该区域。当然，较小的消融斑点尺寸不会在很大程度上受到上述问题的困扰——较小的消融斑点所产生的颗粒本身就必须小得多。此外，通过较小的斑点，因消融而产生的最终的较小的颗粒具有更短且更确定的从样本室冲洗的时间。希望分别解决每个较小的斑点时，这又会导致以下结果：可以更快地获取数据，因为来自每个消融激光脉冲的瞬变在检测器中检测时不会重叠(或重叠到可接受的程度，如下所述)。
然而，如上所述，由于惯性的原因，将样本台以1μm的增量沿一行移动，然后向下一行移动相对较慢。因此，通过使用激光扫描仪***在整个区域上光栅化，在不移动样本台或不频繁或以恒定速度移动样本台的情况下，样本台的相对较慢的速度不会限制样本可以被消融的速率。
因此，为了能够进行快速扫描，激光扫描***必须能够快速切换将激光辐射引导到样本上的位置。切换激光辐射的消融位置所花费的时间被称为激光扫描***的响应时间。因此，在本发明的各方面的一些实施例中，激光采样***的响应时间快于1ms、快于500μs、快于250μs、快于100μs、快于50μs、快于10μs、快于5μs、快于1μs、快于500ns、快于250ns、快于100ns、快于50ns、快于10ns或约1ns。
激光扫描***可以沿相对于样本台的至少一个方向引导激光束，样本在消融期间位于该样本台上。在一些情况下，激光扫描***可以在相对于样本台的两个方向上引导激光辐射。例如，样本台可以用于在X轴上逐渐移动样本，并且激光可以在Y轴上扫过样本(有关相对移动的说明，参见图7至图9)。当使用1μm的斑点尺寸时，X轴上的移动可能以1μm为增量。在X轴上的给定位置，可以使用激光扫描***将激光引导到Y轴上相距1μm的一系列位置。因为激光扫描***可以将激光辐射引导到Y轴上不同位置的速率，比载物台可以在X轴上增量移动的速度快得多，所以在此对扫描仪的简单操作说明中，可以显著提高消融速率。
在某些方面，激光扫描***可以被配置为仅在一个方向上扫描。例如，激光扫描***可以仅具有一个***，该***仅能够在一个方向上进行扫描。在这种情况下，可以移动样本台以提供在不平行于激光束方向的不同方向上的移动。
在某些方面，在激光束由激光扫描***引导的同时，可以通过样本台的移动来增加扫描区域(例如，受关注区域)。在没有样本台移动的情况下，激光束扫描的区域可能会受到光束通过的窗口大小的限制，诸如，激光消融细胞顶部的窗口和/或激光消融细胞(室)内的进样管的一部分的窗口，激光消融细胞(室)位于用于吸收被辐照的样本。可替代地或附加地，在没有样本台移动的情况下，由激光束覆盖的区域可能受到需要将受激光束影响的样本部分定位在气溶胶吸收***(例如进样器管)附近的限制，该气溶胶吸收***将样本(例如，被激光束消融、解吸或提起的样本)输送到电离***和/或质量检测器。由此，在激光扫描过程中平台的移动可能会增加连续扫描的面积。在某些方面，扫描多个受关注区域。
在某些情况下，激光扫描***引导激光束在X和Y轴上。因此，在这种情况下，可以产生更高级的消融图案。例如，当激光扫描***可以引导激光辐射在X轴和Y轴上时，样本台可以在X轴上以恒定速度移动(从而消除了与跨每一行移动期间样本台惯性相关的效率低下的情况，除了在行的开始/结束处的加速/减速之外)，而激光扫描***则将激光辐射脉冲在样本的各列上上下引导，同时补偿样本台的移动。为了实现这一移动，可以在X方向上将三角波控制信号施加到扫描仪，而在Y方向上施加锯齿信号。可替代地，如本领域技术人员将理解的，取决于所使用的处理算法，可能期望在Y方向上将锯齿形驱动信号施加到扫描仪。作为另一种选择，可以稍微旋转一个扫描仪组件，以预补偿倾斜的扫描图案。在一些实施例中，当样本台移动时，激光扫描***的控制器将使激光扫描仪***以数字8图案移动光束。
如果激光采样***中使用的激光具有足够高的重复率(如下所述)，则将激光辐射显著更快地(重新)定向到样本上的不同位置，从而可以更快地消融大面积的样本。例如，如果每秒只能将少于5个脉冲定向到样本上的不同位置，则在1μm的斑点尺寸下研究消融1mm×1mm区域所需的时间将超过两天。如果速率为200Hz，则大约为80分钟，分析时间进一步减少，脉冲频率进一步提高。然而样本通常大得多。可以放置组织切片的平均显微镜载玻片为25×75mm。以200Hz的频率消融将花费约需要110天。然而，如果使用激光扫描***，则可以大大缩短时间，例如，样本台以恒定速度(1mm/s)沿X轴移动，而激光束则随激光扫描***在Y轴方向上前后移动。激光扫描***可以以与载物台移动速度匹配的速率(在这种情况下为500Hz)扫描激光焦点的位置。以这种速度，将在光栅图案中的相邻线之间产生1μm的间距。然后，根据最大激光重复率，选择匹配的激光扫描***对激光辐射的偏转程度。在此处，将产生100微米的峰-峰振幅，将需要100kHz的激光重复速率。与当前设备的最多0.0004mm2/s相比，可使设备处理0.1mm2/s。与上面讨论的110天的数字相比，使用本段中讨论的激光扫描***，仅需要约5小时即可处理载玻片。
另一种应用是任意消融区域整形。如果使用高重复速率的激光器，则可以在一纳秒的激光发送一个脉冲的同时，发送一束紧密间隔的激光脉冲。通过在激光脉冲猝发期间快速调整消融斑点的X和Y位置，可以创建任意形状和尺寸(低至光的衍射极限)的消融坑。例如，猝发中的n和n+1个位置的距离不得大于等于激光斑点直径的10倍(基于第n个斑点和第(n+1)个斑点的消融斑点的中心)，诸如小于斑点尺寸直径的8倍、小于5倍、小于2.5倍、小于2倍、小于1.5倍、约1倍或小于1倍。在下面的方法部分，第36页中讨论了采用此技术的特定方法。
因此，在一些实施例中，激光扫描***包含***，以赋予激光器发射的激光束相对于样本台(例如，相对于样本表面的Y轴)的第一相对移动。
在一些实施例中，激光扫描***的***能够施加激光束相对于样本台的第二相对移动，其中第一相对移动和第二相对移动不平行，诸如其中相对移动是正交的(例如，第一移动方向在相对于样本表面的Y轴上，第二移动方向在相对于样本表面的X轴上)。
在一些实施例中，激光扫描***还包含第二***，该第二***能够施加激光束相对于样本台的第二相对移动，其中第一相对移动和第二相对移动不平行，诸如其中相对移动是正交的(例如，第一移动方向在相对于样本表面的Y轴上，第二移动方向在相对于样本表面的X轴上)。
激光扫描***组件
可以将激光辐射快速引导到样本上不同位置的任何组件都可以用作激光扫描***中的***。下面讨论的各种类型的***是可商购获得的，并且本领域技术人员可以根据要使用设备的特定应用来选择合适的***，因为每种***都具有固有的优势和局限性。在本发明的方面的一些实施例中，如下所述，可以将以下讨论的多个***组合在单个激光扫描***中。***通常可以分为依靠移动组件将相对移动引入激光束的***(例如，检流计镜、压电镜、MEMS镜、多边形扫描仪等)和不使用***(示例包括如声光器件和电光器件)。上一句话中列出的***类型可控制地将激光辐射束偏转到各种角度，从而导致消融斑点平移。激光扫描***可以包括单个***，或者可以包括***和第二***。在激光扫描***中存在两个***的“***”和“第二***”的描述中，并未限定激光辐射脉冲在其从激光源到样本的路径上撞击***的顺序。
-检流计镜***
在安装有镜的轴上的检流计电机，可用于将激光辐射偏转到样本上的不同位置。可以通过使用固定磁体和移动线圈，或者使用固定线圈和移动磁体来实现移动。固定线圈和移动磁体的布置产生更快的响应时间。通常，电机中存在传感器以感测轴和镜的位置，从而向电机的控制器提供反馈。一个检流计镜可以将激光束引导到一个轴内，因此，使用该技术，可以使用成对的检流计镜来实现X和Y轴上的光束方向。
检流计镜的一个优点是它可以实现大偏转角(比固态偏转器大得多)，因此可以使样本台更不频繁地移动。然而，由于电机和镜的移动组件具有质量，它们将受到惯性的影响，因此必须在采样方法内容纳组件加速的时间。通常，使用非谐振检流计镜。如本领域技术人员将理解的，可以使用谐振检流计镜，但是仅使用诸如激光扫描***的***的谐振组件的设备将不能具有任意(也称为随机访问)扫描图案。由于其基于镜，检流计镜偏转器会降低激光辐射束的质量并增加消融斑点的尺寸，因此本领域技术人员将再次理解为最可承受此类对光束的影响的情况。
基于检流计镜的设备可能会由于传感器噪声或跟踪误差而易于导致定位误差。因此，在一些实施例中，每个镜都与位置传感器相关联，该传感器将镜的位置反馈到检流计以细化镜的位置。在某些情况下，位置信息被中继到另一个组件，诸如串联到检流计镜的AOD或EOD，以校正镜的定位误差。
检流计镜***和组件可从各种制造商那里商购获得，诸如Thorlabs(美国新泽西州)、Laser2000(英国)、ScanLab(德国)和Cambridge Technology(美国马萨诸塞州)。
在仅包括基于检流计镜的***的实施例中，消融激光脉冲能够被引导向样本的速率可以在200Hz-1MHz、200Hz-100kHz、200Hz-50kHz、200Hz-10kHz、1kHz-1MHz、5kHz-1MHz、10kHz-1MHz、50kHz-1MHz、100kHz-1MHz、1kHz-100kHz或10kHz-100kHz之间。
因此，在本发明的格方面的一些实施例中，激光扫描仪***包括一个或多个***，该***是检流计镜，诸如检流计镜阵列。现在参考图1、图2、图3和图5讨论基于镜的激光扫描仪的设置。
图1是现有设备设置的光学器件的示意图。此处，激光源(例如脉冲激光源，可选地包含脉冲拾取器)101发出激光束，该激光束被引导通过能量控制模块102，然后是束整形光学器件103。然后，该辐射束通过光束/照明组合光学器件104，穿过聚焦光学器件和物镜105，被引导向样本。样本位于玻璃侧107上，位于样本室106中的三轴(即x、y、z)平移载物台108上。图1的设置还包含用于使用相同的聚焦光学器件和物镜105观察样本的相机111。照明源109发射可见光，该可见光通过照明/检查分离光学器件110穿过光束/照明组合光学器件104和聚焦光学器件105被引导向样本。
图2是本发明各方面的示例性实施例的光学布置的示意图。它包含与图1的设置相同的元件。激光源(例如，脉冲激光源，可选地包含脉冲拾取器)201发出激光辐射束，该激光辐射束被引导通过能量控制模块202。在激光辐射束被束整形和成像光学器件203整形和成像之前，***——诸如检流计镜(或压电镜、MEMS镜或多边形扫描仪，如下所述)的镜212——会偏转激光辐射束。在基于检流计镜的设备中的单个镜允许沿一个方向扫描激光辐射束，例如在相对于样本的Y轴的一个方向上。由镜212引入的偏转在整个光学器件中被承载，导致取决于镜的位置的样本207上的不同位置的消融。该镜由移动和触发控制器213协调。在图2的设置中，控制器213将镜与样本台208上的位置一起协调，以确定在激光辐射束消融后的样本上的特定位置。控制器213还连接到激光源以协调激光脉冲的产生(从而在镜212处于限定位置而不是在其在两个位置之间移动时由激光源产生脉冲)。然后，通过光束/照明组合光学器件204穿过聚焦光学器件和物镜205，将辐射束引导向样本。样本位于玻璃侧207上，位于样本室206中的样本台上，该样本台为三轴(即x、y、z)平移样本台208。图2的设置还包含相机211，用于使用相同的聚焦光学器件和物镜205观察样本。照明源209发射可见光，该可见光通过照明/检查分离光学器件210，通过光束/照明组合光学器件204和聚焦光学器件205被导向样本。在图5中示出了可替代的布置。此处，图5的所有组件与图2相同，除了***操作以通过样本载体消融样本。例如，当需要将额外的动能传递到被消融的样本材料中时，这种布置可能是优选的，以帮助从与消融斑点近端的区域清除材料。
图3是本发明的各方面的另一示例性实施例的光学器件布置的示意图。它包含与图2的设置相同的元素。然而，代替使用单个镜***，而是使用一对镜***将偏转引入激光辐射束中。如本文其他地方所描述的，对镜可以被布置为提供在两个正交方向(X和Y)上的扫描，这可以补偿样本在样本台上的移动。图3的其他组件对应于图2中以相应附图标记标出的组件(即，301是激光源(例如脉冲激光源，可选地包含脉冲拾取器)，如针对图2所述的201等)。
-尽管图1至图5的相机显示在样本支撑物(诸如玻璃载玻片)的同一侧，但实现透照的配置也在本申请的范围之内。例如，可平移载物台可以与样本偏移，使得样本支撑物允许透照。透照可以为某些应用提供改进的光学器件，但可以与将消融的材料传递到质量分析仪的进样器竞争。由此，本文所述的***可能不允许透照。如本文所使用的，样本支撑物可以指用于保持样本的任何载玻片和/或用于保持载玻片的样本台。尽管在一些实例中描述了玻璃载玻片，但是载玻片可以是任何合适的材料，诸如透明材料(例如玻璃、硅、石英等)。
压电镜***
类似地，安装有镜的轴上的压电致动器可以用作***，以将激光辐射偏转到样本上的不同位置。再次，作为基于具有质量的移动组件的镜***，固有地将存在惯性，因此该组件在镜的移动中具有固有的时间开销。因此，本***将被技术人员理解为在某些实施例中具有应用，其中对于激光扫描***的纳秒响应时间不是必须的。类似地，由于其基于镜，压电镜***将降低激光辐射束的质量并增加消融斑点的尺寸，因此本领域技术人员将再次理解为最适用于承受对光束的此类影响的情况。
在基于倾斜尖端镜布置的压电镜中，激光辐射在X轴和Y轴上导向样本的方向以单个组件的形式提供。
压电镜可从诸如Physik Instrumente(德国)的供应商处购得。
因此，在本发明的各方面的一些实施例中，激光扫描仪***包含压电镜，诸如压电镜阵列或倾斜尖端镜。
在仅包含基于压电镜的***(诸如压电镜阵列或倾斜尖端镜)的实施例中，消融激光脉冲能够导向样本的速率可以在200Hz-1MHz、200Hz-100kHz、200Hz-50kHz、200Hz-10kHz、1kHz-1MHz、5kHz-1MHz、10kHz-1MHz、50kHz-1MHz、100kHz-1MHz、1kHz-100kHz或10kHz-100kHz之间。
-MEMS镜***
取决于将激光辐射引导到样本上的表面的物理移动的第三种***是MEMS(微机电***)镜。该组件中的微镜可以通过静电、机电和压电效应来致动。这种类型的组件的许多优点源于它们的小尺寸，诸如重量轻、易于在设备中定位以及功耗低。然而，由于激光辐射的偏转仍然最终取决于部件在组件中的移动，因此部件将经历惯性。再次，由于MEMS镜***是基于镜的，因此它将降低激光辐射束的质量并增加消融斑点的尺寸，因此本领域技术人员将再次理解，此类扫描仪组件因此适用于可承受对激光辐射的此类影响的情况。
MEMS镜可从诸如Mirrorcle技术(美国加利福尼亚州)、Hamamatsu(日本)和Precisely Microtechnology公司(加拿大)的供应商商购获得。
因此，在本发明的各方面的一些实施例中，激光扫描仪***包含MEMS镜。
在仅包含基于MEMS镜的***的情况下，能够将消融激光脉冲引导向样本的速率可以在200Hz-1MHz、200Hz-100kHz、200Hz-50kHz、200Hz-10kHz、1kHz-1MHz、5kHz-1MHz、10kHz-1MHz、50kHz-1MHz、100kHz-1MHz、1kHz至100kHz或10kHz-100kHz之间。
-多边形扫描仪
取决于将激光辐射引导到样本上的表面的物理移动的另一种***是多边形扫描仪。在此，反射的多边形或多面镜在机械轴上旋转，并且每次多边形的平坦面经过入射光束时，都会产生角度偏转的扫描光束。多边形扫描仪是一维扫描仪，可以沿扫描线引导激光束(因此需要辅助***，以便在激光束中相对于样本引入第二次相对移动，或者需要在样本台上移动样本)。与例如基于检流计镜的扫描仪的前后运动相比，一旦到达光栅扫描的一行的末端，光束便被引回到扫描行开始处的位置。取决于应用，多边形可以是规则的或不规则的。斑点尺寸取决于面的尺寸和平坦度，以及扫描线长度/扫描角度取决于面的数量。可以实现非常高的旋转速度，从而实现高扫描速度。然而，这种***确实存在缺陷，这是由于面的制造公差和轴向摆动以及镜面可能产生的波前畸变而导致的较低的定位/反馈精度。本领域技术人员将再次理解，这种扫描仪组件因此可应用于承受对激光辐射的此类影响的情况。
多边形扫描仪例如可从精确激光扫描(Precision Laser Scanning)(美国亚利桑那州)、II-VI(美国宾夕法尼亚州)、Nidec Copal电子公司(日本)等商购获得。
在仅包含基于多边形扫描仪的***中，能够将消融激光脉冲引导向样本的速率可以在200Hz-10MHz、200Hz-1MHz、200Hz-100kHz、200Hz-50kHz、200Hz-10kHz、1kHz-10MHz、5kHz-10MHz、10kHz-10MHz、50kHz-10MHz、100kHz-10MHz、1kHz-1MHz、10kHz-1MHz、或100kHz-1MHz之间。
-光电偏转器(EOD)***
与前面提到的激光扫描仪***组件类型不同，EOD是固态组件——即它们不包含移动组件。因此，它们在偏转激光辐射时不会遇到机械惯性，因此具有非常快的响应时间，为约1ns的量级。它们也不会像机械组件那样遭受磨损。EOD由光学透明材料(例如晶体)形成，该材料的折射率随施加在其上的电场而变化，而电场又通过在介质上施加电压来控制。激光辐射的折射是由于在光束横截面上引入了相位延迟而引起的。如果折射率随电场线性变化，则该效应称为普克尔斯(Pockels)效应。如果它随场强呈二次方变化，则称为克尔(Kerr)效应。克尔效应通常比普克尔斯效应弱得多。两种典型的配置是基于光学棱镜界面处的折射的EOD和基于垂直于激光辐射的传播方向而存在的折射率梯度的折射的EOD。为了在EOD上施加电场，电极应粘结到用作介质的光学透明材料的相对两侧。粘合一组相对的电极会产生一维扫描EOD。正交于第一组电极，粘结第二组电极会产生二维(X、Y)扫描仪。
例如，EOD的偏转角度要比检流计镜小，但如果按顺序放置几个EOD，则可以增加角度，如果给定的设备需要，可以增加该角度。EOD中用于折射介质的示例性材料包括钽铌酸钾KTN(KTaxNb1-xO3)、LiTaO3、LiNbO3，BaTiO3、SrTiO3、SBN(Sr1-xBaxNb2O6)和KTiOPO4，在相同的场强下，KTN显示更大的偏转角。
EOD的角度精度很高，并且主要取决于连接到电极的驱动器的精度。此外，如上所述，EOD的响应时间非常快，甚至比以下讨论的AOD还要快(由于晶体中的(不断变化的)电场是根据材料中的光速建立的，而不是材料中的声速；参见
Figure BDA0003056152930000221
和Bechtold，2014，Physics Procedia 56:29-39中的讨论)。
因此，在本发明的一些方面，激光扫描仪***包含EOD。在一些情况下，EOD是两组电极已正交连接到折射介质的电极。
在包含基于EOD的***的实施例中，消融激光脉冲能够被引导向样本的速率可以在200Hz-100MHz、200Hz-10MHz、200Hz-1MHz、200Hz-100kHz、200Hz-50kHz、200Hz-10kHz、1kHz-100MHz、5kHz-100MHz、10kHz-100MHz、50kHz-100MHz、100kHz-100MHz、1MHz-100MHz、10-100MHz、1kHz-10MHz、10kHz-10MHz、或100kHz-10MHz之间。
-声光偏转器(AOD)***
此类***也是固态组件。组件的偏转基于声波在光学透明材料中的传播，以导致周期性变化的折射率。折射率的变化是由于声波传播通过材料而导致材料的压缩和稀疏化(即密度变化)而发生的。周期性变化的折射率像光栅一样，衍射穿过材料的激光束。
AOD是通过将换能器(通常为压电元件)粘结到声光晶体(例如TeO2)产生的。由电放大器驱动的换能器将声波引入折射介质。在相对端，通常将晶体倾斜切割，并与吸声材料配合使用，以避免将声波反射回晶体中。当波沿一个方向传播通过晶体时，这将形成一维扫描仪。通过将两个AOD连续正交放置，或通过将两个换能器粘结在正交晶体面上，可以产生二维扫描仪。
至于EOD，AOD的偏转角要比检流计镜小，但与此类基于镜的扫描仪相比，其角度精度却很高，其频率驱动晶体是数字控制的，通常可分辨为1Hz。
Figure BDA0003056152930000231
和Bechtold(2014)注意到，AOD通常不会遇到基于检流计镜的扫描仪常见的漂移、以及与模拟控制器相比的温度依赖性的问题。
用作AOD折射介质的示例性材料包括二氧化碲、熔融石英、晶体石英、蓝宝石、AMTIR、GaP、GaAs、InP、SF6、铌酸锂、PbMoO4、三硫化二砷、碲酸盐玻璃、硅酸铅、Ge55As12S33、汞(I)氯化物和铅(II)溴化物。
为了改变偏转角度，必须改变引入晶体的声音的频率，并且声波填充晶体需要花费有限的时间(取决于声波在晶体中的传播速度以及晶体的尺寸)，这意味着存在一定程度的延迟。然而，与基于移动部件的激光******相比，响应时间相对较快。
在特定情况下可以利用的AOD的另一个特性是，施加到晶体上的声功率决定了相对于零级(即非衍射)光束，有多少激光辐射被衍射了。非衍射光束通常被引向光束收集器。因此，AOD可用于有效地高速控制(或调制)偏转光束的强度和功率。
AOD的衍射效率通常是非线性的，因此，可以针对不同的输入频率绘制衍射效率与功率的关系曲线。然后，可以将每个频率的映射效率曲线记录为公式或查找表，以供随后在所公开的设备和方法中使用。
因此，在本发明的一些方面，激光扫描仪***包含AOD。
图4是本发明的各方面的另一示例性实施例的光学器件布置的示意图。它包含与图2的设置相同的元素。然而代替使用旋转镜，而是使用固态***(例如AOD或EOD)412引起偏转到激光辐射束中，而不是使用图2中基于镜的***212。如在其他地方所述，固态扫描仪可以通过将正交电极附着到EOD介质上，或者通过将两个AOD串联正交排列来在两个正交方向(X和Y)上进行扫描。图4的其他组件对应于图2中用相应附图标记标出的组件(即，401是激光源(例如脉冲激光源，可选地包含脉冲拾取器)，如针对图2所述的201等)。
在包含基于AOD的***的实施例中，消融激光脉冲能够被引导向样本的速率可以在200Hz-100MHz、200Hz-10MHz、200Hz-1MHz、200Hz-100kHz、200Hz-50kHz、200Hz-10kHz、1kHz-100MHz、5kHz-100MHz、10kHz-100MHz、50kHz-100MHz、100kHz-100MHz、1MHz-100MHz、10-100MHz、1kHz-10MHz、10kHz-10MHz、或100kHz-10MHz之间。
-***的组合
在前面的段落中，讨论了两种类型的激光扫描******：基于镜的包含移动部件的***和固态***。前者的特点是偏转角大，但由于惯性，响应时间相对较慢。相反，固态***的偏转角范围较小，但响应时间要快得多。因此，在本发明的各方面的一些实施例中，激光扫描***包括串联的基于镜的组件和固态组件。这种布置利用了两者的优点，例如，基于镜的组件提供大的范围，但可以适应基于镜的组件的惯性。参见例如Matsumoto等人，2013(Journal of Laser Micro/Nanoengineering 8:315:320)。
因此，例如可以使用固态***(即，AOD或EOD)来校正基于镜的扫描仪组件中的误差。在这种情况下，可以适当地改变与镜位置反馈到固态组件有关的位置传感器，以及由固态组件引入激光辐射束中的偏转角，以校正基于镜的扫描仪组件的位置误差。
组合***的一个实例包括检流计镜和AOD(其中AOD可以在一个或两个方向上偏转(通过使用两个串联的AOD，或将两个驱动器粘结到单个AOD的晶体的正交面))。该***可以包含两个检流计镜，以便与AOD结合产生二维扫描***(其中AOD可以实现一个或两个方向的偏转(通过串联使用两个AOD，或将两个驱动器粘结到单个AOD晶体的正交面))。在此类***中，消融激光脉冲能够被引导向样本的速率可以在200Hz-100MHz、200Hz-10MHz、200Hz-1MHz、200Hz-100kHz、200Hz-50kHz、200Hz-10kHz、1kHz-100MHz、5kHz-100MHz、10kHz-100MHz、50kHz-100MHz、100kHz-100MHz、1MHz-100MHz、10-100MHz、1kHz-10MHz、10kHz-10MHz、或100kHz-10MHz之间。组合***的替代实例包括检流计镜和EOD(其中EOD可以在一个或两个方向上偏转(通过将两个正交布置的电极粘结到晶体上))。该***可以包含两个检流计镜，以便与EOD组合产生二维扫描***(其中EOD可以在一个或两个方向上偏转(通过将两个正交布置的电极粘结到晶体上))。在此类***中，消融激光脉冲能够被引导向样本的速率可以在200Hz-100MHz、200Hz-10MHz、200Hz-1MHz、200Hz-100kHz、200Hz-50kHz、200Hz-10kHz、1kHz-100MHz、5kHz-100MHz、10kHz-100MHz、50kHz-100MHz、100kHz-100MHz、1MHz-100MHz、10-100MHz、1kHz-10MHz、10kHz-10MHz、或100kHz-10MHz之间。
-激光扫描***的其他可选组件
为了控制激光扫描***的***，激光扫描***可以包含扫描仪控制模块(诸如计算机或编程芯片)，该模块协调***在Y轴和/或X轴上的移动，以及与样本台的移动。在一些情况下，诸如来回光栅化，适当的图案将被预编程到芯片中。然而，在其他情况下，控制模块可以应用逆向动力学来确定要遵循的合适的消融图案。逆向动力学可能特别有用，例如，在产生任意消融图案时，以便在要消融的多个和/或不规则形状的细胞之间绘制最佳消融过程。扫描仪控制模块还可以协调激光辐射的脉冲的发射，例如通过协调脉冲拾取器的操作。
有时，***会导致其引导的激光辐射束发散。因此，在本文所描述的一些设备的实施例中，激光扫描***包括在***和/或第二***与样本之间的至少一个色散补偿器，该色散补偿器适于补偿由***引起的任何色散。当***是AOD和/或第二***是AOD时，色散补偿器是(i)具有适合于补偿由***和/或第二***引起的色散的行距的衍射光栅；(ii)适合于补偿***和/或第二***引起的色散的棱镜(即适当的材料、厚度和棱镜角度)；(iii)包含衍射光栅(i)和棱镜(ii)的组合；和/或(iv)另一种声光器件。在第一***引起色散且第二***引起色散的情况下，激光扫描***可以包括包含补偿由第一***引起的任何色散的第一色散补偿器以及用于补偿由第二***引起的任何色散的第二色散补偿器。WO03/028940描述了如何使用另一种合适的AOD来补偿由AOD***引起的色散。
有时，由于***的移动将激光辐射引导到不同的位置，因此辐射束的焦距可能会相对于样本的位置发生变化。这可以通过多种方式进行补偿。例如，可以移动可移动聚焦透镜，以使斑点尺寸在样本上的直径保持恒定或接近恒定，而与激光辐射所导向的样本上的特定位置无关。可替代地，可以使用可调聚焦透镜(可从Optotune商购获得)。也可以通过更改z轴上样本台的高度来补偿斑点尺寸变化。这两种技术都依赖于移动组件，然而这会给***的操作带来时间开销，如果将AOD与高斯光束一起使用，则可以通过对AOD中的晶体施加功率来控制消融斑点的大小，从而快速调制一阶和零阶光束强度。
激光器
通常，用于消融样本的激光的波长和功率的选择可以遵循细胞分析中的常规用法。激光必须具有足够的能量密度，以使得消融至所需的深度，而又不会实质地消融样本载体。在0.1-5J/cm2之间的激光能量密度通常是合适的，例如从3-4J/cm2或约3.5J/cm2开始，理想情况下激光将能够以200Hz以上的频率产生具有这种能量密度的脉冲。在一些情况下，来自此类激光器的单个激光脉冲应足以消融用于分析的细胞材料，从而使激光脉冲频率与产生消融羽状物的频率相匹配。通常，要成为可用于对生物样本成像的激光，激光应产生持续时间少于100ns(优选少于1ns)的脉冲，该脉冲可以聚焦到例如本文下面讨论的特定斑点尺寸。在本发明的一些实施例中，为了利用上面讨论的激光扫描***的用途，消融速率(即激光消融样本表面上的斑点的速率)为200Hz以上，诸如500Hz以上、750Hz以上、1kHz以上、1.5kHz以上、2kHz以上、2.5kHz以上、3kHz以上、3.5kHz以上、4kHz以上、4.5kHz以上、5kHz以上、10kHz以上、100kHz以上、1MHz以上、10MHz以上、或100MHz以上。许多激光器的重复频率超过激光消融频率，因此可以采用适当的组件，诸如脉冲拾取器等来适当地控制消融速率。因此，在一些实施例中，激光重复率是至少1kHz，诸如至少10kHz、至少100kHz、至少1MHz、至少10MHz、约80MHz或至少100MHz，可选地，其中采样***进一步包含脉冲拾取器，诸如其中脉冲拾取器由控制模块控制，该控制模块还控制激光扫描***的样本台和/或***的移动。在其他情况下，可以使用多个紧密间隔的脉冲猝发(例如，一列3个紧密间隔的脉冲)来消融一个单个的斑点。例如，通过在每个斑点中使用100个由3个紧密间隔的脉冲组成的猝发，可以消融10×10μm的区域；这对于具有有限消融深度的激光(例如飞秒激光)很有用，并且可以在不损失分辨率的情况下产生消融的蜂窝状材料的连续的羽状物。因此，在一些实施例中，激光扫描***适用于使用以下方法消融样本，其中使用3个时间上接近的脉冲消融样本上的每个斑点(例如，其中脉冲之间的间隔小于1μs，诸如小于1ns，或间隔小于1ps)。
如本文所述，激光器可以是fs激光器。例如，可以在二次谐波下操作近红外范围内的fs激光器，以提供绿色范围内的激光辐射，或者在三次谐波下操作，以提供UV范围内的激光辐射。较低的波长(例如绿色或紫外线)可以提供更高的分辨率(例如，较小的斑点尺寸)。当激光辐射穿过样本支撑物传播并撞击样本时，样本支撑物需要对激光辐射透明。玻璃和二氧化硅对绿色波长透明，二氧化硅而非玻璃对UV透明。为了在允许使用玻璃载玻片的同时实现高分辨率，可以以二次谐波(例如，约50％的转换效率)操作IR fs激光器以提供绿色激光辐射。值得注意的是，市售物镜通常在绿色范围内具有最佳校正效果。由绿色或UV fs激光器获得的分辨率可以是小于或等于500nm、400nm、300nm、200nm、150nm或100nm的斑点尺寸。
例如，激光***的消融频率在200Hz-100MHz、200Hz-10MHz、200Hz-1MHz、200Hz-100kHz范围内、在500-50kHz范围内或在1kHz-10kHz范围内。如上所述，激光的消融频率应与激光扫描***的扫描速率相匹配。
在这些频率下，如果需要单独解决每个消融羽状物(如下面所述，在对准样本发射一连串消融脉冲时可能不一定需要)，则仪器必须能够足够迅速地分析消融材料，以免连续消融之间存在明显的信号重叠。优选的是，源自连续羽状物的信号之间的重叠强度＜10％，更优选＜5％，并且理想地＜2％。分析羽状物所需的时间将取决于样本室的冲洗时间(请参见下面的样本室部分)，羽状物气溶胶进出并通过激光电离***的通过时间、以及分析电离物质所需的时间。可以将每个激光脉冲与随后建立的样本图像上的像素相关联，如下面更详细地讨论。
在一些实施例中，激光源包含具有纳秒或皮秒脉冲持续时间的激光或超快激光(脉冲持续时间为1ps(10-12s)或更快速的激光)，诸如飞秒激光。超快脉冲持续时间具有许多优点，因为它们限制了热量从消融区域的扩散，从而提供了更精确、更可靠的消融坑，并最大程度地减少了每个消融事件产生的碎屑飞散。
在某些情况下，飞秒激光被用作激光源。飞秒激光器是发射持续时间低于1ps的光脉冲的激光器。此类短脉冲的产生通常采用被动模式锁定技术。可以使用多种类型的激光器来产生飞秒激光。使用被动锁模固态体激光器可以实现介于30fs和30ps之间的典型持续时间。类似地，在这种情况下工作的各种二极管泵浦激光器，例如基于钕掺杂或镱掺杂增益介质。具有先进色散补偿功能的钛-蓝宝石激光器甚至适用于脉冲持续时间低于10fs，在极端情况下可低至约5fs。在大多数情况下，脉冲重复频率在10MHz和500MHz之间，尽管存在较低的重复频率版本，对于较高的脉冲能量，重复频率为几兆赫兹(可从例如Lumentum(美国加利福尼亚州)、Radiantis(西班牙)、Coherent(美国加利福尼亚州)获得)。这种类型的激光器可以带有放大器***，该放大器***可以增加脉冲能量。
还有各种类型的超快光纤激光器，在大多数情况下，它们也是被动锁模的，通常提供的脉冲持续时间在50和500fs之间，重复频率在10和100MHz之间。此类激光器可以从例如NKT光电(丹麦；以前的Fianium)、Amplitude***(法国)、Laser-Femto(美国加利福尼亚州)商购获得。此类激光器的脉冲能量也可以通过放大器来增加，通常以集成光纤放大器的形式。
一些锁模二极管激光器可以产生飞秒持续时间的脉冲。直接在激光器输出处，脉冲持续时间通常约为数百飞秒(例如，可以从Coherent(美国加利福尼亚州)获得)。
在一些情况下，使用皮秒激光器。在前面的段落中已经讨论过的许多类型的激光器也可以适于产生皮秒范围持续时间的脉冲。最常见的光源是主动或被动锁模固态体激光器，例如被动锁模钕掺杂的YAG、玻璃或钒酸盐激光器。同样，皮秒锁模激光器和激光二极管是可以商购获得的(例如NKT光电(丹麦)、EKSPLA(立陶宛))。
纳秒级脉冲持续时间激光器(增益切换和Q切换)还可以在特定的设备设置(Coherent(美国加利福尼亚州)、Thorlabs(美国新泽西州))中找到实用性。
可替代地，可以使用外部调制的连续波激光器，以产生纳秒或更短的持续时间脉冲。
通常，本文讨论的激光***中用于消融的激光束的斑点尺寸(即在采样位置处)为100μm以下，诸如50μm以下、25μm以下、20μm以下、15μm以下、或10μm以下，诸如约3μm以下、约2μm以下、约1μm以下、约500nm以下、约250nm以下。该距离称为斑点尺寸，对应于光束的最长内部尺寸，例如对于圆形光束，它是光束直径，对于方形光束，它是相对角之间对角线的长度，对于四边形，它是最长对角线的长度，等等。(如上所述，具有高斯分布的圆形光束的直径被定义为能量密度已降低至峰值能量密度的1/e2倍的点之间的距离)。作为高斯光束的替代，可以采用光束成形和光束掩模来提供所需的消融斑点。例如，在一些应用中，具有高顶能量分布的正方形消融点可能是有用的(即，与高斯能量分布相反，具有接近均匀的能量密度的光束)。这种布置减小了消融斑点尺寸对高斯能量分布的峰值处的能量密度与阈值能量密度之间的比率的依赖性。接近阈值能量密度的消融可提供更可靠的消融坑产生，并控制碎屑的产生。因此，激光***可以包含布置在高斯光束中的光束掩模和/或光束成形部件，诸如衍射光学器件，以使光束重新着色并产生均匀或接近均匀能量密度的激光焦点，诸如能量密度在整个光束上变化小于±25％，诸如小于±20％、±15％、±10％或小于±5％。有时，激光束具有正方形的横截面形状。有时，光束具有高顶能量分布。
当用于分析生物样本时，为了分析单个细胞，所用激光束的斑点尺寸将取决于细胞的尺寸和间距。例如，当细胞彼此紧紧地堆积在一起时(诸如在组织切片中)，激光***中的一个或多个激光源的斑点尺寸可以不大于这些细胞。这个尺寸将取决于样本中的特定细胞，但通常激光斑点的直径应小于4μm，例如约3μm以下、约2μm以下、约1μm以下、约500nm以下、约250nm以下、或介于300nm和1μm之间。为了以亚细胞分辨率分析给定的细胞，***使用不大于这些细胞的激光斑点尺寸，更具体地说，使用可以消融具有亚细胞分辨率的材料的激光斑点尺寸。有时，可以使用大于细胞尺寸的斑点进行单细胞分析，例如，将细胞散布在载玻片上，并在细胞之间留出空间。在此，可以使用更大的斑点尺寸，并且可以实现单细胞表征，因为受关注细胞周围的附加消融区域不包含附加细胞。因此所使用的特定斑点尺寸可适当地取决于被分析细胞的尺寸来进行选择。在生物样本中，细胞很少都具有相同的尺寸，因此，如果需要进行亚细胞分辨率成像，则如果在整个消融过程中保持恒定的斑点尺寸，则消融斑点的尺寸应小于最小的细胞。使用激光束聚焦可以实现小斑点尺寸。1μm的激光斑点直径对应于1μm的激光焦点(即，光束焦点处的激光束直径)，但是由于目标上的能量空间分布(例如，高斯光束形状)以及总激光能量相对于消融阈值能量的变化，激光焦点的变化可以是+20％以上。用于聚焦激光束的合适物镜包括反射物镜，诸如SchwarzschildCassegrain设计的物镜(反向Cassegrain)。也可以使用折射物镜，也可以使用反射折射物镜的组合。单个非球面透镜也可以用于实现所需的聚焦。固体浸没透镜或衍射光学器件也可以用于聚焦激光束。可以单独使用或与上述物镜结合使用的另一种控制激光的斑点尺寸的方法是在聚焦之前使光束通过孔径。通过使光束穿过直径阵列中的不同直径的孔径，可以实现不同的光束直径。在一些情况下，例如当孔径是光圈孔径时，存在可变尺寸的单个孔径。有时，光圈孔径是虹膜孔径。斑点尺寸的变化也可以通过光学器件的抖动来实现。一个或多个透镜以及一个或多个孔径位于激光器与样本台之间。
为了完整起见，本领域已知的(例如[5])用于亚细胞分辨率的用于LA的标准激光器是准分子激光器或复合受激态激光器。使用氟化氩激光器(λ＝193nm)可以获得合适的结果。这些激光器的脉冲持续时间为10-15ns，可以实现充分的消融。
总体而言，结合MS检测器的响应特性选择激光脉冲的频率和强度，以允许对单个激光消融羽状物进行不同的检测。结合使用小的激光斑点和冲洗时间短的样本室，现在可以实现快速、高分辨率的成像。
如果激光***发出两个以上波长的激光辐射，可以通过使用两个以上激光源来实现，其中每个激光源都适合于以不同于激光***中其他激光源所发出的激光辐射波长的波长发出激光辐射。
因此，激光***可以包含发射波长为213nm的激光辐射的第一激光源和发射波长为266nm的激光辐射的第二激光源(使得第一激光源主要消融蛋白质材料，第二激光源主要消融DNA材料)。如果需要在第三激光辐射的波长处消融，则在激光***中使用第三激光源，依此类推。
有时，用于发射多个波长的激光辐射的激光***包含适于发射多个波长的激光辐射的单个激光源(即，一个激光器发射多个波长的激光辐射；该激光***可以包括其他激光源)。一些激光源使用波长转换方法，诸如谐波或总和频率生成、超连续谱生成、光学参量放大器或振荡器(OPA/OPO)技术或几种技术的组合，以所需的波长发射激光辐射，作为本领域的标准。例如，Nd YAG激光器会产生1064nm波长的激光辐射，这被称为基波频率。该波长可以通过谐波产生的方法转换成较短的波长(如果需要)。该激光辐射的四次谐波将在266nm(1064nm÷4)处，而五次谐波将在213nm处。因此，四次谐波可以靶向DNA材料的高吸收波段，而五次谐波可以靶向蛋白质的高吸收波段。在许多激光器布置中，五次谐波的产生是基于四次谐波的产生。因此，尽管通常会在激光器中滤除较低的谐波(具有较长的波长)，但是在产生五次谐波输出的激光器中将已经存在四次谐波。因此，去除适当的滤光器使得能够发射多种波长的激光辐射。此类激光器的实例可从Coherent公司、RP光学器件、Lee激光器等商购获得。
另一个有用的谐波频率对是基本波长为约800nm的激光器的四次和三次谐波。这里的四次和三次谐波分别具有200nm和266nm的波长。此类激光器的实例是可商购获得的(Coherent公司、Spectra Physics)。
在一些情况下，激光辐射的第一波长和激光辐射的第二波长是由同一激光源产生的，这些波长不是通过谐波产生的，而是由具有宽发射光谱的激光器产生的。激光器的发射光谱可以是至少10nm、至少30nm、至少50nm或至少100nm。白光激光器或超连续谱激光器会产生多种波长的光。
激光消融焦点
为了最大效率地使激光消融样本中材料，样本应相对于激光焦点位于适当的位置，例如在焦点处，因为焦点是激光束直径最小的位置并具有最集中的能量。这可以通过多种方式来实现。第一种方式是，样本可以在被引导到其上的激光的轴上移动(即，沿激光路径上下移动/朝向和远离激光源)移动到期望的点，在该点处光强度足以实现所需的消融。可替代地或附加地，透镜可用于移动激光的焦点，并因此具有例如通过缩小来消融样本位置处的材料的有效能力。一个或多个透镜位于激光和样本台之间。第三种方式是改变激光的位置，其可以单独使用或与前述两种方式中的一种或两种结合。
为了帮助***的用户将样本放置在最合适的位置，以便从样本中消融材料，可以将相机导向保持样本的载物台(下面将详细讨论)。因此，本公开提供了一种激光消融采样***，其包含对准样本台的相机。相机检测到的图像可以被聚焦到激光聚焦的同一点。这可以通过使用与激光消融和光学成像相同的物镜来实现。通过使两个焦点一致，用户可以确保在光学图像清晰聚焦时激光消融将最有效。可以通过使用压电活化剂，如PhysikInstrumente、Cedrat-technologies、Thorlabs和其他供应商所提供的，来实现载物台的精确移动以便聚焦样本。
在另一种操作模式中，激光消融通过样本载体被引导至样本。在这种情况下，应当选择样本支撑物，以使其对用来消融样本的激光辐射频率(至少部分)透明。在图5中示出了通过样本的消融。在特定情况下，通过样本的消融可能具有优点，因为这种消融模式可以为从样本中消融掉的材料羽状物提供附加的动能，使消融后的材料进一步远离样本表面，从而促进了消融的材料从样本中运走的流动，以便在检测器中进行分析。同样，也可以通过穿过载体的激光辐射来介导基于解吸的方法来去除样本材料的块。提供给被解吸的材料块的附加动能可以帮助将块从样本载体中弹射出来，从而促进该块被夹带在流经样本室的载气中。
为了实现样本的3D成像，可以将样本或其限定区域消融到第一深度，该深度不能完全穿过样本。之后，可以将同一区域再次消融到第二深度，依此类推消融到第三、第四等深度。这样，可以建立样本的3D图像。在一些情况下，可能优选在继续于第二深度处消融之前将所有用于消融的区域消融至第一深度。可替代地，可以在进行到该区域中的下一个位置进行消融之前，在相同的点执行重复的消融以消融不同的深度。在这两种情况下，成像软件都可以将MS处得到的信号解卷积到样本的位置和深度。在某些方面，高速激光器(例如飞秒激光器)可以提供短而强烈的激光脉冲，可以更干净地消融每个斑点，从而允许在该斑点处进行重采样而不会破坏样本(例如，在原始样本斑点周围散布的热量极少)。当为每个激光斑点获得单独的像素时，构建3D图像可能会占用大量时间。由此，如所描述的对受关注区域(例如，诸如细胞)的激光扫描可以允许在第二深度处对ROI进行快速重采样。
用于多种操作模式的激光***光学器件
作为常规布置的问题，光学组件可以用于将可选地具有不同波长的激光辐射引导至不同的相对位置。还可布置光学组件，以将可选地具有不同波长的激光辐射从不同方向引导到样本上。例如，可以从上方将一个或多个波长引导到样本上，并且可以从下方(即，穿过承载样本的基板，诸如显微镜载玻片，也称为样本载体)引导一个或多个波长的激光辐射(可选地，不同的波长)。这使得同一设备可以采用多种操作模式。因此，激光***可以包括光学组件的布置，被布置成将可选地具有不同波长的激光辐射从不同方向引导到样本上。因此，可以布置光学组件，使得该布置将激光辐射(可选地具有不同波长)从相反的方向引导到样本上。在本上下文中，“相反”方向不限于从上方和下方(其为180°相反)垂直被引导到样本上的激光辐射，而是包括以除了垂直于样本的角度之外的角度将激光辐射引导到样本上的布置。从不同方向引导到样本上的激光辐射不需要平行。有时，当样本在样本载体上时，反射器布置可以被布置成将第一波长的激光辐射直接引导到样本上，并且将第二波长的激光辐射通过样本载体引导到样本。
将激光辐射通过样本载体引导至样本可用于消融样本。然而，在一些***中，将激光辐射引导通过载体可以用于“LIFTing”操作模式，如下面关于基于解吸的采样***更详细地讨论的(尽管本领域技术人员将理解的，消融和LIFTing可以由相同的设备执行，因此本文所称的激光消融采样***也可以用作基于解吸的采样***)。用于将激光辐射从第一方向聚焦到样本上的透镜的NA(数值孔径)可能不同于用于将激光辐射(可选地以不同波长)从第二方向聚焦到样本上的透镜的NA(数值孔径)。提升操作(例如，其中激光辐射被引导通过样本载体)通常采用比进行消融时更大的直径的斑点尺寸。
高NA物镜和相反侧消融
在某些方面，本发明方法和***的样本室可以包含高NA物镜(例如，透镜)。例如，图12的样本室1206示出了高NA物镜1205。激光辐射1216被高NA物镜聚焦在样本支撑物1207上的样本1215上，然后将样本材料输送至质量分析仪。高NA物镜可以是空气透镜，也可以是油浸透镜或固体浸没透镜。由此，介质1207可以是空气(或低压真空)、油或固体透明材料。如图12所示，激光辐射1216和高NA物镜可以位于样本支撑物1207中与样本1215相反的一侧。
当使用浸没透镜时(例如，当浸没透镜位于载玻片的与样本相反的一侧时)，样本可以是超薄样本，诸如组织切片的厚度为300nm以下、200nm以下、150nm以下、100nm以下、75nm以下、50nm以下、或30nm以下。此类组织切片(特别是组织切片的厚度为100nm以下)可以以与电子显微镜相似或相同的方式制备。例如，在超薄切片之前，组织可以用树脂(例如环氧树脂、丙烯酸或聚酯)包埋。
高NA物镜的NA可以为0.5以上、0.7以上、0.9以上、1.0以上、1.2以上，或1.4以上。值得注意的是，NA高于1.0可以用诸如油或固体透明材料的介质来实现，该介质具有比空气或真空更高的折射率(例如，高于1.0)。高NA光学器件可以提供400nm以下、300nm以下、200nm以下、150nm以下、或100nm以下的斑点尺寸。
在某些方面，由高NA物镜聚焦的激光辐射的波长为1μm以下，诸如在绿色或UV范围内。如本文所述，激光器可以是fs激光器。例如，可以在二次谐波下操作近红外范围内的fs激光器，以提供绿色范围内的激光辐射，或者在三次谐波下操作以提供UV范围内的激光辐射。较低的波长(诸如绿色或UV)可以提供更高的分辨率(例如，较小的斑点尺寸)。当激光辐射穿过样本支撑物传播并撞击样本时，样本支撑物需要对激光辐射透明。玻璃和二氧化硅对绿色波长透明，二氧化硅载玻片而非玻璃对UV透明。为了在允许使用玻璃载玻片的同时最大化分辨率，可以以二次谐波(例如，约50％的转换效率)操作IR fs激光器以提供绿色激光辐射。值得注意的是，市售物镜通常在绿色范围内具有最佳校正。
激光消融采样***的样本室
当样本进行激光消融时，将其放置在样本室中。样本室包含可保持样本的载物台(通常样本位于样本载体上)。当消融时，样本中的材料会形成羽状物，并且从气体入口到气体出口流经样本室的气流会带走雾化材料的羽状物，包括位于消融位置的所有标记原子。气体将材料带到电离***，电离***将材料电离，以实现检测器的检测。样本中的原子(包括标记原子)可以通过检测器进行区分，因此它们的检测揭示出羽状物中是否存在多个目标，因此可以确定样本上被消融的位点处存在哪些目标。因此，样本室起着双重作用，既容纳被分析的固体样本，还作为将雾化材料转移到电离和检测***的起点。这意味着流经室的气流会影响材料的消融羽状物穿过***时将如何扩散。消融羽状物如何扩散的度量是样本室的冲洗时间。该数值是流经样本室的气体从样本室中将从样本消融的材料带走所需的时间的量度。
以这种方式从激光消融产生的信号的空间分辨率(即，当消融用于成像而不是专门用于清除时，如下所述)取决于以下因素：(i)激光的斑点尺寸，因为信号被积分在被消融的总面积上；以及产生羽状物的速度与样本相对于激光的移动之间的关系；以及(ii)相对于产生羽状物的速度而言能够分析羽状物的速度，以避免如上所述来自连续羽状物的信号的重叠。因此，如果需要对羽状物进行单独分析，则能够在最短的时间内分析羽状物可将羽状物重叠的可能性降到最低(因此又可以使羽状物更频繁地产生)。
因此，具有短冲洗时间(例如100ms以下)的样本室对于与本文公开的设备和方法一起使用是有利的。具有长冲洗时间的样本室将限制产生图像的速度，或导致源自连续样本点的信号之间重叠(例如参考文献vi，信号持续时间超过10秒)。因此，气溶胶冲洗时间是在不增加总扫描时间的情况下获得高分辨率的关键限制因素。冲洗时间≤100ms的样本室在本领域中是已知的。例如，参考文献vii公开了一种样本室，其冲洗时间低于100ms。在参考文献viii(也参见参考文献ix)中公开了一种样本室，其冲洗时间为30ms以下，从而允许高的消融频率(例如20Hz以上)，因此可以进行快速分析。参考文献x中公开了另一种此类样本室。参考文献x中的样本室包含被配置为可操作地靠近目标布置的样本捕获室，该样本捕获室包括：捕获腔，具有在捕获室的表面上形成的开口，其中该捕获腔被配置为通过该开口接收从激光消融部位喷射或产生的目标材料，以及暴露在捕获腔内的导向壁，该导向壁被配置为将捕获腔内的载气从入口引导至出口，使得在捕获腔内接收的至少一部分目标材料的可以作为样本被转移到出口中。参考文献x的样本室中的捕获腔的体积小于1cm3，并且可以小于0.005cm3。有时样本室的冲洗时间为25ms以下，诸如20ms以下、10ms以下、5ms以下、2ms以下、1ms以下、500μs以下、200μs以下、100μs以下、50μs以下、或25μs以下。例如，样本室的冲洗时间可以为10μs以上。通常，样本室的冲洗时间为5ms以下。
为了完整起见，有时可能会比样本室的冲洗时间更频繁地产生样本中的羽状物，并且所产生的图像也会相应地出现拖尾现象(例如，如果认为进行特定分析不需要尽可能高的分辨率)。尽管这对于高分辨率成像可能不是理想的，但是如本文所讨论的那样，脉冲的猝发被引导向样本(例如，脉冲全部被引导向受关注特征/区域，诸如细胞)，并且检测到的作为连续事件的羽状物中的材料、与来自特定羽状物的信号重叠无关紧要。实际上，此处，来自猝发内的每个单独消融事件的羽状物实际上形成了单个羽状物，然后将该羽状物继续进行检测。
样本室通常包括平移载物台，该平移载物台保持样本(和样本载体)并使样本相对于激光辐射束移动(在本发明的一些实施例中，样本台和激光束可以同时移动)，例如，样本台以恒定的速度移动，并且当样本在样本台上移动时，激光扫描***将激光引导到跨过样本的匹配扫描上；例如，样本台在X轴上移动，并且激光扫描***在Y轴上扫过，激光扫描***的移动主矢量与载物台的行进方向(考虑激光扫描仪中的任何移动以考虑载物台的移动)正交。当使用需要激光辐射通过样本载体到达样本的方向的操作模式时，例如如本文讨论的LIFTing方法中一样，保持样本载体的载物台也应对所用的激光辐射透明。
因此，样本可以被定位在样本载体(例如玻璃载玻片)的当激光辐射被引导到样本上时面对激光辐射的一侧上，以使得消融羽状物在与激光辐射被引导到样本上的同一侧上被释放并被捕获。可替代地，样本可以被定位在当激光辐射被引导到样本上时与激光辐射相对的一侧上(即，激光辐射在到达样本之前穿过样本载体)，并且消融羽状物在与激光辐射相对的一侧上被释放并被捕获。
根据本发明各方面的设备中的样本台的移动的控制，可以由同一控制模块协调，该控制模块协调激光扫描仪***的移动，并且可选地控制激光辐射脉冲的发射(例如，用于脉冲拾取器的触发控制器)
样本室的一个特点是广泛的移动范围，在样本室中样本的各个离散区域内的特定部分被消融，在该范围内，样本可以在x和y(即水平)轴上相对于激光(激光束沿z轴被引导到样本上)移动，x和y轴相互垂直。通过在样本室内移动台并将激光器的位置固定在设备的激光消融采样***中，可以实现更加可靠和准确的相对位置。移动范围越大，离散的消融区域彼此之间的距离就越远。通过移动放置样本的载物台，使样本相对于激光移动。因此，样本台在样本室内在x和y轴上的移动范围为至少10mm，诸如在x和y轴上20mm、在x和y轴上30mm、在x和y轴上40mm、在x和y轴上50mm、诸如在x和y轴上75mm。有时，移动范围使得可以在室内分析标准25mm×75mm显微镜载玻片的整个表面。当然，除了能够实现大范围的移动之外，为了能够实现亚细胞消融，移动应该是精确的。因此，该载物台可以被配置为以小于10μm、诸如小于5μm、小于4μm、小于3μm、小于2μm、1μm、或小于1μm、小于500nm、小于200nm、小于100nm的增量在x和y轴上移动样本。例如，载物台可以被配置为以至少50nm的增量移动样本。精确的载物台移动可以以约1μm的增量进行，诸如1μm±0.1μm。可以使用可商购获得的显微镜载物台，例如可以从Thorlabs、Prior Scientific和Applied ScientificInstrumentation获得。可替代地，可以基于提供所需移动范围和合适的精密移动的***，诸如Smaract的SLC-24***，由组件构建电动载物台。样本台的移动速度也会影响分析速度。因此，样本台具有大于1mm/s的操作速度，诸如10mm/s、50mm/s或100mm/s。
自然地，当样本室中的样本台具有广泛的移动范围时，样本的尺寸必须适当调节以适应载物台的移动。因此，样本室的尺寸取决于所涉及样本的尺寸，而样本的尺寸又决定了可移动样本台的尺寸。样本室的示例性尺寸具有10×10cm、15×15cm或20×20cm的内部室。室的深度可以是3cm、4cm或5cm。技术人员将能够根据本文的教导来选择合适的尺寸。用于使用激光消融采样器分析生物样本的样本室的内部尺寸必须大于样本台的移动范围，例如至少5mm、诸如至少10mm。这是因为，如果室的壁太靠近载物台的边缘，则经过室的载气流会使消融的材料羽状物从样本中移出并进入电离***，这会造成湍流。湍流扰动了消融的羽状物，因此，材料羽状物在被消融并被带走至设备的电离***之后开始散布开，而不是作为消融的材料的紧密云团保留。消融材料的较宽峰对电离和检测***产生的数据有负面影响，因为它会由于峰重叠而导致干扰，因此最终会导致空间分辨率差的数据，除非将消融速率减慢到不再具有实验意义这样的程度。
如上所述，样本室包含将材料带到电离***的气体入口和气体出口。然而，如本领域技术人员所确定的那样，它可以包含用作入口或出口的其他端口，以引导气体在室中流动和/或向室提供气体混合物，以适合进行特定消融过程。
相机
除了识别用于激光消融的样本的最有效定位之外，还包括相机(例如，诸如基于电荷耦合器件的图像传感器(CCD)相机、基于有源像素传感器的相机)或激光消融采样***中的任何其他光检测装置，其可以进行各种进一步的分析和技术。CCD是一种用于检测光并将其转换为可用于产生图像的数字信息的装置。在CCD图像传感器中，有一系列检测光的电容器，每个电容器代表所确定图像上的一个像素。这些电容器可以将入射的光子转换为电荷。然后使用CCD读取这些电荷，并且可以将记录的电荷转换为图像。有源像素传感器(APS)是一种图像传感器，由包含像素传感器阵列的集成电路组成，每个像素均包括一个光电检测器和一个有源放大器，例如CMOS传感器。
可以将相机结合到本文讨论的任何激光消融采样***中。相机可用于扫描样本以识别受特定关注的细胞或受特定关注的区域(例如特定形态的细胞)、或对抗原、细胞内受体或结构特异的荧光探针。在某些实施例中，荧光探针是也包含可检测的金属标签的组织化学染色剂或抗体。一旦识别出此类细胞，就可以将激光脉冲引导到这些特定的细胞，以消融材料进行分析，例如以自动化方式(其中***既可以识别也可以消融受关注特征/区域(诸如细胞))或半自动化过程(***的用户(例如临床病理学家)识别受关注特征/区域，然后***以自动方式消融)。这能够显著提高进行分析的速度，因为不需要消融整个样本来分析特定细胞，而是可以对受关注细胞进行特异性消融。在进行消融所花费的时间方面，特别是在解释来自消融的数据所花费的时间方面，在根据消融构造图像的方面，这使得在分析生物样本的方法方面产生了效率。根据数据构造图像是成像过程中比较耗时的部分之一，因此，通过将从样本的相关部分收集到的数据最小化，可以提高整体分析速度。
相机可以记录来自共焦显微镜的图像。共焦显微镜是光学显微镜的一种形式，具有许多优点，包括减少远离焦平面的背景信息(光)的干扰的能力。这可以通过消除散焦的光线或眩光来实现。共焦显微镜可用于评估未染色样本的细胞形态、或细胞是离散细胞还是细胞团的一部分。通常，样本用荧光标记物进行特异性标记(诸如通过标记的抗体或通过标记的核酸)。这些荧光标记物可用于染色特定的细胞群(例如，表达某些基因和/或蛋白质)或细胞上的特定形态特征(诸如细胞核或线粒体)，并在用适当波长的光照射时，这些样本区域是可以明确识别的。因此，本文所述的一些***可以包含用于激发标记中的荧光团的激光，该标记用于标记样本。可替代地，LED光源可以用于激发荧光团。非共焦(例如，宽视野)荧光显微镜也可以用于识别生物样本的某些区域，但是具有比共焦显微镜更低的分辨率。
作为结合荧光和激光消融的示例技术，可以用缀合至荧光部分的抗体或核酸来标记生物样本中的细胞核。因此，通过激发荧光标记，然后使用相机观察并记录荧光的位置，可以将消融激光专门地引导到细胞核或不包括细胞核材料的区域。将样本分为细胞核和细胞质区域，将在细胞化学领域中找到特定的应用。通过使用图像传感器(诸如CCD检测器或有源像素传感器，例如CMOS传感器)，通过使用控制模块(诸如计算机或编程芯片)，将荧光的位置与样本的x、y坐标相关联，然后将消融激光引导到该位置，可以使识别受关注特征/区域然后消融它们的过程全部自动化。作为此过程的一部分，由图像传感器拍摄的第一张图像可能具有低物镜放大倍率(低数值孔径)，从而可以对大面积的样本进行测量。此后，可以使用切换到具有更高放大倍率的物镜，以集中于受关注特定特征，该特征已通过更高放大倍率的光学成像被确定为发出荧光。然后被记录为发出荧光的这些特征可以用激光消融。首先使用较低数值孔径的透镜具有进一步的优点，即景深增加，因此意味着与从一开始就使用较高数值孔径的透镜进行筛查相比，可以更敏感地检测掩埋在样本中的特征。
在使用荧光成像的方法和***中，从样本到相机的荧光的发射路径可以包括一个或多个透镜和/或一个或多个滤光器。通过包括适于使来自一个或多个荧光标记的选定光谱带宽通过的滤光器，该***适于处理与来自荧光标记的发射相关的色差。色差是镜头无法将不同波长的光聚焦到同一焦点的结果。因此，通过包括滤光器，减少了光学***中的背景，并且所得到的光学图像具有更高的分辨率。减少到达相机的不希望波长的发射光量的另一种方法是，通过使用一系列透镜来专门利用透镜的色差，这些透镜被设计用于透射和聚焦滤光器所透射的波长的光，类似于在WO2005/121864中描述的***。
在光学技术和激光消融采样的这种耦合中，更高分辨率的光学图像是有利的，因为随后光学图像的精度确定了可以引导消融激光来消融样本的精度。
因此，在本文公开的一些实施例中，本发明的设备包含相机。该相机可在线使用以识别样本(例如，特定细胞)的特征/区域，然后该样本可以被消融(或通过LIFTing解吸——参见下文)，诸如通过在受关注特征/区域发射脉冲群以从受关注特征/区域消融或解吸样本材料块。在脉冲群被引导向样本的情况下，检测到的最终羽状物中的材料可以作为连续事件(来自每个单独消融的羽状物实际上形成单个羽状物，然后继续进行检测)。虽然可以一起分析由受关注特征/区域内的位置的聚集羽状物形成的样本材料的每个云，但是来自每个不同的受关注特征/区域的羽状物中的样本材料仍保持离散。也就是说，在消融受关注不同特征/区域之间留有足够的时间，以允许在开始消融第(n+1)个特征/区域之前允许来自第n个特征/区域的样本材料。
在结合荧光分析和激光消融采样的另一种操作模式下，取代将激光消融定位到那些位置之前分析整个载玻片上的荧光，而是可以将激光脉冲发射到样本上的一个斑点上(低能量以仅激发样本中的荧光部分而不是消融样本)，并且如果检测到预期波长的荧光发射，则可以通过在该斑点以全能量发射激光来消融该斑点处的样本，并且产生的羽状物由检测器进行如下所述的分析。这样做的优点是，可以保持光栅化的分析模式，但可以提高速度，因为可以对荧光进行脉冲和测试，并立即从荧光中获取结果(而不是分析和解释来自检测器的离子数据以确定该区域是否受关注所花费的时间)，再次仅使重要的位点成为分析目标。因此，将这种策略应用于对包含多个细胞的生物样本进行成像时，可以执行以下步骤：(i)用一个或多个不同的标记原子以及一个或多个荧光标记物标记样本中的多个不同目标分子，提供被标记的样本；(ii)用光照射样本的已知位置以激发一种或多种荧光标记；(iii)观察并记录该位置是否有荧光；(iv)如果有荧光，则引导激光消融该位置，以形成羽状物；(v)将羽状物进行电感耦合等离子体质谱法，以及(vi)对样本上一个或多个其他已知位置重复步骤(ii)-(v)，从而检测羽状物中的标记原子可构建已被消融区域的样本的图像。
在一些情况下，可以修改样本或样本载体，以便在特定位置包含光学可检测(例如，通过光学或荧光显微术)的部分。然后可以使用荧光位置将样本定位在设备中。此类标记物位置的使用很有用，例如，可以在视觉上“离线”检查样本——即在除本发明的设备以外的其他设备中进行检查。可以在被突出显示的受关注特征/区域的光学图像及样本被转移到根据本发明各方面的设备中之前，由例如医师用与特定细胞相对应的受关注特征/区域对此类光学图像进行标记。在此，通过参考带注释的光学图像中的标记物位置，本发明各方面的设备可以通过使用相机来识别相应的荧光位置，并相应地为激光脉冲的位置计算消融和/或解吸(LIFTing)计划。因此，在一些实施例中，本发明各方面包含能够执行上述步骤的定向控制器模块。
在一些情况下，可以基于由本发明各方面的设备的相机拍摄的样本的图像，使用本发明各方面的设备来执行对受关注特征/区域的选择。
非线性显微术
另一种成像技术是双光子激发显微镜(也称为非线性或多光子显微镜)。该技术通常采用近红外光来激发荧光团。每个激发事件吸收两个红外光子。IR可使组织中的散射最小化。此外，由于多光子吸收，强烈抑制了背景信号。最常用的荧光团的激发光谱在400-500nm范围内，而用于激发双光子荧光的激光则在近红外范围内。如果荧光团同时吸收两个红外光子，它将吸收足够的能量以激发到激发态。然后，荧光团将发射单个光子，该光子的波长取决于随后可以检测到的所用荧光团的类型。
当使用激光激发荧光显微镜的荧光团时，有时该激光与产生用于从生物样本消融材料的激光相同，但是所使用的功率不足以导致从样本消融材料。有时荧光团会被光的波长激发，然后激光用该光消融样本。在其他情况下，可以使用不同的波长，例如，除了用于消融样本的谐波之外，还可以通过产生激光的不同谐波来获得不同波长的光，或利用在上述谐波产生***中产生的不同谐波。例如，如果使用Nd:YAG激光的第四和/或第五谐波，则可以将基波或第二至第三谐波用于荧光显微镜检查。
集成了非线性显微术的成像质量细胞计数***可以提供一个或多个双光子荧光、二次谐波产生(SHG)、三光子荧光(3PF)、三次谐波产生(THG)和/或相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)。在某些方面，可以通过一种或多种形式的非线性显微术，诸如通过造影剂或通过荧光团标记的SBP，准备用于成像的样本。样本可以进一步用带质量标签的SBP制备。
在二次谐波产生(SHG)中，该信号在含胶原的组织中产生的强度最高，已显示该信号可提供有关激光焦点中的胶原类型及其3维方向的丰富信息。此类信息无法通过其他显微镜技术获得。在三次谐波产生中，在不同材料之间存在界面的情况下，信号是在样本中唯一产生的。例如，该信号在细胞膜上产生，这意味着可以将其用于提高细胞分割的准确性。在双光子激发荧光中，信号的行为与“正常”荧光非常相似，不同之处在于，由于没有在激光焦点之外产生信号，因此所得图像的信噪比通常要好得多。在受激拉曼散射或相干反斯托克斯拉曼散射(SRS、CARS)中，信号是通过特定化学物质(固有的或引入的)的浓度以及在特定频率下发生谐振的光学活性振动键而产生的。例如，最近的研究显示了一系列工程化学物质的30重SRS成像。该信号的另一个强应用是检测高脂质浓度，诸如细胞壁或细胞内脂质滴。
图13是明尼苏达大学生物科学学院在线发布的胶原组织的二次谐波产生(SHG)图像。
图14显示了伊利诺伊大学Biophotonics成像实验室在线发布的乳腺癌组织的非线性显微镜图像。使用各种非线性显微镜信号对乳腺癌组织进行成像。可以看到SHG突出了细胞外基质(主要由胶原蛋白组成)并暴露了其结构和方向。可以看到THG突出了细胞界面和脂质(即脂质滴)的浓度。双光子和三光子激发荧光图像显示引入组织的荧光染色或固有荧光团的自发荧光。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS，一种类似于SRS的技术)显示了特定化学物质的浓度，这些化学物质可能是组织固有的或由研究人员引入的。这些信号中的每一个对研究人员都可能具有重大益处，并且可以与来自成像质量细胞计数的信息高度互补。
如图15所示，集成了非线性显微镜的***可以包含其他实施例和附图中所述的其他元素。例如，该***可以包括收集物镜1514、分光光学器件1516和积分检测器1515，诸如光电倍增管。尽管非线性显微镜可能会受益于透照(例如，用于某些特征的检测)，但集成了非线性显微镜的***可能无法提供透照。例如，样本支撑物1507的一侧上的定向光学器件(包括照明光学器件和收集物镜1514两者、分光光学器件1516和积分检测器1515)可以允许更多的位于样本上方的进样器直接将消融羽状物注入到质量分析仪。如本文所述，此类进样器可能是短而直的。
图15显示了可用于在成像质量细胞计数中捕获非线性显微镜信号的设置示图。可以检测到多个不同的非线性显微镜信号，诸如由三个积分检测器1515检测到的三个信号。这些信号可以包括例如二次谐波产生、三次谐波产生和/或双光子激发荧光。如果要在设置中添加受激拉曼散射(SRS)或CARS，则激光源也需要修改，因为两个相干的同步激光束之间具有明确的波长差，可以产生SRS或CARS信号。由此，集成了SRS或CARS的成像质谱分析***可以包括激光源1501，该激光源1501以限定的波长差提供两个相干的激光束。具体地，激光源1501可以产生与主脉冲相干并且共传播的副脉冲，并且与主脉冲相比具有特定的波长偏移。在CARS中，可以将激光源调谐到特定目标(例如，分子类别)的化学转变频率。集成CARS显微镜的成像质量细胞仪包括陷波滤镜。
基于激光扫描的采样和分析方法
如上文在激光扫描仪***本身的讨论中所指出的，该***允许对样本上的激光束进行快速扫描，从而提高了可消融和分析样本的速度，而且还能够消融任意形状，从而实现了特定的单个区域被消融，包括形状不规则的细胞，而不会消融邻近区域/细胞的材料。
因此，本发明的各方面提供了一种分析样本诸如生物样本的方法，该方法包含：
(i)对样本进行激光消融，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本台上的样本上，并且其中在多个位置进行消融以形成多个羽状物；以及
(ii)对羽状物进行电离和质谱分析，由此检测羽状物中的原子允许构建样本的图像，可选地其中多个位置是多个已知位置。
本发明的各方面还提供了一种对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，该方法包含：
(i)用一个或多个不同的标记原子来标记样本中的多个不同的目标分子，以提供标记的样本；
(ii)对样本进行激光消融，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本台上的样本上，并且其中在多个位置进行消融以形成多个羽状物；以及
(iii)对羽状物进行电离和质谱分析，从而检测羽状物中的原子允许构建样本的图像，可选地其中多个位置是多个已知位置。
在标记分节的下文中提供了标记样本、合适标记和其他相关教导的示例性方法。
通过本文描述的激光扫描方法和***，可以独特地启用或增强许多应用程序。
生物样本可能具有小的和/或不规则的特征(例如，微米级的细胞)，并且可能会受益于大视野的分析。如本文所使用的，特征可以包括组织区域、单个细胞、亚细胞成分、细胞膜、细胞-细胞界面和/或细胞外基质、以及切片或图像内的不同组织或细胞(例如，健康组织、肿瘤、淋巴细胞(诸如肿瘤浸润淋巴细胞)、肌肉(诸如骨骼肌或平滑肌)、上皮(诸如脉管***)和/或***(诸如基质或纤维))。可以通过如本文所述的激光扫描来获取(例如，选择性地获取)此类特征。在传统的IMC中，在宽视野(例如，以毫米或厘米为单位)和/或跨多个样本分析此类特征，可能需要花费数小时或数天的时间，其中每个像素的大小约为1um，并且需要与周围的像素区分开。在本方法和***中，激光扫描(可选地与载物台移动相结合)可以允许快速获取各个特征。在某些方面，一种***和/或方法使得每秒的细胞获取速率大于10、50、100、200、500、1000、2000或5000个细胞。可以通过光学显微镜(例如明场和/或荧光显微镜)自动识别特征，并通过激光调制对其进行采样，如本文所述。在某些方面，造影剂可以改善对这些特征的识别。
在某些方面，一种方法和/或***可以在宽视野上采样以识别受关注区域(ROI)。具体而言，可以通过使用fs激光进行快速扫描，仅去除样本的薄层并使完整的质量标记样本的其余部分保持完整(适用于进一步分析)来检测质量标签的存在。从间隔的(不相邻的)斑点采样，可以允许对质量标签的空间分布进行初始询问，并且可以识别受关注区域，以进行更深入的采样(例如，逐像素或重复扫描)。在这种初始询问期间，可以扫描激光并且使载物台连续移动。由此，可以迅速地(例如，在不到一小时、30分钟、10分钟或5分钟内)对大视野和/或大量样本(例如，合计超过一平方厘米)进行快速初始询问，以确定ROI，以供IMC进一步调查。
在某些方面，可以提供悬浮细胞(诸如外周血单核细胞(PBMC)、非贴壁细胞培养物或来自完整组织或贴壁细胞培养物的分解细胞)的样本，作为细胞涂片进行分析。可以将这些细胞在悬浮液中用标记有质量的SBP染色，并施加到表面(诸如载玻片)上，以通过本方法和***进行分析。可将细胞涂片与元素标准颗粒一起提供在支撑物上，以进行校准和/或归一化。可替代地或附加地，可以沿着测定条形码珠提供细胞涂片，以检测生物样本中的游离分析物。例如，可以提供包含PBMC的细胞涂片以及与游离分析物结合的测定条形码珠，游离分析物来自与PBMC相同的血液样本。在某些方面，该表面可以具有捕获位点，诸如微米级的孔，用于保留细胞和/或珠。
测定条形码的珠可以是单独可检测的，并且可以是微米级的。此类珠可在其表面上或在其内部包含测定条形码，其识别珠表面上的SBP。测定条形码同位素的独特组合可以识别珠表面上的SBP，从而通过测定条形码区分具有不同SBP的每个测定条形码珠。可以将测定条形码珠与生物流体(例如，细胞上清液、细胞裂解物或血清)混合，并与样本中的游离分析物(例如，细胞因子)结合。结合到报道分子质量标签的报道分子SBP，可以结合到细胞表面上的SBP的分析物。相同的报道分子质量标签可用于测定条形码的珠，因为测定条形码会区分分析物。
在某些方面，可以将对照细胞样本，诸如同质细胞系或PBMC，施加到载玻片上(例如，作为细胞涂片、组织切片或作为贴壁细胞)。对照细胞样本可以用于归一化样本处理中的变化，诸如染色。对照细胞样本可以来自先前表征的样本(例如，并且具有已知的标记物表达水平)和/或可以与其他样本一起在多个载玻片上使用。对照细胞样本可以用于归一化和/或定量、和/或用于分类，并且可以控制样本染色的变化。例如，尽管元素标准品可用于质量标签的校准、归一化和/或定量，以解决仪器灵敏度的波动，但与受关注样本一起染色的对照细胞可允许归一化，以解决样本染色的变化。具有先前定义的受关注群体(例如，PBMC)的对照细胞，可以用于在一个或多个受关注样本中对相似群体的细胞进行分类。对照细胞可以具有一个或多个标记原子(诸如样本条形码)，这些标记原子可以将细胞识别为对照细胞。
对照细胞样本可以是石蜡化细胞样本，例如当受关注样本(例如，在同一载玻片上)也是石蜡化样本时。在某些方面，对照细胞样本可以是样本载玻片上的石蜡化细胞系，用于追踪样本处理的再现性。可替代地，对照细胞样本可以是冷冻的组织切片，例如当受关注样本(例如，在同一载玻片上)也是冷冻的组织样本时。在任一种情况下，都可以将对照细胞样本与受关注样本一起进行处理，包括染色步骤。可替代地或附加地，可以将对照细胞样本预先染色。例如，预先染色的对照细胞样本可以是与受关注样本一起染色的对照细胞样本，以确定染色是否相似(并且可选地归一化来自染色和/或样本制备的其他方面的变化)。
测定条形码珠的内部可以包括测定条形码，诸如金属同位素的可区分的组合。珠的内部可以是多种合适的结构中的任何一种，诸如固体金属芯、金属螯合聚合物内部、纳米复合材料内部或混合内部。可以通过使一种或多种金属元素和/或同位素的混合物(例如溶液)经受高热和/或高压来形成固体金属核。纳米复合结构可以包含纳米颗粒/纳米结构的组合(例如，基质)(例如，各自包含不同的物理性质并且贡献一种或多种测定条形码元素/同位素和/或为包含测定条形码元素/同位素的其他纳米颗粒提供支撑物)。珠的内部可以包括截留测定条形码金属和/或螯合测定条形码金属的聚合物(例如，通过侧基如DOTA、DTPA或其衍生物)。合适的聚合物主链可以是分支的(例如，超支化的)或形成基质。在一些方面，聚合物可以以乳液形式或通过受控的活性聚合形成。在某些方面，测定珠的内部可以呈现惰性表面(例如，诸如固体金属表面)，该惰性表面需要在附接至测定生物分子(例如，寡核苷酸或抗体)之前被官能化(例如，通过整个表面上的聚合)。测定珠的表面可包含聚合物、远离表面的空间分析生物分子(例如SBP)和/或增加胶体稳定性的连接物(例如PEG连接物)、用于连接(或与其连接)的一个或多个官能团测定生物分子和/或样本条形码。
当对样本进行条形码处理时，可以合并来自多个样本的细胞涂片和/或测定条形码珠的细胞。样本条形码可以包含多个不用于染色的同位素(即，不与SBP的质量标签相关联)。样本条形码可以包括一个或多个将样本条形码同位素传递到细胞或珠的小分子或SBP。同位素的独特组合适用于每个样本的珠和/或细胞。当通过质量流式细胞仪(例如LA-ICP-MS)分析细胞或珠时，条形码同位素的独特组合可识别出该细胞或珠的原始样本。样本可能来自不同的来源和/或可能受到不同的处理和/或染色条件。在某些方面，可以使用活细胞条形码(例如，基于硫醇反应性的碲基条形码，或针对广泛表达的表面标记的元素标记的抗体)，这还可以增加对样本中活细胞进行条形码编码的好处(例如新鲜血液)。该方法可以与活细胞(例如，PBMC)的刺激或其他处理同时进行。在一些情况下，样本条形码可以对活细胞进行条形码处理。在一些情况下，样本条形码可以是对活细胞无害的，诸如对活细胞无毒。
在一些情况下，可以通过准备具有许多检测条形码和样本条形码的唯一组合的条形码试剂，以预先配置的形式提供条形码试剂。在此类情况下，每种独特的条形码试剂都可以存储在不同的容器中，诸如孔板的不同孔中。在一个实例中，可以建立孔板，使得沿着特定列(或行)的所有孔共享相同的测定条形码，而沿着特定行(或列)的所有孔共享相同的样本条形码。在另一实例中，可以建立孔板，使得每个填充的孔包含条形码试剂，条形码试剂具有特定独特样本条形码和大量测定条形码的各种组合。因此，第一孔可以包含全部具有第一样本条形码但各自具有不同的测定条形码的条形码试剂，并且第二孔可以包含全部具有第二条形码但各自具有不同的测定条形码的条形码试剂。在一些情况下，预先配置的条形码试剂可能需要制造成千上万组独特的珠。
为了自动染色，可以通过使带质量标签的SBP在细胞表面上流动(例如，使用自动流***)来对表面上的生物样本(例如，包含细胞)进行染色。
在一些实施例中，通过执行激光消融产生的羽状物单独接受电离和质谱分析。在此类情况下，每个羽状物将代表图像的离散像素。然而，在其他情况下，激光辐射脉冲猝发会快速连续地被引导到样本上的不同位置，以使来自每个位置的羽状物都不会被单独分析，而是被电离并作为单一的样本材料团进行质谱分析。此类方法可用于消融整个细胞作为检测器上的一个事件。因此，在一些情况下，在本发明的方面的上述方法中，激光辐射脉冲的猝发被引导到样本上的紧密间隔的区域，并且由激光辐射脉冲的猝发产生的羽状物被电离并被检测为连续的事件(即羽状物重叠)。使用诸如飞秒激光器和快速移动激光扫描阵列(例如基于AOD和/或EOD)的激光器，将允许使用多个直径为1μm的消融斑点在具有纳秒脉冲持续时间的激光器的脉冲持续时间内消融任意形状(诸如单细胞)。因此，在一些实施例中，对于每个激光脉冲，使用3μm以下、约2μm以下、约1μm以下的斑点尺寸来执行该方法。激光辐射猝发包括至少三个激光脉冲，其中每个激光脉冲之间的持续时间短于1ms，例如短于500μs、短于250μs、短于100μs、短于50μs、短于10μs、短于1μs、短于500ns、短于250ns、短于100ns、短于50ns或约10ns以下。激光辐射的猝发可以包括至少10个、至少20个、至少50个或至少100个激光脉冲。为了在激光脉冲之间实现如此短的时间，需要使用高重复率的激光器，其重复率适合于定时间隔，诸如以上在本发明的各方面的设备的“激光器”小节中所讨论的那些。例如，对于其中每个脉冲相距约10ns的脉冲猝发，激光器应具有100MHz的重复率(即1s÷10ns)。
在一些实施例中，激光扫描***赋予用于消融的激光辐射束相对于样本(例如Y轴)的第一相对移动。在一些实施例中，激光扫描***赋予用于消融的激光辐射束相对于样本(例如，Y轴和X轴)的第一相对移动和第二相对移动，其中第一相对移动和第二相对移动是正交的。在一些实施例中，激光扫描***中的单个***会同时赋予两种移动(例如，已连接正交电极组的EOD)。换言之，第一***赋予第一相对移动，第二***赋予第二相对移动。可以看到这种设置，例如，使用一对检流计镜，或使用两个正交放置的AOD。因此，在一些实施例中，该方法包含控制至少一个第一***和可选的第二***(如果存在的话)，以在用于消融样本的激光辐射束中赋予第一相对移动和可选的第二相对移动。
如上所述，AOD也可以用于调制激光辐射束的强度。因此，在以上公开的本发明的各方面的方法的一些实施例中，该方法包含通过AOD控制激光辐射束的强度的步骤。此外，在包含基于镜的***和固态***两者的实验布置中，可以控制固态***以校正基于镜的***将激光辐射引导到样本上的位置中的位置误差或由噪声引起的不准确性。
本发明的一个优点是激光扫描***允许样本台在一个方向(例如X)上以恒定的速度移动，然后使激光扫描***在消融载物台的X轴移动的中心线上方和下方消融，如图7至图9所示的扫描设备的移动路径中所示。此外，在允许在X和Y轴两者上移动的激光扫描***中，扫描可以补偿在样本台上沿着样本X轴的移动。因此，在一些实施例中，被分析的样本中处于样本台上。在一些情况下，样本台相对于激光扫描***在第一方向上以恒定的速度移动，从而赋予在样本中相对于激光扫描***(例如X轴)的第一相对移动，并且激光扫描***会赋予第二相对移动(例如，在Y轴上)。换言之，载物台可以在第一方向上移动样本，并且该位置可以在第二方向上(即，不平行，诸如基本上正交，例如正交)将相对移动引入到激光束中。在一些情况下，激光扫描***补偿了样本台的相对移动，从而为样本上的消融斑点(即其中由激光扫描***的单次扫描产生的斑点，Y轴在X轴上彼此相对不偏移)保持了规则的直线光栅图样。因此，在一些实施例中，样本台至少在x轴上是可移动的，并且其中***适于将至少在y轴上的偏转引入到激光束到样本台上的路径中。在一些实施例中，***还适于将x轴上的偏转引入到激光束到样本台上的路径中；或(ii)设备包含第二***，该第二***适于将x轴上的偏转引入到激光束到样本台上的路径中；可选地，其中激光扫描***的***由控制模块控制，该控制模块还控制样本台的移动。在这些实施例中，样本台可在x和y轴以及z轴上移动。
然而，激光扫描***没有必要在***中可能的整个振幅上执行全扫描。而是，可以消融任意的消融图案，以便仅消融受关注的特定特征，诸如单个细胞。
为了能够识别应当消融的区域，对受关注细胞的识别通常涉及对细胞的视觉图像的检查。例如，为了简化分析，在细胞涂片中，需要分析在涂片上以离散细胞形式存在的单个细胞(即不是双体、三体或更高数量的细胞簇)，并且通过目测检查样本可以轻松完成这种确定。如下所述，在本文公开的某些实施例中，可以检查样本中的标记物，这些标记物是通过在可见光范围内检查细胞而显而易见的。有时，在共焦显微镜下识别的细胞形态足以识别受关注细胞。在其他情况下，样本可以用一种或多种组织化学染色剂或与荧光标记物偶联的一种或多种SBP而染色(在一些情况下，可以是也缀合至标记原子的SBP)。这些荧光标记物可用于染色特定的细胞群(例如表达某些基因和/或蛋白质)或细胞上的特定形态特征(诸如细胞核或线粒体)，并在用适当波长的光照射时，这些区域样本是可以明确识别的。在一些情况下，从特定区域缺少特定种类的荧光可能是特征性的。例如，靶向细胞膜蛋白的第一个荧光标记可用于广泛识别细胞，但随后靶向ki67抗原(由MKI67基因编码)的第二个荧光标记可区分增殖细胞和非增殖细胞。因此，通过靶向缺少来自第二标记荧光的荧光的细胞，可以将非复制细胞特异性地靶向用于分析。因此，在一些实施例中，本文所述的***可包含用于激发用于标记样本的标记中的荧光团的激光器。可替代地，LED光源可以用于激发荧光团。非共焦(例如，宽视野)荧光显微镜也可以用于识别生物样本的某些区域，但是具有比共焦显微镜更低的分辨率。
当使用激光激发荧光显微镜进行荧光显微镜检查时，在一些实施例中，该激光与产生激光辐射的激光相同，该激光辐射用于从生物样本中消融材料(并用于LIFTing(解吸))，但使用的能量密度不足以引起样本中材料的消融或解吸。在一些实施例中，荧光团被用于样本消融或解吸的激光辐射波长激发。在其他实施例中，可以使用不同的波长，例如通过利用激光的不同谐波来获得不同波长的激光辐射。激发荧光团的激光辐射可以由与消融和/或提升激光源不同的激光源提供。
通过使用图像传感器(诸如CCD检测器或有源像素传感器，例如CMOS传感器)，可以通过使用控制模块(诸如计算机或编程芯片)，将荧光的位置与样本的x、y坐标相关联，然后在提升该位置的细胞之前，将消融激光引导到围绕该位置的区域，可以使识别受关注特征/区域并消融它们的过程完全自动化。作为此过程的一部分，在一些实施例中，由图像传感器拍摄的第一张图像可能具有低物镜放大倍率(低数值孔径)，从而可以对大面积的样本进行测量。此后，可以使用切换到具有更高放大倍率的物镜，将集中于受关注特定特征，其已通过更高放大倍率的光学成像被确定为受关注，例如如果该样本被荧光标记试剂染色则发出荧光。然后被记录为受关注的这些特征(例如发出荧光)可以消融/解吸。首先使用较低数值孔径的透镜具有进一步的优点，即景深增加，因此意味着与从一开始就使用较高数值孔径的透镜进行筛查相比，可以更敏感地检测掩埋在样本中的特征。
识别受关注特征/区域的分析可以由本发明各方面的设备进行，或可以在设备外部进行。例如，可以由医师或组织学家与本发明的各方面的设备远程地分析载玻片，并且可以将载玻片上应消融的位置信息反馈给该设备。
因此，在一些实施例中，上述方法包含识别样本上一个或多个受关注特征以及一个或多个受关注特征的位置的步骤。例如，本发明的各方面的一些方法包含以下步骤：
(i)识别样本上的一个或多个受关注特征；
(ii)记录样本上的一个或多个受关注特征的位置信息；
(iiI)进行样本的激光消融，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本台上的样本上，使用一个或多个受关注特征的位置信息，以形成多个羽状物；以及
(iv)对羽状物进行电离和质谱分析，从而检测羽状物中的原子以允许构建样本的图像。
本发明的各方面的一些方法包含以下步骤：
(i)用一个或多个不同的标记原子来标记样本中的多个不同的目标分子，以提供标记的样本；
(ii)识别样本上的一个或多个受关注特征；
(ii)记录样本上的一个或多个受关注特征的位置信息；
(iiI)进行样本的激光消融，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本台上的样本上，使用一个或多个受关注特征的位置信息，以形成多个羽状物；以及
(iv)对羽状物进行电离和质谱分析，从而检测羽状物中的原子以允许构建样本的图像。
例如，本发明的各方面的实施例可以包括：识别诸如细胞的受关注特征的位置；以及引导激光脉冲的猝发来对全部或部分细胞进行采样。如本文所描述的，激光脉冲的猝发被激光扫描***引导到受关注特征内的多个已知位置处，并且可以将由激光脉冲的猝发产生的羽状物检测为单个事件。
在一些情况下，位置信息可以是关于受关注特征在样本载体上的位置的绝对测量的形式。在其他情况下，受关注特征的位置信息可以以相对方式记录。例如，在用具有许多荧光特征的UV光照射之后，可以记录样本的视觉图像。受关注特征的位置可以被记录为相对于荧光特征的图案的位置信息。使用相对位置信息来识别将被消融的位置，因此减少了由于样本在设备中的不精确定位而导致的误差。用于计算受关注特征相对于此类参考图案的位置的方法对于本领域技术人员是标准的，例如通过使用重心坐标系。
在一些情况下，受关注特征，例如生物样本中的细胞，可能被其他生物材料包围，例如细胞内基质或其他可能影响受关注细胞消融的细胞。在此，使用激光扫描仪***的消融可用于清除受关注细胞周围的物质，从而允许激光脉冲猝发以连续事件或亚细胞分辨率消融目标细胞。有时，没有记录用于清除受关注特征(例如受关注细胞)周围区域的消融的数据。有时，通过消融周围区域来记录数据。可以从周围区域获得的有用信息包括周围细胞和细胞间环境中存在哪些目标分子，诸如蛋白质和RNA转录物。当对实体组织样本进行成像时，这可能会特别令人受关注，在这种情况下，直接的细胞与细胞之间的相互作用是共同的，周围的细胞中表达了哪些蛋白质等，可能对受关注细胞的状态有帮助。
因此，在本文公开的一下实施例中，该方法包含使用受关注特征的位置信息来消融细胞，包含在消融受关注细胞之前首先进行激光消融以去除围绕受关注特征的样本材料。在一些特征中，通过检查样本的光学图像来识别特征，可选地，其中样本已经用荧光标记物标记并且在荧光标记物发荧光的条件下照射样本。
否则，通常在该方法中，以之前描述的方式进行激光消融，例如在Giesen等人(2014)和WO2014169394中，鉴于本文相关的修改(例如，并非必须使用ICP来电离样本材料，也不需要使用TOF MS检测器)。例如，如下所述，也可以执行该方法，但是用OES检测代替质谱检测。
本文公开的方法还可以被提供为计算机程序产品，该计算机程序产品包括存储有指令的非暂时性机器可读介质，该指令可以用于对计算机(或其他电子设备)进行编程以执行本文所述的过程。机器可读介质可以包括但不限于硬盘驱动器、软盘、光盘、CD-ROM、DVD-ROM、ROM、RAM、EPROM、EEPROM、磁卡或光卡、固态存储设备、或适于存储电子指令的其他类型的介质/计算机可读介质。因此，本发明的各方面还提供了一种机器可读介质，该机器可读介质包含用于执行本文所公开的方法的指令。
输送导管
在某些方面，输送导管(transfer conduit)(也称为进样器)形成介于激光消融采样***和电离***之间的链路，并允许将由样本的激光消融产生的样本材料羽状物从激光消融采样***传输到电离***。可以例如通过钻穿合适的材料以形成用于羽状物通过的内腔(例如，具有圆形、矩形或其他横截面的内腔)，来形成输送导管的部分(或全部)。输送导管的内径有时在0.2mm至3mm范围内。有时，输送导管的内径可以沿其长度变化。例如，输送导管的一端可以是锥形的。输送导管的长度有时在1厘米至100厘米的范围内。有时长度不超过10厘米(例如1-10厘米)、不超过5厘米(例如1-5厘米)或不超过3厘米(例如0.1-3厘米)。有时，输送导管内腔沿从消融***到电离***的整个距离(或几乎整个距离)是笔直的。其他时候，输送导管内腔在整个距离上都不是笔直的，并改变方向。例如，输送导管可以逐渐旋转90度。这种配置允许通过激光消融采样***中的样本消融产生的羽状物最初在垂直平面中移动，而输送导管入口处的轴将指向笔直向上，并在其接近电离***时水平移动(例如，ICP炬管通常被水平定向以利用对流冷却)。输送导管可以是笔直的，与进入或形成的羽状物通过的入口孔径的距离为至少0.1厘米、至少0.5厘米或至少1厘米。一般而言，通常，输送导管适于使将材料从激光消融采样***输送到电离***所花费的时间最小化。
一个或多个气体流可以将消融羽状物传递到电离***。例如，氦气、氩气或其组合可以将消融羽状物传递到电离***。在某些情况下，独立的气流可以被提供至样本室和进样器，其在夹带消融羽状物到进样器中时混合。在某些情况下，只有一种气体流，诸如当进样器入口在样本室内启动时。
输送导管入口和/或孔径
输送导管可以激光消融采样***中的入口(具体是在激光消融采样***的样本室内；因此，它也代表了样本室的主要气体出口)。输送导管的入口接收在激光消融采样***中从样本消融的样本材料，并将该样本材料输送到电离***。在一些情况下，激光消融采样***的入口是所有气体沿输送导管流向电离***的来源。在一些情况下，从激光消融采样***接收材料的激光消融采样***入口是导管的壁中的孔径，第二“输送”气体从单独的输送流入口沿着该导管流动(例如，如WO2014146724和WO2014147260中所公开)。在这种情况下，输送气体形成很大比例，并且在许多情况下，大部分气体流向电离***。激光消融采样***的样本室包括气体入口。气体通过该入口流入室，通过输送导管的入口产生了从室流出的气体流。该气体流可以捕获消融材料的单独的羽状物，并在羽状物进入输送导管中时夹带该羽状物(例如，通过输送导管的孔径可以为锥形，在本文中称为样本锥)并从样本室流出，进入穿过室上方的导管。该导管还具有从单独的输送流入口流入其中的气体(图中的左手侧，由输送流箭头指示)。包含输送流入口、激光消融采样***入口并从输送导管开始的组件也可以称为流动池(如在WO2014146724和WO2014147260中)，该输送导管将被消融的样本材料带向电离***。
输送流至少承担三个角色：它沿电离***的方向冲洗进入输送导管的羽状物，并防止羽状物材料接触输送导管的侧壁；它在样本表面上方形成“保护区域”，并确保在受控环境下进行消融；并且它增加了输送导管中的流速。通常，捕获气体的粘度低于输送气体的粘度。这有助于将样本材料的羽状物限制在输送导管中心的捕获气体中，并使激光消融采样***下游的样本材料的羽状物扩散最小化(因为在流的中心，输送速率更加稳定且接***坦)。气体可以是例如但不限于氩气、氙气、氦气、氮气或这些气体的混合物。常见的输送气体是氩气。氩气特别适合在羽状物到达输送导管壁之前阻止羽状物扩散(并且在电离***是基于氩气的ICP的设备中，它还有助于提高仪器的灵敏度)。捕获气体优选是氦气。然而，捕获气体可以被例如氢气、氮气或水蒸气的其他气体替代或包含它们。在25℃下，氩气的粘度为22.6μPas，而氦气的粘度为19.8μPas。有时，捕获气体是氦气，而输送气体是氩气。
如WO2014169394中所述，样本锥的使用使目标与输送导管的激光消融采样***入口之间的距离最小化。由于样本与捕获气体可以通过的锥点之间的距离减小，因此可以在减少湍流的情况下提升对样本材料的捕获，并减少消融后的样本材料的羽状物的扩散。因此，输送导管的入口是样本锥顶端的孔径。锥体伸入样本室中。
样本锥的可选修改是使其不对称。当锥对称时，恰在中心处来自各个方向的气流都将被抵消，因此沿着样本表面在样本锥的轴处的总气流为零。通过使锥不对称，沿样本表面会产生非零速度，这有助于从激光消融采样***的样本室冲洗出羽状物材料。
在实践中，可以采用对样本锥的任何修改，该修改会沿样本表面在锥的轴处导致非零矢量气体流。例如，不对称的锥可包含凹口或一系列凹口，其适于沿样本表面在锥的轴处产生非零矢量气体流。非对称锥可包含在锥侧面中的孔口，该孔口适于沿样本表面在锥的轴处产生非零矢量气体流。该孔口将使锥周围的气体流失衡，从而再次在目标处沿样本表面在锥的轴处产生非零矢量气体流。锥的侧面可以包含一个以上的孔口，并且可以包含一个或多个凹口以及一个或多个孔口。凹口和/或孔口的边缘通常被平滑化、倒圆或倒角，以防止或最小化湍流。
取决于捕获和输送气体的选择及其流速，锥的不对称性的不同方向将适用于不同情况，并且在技术人员的能力范围内可以适当地识别出气体和流速对于每个方向的组合。
如本发明的各方面中所使用的，所有以上的适应可以存在于单个非对称样本锥中。例如，锥可以被非对称地截断并且由两个不同的椭圆形锥半部形成，锥可以被非对称地截断并且包含多个孔口中的一个等。
因此，样本锥适于捕获在激光消融采样***中从样本消融的材料羽状物。在使用中，将样本锥可操作地定位在样本附近，例如，如上所述，通过在可移动样本载体托盘上操纵激光消融采样***中的样本来进行操作。如上所述，被消融的样本材料的羽状物通过样本锥的窄端处的孔径进入输送导管。孔径的直径可以是：a)可调节的；b)尺寸被设计成能防止消融的羽状物进入输送导管时对其的扰动；和/或c)约等于消融羽状物的横截面直径。
锥形导管
在具有较小内径的管中，相同的气体流速以较高的速度移动。因此，通过使用具有较小内径的管，可以以给定的流速更快速地将气流中携带的消融样本材料的羽状物沿限定距离输送(例如，在输送导管中从激光消融采样***到电离***)。可以快速分析单个羽状物的关键因素之一是，在从通过消融产生羽状物的时间到在设备的质谱仪组件中检测到其组成离子的时间(检测器上的瞬态时间)期间，羽状物已扩散了多少。因此，通过使用窄的输送导管，消融和检测之间的时间减少了，从而意味着扩散减少了，因为扩散能够发生的时间更少了，最终结果是每个消融羽状物在检测器上的瞬态时间减少了。较短的瞬态时间意味着每单位时间可以产生和分析更多的羽状物，从而更高质量和/或更快速地产生图像。
锥体可以包含输送导管的内径沿着输送导管长度的所述部分逐渐变化(即，管的内径是通过该管截取的横截面，该横截面沿着从朝向入口(在激光消融采样***端)到出口(在电离***端)的部分的端部的部分减小)。通常，导管附近发生消融的区域具有相对较宽的内径。锥体之前导管的体积较大，有助于限制消融产生的材料。当消融的颗粒从消融斑点飞离时，它们以高速行进。气体中的摩擦力使这些颗粒变慢，但羽状物仍可在亚毫米范围内扩散到毫米级。与壁之间留有足够的距离，这有助于将羽状物控制在流中心附近。
因为宽的内径部分仅是短的(1-2mm的数量级)，所以如果羽状物在内径较窄的输送导管的较长部分中花费更多的时间，对总的瞬态时间没有明显的影响。因此，较大的内径部分用于捕获消融产物，较小的内径导管用于将这些颗粒快速输送至电离***。
窄的内径部分的直径由对应于湍流开始的直径限制。可以计算出圆管和已知流的雷诺(Reynolds)数。通常，雷诺数大于4000将指示湍流，因此应避免。大于2000的雷诺数将指示过渡流(介于非湍流和湍流之间)，因此也可能需要避免。对于给定质量的气体流，雷诺数与导管的直径成反比。输送导管的窄内径部分的内径通常窄于2mm，例如窄于1.5mm、窄于1.25mm、窄于1mm，但大于导管中每分钟4升氦气流具有大于4000的雷诺数时的直径。
输送导管的恒定直径部分和锥体之间的过渡中的粗糙或甚至有角的边缘可能会在气体流中导致湍流，通常可以避免。
牺牲流(sacrificial flow)
在较高流量下，导管中发生湍流的风险增加。特别是在输送导管具有小内径(例如1mm)的情况下。然而，如果使用轻气体(诸如氦气或氢气)代替传统上用作输送气体流的氩气，则可以在具有小内径的输送导管中实现高速输送(高达300m/s以上)。
高速输送带来了问题，因为这可能导致消融的样本材料的羽状物在没有发生可接受水平的电离的情况下通过电离***。电离水平可能会下降，因为增加的冷气体流会降低炬管端部的等离子体温度。如果样本材料的羽状物没有被电离到合适的水平，则来自被消融的样本材料的信息将会丢失——因为其成分(包括任何标记原子/元素标签)无法被质谱仪检测到。例如，在ICP电离***中，样本在炬管端部可能很快通过等离子体，以致等离子体离子没有足够的时间作用于样本材料以使其电离。可以通过在输送导管的出口处引入流牺牲***，来解决由窄内径的输送导管中的高流量、高速输送引起的这个问题。流牺牲***适于接收来自输送导管的气体流，并且仅将该流的一部分(该流的中心部分包含任何消融的样本材料羽状物)向前传递到通向电离***的进样器中。为了促进来自输送导管的气体在流牺牲***中扩散，可以将输送导管出口扩口。
流牺牲***的位置靠近电离***，因此从流牺牲***通向电离***的管(例如进样器)的长度是短的(例如，～1cm；与输送导管的长度相比，输送导管的长度通常为数十厘米级，例如～50cm)。因此，由于整个输送***的相对较慢的部分要短得多，因此从流牺牲***通向电离***的管内的较低气体速度不会显著影响总输送时间。
在大多数布置中，不希望或在某些情况下不可能显著增加从流牺牲***传递到电离***的管(例如进样器)的直径，以此作为降低在体积流率下气体速度的一种方法。例如，在电离***为ICP的情况下，来自流牺牲***的导管在ICP炬管的中心形成进样器。当使用更宽的内径进样器时，信号质量会降低，因为不能将消融的样本材料的羽状物如此精确地注入等离子体的中心(等离子体的中心是最热的，因此是电离效率最高的部分)。强烈优选内径为1mm或更窄的进样器(例如，内径为800μm以下、诸如600μm以下、500μm以下、或400μm以下)。其他电离技术依赖于要在三维空间中以相对小的体积进行电离的材料(因为只能在较小的体积中实现电离所需的能量密度)，因此具有较宽内径的导管意味着通过导管的大部分样本材料在能量密度足以使样本材料电离的区域之外。因此，从流牺牲***到电离***的窄直径的管也被用于具有非ICP电离***的设备中。如上所述，如果样本材料中的羽状物没有被电离到合适的水平，则来自被消融的样本材料的信息会丢失——因为成分(包括任何标记原子/元素标签)无法被质谱仪检测到。
泵送可用于帮助确保牺牲流与进入电离***入口的流之间的期望分流比。因此，有时，流牺牲***包含附接到牺牲流出口的泵。可以将受控节流器添加到泵中，以控制牺牲流。有时，流牺牲***还包含适于控制节流器的质量流控制器。
在使用昂贵的气体的情况下，可以使用已知的气体净化方法对从牺牲流出口泵出的气体进行净化并循环回同一***中。如上所述，氦气特别适合作为输送气体，但价格昂贵。因此，减少氦气在***中的损失是有利的(即，当氦气进入电离***并被电离时)。因此，有时将气体净化***连接到流牺牲***的牺牲流出口。
电离***
为了产生元素离子，需要使用一种硬电离技术，该技术能够蒸发、雾化和电离被雾化的样本。
电感耦合等离子炬
通常，在将要分析的材料传递到质量检测器进行分析之前，使用电感耦合等离子体将材料电离。它是一种等离子源，其中能量由电磁感应产生的电流提供。电感耦合等离子体维持在可以由多个同心管(例如，三个)组成的炬中，最里面的管被称为进样器。
图11是激光消融质谱细胞仪的示例性示意图，其包括激光消融源，该激光消融源可以连接到进样器(诸如管)，并安装用于将样本输送到感应耦合等离子体(ICP)源(也被称作ICP炬)中。ICP炬的等离子体可使样本汽化和电离，形成可被质量分析仪(诸如飞行时间或扇形磁质谱仪)接收的离子。激光消融源可以包括激光器和样本室。激光消融源可以包括如本文所述的***。在某些方面，激光消融源可以是图1至图5中任一者所描述的***。进样器可以耦接至激光消融源的样本室。
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进样器可以耦接至本文所述的样本室。进样器可以包含位于样本支撑物上方的入口或孔径，从而可以将通过激光消融从样本释放的材料携带到进样器中。样本室可以包括一个或多个气体入口，用于将消融羽状物携带到进样器中，而进样器可以包括用于将在进样器中捕获的消融羽状物输送到ICP炬的输送气体入口(例如，屏蔽气体入口)。在某些方面，该***可以包括单个气体源。
进样器可以在样本室的外部具有入口和出口，或者可以在样本室的内部具有入口。例如，当进样器与激光辐射位于样本(或样本支撑物)的同一侧时，进样器可以包括激光辐射通过的窗口，以及孔径，激光辐射通过该孔径，并且进样器将捕获的得到的激光消融羽状物通过该孔径然后被传递到ICP炬。可替代地，进样器可以延伸穿过透镜、窗口或其他光学器件以进行激光消融。在另一实例中，激光辐射可以与来自进样器的样本(或样本室)相对，并且可以穿过样本支撑物。当激光辐射穿过样本支撑物撞击样本时，进样器可能包含靠近激光消融部位的入口，与激光辐射的一侧相对。在某些方面，进样器的入口或孔径可以呈样本锥的形式(例如，其窄端朝向激光消融部位定向)。
进样器可以是刚性的，并且可以沿直线从激光消融部位延伸到ICP炬。进样器可以很短，并且长度可以小于20、小于10、小于5cm或小于3cm。直和/或短的进样器可以减少将激光消融羽状物传递到ICP炬的时间，并且/或者可以减少激光消融羽状物的散布，从而可以每秒分析更多不同的激光消融羽状物。在某些方面，诸如激光消融光学器件、照明光学器件、图像传感器(例如CCD或CMOS)的光学器件可以远离进样器放置(例如，在来自进样器的样本支撑物的相对侧)。如上所述，进样器可以在短距离内将消融羽状物传递到ICP-MS***。
流体和/或光学器件的各方面可以被配置成允许从进样器孔径或入口到ICP-MS***的短的和/或直的路径。例如，一些光学器件或所有光学器件都可以与来自进样器的样本支撑物相对放置。可替代地或附加地，进样器可以穿过光学元件，诸如一个或多个透镜和/或镜。
提供维持等离子体的电磁能的感应线圈位于炬的输出端周围。交变电磁场每秒会反转极性数百万次。在两个最外面的同心管之间供应氩气。通过放电引入自由电子，然后在交变电磁场中加速，然后它们与氩原子碰撞并使它们电离。在稳态下，等离子体主要由氩原子组成，并带有一小部分的自由电子和氩离子。
ICP可以保留在炬中，因为两个最外管之间的气流使等离子体远离炬的壁。在进样器(中心管)和中间管之间引入的第二氩气流使等离子体保持远离进样器。将第三气流引入到炬中心的进样器中。通过进样器将要分析的样本引入等离子体中。
ICP可以包含内径小于2mm且大于250μm的进样器，用于将样本中的材料引入等离子体中。进样器的直径是指在接近等离子体的端部处的进样器的内径。远离等离子体延伸，进样器可以具有不同的直径，例如更宽的直径，其中直径的差异是通过直径的逐步增加或由于进样器沿其长度呈锥形而实现的。例如，进样器的内径可以在1.75mm和250μm之间，诸如直径在1.5mm和300μm之间、直径在1.25mm和300μm之间、直径在1mm和300μm之间、直径在900μm和300μm之间、直径在900μm和400μm之间，例如直径为850μm左右。内径小于2mm的进样器与直径较大的进样器相比，具有明显的优点。此特征的一个优点是，使用较窄的进样器可减少在将样本材料的羽状物引入等离子体时在质量检测器中检测到的信号的瞬变(样本材料的羽状物是特定及气态的材料云团，其已通过激光消融采样***从样本中去除)。因此，减少了从将样本材料的羽状物被引入ICP中进行电离直到在质量检测器中检测到最终离子的分析所花费的时间。分析样本材料的羽状物所花费的时间减少使得在任何给定时间段内都可以检测到更多的样本材料的羽状物。同样，具有较小内径的进样器可将样本材料更准确地引入到电感耦合等离子体的中心，在中心处发生更有效的电离(与直径更大的进样器相比，进样器可将样本材料更多地引入到等离子体的边缘，在该处电离效率不高)。
ICP炬(Agilent、Varian、Nu Instruments、Spectro、Leeman Labs、PerkinElmer、Thermo Fisher等)和进样器(例如，来自Elemental Scientific和Meinhard)是可获得的。
对侧消融(opposite side ablation)
如上所述，辐射(例如，激光辐射)可以穿过样本支撑物以撞击在样本上。辐射可以由诸如紫外、红外或绿色激光器的fs激光产生。当激光是紫外激光时，样本载体可以是石英或二氧化硅。当激光是红外或绿色时，样本支撑物可以是玻璃。绿色fs激光可以允许玻璃支撑物(例如，玻璃载玻片)，从成本的角度来看这是优选的，同时仍然可以实现高分辨率。
其他电离技术
电子电离
电子电离涉及用电子束轰击气相样本。电子电离室包括电子源和电子陷阱。电子束的典型来源是铼或钨丝，通常以70电子伏特的能量工作。可从Markes International获得用于电子电离的电子束源。电子束指向电子陷阱，并且平行于电子行进方向施加的磁场使电子以螺旋路径行进。气相样本被引导通过电子电离室，并与电子束相互作用形成离子。电子电离被认为是一种困难的电离方法，因为该过程通常会导致样本分子碎裂。可商购获得的电子电离***的实例包括高级马库斯电子电离室(Advanced Markus ElectronIonisation Chamber)。
基于激光消融的采样和电离***的可选其他组件
离子偏转器
质谱仪在离子碰到检测器表面时会检测它们。离子与检测器的碰撞会导致电子从检测器表面释放出来。这些电子在通过检测器时会倍增(第一个释放的电子在检测器中敲除其他电子，然后这些电子撞击次级板，从而进一步增大电子数)。撞击检测器阳极的电子数量产生电流。可以通过改变施加到次级板上的电压来控制撞击阳极的电子数量。电流是一个模拟信号，该信号然后可以通过模数转换器将其转换为击中检测器的离子计数。当检测器在其线性范围内运行时，电流可以直接与离子数相关。一次可以检测到的离子数量有一个限制(可以表示为每秒可检测到的离子数量)。在此之上，离子撞击检测器释放的电子数量不再与离子数量相关。因此，这对检测器的定量能力设置了上限。
当离子撞击检测器时，其表面会被污染损坏。随着时间的流逝，这种不可逆的污染损害会导致当离子撞击检测器时，检测器表面释放的电子更少，最终结果是需要更换检测器。这被称为“检测器老化”，是MS中的一种众所周知的现象。
因此，可以通过避免将过量的离子引入MS中来延长检测器的寿命。如上所述，当撞击MS检测器的离子总数超过检测上限时，由于离子不再定量，因此信号不如离子数量低于上限时提供的信息多。因此，希望避免超过检测上限，因为这会导致检测器加速老化而不会产生有用的数据。
通过质谱分析大量离子涉及正常质谱中未发现的特定挑战。具体地，典型的MS技术涉及将低且恒定水平的材料引入检测器中，其不应接近检测上限或导致检测器的加速老化。另一方面，基于激光消融和解吸的技术可在MS的非常短的时间窗口内分析相对大量的材料：例如，从组织样本的细胞尺寸的贴片中提取的离子比通常在MS中分析的小包离子大得多。实际上，这是检测器的故意几乎过载，分析的是由于消融或提升引起的离子堆积。在两次分析事件之间，信号处于基线状态(信号接近零，因为没有故意将来自标记原子的离子从采样和电离***进入MS；一些离子将不可避免地被检测到，因为MS不是完全真空)。
因此，在本文所述的设备中，存在加速检测器老化的风险，因为来自被大量可检测原子标记的电离样本材料包中的离子，可能会超过检测上限并损坏检测器而没有提供有用的数据。
为了解决这些问题，该设备可以包含位于采样和电离***与检测器***(质谱仪)之间的离子偏转器，该离子偏转器可操作以控制离子进入质谱仪。在一种布置中，当打开离子偏转器时，将从采样和电离***接收的离子偏转(即，离子的路径已被更改，因此它们不会到达检测器)，但是当偏转器关闭时，离子将不会被偏转并到达检测器。离子偏转器的部署方式将取决于采样和电离***以及设备的MS的布置。例如，如果离子进入MS的通道与离开采样和电离***的离子路径不直接一致，则默认情况下将打开适当布置的离子偏转器，以引导来自采样和电离***的离子进入MS。当检测到由被认为可能会使MS超载的电离样本材料包的电离引起的事件时(请参见下文)，离子偏转器被关闭，因此来自该事件的其余电离材料不会被偏转到MS中而是可以简单地撞击***的内部表面，从而延长了MS检测器的使用寿命。在防止了来自破坏性事件的离子进入MS之后，离子偏转器返回到其原始状态，从而使来自随后被电离的样本材料包中的离子进入MS并被检测到。
可替代地，(在正常操作条件下)从采样和电离***中出来的离子在进入MS之前方向不变的布置中，离子偏转器将关闭，而来自采样和电离***的离子将穿过它以在MS中进行分析。为了防止在检测到检测器潜在过载时造成损坏，在这种配置下，将打开离子偏转器，然后转移离子，使离子不会进入检测器，以防止损坏检测器。
通过样本材料的电离(诸如由激光消融或解吸产生的材料羽状物)进入MS的离子不会同时全部进入MS，而是以具有遵循围绕最大频率的概率分布曲线的频率的峰的形式进入MS：从基线开始，起初少量离子进入MS并被检测到，然后离子的频率增加到最大，然后离子数量再次减少并下降到基线。可以识别出可能损坏检测器的事件，因为不是峰值处前沿的离子频率缓慢增加，而是击中检测器的离子数量迅速增加。
在分析电离的样本材料包中的离子期间，撞击TOF MS检测器(以下将讨论的一种特殊类型的检测器)的离子流不是连续的。TOF包含脉冲器，该脉冲器以脉冲组的形式定期将离子释放到TOF MS的飞行室中。通过在已知的同时全部释放离子，可以确定飞行时间质谱。用于确定飞行时间质谱确定的离子脉冲释放之间的时间被称为TOF MS的提取或推送。推送的时间为微秒级。因此，来自采样和电离***的一个或多个离子包的信号覆盖了许多推送。
因此，当一次推送中离子计数读数从基线跃升到很高的计数值时(即离子的第一部分来自特定的被电离的样本材料包)，则可以预测出样本材料包电离所产生的离子主体将更大，因此超过了检测上限。在这一点上，可以操作离子偏转器以确保将有害的大部分离子引导远离检测器(通过激活或去激活，取决于***的布置，如上所讨论的)。
基于四极的合适的离子偏转器在本领域中是可获得的(例如，可以从Colutron研究公司和Dreebit公司获得)。
b.基于解吸的采样和电离***
基于解吸的分析仪通常包含三个组件。第一个是解吸***，用于从样本中产生样本材料块以进行分析。在可以检测到解吸的样本材料块中的原子(包括以下讨论的任何可检测的标记原子)之前，必须将样本电离(并雾化)。因此，该设备包含第二组件，该第二组件是电离***，该电离***使原子电离以形成元素离子，从而能够基于质荷比通过MS检测器组件(第三组件)对其进行检测。基于解吸的采样***和电离***通过输送导管连接。在许多情况下，基于解吸的采样***也是基于激光消融的采样***。
解吸采样***
在一些情况下，不是使用激光消融来产生样本材料的颗粒状和/或汽化羽状物，在没有实质改变样本并将其转化为样本小颗粒和/或汽化的情况下，从样本所位于的样本载体解吸大块体的样本材料(例如参见WO2016109825的图8和所附描述，其通过引用并入本文)。在本文中，术语“块(slug)”用于指代该解吸材料(本文讨论的样本材料包的一种特定形式)。块的尺寸可以为10nm至10μm、100nm至10μm，并且在某些情况下可以为1μm至100μm。该过程可以被称为样本弹射。通常，块代表单个细胞(在这种情况下，该过程可以被称为细胞弹射)。
从样本释放的样本材料块可以是一部分样本，该部分样本已在解吸步骤之前被切成单独的块用于解吸，可选地在将样本***设备之前的过程中。在分析之前将样本分为离散的块，这称为结构化样本。因此，这些单个块中的每一个都代表样本的离散部分，该离散部分可以在设备中解吸、电离和分析。通过分析来自离散位点的块，可以以与通过上述激光消融采样***消融的样本的每个位置相同的方式来构建图像，其中每个块代表图像的像素。
可以通过各种方法制备结构化样本。例如，可以使用包含被配置为切割生物样本的形态特征的样本载体。此处，将生物样本施加到载体的表面上，这将导致切割形态特征并对样本进行切片，进而使生物材料的部分被特征之间的多个离散位点保留，从而提供结构化生物样本。可替代地，样本载体可以不包含此类形态特征(实际上，平坦的表面，如显微镜载玻片，可选地如下所述进行功能化)，在这种情况下，可以将样本施加到样本载体上，并且可以对样本进行切片以限定可以被解吸用于电离和分析的样本块。如果样本是组织切片，则可以通过诸如刀片或印戳的机械工具来完成样本的切片。可替代地，可以在相同或单独的样本制备设置中通过激光消融去除待解吸的样本切片周围的材料。在某些技术中，可以通过采用聚焦电子或离子束的设置来去除材料。聚焦的电子束或离子束会导致分段切片之间的切口特别窄(可能在10nm级别)，从而导致像素大小为1μm级，在某些情况下为100nm。
可以从载体释放样本材料的块，并且样本材料的每个离散部分依次作为离散事件被引入检测器中进行分析(通过以下讨论的技术产生图像的像素)。与在常规质谱分析或质谱分析中随机引入生物样本相比，按顺序引入离散材料的益处包括更高的样本处理速率。这是因为该块优选作为单件物质从样本室输送到电离***，因此无法像消融材料的羽状物一样在气体流(特别是其中存在湍流的气体流)中扩散。
用于采样的解吸
可以通过热能、机械能、动能以及前述任何一种的组合从样本中解吸样本材料。这种采样特别适用于分析生物样本。
在某些情况下，可以通过热机制从样本中释放样本材料。例如，样本载体的表面变得足够热以解吸样本材料块。可以用例如聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)聚合物或PMMA聚合物膜，涂覆样本载体以促进块解吸过程。热量可以由辐射源提供，诸如激光(例如上面讨论的激光消融采样***的激光)。施加到表面的能量应该足以解吸生物材料，如果来自生物样本，则优选不改变样本材料。可以使用任何合适的辐射波长，辐射波长可以部分取决于样本载体的吸收特性。样本载体的表面或层可以涂覆有吸收剂或包括吸收剂，该吸收剂吸收激光辐射以转换成热。辐射可以被传递到载体的除了样本所位于的表面之外的表面，或可以诸如通过载体的厚度被传递到承载样本的表面。被加热的表面可以是样本载体的多层结构的表面层或可以是内部层。使用激光辐射能量的一个实例是一种被称为LIFTing(LaserInduced Forward Transfer；参见例如Doraiswamy等人，2006，Applied Surface Science，52:4743-4474；Fernández-Pradas，2004，Thin Solid Films 453-454:27–30；Kyrkis等人，Recent Advances in Laser Processing of Materials，Perriere等人编，2006，Elsivier)的技术，其中样本载体可以包含解吸膜层。解吸膜可以吸收辐射以引起解吸膜和/或生物样本的释放(例如，在一些情况下，样本膜从样本载体与生物样本一起解吸，在其他情况下，膜保持附着到样本载体，生物样本从解吸膜解吸)。
加热解吸可以在纳秒、皮秒或飞秒的时间范围内进行，具体取决于用于解吸的激光。
样本可以通过可裂解的光反应性部分附接至样本载体。在用辐射(例如来自激光消融采样***的激光***中的激光)照射可裂解的光反应性部分后，该光反应性部分可以裂解以释放样本材料。样本载体可以包含(i)将样本偶联至样本载体的可裂解的光反应性部分，以及(ii)如上所述的解吸膜。在这种情况下，第一激光辐射脉冲可用于引起光反应性部分的裂解，第二激光辐射脉冲可用于靶向解吸膜，从而通过提升使样本与样本载体分离(或通过其他方式引入的热能脉冲可用于加热解吸膜，从而导致样本材料与样本载体分离)。第一脉冲和第二脉冲可以具有不同的波长。因此，在一些方法中(例如，包含消融和解吸两者)，样本与样本载体的分离可能涉及多个不同波长的激光脉冲。在一些情况下，可以通过相同的激光脉冲来完成光反应性部分的裂解和提升。
样本载体可以包括化学反应性物质的涂层或层，其赋予样本动能以从表面释放样本。例如，化学反应性物质可以释放气体，诸如，例如H2、CO2、N2或氢氯氟烃。此类化合物的实例包括起泡剂和发泡剂，它们在加热时释放出气体。气体的产生可用于将动能传递给解吸的样本材料，从而可提高材料的重现性和释放方向。
样本载体可以包含光引发的化学反应物，其发生放热反应以产生热量以解吸样本材料。上面段落中讨论的载体涂层，或者实际上是该载体中的特定化学链接(被激光照射以从载体中释放样本材料块)是可以被激光辐射波长靶向的材料的实例。
在根据本发明的各方面的设备中，以上关于基于激光消融的采样***所讨论的激光扫描***也可以应用于其中一些或全部样本材料通过解吸被引入进行电离和分析的设备和技术中。激光扫描***的优势再次源于该***快速消融样本上各种斑点的能力。因此，可以通过对靶向例如解吸膜的样本发射激光脉冲的快速猝发来进行LIFTing，从而从样本中释放出材料块。这样做时，可以使用激光脉冲的特定图案来有效地解吸该块。一个此类实例是螺旋形图案，它从细胞的***向内移动，如图10所示。因此，在一些实施例中，通过将一系列激光辐射脉冲引导到待以螺旋形图案方式解吸的样本材料上来实现解吸，可选地在一系列脉冲中以猝发的形式传递，诸如其中猝发中的脉冲的持续时间短于10-12s。通常，在进行消融时，消融的位置被分辨为单独的、不重叠的斑点。然而，当使用解吸作为将样本材料引入设备的手段时，则可以使用重叠的斑点，例如以确保去除在特定位置将样本锚定到样本载体的所有解吸膜。发明人已经发现，利用单个激光脉冲来解吸细胞，该激光脉冲具有足够大的斑点尺寸以从样本载体完全解吸细胞，这通常会导致材料块的破裂。一旦样本材料块分解成较小的部分，消融块中的材料的瞬态时间就会增加，这是因为随着从样本被解吸的室穿过输送导管、到达电离***、然后到检测器上，材料不可避免地散布开来。因此，如果样本是例如细胞涂片，则保持解吸的团块的完整性使得能够以最快的速率分析消融的块，这意味着最快的细胞分析速率。单个细胞作为离散块解吸，通常保持其完整性，直到电离，提供了机会以与CyTOF(Fluidigm，美国加利福尼亚州)分析液体溶液中的细胞的速率相似的速率分析载玻片中的单个细胞。然而，从载玻片上解吸单个细胞提供了附加的优点，即可以首先在视觉上分析细胞，因此意味着可以选择受关注细胞，以及例如能够排除错误的细胞类型的细胞，从而提高分析效率。此外，这意味着可以选择要解吸的材料块，以使它们实际上是单个细胞。有时，在分析液体样本时，细胞会成簇地聚集在一起，成为更高的多聚体的双联体、三联体，或偶然地，由于样本引入过程，可能会在同一事件中分析两个离散的细胞。因此，来自两个或多个细胞的原子一起进入电离和检测***，不仅导致结果不准确，而且由于MS检测器的过载而可能导致设备损坏。因此，如本发明的各方面所提供的通过使用激光扫描所允许的通过解吸的单细胞分析而没有解吸的块的破裂或具有最小程度的破裂，因此提供了优于本领域已知的分析模式。
通常，受关注样本特征/区域并不代表离散位置上的离散实体，诸如孤细胞，该位置很容易隔离解吸。取而代之的是，受关注细胞可能被其他不需要或不期望分析的细胞或材料所包围。因此，尝试进行受关注特征/区域的解吸(例如，提升)可能会同时解吸受关注细胞和周围材料。来自被承载于除受关注特定特征/区域(例如细胞)之外的解吸材料块中的样本周围区域(例如来自已被标记的其他细胞)的原子，诸如元素标签中使用的标记原子(参见下文讨论)，可能因此会污染受关注位置的读数。
消融和解吸(诸如通过提升)技术可以组合在一个方法中。例如，为了在样本载体上的生物样本(例如组织切片样本或细胞悬液分散液)上进行受关注特征/区域(例如细胞)的精确解吸，可以使用激光消融来消融受关注细胞周围的区域，以清除其他材料。在通过消融清除周围区域之后，可以从样本载体解吸受关注特征/区域，然后进行电离，并按照标准质谱仪或质谱仪程序通过质谱仪进行分析。与以上讨论一致，可选地在已经使用消融来清除将被解吸的位置周围的区域之后，可以使用热、光解、化学或物理技术从受关注特征/区域解吸材料。通常，采用提升的方式将材料块与样本载体分离(例如，上面已经涂覆了解吸膜以辅助提升过程的样本载体，如上面关于离散的样本材料块的解吸所讨论的)。
因此，本发明的各方面提供了一种分析样本的方法，该方法包含
(i)使用激光辐射解吸样本材料块，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本台上的样本上；以及
(ii)电离所述样本材料块，并通过质谱法检测块中的原子。
样本可以在样本载体上，并且在一些情况下，激光辐射被引导通过样本载体以从样本载体解吸样本材料块。
在一些实施例中，该方法另外包含在步骤(i)之前对样本进行激光消融。有时，样本的消融会产生一个或多个样本材料羽状物，该羽状物会被单独电离，并通过质谱法检测羽状物中的原子。有时，该方法进一步包含在步骤(i)之前的附加步骤，该附加步骤用一个或多个不同的标记原子/元素标签标记样本中的多个不同目标分子，以提供标记的样本。在该方法的一些变体中，使用激光消融来消融受关注特征/区域周围的材料，以在将受关注特征/区域中的样本材料作为材料块从样本载体上解吸之前清除周围区域。
可以在执行激光消融和解吸(例如通过提升)之前通过另一种技术来识别受关注特征/区域。包括相机(诸如，基于电荷耦合器件的图像传感器(CCD)相机或CMOS相机或基于有源像素传感器的相机)或前述部分中所述的任何其他光检测装置是启用这些技术的一种方式，用于在线和离线分析。相机可用于扫描样本以识别特别受关注细胞或特别受关注特征/区域(例如，特定形态的细胞)。一旦确定了此类位置，就可以在将激光脉冲引导到受关注特征/区域周围的区域之后提升位置，以便在提升位置(例如细胞)之前通过消融清除其他材料。该过程可以是自动化的(***可以识别、消融和提升受关注特征/区域)或半自动化的过程(***的用户，例如临床病理学家，可以识别受关注特征/区域，然后***将以自动方式执行消融和提升)。这可以显著提高进行分析的速度，因为不需要消融整个样本来分析特定细胞，而是可以对受关注细胞进行特异性消融。
相机可以记录来自显微镜(例如共焦显微镜)的图像。可以通过光学显微镜进行识别，例如通过检查细胞形态或细胞尺寸，或关于该细胞是否为离散的单个细胞(与成簇的细胞的成员相反)。有时，可以对样本进行特殊标记，以识别受关注特征(例如细胞)。如上文关于消融视觉识别的受关注特征/区域的方法所讨论的，通常，荧光标记物被用于特异性地染色受关注细胞(诸如通过使用标记的抗体或标记的核酸)；为了简洁起见，在此不完整重复该部分，但是本领域的技术人员将立即理解，那些方法的特征可以应用于基于解吸的方法，并且这在本文档的技术教导之内。高分辨率光学图像在光学技术和提升的这种偶联中是有利的，因为光学图像的精度随后确定了消融激光源可以被引导以消融受关注细胞周围区域的精度，该区域随后可以被解吸。
本发明的各方面还提供了一种分析包含多个细胞的样本的方法，该方法包含以下步骤：
(i)用一个或多个标记原子来标记样本中的多个不同的目标分子，以提供标记的样本；
(ii)照射样本以识别一个或多个受关注特征；
(iii)记录样本上的一个或多个受关注特征的位置信息；
(iv)使用受关注特征的位置信息从受关注特征解吸样本材料块，包含在使用激光辐射将样本材料块从该位置解吸之前，首先进行激光消融以使用激光辐射去除围绕受关注特征的样本材料，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本上；
(v)将被解吸的样本材料块电离；以及
(vi)对电离的样本材料进行质谱分析，以检测样本材料中的标记原子。
本发明的各方面还提供了上述方法的变体，例如，一种执行包含多个细胞的质量细胞计数的方法，该方法包含以下步骤：
(i)用一个或多个不同的标记原子以及一个或多个荧光标记物来标记样本中的多个不同目标分子，以提供标记的样本；
(ii)用激光辐射照射样本以激发一种或多种荧光标记；
(iii)基于荧光图案记录样本的一个或多个位置的位置信息；
(iv)使用基于荧光图案的位置信息从受关注特征解吸样本材料块，包含使用激光辐射将样本材料块从该位置解吸之前，首先进行激光消融以使用激光辐射去除围绕受关注特征的样本材料，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到样本上；
(v)将被解吸的样本材料块电离；以及
(vi)对电离的样本材料进行质谱分析，以检测样本材料中的标记原子。
有时，没有记录用于清除待解吸位置(例如受关注细胞)周围区域的消融的数据。有时，根据周围区域的消融来记录数据。可以从周围区域获得的有用信息包括周围细胞和细胞间环境中存在哪些目标分子，诸如蛋白质和RNA转录物。当对实体组织样本进行成像时，这可能会特别受关注，在这种情况下，直接的细胞与细胞之间的相互作用是常见的，周围细胞中表达的蛋白质等可能对受关注细胞的状态提供信息。
与以上所述一致，此处，由激光扫描***所引导，通过向样本发射激光脉冲的猝发，可以实现块的解吸。
相机
在基于解吸的采样***中使用的相机可以如以上所述用于基于激光消融的采样***，并且对于基于激光消融的采样***的相机的讨论应该在这里被阅读。
样本室
基于解吸的采样***中使用的样本室可以如以上所述用于基于激光消融的采样***。在对样本材料块进行采样的情况下，本领域技术人员将理解，可能需要增加气体流量以确保该材料块被夹带在气体流中并被携带到输送导管中以传输至电离***。
输送导管
基于解吸的采样***中使用的样本室可以如以上所述用于基于激光消融的采样***。在对大样本材料块进行采样的情况下，本领域技术人员将意识到，导管内腔的直径将需要适当地设置尺寸以容纳任何块，而该块不接触内腔的侧面(因为任何接触可能导致块碎裂，并导致信号重叠——导致第n个解吸事件的块中的原子散布到第n+1个或后续块的检测窗口中)。
基于解吸的***的电离***
在许多情况下，上面讨论的提升技术涉及去除相对大的样本材料块(10nm至10μm、从100nm至10μm、在某些情况下从1μm至100μm)，这些样本材料尚未转换成颗粒状和气态材料。因此，需要一种能够汽化和雾化这种相对大量的材料的电离技术。
电感耦合等离子炬
一种此类合适的电离***是电感耦合等离子体，如以上在第57页开始的部分中已经关于基于激光消融的采样和电离***所讨论的。
基于解吸的采样和电离***的可选的其他组件
离子偏转器
在基于解吸的采样***中使用的离子偏转器可以如以上所述用于基于激光消融的采样***。考虑到基于解吸的采样有可能去除完整的大样本材料块，在这种用于保护检测器的***中，离子偏转器尤其有用。
2.质量检测器***
质量检测器***的示例性类型包括四极、飞行时间(TOF)、扇形磁、高分辨率、基于单收集器或多收集器的质谱仪。
分析电离材料所花费的时间将取决于用于检测离子的质量分析仪的类型。例如，使用法拉第杯的仪器通常太慢，无法分析快速信号。总体而言，所需的成像速度、分辨率和多路复用程度将决定应使用的质量分析仪的类型(相反，质量分析仪的选择将决定可以实现的速度、分辨率和多路复用)。
一次仅以一种质荷比(m/Q，在MS中通常称为m/z)检测离子的质谱仪(例如使用点离子检测器)在成像检测中将产生不良的结果。首先，在质荷比之间切换所花费的时间限制了可以确定多个信号的速度；其次，如果离子的丰度较低，则当仪器聚焦于其他质荷比时会丢失信号。因此，优选使用提供基本上同时检测具有不同m/Q值的离子的技术。
检测器类型
四极检测器
四极质量分析仪包含四个平行杆，一端带有检测器。在一对杆和另一对杆之间施加交替的RF电位和固定的DC偏移电位，以使一对杆(每个杆彼此相对)具有与另一对杆相反的替代电位。电离的样本在平行于杆的方向上朝向检测器穿过杆的中间。所施加的电势会影响离子的轨迹，从而只有具有特定质荷比的离子才会具有稳定的轨迹，并因此到达检测器。其他质荷比的离子将与杆碰撞。
扇形磁检测器
在扇形磁质谱仪中，电离的样本通过弯曲的飞行管流向离子检测器。横跨飞行管的磁场使离子从其路径偏转。每个离子的偏转量基于每个离子的质荷比，因此只有一些离子会与检测器碰撞——其他离子将从检测器偏转。在多收集器扇区的现场仪器中，使用检测器阵列来检测不同质量的离子。在一些仪器中，诸如ThermoScientific Neptune Plus和Nu Plasma II，扇形磁与静电扇区结合在一起，提供了一种双聚焦扇形磁仪器，该仪器除了质荷比外还可以通过动能分析离子。具体地，可以使用具有Mattauch-Herzog几何形状的那些多检测器(例如SPECTRO MS，它可以使用半导体直接电荷检测器在一次测量中同时记录从锂到铀的所有元素)。这些仪器可以基本同时测量多个m/Q信号。通过在检测器中包含电子倍增器，可以提高其灵敏度。然而，阵列扇区仪器始终适用，因为尽管它们可用于检测不断增加的信号，但在信号水平降低时它们的用处不大，因此它们不太适用于特别是标签浓度高度可变的情况。
飞行时间(TOF)检测器
飞行时间质谱仪包含样本入口、在其上施加有强电场的加速室、和离子检测器。电离的样本分子包通过样本入口引入并进入加速室。最初，每个电离的样本分子具有相同的动能，但是当电离的样本分子通过加速室加速时，它们通过各自的质量分开，较轻的电离样本分子比较重的离子行进得更快。然后，检测器会在所有离子到达时对其进行检测。每个粒子到达检测器所花费的时间取决于粒子的质荷比。
因此，TOF检测器可以在单个样本中准同时记录多个质量。从理论上讲，TOF技术由于其空间电荷特性而不适用于ICP离子源，但是TOF仪器实际上可以足够快速且灵敏地分析ICP离子气雾，以实现可行的单细胞成像。尽管由于需要处理TOF加速器和飞行管中的空间电荷的影响而导致折衷，TOF质量分析仪通常在用于原子分析方面不受欢迎，但是根据本发明的组织成像可以通过仅检测标记原子而有效，因此可以去除其他原子(例如原子质量低于100的那些原子)。这导致密度较小的离子束，其聚集在(例如)100-250道尔顿区域的质量中，可以更有效地对其进行操纵和聚焦，从而有助于TOF检测并利用TOF的高光谱扫描速率。因此，可以通过将TOF检测与选择样本中不常见的标记原子相结合来实现快速成像，理想情况下，其质量应高于未标记样本中可见的质量，例如，通过使用更高质量的过渡元素。因此，使用较窄的标签质量窗口意味着将TOF检测用于有效的成像。
合适的TOF仪器可从Tofwerk、GBC科学仪器(例如Optimass 9500ICP-TOFMS)和加拿大Fluidigm(例如CyTOFTM和CyTOFTM2仪器)获得。这些CyTOFTM仪器比Tofwerk和GBC仪器具有更高的灵敏度，并且由于可快速、灵敏地检测稀土金属(诸如镧系元素(特别是在100-200m/Q范围内))质量范围内的离子，因此被已知用于质量细胞计数[xi]。本申请的质量细胞仪可以优先检测在此类质量范围内的离子。例如，本申请的设备可以被配置为选择性地检测多个质量标签的存在，诸如质量标签的镧系元素同位素。
因此，这些是与本公开一起使用的优选仪器，并且它们可以通过本领域已知的仪器设置用于成像，例如参考文献xii和xiii。他们的质量分析仪可以在高频激光消融或样本解吸的时间尺度上以高质谱采集频率准同时地检测大量标记物。它们可以测量标记原子的丰度，检测限为每个细胞约100个，从而可以灵敏地构建组织样本的图像。由于这些特征，质量细胞计数现在可以用来满足亚细胞分辨率下组织成像的灵敏度和多路复用需求。通过将质量细胞计数仪与高分辨率激光消融采样***和高快速低色散样本室相结合，可以在实际的时间范围内以高度多路复用的方式构建组织样本的图像。
TOF可以与质量分配校正器耦合。绝大多数电离事件会产生M+离子，其中单个电子已从原子中被剔除。由于TOF MS的操作模式，有时一个质量(M)的离子会渗入(或串扰)到相邻质量(M±1)的通道中，特别是在大量质量M的离子进入检测器的情况下(即，离子计数很高，但不能太高，如果设备要包含此类离子偏转器，则位于采样电离***和MS之间的离子偏转器将阻止它们进入MS)。随着每个M+离子到达检测器的时间遵循均值的概率分布(每个M已知)，当质量为M+的离子数量很高时，则一些离子将到达通常与M-1+或M+1+离子相关联的时间。然而，由于每个离子在进入TOF MS时都具有已知的分布曲线，因此基于质量M通道中的峰值，可以确定质量M的离子到M±1通道中的重叠(与已知的峰值形状相比)。该计算特别适用于TOF MS，因为在TOF MS中检测到的离子峰是不对称的。因此，由此可以校正M-1、M和M+1通道的读数，以将所有检测到的离子适当地分配给M通道。由于通过采样和电离***产生的大离子包的性质，诸如本文公开的那些涉及激光消融(或如下所述的解吸)作为从样本去除材料的技术，此类校正在校正成像数据中具有特殊的用途。在参考文献xiv、xv和xvi中讨论了通过对来自TOF MS的数据进行去卷积来改善数据质量的程序和方法。
停滞时间校正器
如上所述，MS中的信号是根据离子与检测器之间的碰撞以及离子与从检测器表面释放的电子撞击而检测到的。当MS检测到离子的高计数导致大量电子释放时，MS的检测器可能会暂时疲劳，结果是从检测器输出的模拟信号对于一个或多个后续的离子包会暂时被压制。换言之，电离的样本材料包中离子的计数特别高，导致在从电离的样本材料包中检测离子的过程中，许多电子从检测器表面和次级倍增器中释放出来，这意味着当随后被电离的样本材料包中的离子撞击检测器时，可以释放更少的电子，直到补充检测器表面和次级倍增器中的电子。
基于检测器行为的表征，可以补偿这种停滞时间(dead time)现象。第一步是分析模拟信号中的离子峰，该信号是由检测器对第n包电离样本材料的检测所导致的。峰的幅度可以由峰的高度、由峰的面积、或由峰的高度和峰的面积的组合来确定。
然后比较峰的幅度，看它是否超过预定阈值。如果幅度低于此阈值，则无需校正。如果幅度高于阈值，则将对来自至少一个后续电离样本材料包的数字信号进行校正(至少第(n+1)个电离样本材料包，但可能还会是进一步的电离样本材料包，诸如第(n+2)、(n+3)、(n+4)等)，以补偿由于第n个电离样本材料包引起的检测器疲劳而导致的这些电离样本材料包中模拟信号的暂时抑制。第n个电离样本材料包的峰的幅度越大，则需要对随后的电离样本材料包的峰进行更多的校正，并且校正的幅度将需要更大。参考文献xvii、xviii、xix、xx和xxi讨论了用于校正此类现象的方法，并且这些方法可以由停滞时间校正器应用于数据，如本文所述。
基于光发射光谱检测的分析仪设备
1.采样和电离***
a.基于激光消融的采样和电离***
包括上面关于基于质量的分析仪描述的激光扫描***的激光消融采样***可以用于基于OES检测器的***。为了检测原子发射光谱，最优选地，使用ICP使从样本去除的样本材料电离，但是可以使用任何能够产生元素离子的硬电离技术。
如本领域技术人员所理解的，关于避免基于质量的检测器的过载而描述的上述基于激光消融的采样和电离***的某些可选的其他组件可能不适用于所有基于OES检测器的***，如果不适合，则技术人员不会将其并入。
b.基于解吸的采样和电离***
上面关于基于质量的分析仪所描述的包括激光扫描***的基于解吸的采样***可以在基于OES检测器的***中使用。为了检测原子发射光谱，最优选地，使用ICP使从样本去除的样本材料电离，但是可以使用任何能够产生元素离子的硬电离技术。
如本领域技术人员所理解的，关于避免基于质量的检测器的过载而描述的上述基于解吸的采样和电离***的某些可选的其他组件，可能不适用于所有基于OES检测器的***，并且如果不适合，则技术人员不会将其并入。
c.激光解吸/电离***
基于激光解吸/电离的分析仪通常包含两个组件。第一个是用于从样本产生离子以进行分析的***。在这种设备中，这是通过将激光束引导到样本上以产生离子来实现的；在本文中，它被称为激光解吸离子产生***。这些喷射的样本离子(包括如下所述的来自标记原子的任何可检测到的离子)可以由检测器***(第二组件)例如质谱仪(检测器将在下面更详细地讨论)进行检测。这项技术称为激光解吸/电离质谱(LDI-MS)。LDI与下面更详细讨论的基于解吸的采样***不同，因为在基于解吸的采样***中，样本材料被解吸为带电荷的中性材料块，随后该材料块被电离以形成元素离子。相反，在此，由于激光照射样本而直接产生离子，因此不需要单独的电离***。
激光解吸离子产生***包含：激光器；样本室，用于容纳样本，来自激光的辐射被引导到该样本上；以及离子光学器件，其可以吸收从样本产生的离子，并将其引导至检测器进行分析。因此，本发明的方面提供了一种用于分析样本的设备，该设备包含：a.用于容纳样本的样本室；b.激光，其适于从样本解吸和电离材料，形成离子；c.离子光学器件，其被布置为对由解吸电离形成的离子进行采样，并引导它们远离样本朝向检测器；以及d.检测器，其接收来自所述离子光学器件的离子并分析所述离子，可选地进一步包含如上所述的本发明的各方面的激光扫描***。在一些实施例中，该设备包含激光，该激光适于从样本解吸和电离材料以形成元素离子，并且其中检测器从所述采样和电离***接收元素离子并检测所述元素离子。在某些情况下，LDI是矩阵辅助的(即MALDI)。
在此过程中，一些分子达到了一定的能级，在该能级上它们从样本解吸并被电离。离子可能由于激光照射而直接作为初级离子出现，也可能作为次级离子出现，这些次级离子是由电荷中性物质与初级离子的碰撞(例如质子转移、阳离子化和电子捕获)形成的。在一些情况下，如下所述，在制备样本时通过添加到样本中的化合物(例如基质)来辅助电离。
激光器
各种不同的激光器可以用于LDI，包括以上关于激光消融采样***的激光所讨论的商用激光器，这些激光器根据需要适于使离子解吸。因此，在一些实施例中，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸和电离材料，形成元素离子，并且其中检测器从采样和电离***接收元素离子，并且适于检测元素离子。有时，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸和电离材料，从而形成分子离子，并且其中检测器从采样和电离***接收分子离子，并且适于检测分子离子。在其他情况下，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸和电离材料，从而形成元素离子和分子离子，并且其中检测器从采样和电离***接收离子，并且适于检测元素离子和分子离子两者。
示例性激光器包括在193nm、213nm或266nm处发射的那些激光(深紫外激光器，其可以引起离子从样本释放，而无需基质来促进电离，如在MALDI中)。Le Pogam等人(2016)(Scientific Reports 6，文章编号：37807)描述了在355nm处进行样本在激光辐照后代表地衣代谢物的离子的解吸。
如上所述的飞秒激光器在特定的LDI应用中也是有利的。
为了快速分析样本，需要高频率的消融，例如大于200Hz(即每秒多于200个激光发射，每秒产生多于200个离子云)。通常，由激光***产生的离子云的频率为至少400Hz，诸如至少500Hz、至少1kHz、至少10kHz、至少100kHz或至少1MHz。例如，激光***的消融频率在200Hz-1MHz范围内、在500Hz-100kHz范围内、在1kHz-10kHz范围内。
如上面关于激光消融采样***的解释，激光辐射可以经由各种光学组件被引导到样本，并聚焦到100μm以下的斑点尺寸(即，激光辐射撞击到样本上时的激光束尺寸)，诸如50μm以下、25μm以下、20μm以下、15μm以下、或10μm或1μm以下。当用于分析包括组织切片的生物样本时，为了分析单个细胞，所用激光束的斑点尺寸将取决于细胞的尺寸和间距。例如，如果要进行单细胞分析，则在细胞彼此紧紧堆积在一起的情况下(诸如在组织切片中)，激光斑点的斑点尺寸不大于这些细胞。该尺寸将取决于样本中的特定细胞，但通常用于LDI的激光斑点的直径应小于4μm，例如在0.1-4μm、0.25-3μm或0.4-2μm的范围内。为了以亚细胞分辨率分析细胞，LDI***使用的激光斑点尺寸不大于这些细胞，更具体地说，是使用可以消融具有亚细胞分辨率的材料的激光束斑点尺寸。有时，可以使用尺寸大于细胞尺寸的斑点进行单细胞分析，例如将细胞散布在载玻片上，并在细胞之间留出空间。因此可适当地选择所使用的特定斑点尺寸，取决于被分析的细胞的尺寸。在生物样本中，细胞很少都具有相同的尺寸，因此，如果需要亚细胞分辨率成像，并且在整个离子产生过程中保持恒定的斑点尺寸，则激光斑点尺寸应小于最小的细胞。
有时，激光器可以包含以上关于激光消融采样所讨论的激光扫描仪(参见第8页)。
样本室
LDI***的样本室与上述基于激光消融和基于解吸的采样***的样本室具有许多共同点。它包含用于支撑样本的载物台。该载物台可以是可在x-y或x-y-z轴上移动的平移载物台。样本室还将包含出口，通过激光辐射从样本去除的材料可以被引导通过该出口。出口连接到检测器，使得能够分析样本离子。
样本室可以处于大气压下。在大气压下的LDI(具体是MALDI)是已知的。在此，辅助LDI产生的离子通过气体(例如氮气)的气动流从电离输送到高真空区域用于分析(例如MS检测器)(Laiko等人,2000,Anal.Chem.,72:652–657)。
在一些情况下，样本室被保持在真空或部分真空下。因此，在一些情况下，样本室压力低于50000Pa、低于10000Pa、低于5000Pa、低于1000Pa、低于500Pa、低于100Pa、低于10Pa、低于1Pa、约0.1Pa或小于0.1Pa，诸如0.01Pa以下。例如，部分真空压力可以为约200-700Pa，并且真空压力为0.2Pa以下。
如本领域技术人员将理解的，样本压力是否在(部分)真空下处于大气压的选择，取决于所执行的特定分析。例如，在大气压下，样本处理更容易，并且可以应用更软的电离。此外，可能需要气体分子的存在，以便能够发生碰撞冷却的现象，当标记物是大分子时，这可能是受关注的，不希望其断裂，例如包含标记原子或其组合的分子片段。
将样本室保持在真空状态可以防止LDI产生的样本离子与室内的其他粒子发生碰撞。在一些情况下，这可能是优选的，因为与室中的气体分子的碰撞可能会导致所产生的样本离子带走电荷。样本离子的电荷损失将导致设备无法检测到它们。
在一些实施例中，样本室包含一个或多个气体端口，气体端口被布置成使得在激光解吸/电离期间能够将一种或多种气体流输送到样本上的激光解吸/电离的位置，诸如其中一个或多个气体端口为喷嘴的形式。气体端口(例如喷嘴)可操作以在解吸和电离的时刻输送气体，为被解吸的离子提供碰撞冷却，但仅在该特定时间。在其余时间中，它们不会将气体引入室，从而减少了真空泵上的应变。
离子光学器件
样本离子束是通过位于样本附近的静电板从样本捕获的，在本领域中称为引出电极。引出电极从样本的局部去除通过激光消融解吸的样本离子。这通常是通过放置在也起作用的板上的样本和电极(样本电极)以及电压电位差大的引出电极来实现的。根据样本相对于引出电极的极性，带正电或负电的二次离子会被引出电极捕获。
在一些实施例中，在激光解吸/电离期间，跨电极的电荷是恒定的。有时，电荷在解吸/电离后发生变化，例如延迟提取，其中在由激光脉冲引起的解吸/电离后的短时间延迟之后施加加速电压。此技术可对离子能量散布产生飞行时间补偿，其中动能较大的离子比动能较低的离子以更快的速度从样本移向检测器。因此，这种速度差异会导致检测器的分辨率降低，因为并非所有离子都以相同的速度移动。因此，通过延迟在样本电极和引出电极之间施加电压，当施加加速电压时，动能较低的那些离子仍保持更靠近样本电极，因此与距目标电极更远的离子相比，它们以更大的电势开始加速。在适当的延迟时间下，较慢的离子将被充分加速，以捕获在离开脉冲加速***一定距离后进行激光解吸/电离后具有较高动能的离子。然后，相同质荷比的离子将同时通过飞行管漂移到检测器。因此，在一些实施例中，样本电极和提取电极是可控制的，以在激光短路后的设定时间在电极上施加电荷，从而引起样本的解吸/电离。
然后，样本离子通过一个或多个其他静电透镜(在本领域中称为转移透镜)转移至检测器。转移透镜将样本离子束聚焦到检测器中。通常，在具有多个转移透镜的***中，给定分析中仅使用一个转移透镜。每个透镜可以提供样本表面的不同放大率。通常，在电极和检测器之间存在其他离子操纵组件，例如一个或多个孔径、质量过滤器或一组偏转板。电极、转移透镜和任何其他组件共同构成离子光学器件。用于产生合适的离子光学布置的组件可以从商业供应商处获得，例如Agilent、Waters、Bruker，并且可以由本领域技术人员适当地定位，以将离子递送到检测器，如下文所述。
除了下面讨论的检测器外，由于可以执行LDI从而导致软电离(例如，电离不会破坏所分析的分子中的键)，在一些情况下，检测器可以是串联MS，其中在将选定的离子分解成碎片并进行第二次m/z分离(碎片随之被检测)之前，先进行第一次m/z分离从样本选择离子。
采用LDI的方法
本发明的各方面还提供了使用LDI分析生物样本的方法。在此分析中，用标记物标记细胞，然后在样本进行LDI后产生的离子中检测到这些标记物。因此，本发明的各方面提供了一种用于对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，方法包含：a.用一种或多种不同的标记物标记样本中的多个不同的目标分子，以提供标记的样本；b.进行样本的激光解吸/电离，其中在多个位置处进行激光解吸/电离以形成多个单独的离子云；以及c.对离子云分别进行质谱分析，从而检测羽状物中的标记物可以构建样本的图像，可选地，其中多个位置是多个已知位置。
在一些实施例中，一个或多个标记物包含标记原子。在这种情况下，标记的作用如下文所述，其中特异性结合对的成员(例如与蛋白抗原结合的抗体，或与样本中的RNA结合的核酸)附接到包含一个或多个标记原子的元素标签(例如镧系元素和锕系元素)。元素标签可以仅包含单一类型的标记原子(例如，特定元素的单个同位素的一个或多个原子)，也可以包含不同的多种标记原子(例如，不同的元素/同位素)，从而使得作为特定组合元素/同位素产生的大量不同的标签用作标记物。在一些情况下，标记原子被检测为元素离子。在一些实施例中，标记原子在分子离子内从样本发射。因此，代替在质量通道中检测标记原子，将在分子离子的质量通道中检测样本中标记材料的存在(即，通过分子的质量减去标记原子，将简单地变换质量通道，相对于单独的标记原子)。然而，在一些实施例中，含有标记原子的分子可以在不同的标记原子之间变化。在那种情况下，含有分子残基和标记原子的离子将经受碎片化方法的处理，从而针对每种试剂产生更一致的质量峰，诸如通过串联MS的应用。对主要LDI成像质谱流式方案进行所有这些更改和修改的目的是，使可用质量通道的数量最大化，同时减少质量通道之间的重叠。
在一些实施例中，可以设计染色试剂以促进质量标签材料和含有单拷贝标记原子的单个元素离子或分子离子的释放和电离。染色试剂也可以被设计成促进质量标签材料和含有多个拷贝的标记原子(或其组合，如上所述)的单个元素离子或分子离子的释放和电离。作为另一替代方案，可以利用染色试剂本身的质量来创建用于质量细胞计数的检测通道。在这种情况下，在染色中将不使用稀土同位素，并且通过改变染色试剂的化学性质以产生许多质量通道来改变染色试剂的质量。这种变化可以用碳、氧、氮、硫、磷、氢和类似的同位素来完成，而无需稀土同位素。
在一些实施例中，还用激光辐射吸收剂组合物处理样本。该组合物起到增强样本在被照射时对激光的吸收的作用，并因此增加能量转移以激发标记原子(并因此促进含有标记原子的元素离子或分子离子或其组合的产生)。
与LDI有关的编号实施例
1.一种用于分析样本的设备，包含：a.用于容纳样本的样本室；b.激光，适于从样本解吸并电离材料，形成离子；c.离子光学器件，被布置为对由解吸电离形成的离子进行采样，并引导其朝向检测器远离样本；以及d.检测器，接收来自离子光学器件的离子并分析离子，可选地其中该设备包括本发明的各方面的激光扫描***。
2.根据实施例1的设备，其中，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸并电离材料，以形成元素离子，并且其中检测器接收来自采样和电离***的元素离子并适于分析元素离子。
3.根据任一前述实施例的设备，其中该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸并电离材料，以形成分子离子，并且其中检测器接收来自采样和电离***的分子离子并适于检测分子离子。
4.根据任一前述实施例的设备，其中，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸并电离材料，以形成元素离子和分子离子，并且其中检测器接收来自采样和电离***的离子并适于检测元素离子和分子离子两者。
5.根据任一前述实施例的设备，其中，激光器是深UV激光器，诸如发射193nm、213nm或266nm辐射的激光器。
6.根据任一前述实施例的设备，其中，激光器是飞秒激光器。
7.根据任一前述实施例的设备，其中，在真空、部分真空或大气压下，在样本室中发生解吸电离。
8.根据任一前述实施例的设备，其中，样本室包含一个或多个气体端口，该气体端口被布置为使得在激光解吸电离期间能够将一个或多个气体脉冲递送到样本上的激光解吸电离的位置，诸如其中一个或多个气体端口为喷嘴形式。
9.根据实施例8的设备，其中，布置一个或多个气体端口以使得一个或多个气体脉冲能够碰撞冷却通过来自激光器的激光辐射从样本产生的离子。
10.一种用于对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，包含：a.用一个或多个质量标签标记样本中的一个或多个不同的目标分子，以提供标记的样本；b.对样本进行激光解吸电离，其中在多个已知位置进行激光解吸电离以形成多个离子云；以及c.对离子云进行质谱分析，从而从云中的一个或多个质量标签检测离子，允许构建样本的图像。
11.根据实施例10的方法，其中，多个离子云是多个单独的离子云，每个单独的离子云由在已知位置处的激光解吸电离形成，并且其中使离子云进行质谱分析包含使单个离子云进行质谱分析。
12.根据实施例10或11的方法，其中每个不同的目标被不同的特异性结合对成员(SBP)结合，并且每个不同的SBP被链接到质量标签，使得每个目标都被特异性质量标签标记。
13.根据实施例10至12中任一项的方法，还包含在步骤a之前、或在步骤a和b之间，用电离促进剂组合物处理样本。
14.根据实施例13的方法，其中电离促进剂组合物促进标记原子的电离和/或含有标记原子的分子离子的电离。
15.根据实施例10至14中任一项的方法，还包含在步骤a之、或在步骤a和b之间，用激光辐射吸收剂组合物处理样本。
2.光电检测器
光电检测器的示例类型包括光电倍增管和电荷耦合器件(CCD)。在通过元素质谱仪成像之前，可以使用光电检测器对样本成像和/或识别受关注特征/区域。
光电倍增管包含真空室，该真空室包含一个光电阴极、几个倍增电极和一个阳极。由于光电效应，入射在光电阴极上的光子使光电阴极发射电子。由于二次发射的过程，电子被倍增电极倍增以产生倍增的电子电流，然后阳极检测到倍增的电子电流，从而提供了一种检测入射在光电阴极上的电磁辐射的措施。光电倍增管可以从例如ThorLabs获得。
CCD包含含有光敏像素阵列的硅芯片。在曝光期间，每个像素都会产生与入射到像素上的光强度成比例的电荷。曝光后，控制电路将产生一系列电荷转移，以产生一系列电压。然后可以分析这些电压以产生图像。合适的CCD可从例如细胞生物科学公司(CellBiosciences)获得。
构建图像
上面的设备可以为从样本中去除的电离样本材料包中的多个原子提供信号。对样本材料包中原子的检测揭示了它在消融位置处的存在，这是因为该原子天然存在于样本中，或是因为该原子已被标记试剂定位在该位置。通过从样本表面上已知的空间位置产生一系列电离的样本材料包，检测器信号可以揭示原子在样本上的位置，因此这些信号可用于构建样本图像。通过用可区分的标记物标记多个目标，可以将标记原子的位置与同源目标的位置关联起来，因此该方法可以构建复杂的图像，达到的多路复用水平远远超过使用传统技术(诸如荧光显微镜)可以达到的水平。
将信号组装成图像将使用计算机，并且可以使用已知技术和软件包来实现。例如，可以使用来自Kylebank软件公司的GRAPHIS软件包，或者也可以使用诸如TERAPLOT的其他软件包。使用来自诸如MALDI-MSI的技术的MS数据进行成像是本领域已知的，例如参考文献xxii公开了“MSiReader”界面，用于在Matlab平台上查看和分析MS成像文件，以及参考文献xxiii公开了两种软件工具，用于在完整的空间和光谱范围内快速进行2D和3D MSI数据集的数据探索和可视化分辨率，例如“Datacube Explorer”程序。
使用本文公开的方法获得的图像可以被进一步分析，例如以与分析IHC结果相同的方式。例如，图像可以用于描绘样本中的细胞亚群，并且可以提供对临床诊断有用的信息。类似地，可以使用SPADE分析从本公开方法提供的高维细胞计数数据中提取细胞层次[xxiv]。在某些方面，可以对细胞类型(例如，通过SPADE分析识别的)进行着色，以允许同时可视化多种细胞类型(其中至少一些特征是通过标记的组合来表征)。
可替代地或附加地，可以通过成像质量细胞计数对连续切片进行成像并且堆叠以提供样本的3D图像。可以在2个或3个维度上跨特征或受关注区域(ROI)集成大量标记原子，诸如跨细胞、细胞簇、微转移、肿瘤或组织子区域等等。在某些方面，可以执行激光扫描以快速分析一个或多个组织切片上的此类特征或ROI。信号的此类集成可以简化分析和/或提高灵敏度。
多种成像模式
可以使用多种成像模式来对一个或多个组织切片进行成像。在一些情况下，来自同一组织的切片可以分别通过不同的模式成像，然后将其共配准(例如，映射到相同的坐标系、堆叠、叠加和/或组合以识别更高级别的特征)。
本发明的各方面包括共配准图像的方法，该方法包括：通过除成像质量细胞计数之外的成像模式从组织样本的第一组织切片获得第一图像，通过成像质量细胞计数获得组织样本的第二组织切片的第二图像，并共配准第一图像和第二图像。在某些方面，第一图像、或第一图像和第二图像两者可以由第三方提供。
在一些情况下，可以配备成像质量细胞仪以其他模式成像，包括但不限于光学显微镜，例如明场、荧光和/或非线性显微镜。例如，成像质量细胞仪可以堆叠用于激光消融和光学显微镜的光学器件。可以通过光学显微镜对组织化学染色剂进行成像，以识别受关注区域(ROI)，以通过成像质量细胞计数进行分析。可替代地或附加地，如本文所述，光学显微镜可以用于将通过成像质量细胞计数从第一组织切片获得的图像与通过另一模式(例如通过另一***)从第二组织切片(例如，连续切片)获得的图像共配准。当使用高速(例如飞秒)激光时，可以在一个或多个谐波处执行非线性显微镜检查，从而对样本的结构方面进行成像。当用标记原子和荧光团标记同时标记抗体时，对荧光团标记的分布进行分析可能对样本无损，然后可以对标记原子进行IMC分析。在某些方面，荧光团标记可以是从受关注区域切割(例如，光切割)的荧光条形码，并且在抽吸之后进行分析。
在一些情况下，附加的成像模式可以是电子显微镜，诸如扫描电子显微镜或透射电子显微镜。通常，电子显微镜包含电子枪(例如具有钨丝阴极)、静电/电磁透镜和孔径(控制射束以将其引导到样本室中的样本上)。样本被保持在真空下，因此气体分子在从电子枪到样本的途中不会阻碍或衍射电子。在透射电子显微镜(TEM)中，电子穿过样本，然后偏转。偏转的电子然后由检测器检测，诸如荧光屏，或者在一些情况下是与CCD耦合的高分辨率磷光体。在样本和检测器之间是物镜，用于控制检测器上偏转的电子的放大倍数。
TEM需要超薄切片，以使足够的电子能够穿过样本，从而可以从撞击检测器的偏转电子中重建图像。通常，通过使用超薄切片机制备的TEM样本为100nm或更薄。将生物组织样本进行化学固定、脱水并包埋在聚合物树脂中，以充分稳定它们，以进行超薄切片。生物样本、有机聚合物和类似材料的切片可能需要用重原子标记染色才能获得所需的图像对比度，因为未染色的生物样本在其天然未染色状态下很少与电子发生强烈相互作用，从而使其偏转以进行电子显微镜检查要记录的图像。
如上所述，当使用薄切片时，可以对同样由IMS或IMC分析的样本进行电子显微镜检查。因此，可以通过电子显微镜(例如透射电子显微镜)获得高分辨率的结构图像，然后将该高分辨率图像用于将IMS或IMC获得的图像数据的分辨率细化为使用激光辐射消融所能达到之外的分辨率(由于电子的波长比光子短得多)。在一些情况下，通过IMC或IMS进行电子显微镜检查和元素分析均在单个设备中对样本进行(因为IMC/IMS是破坏性过程，因此在IMC/IMS之前进行电子显微镜检查)。
一个或多个组织切片可通过成像质量细胞计数和一种或多种其他成像模式进行分析，并基于存在于保持组织切片的载玻片上的基准(诸如坐标系)共配准。可替代地或附加地，可以通过对准存在于来自相同组织的两个切片上的特征(例如，结构或图案)来执行共配准。可以通过相同或不同的成像模式来识别特征。即使当通过相同的成像模式识别时，特征或它们的x、y坐标也可以用于共配准不同的成像模式。
在某些方面，另外的成像模式是MALDI质谱成像。用于MALDI成像的组织切片的样本制备，可能与用于成像质量细胞计数的制备不兼容。由此，第一切片的MALDI成像可以与来自相同组织的第二切片(例如，连续切片)的成像质量细胞计数共配准。MALDI成像中的激光解吸电离可提供通过质谱检测到的分子离子。样本的MALDI图像可以识别分析物(例如药物，诸如癌症药物、潜在的癌症药物或其代谢物)在包含肿瘤和/或健康组织的组织切片或子区域中的分布。当分析物是药物时，可以将其施用于受试者(例如，人类患者或动物模型)，从中收集组织样本以进行分析，如本文所述。其他相同的分析物可以进行同位素标记，诸如使用非天然丰富的同位素(例如H、C或N的同位素)进行同位素标记，然后与基质一起应用于组织，以识别和预期与原始分析物相关的质谱中的峰。可替代地或除了对分析物的分布进行成像之外，MALDI图像还可以提供内源性生物分子(或其分子离子)的分布。可以通过共享的或相似的组织化学染色剂(诸如甲苯酚紫、丽春红S、溴酚蓝、钌红、三色染色、四氧化锇等)将MALDI成像与IMC图像共配准。在某些方面，通过MALDI成像分析的样本的标记原子可以在该过程中幸存下来，从而允许IMC进行分析。然而MALDI样本制备可能会使IMC成像的样本制备复杂化，在这种情况下，可以从不同的组织切片中获得MALDI和IMC图像。
MALDI图像与质谱分析图像的共配准可提供对保留药物的组织部分和/或药物对组织的作用的更多了解。例如，含有金属的组织化学染色剂、活性试剂和/或细胞状态指示剂，可以识别药物是否靶向***(例如基质、细胞外基质或大分子(诸如胶原蛋白或糖蛋白、纤维蛋白(诸如肌动蛋白)、角蛋白、微管蛋白)、细胞或细胞亚区域(例如细胞膜、细胞质和/或细胞核)、增殖细胞、活细胞或死细胞、低氧细胞或区域、坏死区域、肿瘤细胞或具有肿瘤特征(例如，肿瘤的表面标记物和/或细胞状态标记物特性的组合)和/或健康组织中的至少一种。在一些情况下，可以通过结合药物分布(例如，通过MALDI成像来识别)和在药物处或周围的组织状态(例如，通过成像质量细胞计数来识别)来推断药物的作用。例如，肿瘤细胞或肿瘤浸润性免疫细胞的数目、位置、细胞活性表面标记物、细胞内信号转导标记物、细胞类型标记物，可用于识别药物的作用和/或识别其他药物靶标(诸如受体，其响应于药物而在肿瘤细胞或肿瘤浸润免疫细胞中被上调或下调)。肿瘤浸润免疫细胞可以包括树突状细胞、淋巴细胞(诸如B细胞、T细胞和/或NK细胞)或免疫细胞子集(诸如CD4+、CD8+和/或CD4+CD25+T细胞)中的一种或多种。在一些情况下，成像质量细胞计数可以识别肿瘤微环境中的多种免疫细胞类型，并且可以进一步识别细胞状态(例如，细胞内信号传导和/或参与免疫应答的激活或抑制的受体的表达)。MALDI成像的药物分布区域，可以识别用于成像细胞计数分析的ROI和/或与质量细胞计数图像共配准。
在某些方面，将IMC图像与非IMC图像共配准以细胞或亚细胞分辨率提供多个(例如至少5、10、20或30个)不同靶标(例如，或其相关的标记原子)的分布。可以通过LA-ICP-MS以及可选地通过使用如本文所述的飞秒激光器和/或激光扫描***来获得IMC图像。
共配准可以包括将两个图像(通过不同的成像模式获得)彼此(例如，共享坐标系)映射(例如，对准)。可以叠加或组合两个共配准的图像(或每个图像的各个方面)，以呈现更高级别的特征，诸如通过两个不同的成像模式检测到的两个目标的共同表达。在某些方面，共配准可能仅在受关注区域。
样本
本公开的某些方面提供了对生物样本进行成像的方法。此类样本可以包含多个细胞，可以对细胞进行成像质量细胞计数(IMC)，以提供样本中这些细胞的图像。通常，本发明的各方面可用于分析现在通过免疫组织化学(IHC)技术研究的组织样本，但是使用适合于通过质谱(MS)或光发射光谱(OES)检测的标记原子。
在某些方面，样本可以包含多个切片(例如，连续组织切片)。在某些方面，可以在切片之前将组织切片冷冻(例如冷冻)和/或用蜡(例如石蜡)包埋。可以使用本领域技术人员已知的任何切片方法，尽管大多数切片方法涉及使用以一定角度施加的锋利刀片切割组织样本，然后将所得组织切片安装在固体支撑物(诸如载玻片)上。来自同一组织的切片(例如，连续切片)可以通过成像质量细胞计数和/或不同的模式来成像，并且如本文所述，彼此共配准。当染色剂的渗透和/或成像模式仅允许分析组织切片的顶层时，组织切片可能涉及准备两个在彼此面对的一侧进行染色和/或成像的连续切片。例如，一个切片可以翻转，使其呈现与另一切片相邻的面。当基于第一切片来识别ROI时，和/或当从两个切片中共配准图像时，从一个切片获得的图像可能会翻转。可替代地或附加地，可以将连续切片与相应的载玻片上(或在相同的载玻片上)的基准对准，使得在切片之前保留或表示它们相对于彼此的大致位置。任何合适的组织样本均可用于本文所述的方法。例如，组织可以包括来自上皮、肌肉、神经、皮肤、肠、胰腺、肾脏、脑、肝、血液(例如血液涂片)、骨髓、颊刷、宫颈刷的一种或多种的组织、或任何其他组织。生物样本可以是永生的细胞系或获自活体的原代细胞。为了诊断、预后或实验(例如药物开发)目的，组织可以来自肿瘤。在一些实施例中，样本可以来自已知组织，但是样本是否包含肿瘤细胞可能是未知的。成像可以揭示目标的存在，该目标指示肿瘤的存在，从而促进诊断。来自肿瘤的组织可以包含也由本方法表征的免疫细胞，并且可以提供对肿瘤生物学的了解。组织样本可以包含***固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织。组织可获自任何活体的多细胞生物，诸如哺乳动物、动物研究模型(例如，特定疾病的模型，诸如具有人类肿瘤异种移植物的免疫缺陷啮齿动物)或人类患者。
组织样本可以是例如切片，其厚度在2-10μm的范围内，诸如介于4-6μm之间。制备此类切片的技术在IHC领域是众所周知的，例如使用切片机，包括脱水步骤、固定、包埋、透化、切片等。因此，可以将组织进行化学固定，然后可以在所需平面中制备切片。冷冻切片或激光捕获显微切割也可用于制备组织样本。样本可以被透化，例如以允许摄取用于标记细胞内目标的试剂(参见上文)。
尽管最大尺寸将由激光消融设备决定，特别是由可放入其样本室中的样本的尺寸决定，但要分析的组织样本的尺寸将与当前的IHC方法相似。典型的最大尺寸是5mm×5mm，但较小的样本(例如1mm×1mm)也是有用的(这些尺寸是指切片的大小，而不是其厚度)。
除了可用于对组织样本进行成像之外，本公开内容还可以用于对细胞样本进行成像，诸如单层贴壁细胞或固定在固体表面上的细胞(如常规免疫细胞化学中那样)。这些实施例对于分析对细胞悬浮质量细胞计数不易溶解的贴壁细胞特别有用。因此，本公开不仅可用于增强当前的免疫组织化学分析，而且可用于增强免疫细胞化学。
连续切片和重采样
在某些方面，可以通过成像质量细胞计数来分析组织的连续切片。连续切片可以相同地染色或针对不同标记物染色。例如，第一连续切片可以被染色以用于蛋白质标记物(或主要为蛋白质标记物)，而第二连续切片可以被染色以用于RNA标记物(或主要为RNA标记物)。当针对一组标记物的样本制备(诸如用于检索蛋白质标记物的抗原)可能损坏或削弱检测另一组标记物(诸如RNA标记物)的能力时，此功能特别有用。
多个连续切片可以用包含相同或重叠质量标签的不同组的SBP染色。可替代地，可以用包含相同或重叠质量标签的相同或重叠的一组SBP对连续切片进行染色。跨连续切片共享的特征上存在的标记物可以被整合或以其他方式组合以进行分析。例如，可以将在诸如细胞的特征中跨后续切片检测到的相同标记物(例如，由相同的SBP结合)加在一起，以确定在该特征中的表达。这可以提供更高的灵敏度，并且对于检测和/或确定低表达标记的丰度可能特别有用。诸如细胞的特征可能大于单个切片，也可能会分成多个切片。各种方法都可以将薄片切成微米级。样本制备过程中切片的脱水与激光消融的深度相结合，可以切除大部分待消融的切片厚度。如果切片的厚度明显大于激光消融的深度，则在某个位置进行重采样可以从要分析的特征中获取更多材料。具有短强脉冲的激光(诸如fs激光)可以更干净地从样本中采样(例如，在消融部位之外的热量很少)，从而更好地实现了重采样。如上所述，多个连续切片的重采样和/或分析可以允许更高的灵敏度。此外，多个连续切片的重采样和/或分析可以允许重建3D质量细胞计数图像。
在某些方面，特征的识别可以在光学询问期间进行，并且可以沿着光学识别的受关注特征扫描激光。可替代地，可以从逐像素的质量细胞计数图像中识别特征，诸如微米级(例如，直径为0.5至2微米)的像素阵列。可以在分析阶段识别与特征有关的像素，并且可以整合来自该特征中的标记的信号。沿特征进行激光扫描，将像素分组(通过载物台的平移和/或激光扫描获得)成特征，在某个位置重采样和/或跨连续切片整合特征，可以任意组合提高关联特征的标记物的灵敏度。当应用激光扫描时，可以节省大量时间，这在分析连续切片时变得更加有价值。
IMC提供了优于免疫组织化学成像或免疫荧光显微镜检查的固有优势，因为来自金属标记的信号几乎没有或没有重叠，从而可以从一个组织切片同时成像40种以上的蛋白质(和/或其他标记物)。在一些情况下，IMC的灵敏度可能比其他方法更低。例如，基于标记有100种原子的抗体和ICP-TOF-MS的典型透射率，传统IMC的检测极限可能是每1微米直径激光斑点(像素)有400个拷贝的抗体。诸如细胞的特征可能大于10、20、50或100平方微米。在传统IMC中，通常将3-10微米厚(即5-7微米厚)的组织干燥到等于或小于1微米的厚度，这对于IMC中使用的典型激光能量是完全消融的近似极限(假设激光头处为1微焦耳)。如果没有很多细胞的话，一些初始切片的厚度会更大。因此，组织切片通常包含细胞碎片，而不是完整细胞。值得注意的是，不同的激光速度、波长和能量可能会改变这些假设。在一些情况下，快速(例如fs)激光可允许重新采样并“钻”入较厚的组织切片。
通过IMC询问诸如细胞的特征，可能会导致低丰度标记物的检测力降低，这些标记物可能会均匀分布(例如，遍布整个细胞质)，并且它们在一部分细胞中的丰度可能低于整个细胞中的丰度。此外，某些标记物可能在细胞的特定部分中表达不足，因为某些标记物可能存在于特定的细胞隔室中。例如，在特定的组织切片中，细胞核(例如通过铱核酸嵌入剂可检测到)可以完全存在、完全不存在或存在于其部分中。结果，它可以完全被检测到，具有良好的信噪比，可以部分检测，或者根本无法检测/根本不存在；同样，根据蛋白质标记物在细胞隔室/切片中的存在，它们可以被检测、部分检测或根本无法检测。即使对于高于检测阈值的标记物，较高的灵敏度也可以改善或允许对标记物的丰度进行定性或定量评估。
如本文所描述的，一种方法或***可以测量以高丰度存在于细胞中的主要标记物，在连续的组织切片中进行测量。然后，主要标记物信号可用于识别对象/分割代表每个横截面中特定细胞的类细胞对象，或形成每个组织切片中存在的典型细胞表型。然后，可以将标记签名或细胞表型链接到每个识别的对象的XY坐标。然后，具有相似的主要标记物特征/表型且具有接近的XY坐标的对象将彼此链接在一起，作为在切片过程中被切片的同一细胞的片段。一旦连续切片中的对象被识别为代表相同的细胞，就将连续组织切片之间的所有标记物的信号进行积分(例如，求和)，从而有效地产生标记物信号的“体积积分”。由于标记物信号的总和可能与求和切片的数量成比例，而背景信号将与求和切片的数量的平方根成比例，因此这提高了信号和信噪比。
此外，在一个组织切片中不存在特定细胞隔室(或隔室中的标记物)的情况下，它可以存在于同一组织块的上一个或下一个切片中。因此，可以将一些标记物的检测提高很多倍，甚至可以实现。可以使用多种识别主要标记物签名属于同一细胞的方法，包括在图像分割的现场方法(例如分水岭方法)中已知的方法。虽然以上实例是为细胞提供的，但该方法可用于本文描述的任何特征。具有类似特性(诸如形状和/或标记物表达)和/或具有类似周围特征集的类似XY坐标处的特征，在此类分割之后可以被识别为属于相同的细胞特征(例如细胞)。
样本载体
在某些实施例中，可以将样本固定在固体支撑物(即样本载体)上，以将其定位以用于成像质谱。固体支撑物可以是光学透明的，例如由玻璃或塑料制成。在样本载体是光学透明的的情况下，其使得能够通过支撑物消融样本材料，如图5所示。有时，样本载体将包括用作与本文描述的设备和方法一起使用的参考点的特征，例如以允许计算要消融或解吸和分析的受关注特征/区域的相对位置。参考点可以是光学可分辨的，或者可以是通过质量分析可分辨的。
目标元素
在成像质谱法中，可能需要关注一种或多种目标元素(即元素或元素同位素)的分布。在某些方面，目标元素是如本文所述的标记原子。标记原子可以单独添加到样本中或共价结合到生物活性分子上或之内。在某些实施例中，标记原子(例如，金属标签)可以与特异性结合对(SBP)的成员缀合，诸如与DNA或RNA目标杂交的抗体(与其同源抗原结合)、适体或寡核苷酸，如下更详细地描述。标记原子可以通过本领域已知的任何方法连接至SBP。在某些方面，标记原子是金属元素，诸如镧系元素或过渡元素或另一种金属标签，如本文所述。金属元素的质量可以大于60amu、大于80amu、大于100amu或大于120amu。本文所述的质谱仪可消耗低于金属元素质量的元素离子，以使大量的较轻元素不会产生空间电荷效应和/或使质量检测器过载。
组织样本的标记
本公开产生已经用标记原子来标记的样本的图像，该标记原子例如是多个不同的标记原子，其中标记原子由能够对样本的特定的优选亚细胞的区域进行采样的设备来检测(因此，标记原子代表元素标签)。提及多个不同的原子是指使用一种以上的原子种类来标记样本。可以使用质量检测器来区分这些原子种类(例如，它们具有不同的m/Q比)，以使羽状物内存在两个不同的标记原子会产生两个不同的MS信号。也可以使用光谱仪来区分原子种类(例如，不同的原子具有不同的发射光谱)，从而羽状物内两个不同的标记原子的存在会引起两个不同的发射光谱信号。
带质量标签的试剂
如本文所用，带质量标签的试剂包含许多组分。首先是SBP。第二个是质量标签。质量标签和SBP通过接头连接，至少部分由质量标签和SBP的缀合形成。SBP和质量标签之间的连接也可以包含间隔物。质量标签和SBP可以通过一系列反应化学物共轭在一起。示例性的共轭反应化学物包括巯基马来酰亚胺、NHS酯和胺，或点击化学反应物(优选无Cu(I)化学物)，诸如应变炔和叠氮化物、应变炔和硝酮以及应变烯烃和四嗪。
质量标签
本发明中使用的质量标签(也称作元素标签)可以采取多种形式。通常，标签包含至少一个标记原子。标记原子在下文讨论。
因此，质量标签可以以其最简单的形式包含金属螯合部分，该金属螯合部分(metal-chelating moiety)是金属螯合基团，其中金属标记原子在配体中配位。在一些情况下，每个质量标签仅检测单个金属原子就足够了。但是，在其他情况下，可能希望每个质量标签都含有一个以上的标记原子。如下所述，这可以通过多种方式来实现。
产生可包含一个以上标记原子的质量标签的第一种方法是使用包含与金属的一个以上亚基连接的金属螯合配体的聚合物。能够结合聚合物中的至少一个金属原子的金属螯合基团的数目可以在大约1至10000之间，诸如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000。至少一个金属原子可与至少一个金属螯合基团结合。聚合物的聚合度可以在约1至10000之间，诸如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000。因此，基于聚合物的质量标签可包含约1至10000、诸如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000个标记原子。
聚合物可以选自由线性聚合物、共聚物、支链聚合物、接枝共聚物、嵌段聚合物、星形聚合物和超支化聚合物组成的群组。聚合物的主链可以衍生自取代的聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚甲基丙烯酰胺、并且可以是丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的均聚物或共聚物的取代衍生物。聚合物可以由可逆加成断裂聚合(RAFT)、原子转移自由基聚合(ATRP)和阴离子聚合组成的群组而合成。提供聚合物的步骤可以包含由化合物合成聚合物，化合物选自以下项组成的群组：N-烷基丙烯酰胺、N,N-二烷基丙烯酰胺、N-芳基丙烯酰胺、N-烷基甲基丙烯酰胺、N,N-二烷基甲基丙烯酰胺、N芳基甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯及其功能等同物。
该聚合物可以是水溶性的。该部分不受化学含量的限制。但是，如果骨架具有相对可复制的大小(例如长度、标签原子数、可复制的树枝状聚合物特征等)，则可以简化分析。还考虑了对稳定性、溶解性和无毒的要求。因此，通过合成策略制备和表征功能性水溶性聚合物，该策略沿主链放置许多官能团以及不同的反应性基团(连接基团)，该反应性基团可用于通过连接物和任选的间隔物将聚合物连接到分子(例如SBP)上。聚合物的大小可通过控制聚合反应来控制。通常，将选择聚合物的尺寸，以使聚合物的回转辐射尽可能小，诸如在2至11纳米之间。IgG抗体(一种示例性SBP)的长度为约10纳米，因此，相对于SBP大小而言，过大的聚合物标签可能会在空间上干扰SBP与其靶标的结合。
能够结合至少一个金属原子的金属螯合基团可以包含至少四个乙酸基团。例如，金属螯合基团可以是二亚乙基三胺五乙酸酯(DTPA)基团或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)基团。替代基团包括乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。
金属螯合基团可以通过酯或通过酰胺连接至聚合物。合适的金属螯合聚合物的实例包括可从加拿大Fluidigm公司获得的X8和DM3聚合物。
聚合物可以是水溶性的。由于它们的水解稳定性，可以使用N-烷基丙烯酰胺、N-烷基甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯或功能等同物。约1至1000(1至2000个主链原子)的聚合度(DP)涵盖了大多数目标聚合物。较大的聚合物在本发明各方面的范围内具有相同的功能性，并且是可行的，如本领域技术人员所理解的那样。通常，聚合度将在1和10000之间，诸如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000。聚合物可以通过导致相对窄的多分散性的途径进行合成。聚合物可以通过原子转移自由基聚合(ATRP)或可逆加成片段化(RAFT)聚合合成，其Mw(重均分子量)/Mn(数均分子量)值应在1.1至1.2范围内。一种涉及阴离子聚合的替代策略，其中可获得Mw/Mn为约1.02至1.05的聚合物。两种方法都可以通过选择引发剂或终止剂来控制端基。这允许合成可以连接接头的聚合物。可以采用制备在重复单元中包含官能侧基的聚合物的策略，该配体的过渡金属单元(例如Ln单元)可以在随后的步骤中连接到该重复单元上。该实施例具有几个优点。它避免了由于进行含配体的单体的聚合而可能引起的复杂性。
为了最大程度地减少侧基之间的电荷排斥，(M3+)的目标配体应在螯合物上赋予-1的净电荷。
用于本发明的各方面的聚合物包括：
-无规共聚物聚(DMA-co-NAS)：在Relógio等人(2004)(Polymer，45,8639-49)中报道了通过RAFT合成具有75/25摩尔比的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)与N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)的无规共聚物，其具有高转化率、出色的摩尔质量控制(在5000至130,000的范围内)，并且Mw/Mn≈1.1。使活性NHS酯与带有反应性氨基的金属螯合基团反应，以产生通过RAFT聚合合成的金属螯合共聚物。
-聚(NMAS)：N可以通过ATRP聚合MAS，获得平均摩尔质量为12至40KDa且Mw/Mn为约1.1的聚合物(参见例如Godwin等人，2001；Angew.Chem.Int.Ed，40:594-97)。
-聚(MAA)：聚甲基丙烯酸(PMAA)可以通过其叔丁基或三甲基甲硅烷基(TMS)酯的阴离子聚合来制备。
-聚(DMAEMA)：聚(甲基丙烯酸二甲基氨基乙基酯)(PDMAEMA)可以通过ATRP制备(参见Wang等人，2004，J.Am.Chem.Soc，126,7784-85)。这是一种众所周知的聚合物，可以方便地制备，其平均Mn值在2至35KDa之间，Mw/Mn为约1.2。该聚合物还可以通过阴离子聚合法以较窄的粒度分布合成。
-聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺。
可以通过本领域技术人员已知的方法将金属螯合基团连接至聚合物，例如，侧基可以通过酯或通过酰胺连接。例如，对于基于丙烯酸甲酯的聚合物，金属螯合基团可以首先通过使聚合物与乙二胺在甲醇中反应，然后在碱性条件下在碳酸盐缓冲液中使DTPA酸酐反应，而将金属螯合基团连接至聚合物主链。
第二种方法是产生可以用作质量标签的纳米颗粒。产生这种质量标签的第一条途径是使用已经被涂覆在聚合物中的金属的纳米级颗粒。在此，金属被聚合物隔离并与环境隔离，并且在例如通过结合到聚合物壳中的官能团可以使聚合物壳反应时，金属不发生反应。官能团可以与连接物组分(可选地包含间隔物)反应以附接点击化学试剂，因此允许这种类型的质量标签以简单、模块化的方式***上文讨论的合成策略中。
接入法和接出法是在纳米粒子周围产生聚合物刷的两个主要机理。在接入法中，聚合物是单独合成的，因此合成不受需要保持纳米粒子胶体稳定的限制。可逆的加成-断裂链转移(RAFT)合成由于单体种类繁多且易于官能化而非常出色。链转移剂(CTA)可以容易地用作官能团本身，可以使用官能化的CTA或可以对聚合物链进行后官能化。使用化学反应或物理吸附将聚合物连接到纳米颗粒上。接入法的一个缺点是通常较低的接枝密度，这是由于在连接至颗粒表面期间盘绕的聚合物链的空间排斥。所有的接入法都具有缺点，即必须进行严格的后处理才能从官能化的纳米复合材料颗粒中去除过量的游离配体。这通常通过选择性沉淀和离心来实现。在接出法中，分子(如用于原子转移自由基聚合(ATRP)的引发剂或用于(RAFT)聚合的CTA)固定在颗粒表面。该方法的缺点是开发了新的引发剂偶联反应。而且，与接入法相反，颗粒在聚合条件下必须是胶体稳定的。
产生质量标签的另一种方法是通过使用掺杂的珠。螯合的镧系元素(或其他金属)离子可用于细乳液聚合中，以产生具有嵌入聚合物中的螯合的镧系元素离子的聚合物颗粒。如本领域技术人员已知的，选择螯合基团，使得金属螯合物在水中的溶解度可忽略不计，而在用于细乳液聚合的单体中的溶解度则是合理的。如本领域技术人员已知的，可以使用的典型单体是苯乙烯、甲基苯乙烯、各种丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯。为了提高机械强度，带有金属标签的颗粒的玻璃化转变温度(Tg)高于室温。在某些情况下，使用核-壳颗粒，其中通过细乳液聚合制备的含金属的颗粒用作种子乳液聚合的种子颗粒，以控制表面官能度的性质。通过为该第二阶段聚合选择合适的单体，可以引入表面官能度。另外，丙烯酸酯(和可能的甲基丙烯酸酯)聚合物优于聚苯乙烯颗粒，因为酯基团可以结合或稳定镧系元素配合物上不满意的配***点。制备这种掺杂的珠的示例性方法是：(a)在含有至少一种有机单体(在一个实施例中为诸如苯乙烯和/或甲基丙烯酸甲酯)的溶剂混合物中结合含有至少一种标记原子的配合物，其中该含有至少一种标记原子的配合物是可溶的，以及至少一种不同的溶剂，在该不同的溶剂中，所述有机单体和含有至少一种标记原子的配合物不易溶解，(b)将步骤(a)的混合物乳化足够的时间以提供均匀的乳液；(c)引发聚合反应并继续反应，直到大部分单体转化为聚合物为止；以及(d)将步骤(c)的产物温育足以获得聚合物颗粒的胶乳悬浮液的时间，聚合物颗粒的胶乳悬浮液具有掺入颗粒中或之上的含有至少一种标记原子的配合物，其中选择所述含有至少一种标记原子的配合物，使得在检查聚合物质量标签时，从所述至少一种标记原子获得不同的质量信号。通过使用含有不同标记原子的两种以上配合物，可以制备包含两种以上不同标记原子的掺杂珠。此外，控制含有不同标记原子的配合物的比例，使得制备具有不同标记原子比例的掺杂珠。通过使用多种标记原子，并且以不同的比例，增加了可明显识别的质量标签的数量。在核-壳珠中，这可以通过将含有第一标记原子的配合物掺入核中以及将含有第二标记原子的配合物掺入壳中来实现。
还有一种方法是产生聚合物，该聚合物在聚合物的主链中包括标记原子，而不是作为配位的金属配体。例如，Carerra和Seferos(Macromolecules2015，48,297-308)公开了将碲纳入聚合物主链的方法。其他掺入可用作标记原子的原子的聚合物是锡、锑和铋掺入的聚合物。在Priegert等人，2016(Chem.Soc.Rev.，45,922-953)中特别讨论了此类分子。
因此，质量标签可以包含至少两个组分：标记原子，以及螯合、含有或掺有标记原子的聚合物。此外，质量标签还包含一个连接基团(未与SBP结合时)，该连接基团在两个组分发生化学反应后，在点击化学反应中形成了质量标签与SBP之间化学键的一部分，如上面所讨论的。
聚多巴胺涂层可以用作将SBP连接到掺杂的珠或纳米颗粒的另一种方式。给定聚多巴胺中的功能范围，SBP可以缀合至质量标签，该质量标签通过例如SBP(诸如抗体)上的氨基或巯基的反应由PDA涂覆的珠或颗粒形成。可替代地，可以使PDA上的官能团与诸如双功能接头的试剂反应，该试剂依次引入进一步的官能团以与SBP反应。在一些情况下，接头可含有间隔物，如下所述。这些间隔物增加了质量标签与SBP之间的距离，从而使SBP的空间位阻最小。因此，本发明的各方面包含具有质量标签的SBP、包含SBP和含聚多巴胺的质量标签，其中聚多巴胺包含SBP和质量标签之间的连接的至少一部分。纳米颗粒和珠(特别是聚多巴胺涂覆的纳米颗粒和珠)可用于信号增强以检测低丰度靶标，因为它们可以具有数千个金属原子并且可以具有相同亲和试剂的多个拷贝。亲和试剂可以是第二抗体，其可以进一步增强信号。
标记原子
可以与本公开一起使用的标记原子包括可由MS或OES检测到并且未标记的组织样本中基本上不存在的任何物质。因此，例如，12C原子由于天然丰富，因此不适合用作标记原子，而理论上11C可以用于MS，因为它是非天然存在的人工同位素。通常，标记原子是金属。然而，在优选的实施例中，标记原子是过渡金属，诸如稀土金属(15种镧系元素，加上钪和钇)。这17种元素(可以由OES和MS区分)提供了许多(通过MS)易于区分的同位素。以富集同位素的形式可获得各种这些元素，例如钐具有6种稳定同位素、钕具有7种稳定同位素，所有这些都可以富集形式获得。15种镧系元素可提供至少37种具有非冗余独特质量的同位素。适合用作标记原子的元素的实例包括镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)。除稀土金属外，其他金属原子也适用于检测，例如金(Au)、铂(Pt)、铱(Ir)、铑(Rh)、铋(Bi)等。不优选使用放射性同位素，因为它们操作起来较不方便并且不稳定，例如：在镧系元素中，Pm不是优选的标记原子。
为了促进飞行时间(TOF)分析(如本文所讨论的)，使用原子质量在80-250范围内的标记原子是有帮助的，例如在80-210范围内或100-200范围内。此范围包括所有镧系元素，但不包括Sc和Y。100-200的范围允许通过使用不同的标记原子，在理论上进行101丛分析，同时利用TOF MS的高光谱扫描速率。如上所述，通过选择质量位于未标记样本中可见质量之上的窗口中的标记原子(例如，在100-200范围内)，TOF检测可用于提供生物学上显著水平的快速成像。
取决于所使用的质量标签(以及每个质量标签的标签原子数)以及每个SBP所连接的质量标签数，可以将各种数量的标记原子连接到单个SBP成员上。当更多的标记原子连接到任何SBP成员时，可以实现更高的灵敏度。例如，可以将大于10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个标记原子连接到SBP成员，诸如至多10000个，例如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000个标记原子。如上所述，可以使用含有多个单体单元的单分散聚合物，每个含有螯合剂，诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或DOTA。例如，DTPA以约10-6M的解离常数结合3+镧系元素离子。这些聚合物可以终止于巯基，可通过与马来酰亚胺反应将其连接到SBP上以连接点击化学反应性，如以上所讨论的。其他官能团也可以用于这些聚合物的缀合，例如胺反应性基团，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯，或对羧基或对抗体的糖基化有反应性的基团。任何数量的聚合物均可与每个SBP结合。可以使用的聚合物的具体实例包括直链(“X8”)聚合物或第三代树状(“DN3”)聚合物，均可以作为MaxParTM试剂使用。如上所述，还可以使用金属纳米颗粒来增加标记中的原子数。
在一些实施例中，质量标签中的所有标记原子均具有相同的原子质量。可替代地，质量标签可以包含不同原子质量的标记原子。因此，在一些情况下，标记的样本可以用一系列带有质量标记的SBP进行标记，每个SBP仅包含一种类型的标记原子(其中每个SBP结合其同源靶标，因此每种质量标签位于样本上针对特异性的例如抗原)。可替代地，在一些情况下，可以用一系列带质量标签的SBP来标记样本，每个SBP均包含标记原子的混合物。在一些情况下，用于标记样本的带质量标签的SBP可以包含那些具有单个标记原子质量标签的SBP以及它们质量标签中标记原子的混合。
间隔物
如上所述，在一些情况下，SBP通过包含间隔物的接头与质量标签缀合。在SBP与点击化学试剂之间可能存在间隔物(例如，在SBP与应变环炔烃(或叠氮化物)、应变环烯烃(或四嗪)等之间)。在质量标签和点击化学试剂之间(例如在质量标签和叠氮化物(或应变环炔烃)；四嗪(或应变的环烯烃)等之间)可能存在间隔物。在一些情况下，SNP和点击化学试剂之间以及点击化学试剂和质量标签之间可能都存在间隔物。
间隔物可以是聚乙二醇(PEG)间隔物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)间隔物、聚甘油(PG)间隔物、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)间隔物或聚恶唑啉(POZ，诸如聚甲基恶唑啉、聚乙基恶唑啉或聚丙基恶唑啉)或C5-C20非环状烷基间隔物。例如，间隔物可以是具有3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、11个以上、12个以上、15个以上、20个以上EG(乙二醇)单元的PEG间隔物。PEG接头可具有3至12个EG单元，从4至10个，或可具有4、5、6、7、8、9或10个EG单元。接头可以包括胱胺或其衍生物，可以包括一个或多个二硫基，或可以是本领域技术人员已知的任何其他合适的接头。
间隔物可能有利于使质量标签在与之结合的SBP上的空间效应最小化。亲水性间隔物，例如基于PEG的间隔物，也可以起到改善带质量标签的SBP的溶解度并防止聚集的作用。
SBP
质量细胞计数，包括成像质量细胞计数，是基于特异性结合对成员之间特异性结合的原理。质量标签连接到特定的结合对成员，这将质量标签定位到靶标/分析物，该靶标/分析物是该对的另一个成员。然而，特异性结合不需要仅结合一种分子以排除其他分子。相反，它限定了结合不是非特定的，即不是随机交互。因此，与多个靶标结合的SBP的一个实例是识别许多不同蛋白质之间共有的表位的抗体。在此，结合将是特异性的，并由抗体的CDR介导，但是抗体会检测到多种不同的蛋白质。共同的表位可以是天然存在的，或者共同的表位可以是人工标签，诸如FLAG标签。类似地，如本领域的技术人员将理解的，对于核酸，限定序列的核酸可以不排他地与完全互补的序列结合，但是可以在使用不同严格性的杂交条件下引入不同的错配耐受性。尽管如此，这种杂交并非是非特异性的，因为它是由SBP核酸与靶标分析物之间的同源性介导的。类似地，配体可以特异性结合多种受体，一个简单的实例是既可以与TNFR1又可以与TNFR2结合的TNFα。
SBP可以包含以下任意一种：核酸双链体；抗体/抗原配合物；受体/配体对；或适配体/靶标对。因此，可以将标记原子连接至核酸探针，然后将核算探针与组织样本接触，以使探针可以与其中的互补核酸杂交，例如以形成DNA/DNA双链体、DNA/RNA双链体或RNA/RNA双链体。类似地，可以将标记原子连接至抗体，然后将抗体与组织样本接触，使其可以结合其抗原。标记原子可以与配体连接，然后配体与组织样本接触，使其可以结合其受体。可以将标记原子连接至适配体，然后将适配体与组织样本接触，使其可以结合其靶标。因此，标记的SBP成员可用于检测样本中的各种靶标，包括DNA序列、RNA序列、蛋白质、糖、脂质或代谢产物。
因此，带质量标签的SBP可以是蛋白质或肽，也可以是多核苷酸或寡核苷酸。
蛋白质SBP的实例包括抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、scFv、抗体模拟物、亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、生物素或其组合，其中抗体模拟物任选地包含纳米抗体、亲和体(affibody)、亲和素、affimer、affitin、α体(alphabody)、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、kunitz结构域肽、单株(monobody)或其任何组合、受体(诸如受体-Fc融合物)、配体(诸如配体-Fc融合物)、凝集素(lectin)(例如凝集素(agglutinin)，诸如小麦胚芽凝集素)。
该肽可以是线性肽或环状肽，诸如双环肽。可以使用的肽的一个实例是鬼笔环肽。
多核苷酸或寡核苷酸通常是指含有通过3'-5'磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核苷酸的单链或双链聚合物，以及多核苷酸类似物。核酸分子包括但不限于DNA、RNA和cDNA。多核苷酸类似物可以具有除天然多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键以外的主链，以及可选地具有除核糖或脱氧核糖以外的修饰的糖部分或多个部分。多核苷酸类似物含有能够通过Watson-Crick碱基配对与标准多核苷酸碱基氢键合的碱基，其中类似物主链以允许寡核苷酸类似物分子与标准多核苷酸中的碱基之间以序列特异性方式进行此类氢键合的方式来提供碱基多核苷酸。多核苷酸类似物的实例包括但不限于异种核酸(XNA)、桥连核酸(BNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、yPNAs、吗啉代多核苷酸、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TNA)、2'-0-甲基多核苷酸、2'-0-烷基核糖基取代的多核苷酸、硫代磷酸酯多核苷酸和硼酸磷酸多核苷酸。多核苷酸类似物可以具有嘌呤或嘧啶类似物，包括例如7-脱氮嘌呤类似物、8-卤代嘌呤类似物、5-卤代嘧啶类似物或可与任何碱基配对的通用碱基类似物，包括次黄嘌呤、硝基唑、异卡比丁酮类似物、唑羧酰胺和芳香族***类似物、或具有其他功能的碱基类似物，诸如用于亲和结合的生物素部分。
抗体SBP成员
在典型的实施例中，标记的SBP成员是抗体。可以通过将一个或多个标记原子结合分子与抗体缀合来实现抗体的标记，通过使用例如NHS-胺化学物、巯基-马来酰亚胺化学物或点击化学物(诸如应变炔和叠氮化物、应变炔和硝酮、应变烯烃和四嗪等)连接质量标签。识别可用于成像的细胞蛋白质的抗体已广泛用于IHC，并且通过使用标记原子代替当前的标记技术(例如荧光)，这些已知抗体可以轻松地用于本文公开的方法中，但具有提高多路复用能力的益处。抗体可以识别细胞表面上的靶标或细胞内的靶标。抗体可以识别多种靶标，例如它们可以特异性识别单个蛋白质，或可以识别具有共同表位的多个相关蛋白质，或可以识别蛋白质上的特定翻译后修饰(例如，区分受关注蛋白质上的酪氨酸和磷酸酪氨酸，以区分赖氨酸和乙酰基-赖氨酸、检测泛素化等)。在与靶标结合后，可以检测与抗体偶联的标记原子，从而揭示该靶标在样本中的位置。
标记的SBP成员通常会直接与样本中的目标SBP成员相互作用。然而，在一些实施例中，标记的SBP成员可能与目标SBP成员间接地相互作用，例如，一抗可以与目标SBP成员结合，然后标记的二抗可以以夹心测定的方式与一抗结合。然而，通常该方法依赖于直接相互作用，因为这可以更容易地实现并且允许更高的多路复用。然而，在这两种情况下，样本都与可以结合到样本中目标SBP成员的SBP成员接触，并在以后的阶段检测到连接至目标SBP成员上的标记。
核酸SBP和标记方法修改
RNA是另一种生物分子，本文公开的方法和装置能够以特异性、灵敏的和如果需要的定量方式进行检测。以与上述用于蛋白质分析的相同方式，可以通过使用标记有与RNA特异性结合的元素标签的SBP成员来检测RNA(例如，如上所述的互补序列的多核苷酸或寡核苷酸，包括互补序列的锁核酸(LNA)分子、互补序列的肽核酸(PNA)分子、互补序列的质粒DNA、互补序列的扩增DNA、互补序列的RNA片段和互补序列的基因组DNA片段)。RNA不仅包括成熟的mRNA，还包括RNA加工中间体和新生的前体-mRNA(pre-mRNA)转录物。
在某些实施例中，使用要求保护的发明的方法检测RNA和蛋白质。
为了检测RNA，可以使用本文所述的方法和设备制备本文所述的生物学样本中的细胞以分析RNA和蛋白质含量。在某些方面，在杂交步骤之前，将细胞固定并透化。可以固定和/或透化的方式提供细胞。细胞可以通过交联固定剂诸如甲醛、戊二醛固定。可替代地或另外地，可以使用沉淀的固定剂诸如乙醇、甲醇或丙酮来固定细胞。可以用去污剂透化细胞，诸如聚乙二醇(例如Triton X-100)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20)、皂苷(一组两亲性糖苷)或诸如甲醇或丙酮的化学物质。在某些情况下，可以使用相同的试剂或一组试剂进行固定和透化。Jamur等人在“Permeabilization of CellMembranes”(Methods Mol.Biol.，2010)中讨论了固定和透化技术。
先前已经使用荧光团标记的寡核苷酸探针进行了细胞中靶核酸的检测或“原位杂交(ISH)”。如本文所讨论的，与电离和质谱联用的具有质量标签的寡核苷酸可用于检测细胞中的靶核酸。原位杂交的方法在本领域中是已知的(参见Zenobi等人，“Single-CellMetabolomics:Analytical and Biological Perspectives”，Science第342卷，第6163号，2013)。美国专利号5,225,326和美国公开号2010/0092972和2013/0164750中也描述了杂交方案，其通过引用并入本文。
在杂交之前，可以如前所述将悬浮或固定在固体支持物上的细胞固定并透化。透化可以允许细胞保留靶核酸，同时允许靶杂交核苷酸、扩增寡核苷酸和/或带质量标签的寡核苷酸进入细胞。可以在任何杂交步骤之后，例如在靶杂交寡核苷酸与核酸靶杂交之后、在扩增寡核苷酸杂交之后和/或带质量标签的寡核苷酸杂交之后，洗涤细胞。
对于该方法的所有或大多数步骤，可以将细胞悬浮，以便于处理。然而，该方法也适用于固体组织样本(例如组织切片)中的细胞和/或固定在固体支持物(例如载玻片或其他表面)上的细胞。因此，有时，细胞可以在样本中以及在杂交步骤中处于悬浮状态。其他时候，细胞在杂交过程中被固定在固体支撑物上。
靶核酸包括任何受关注核酸，并在细胞中具有足够的丰度，可通过本发明的方法进行检测。靶核酸可以是RNA，其在细胞内存在多个拷贝。例如，细胞中可以存在靶RNA的10个以上、20个以上、50个以上、100个以上、200个以上、500个以上、或1000个以上复制。靶RNA可以是信使NA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、小干扰RNA(siRNA)、长非编码RNA(IncRNA)或本领域已知的任何其他类型的RNA。靶RNA可以是20个核苷酸以上、30个核苷酸以上、40个核苷酸以上、50个核苷酸以上、100个核苷酸以上、200个核苷酸以上、500个核苷酸以上、1000个核苷酸以上、在20和1000个核苷酸之间、长度在20和500个核苷酸之间、长度在40和200个核苷酸之间，依此类推。
在某些实施例中，可以将带质量标签的寡核苷酸直接与靶核酸序列杂交。然而，其他寡核苷酸的杂交可以允许改善的特异性和/或信号放大。
在某些实施例中，可以将两个以上靶杂交寡核苷酸与靶核酸上的近端区域杂交，并且可以一起提供用于在杂交方案中与其他寡核苷酸杂交的位点。
在某些实施例中，可以将带质量标签的寡核苷酸直接与两个或更多个靶杂交寡核苷酸杂交。在其他实施例中，可以同时或相继添加一个或多个扩增寡核苷酸，以使两个或多个靶杂交寡核苷酸杂交并提供可以与带质量标签的寡核苷酸结合的多个杂交位点。一种或多种扩增寡核苷酸(具有或不具有带质量标签的寡核苷酸)可以作为能够与两种以上靶杂交寡核苷酸杂交的多聚体提供。
虽然使用两个以上靶杂交寡核苷酸改善了特异性，但是使用扩增寡核苷酸增加了信号。两个靶杂交寡核苷酸与细胞中的靶RNA杂交。两个靶杂交寡核苷酸一起提供了扩增寡核苷酸可以结合的杂交位点。扩增寡核苷酸的杂交和/或随后的洗涤可以在允许与两个近端靶杂交寡核苷酸杂交但高于扩增寡核苷酸与仅一个靶杂交寡核苷酸的杂交的解链温度的温度下进行。第一扩增寡核苷酸提供了多个杂交位点，第二扩增寡核苷酸可结合至该杂交位点，从而形成分支模式。带质量标签的寡核苷酸可以结合至第二个扩增核苷酸提供的多个杂交位点。一起，这些扩增寡核苷酸(带或不带质量标签的寡核苷酸)在本文中被称为“多聚体(multimer)”。因此，术语“扩增寡核苷酸”包括提供相同结合位点的多个拷贝的寡核苷酸，其他寡核苷酸可以与之退火。通过增加其他寡核苷酸的结合位点数目，可以发现靶标的最终标记数目增加。因此，多个标记的寡核苷酸间接地与单个靶RNA杂交。通过增加每个RNA使用的元素的可检测原子数，这可以检测低拷贝数的RNA。
进行该扩增的一种特定方法包含使用来自先进细胞诊断(Advanced celldiagnostics)的
Figure BDA0003056152930001151
方法，如下面更详细地讨论。另一种替代方法是使用一种适合
Figure BDA0003056152930001152
FlowRNA方法(Affymetrix eBioscience)的方法。该测定基于具有分支DNA(bDNA)信号放大作用的寡核苷酸对探针设计。目录中有4000多种探针，也可以***定制套件。与上一段一致，该方法通过将靶杂交寡核苷酸与靶标杂交，然后形成包含第一个扩增寡核苷酸(在
Figure BDA0003056152930001153
方法中称为预扩增寡核苷酸)的分支结构，形成茎，多个第二个扩增寡核苷酸(在
Figure BDA0003056152930001154
方法中简称为扩增寡核苷酸)可以与之退火。然后可以结合多个带质量标签的寡核苷酸。
RNA信号的另一种扩增手段依赖于滚环扩增手段(RCA)。可以将该扩增***引入扩增过程的方法有很多种。在第一种情况中，第一核酸被用作杂交核酸，其中第一核酸是环状的。第一核酸可以是单链的或可以是双链的。它包含与靶RNA互补的序列。在第一核酸与靶RNA杂交后，将与第一核酸互补的引物与第一核酸杂交，并使用通常外源添加到样本中的聚合酶和核酸用于引物延伸。然而，在一些情况下，当将第一核酸添加到样本中时，它可能已经具有用于延伸的引物与之杂交。由于第一核酸是环状的，一旦引物延伸完成了完整的一轮复制，聚合酶就可以取代引物并继续延伸(即，没有5'→3'核酸外切酶活性)，从而产生越来越多第一核酸的互补序列的链状拷贝，从而扩增该核酸序列。因此可以将包含元素标签的寡核苷酸(如上文所讨论的RNA或DNA、或LNA或PNA等)与第一核酸的补体的链状拷贝杂交。因此，可以通过分配给环状核酸的扩增步骤的时间长度来控制RNA信号的扩增程度。
在RCA的另一种应用中，不是环状的与靶RNA杂交的例如第一寡核苷酸，而是它可以是线性的，并且包含具有与其靶标互补的序列的第一部分和用户选择的第二部分。然后可以将具有与第二部分同源的序列的环状RCA模板与此第一寡核苷酸杂交，并如上所述进行RCA扩增。具有靶标特异性部分和用户选择的部分的例如第一寡核苷酸的使用是可以被选择的用户选择部分，以便在各种不同的探针之间是共同的。这是试剂有效的，因为可以在检测不同目标的一系列反应中使用相同的后续扩增试剂。然而，如本领域技术人员所理解的，当采用这种策略时，为了在多重反应中单独检测特定的RNA，与靶RNA杂交的每个第一核酸将需要具有独特的第二序列，并且随后每个环状核酸应含有可以被标记的寡核苷酸杂交的独特序列。以这种方式，可以特异性地扩增和检测来自每个靶RNA的信号。
引起RCA分析的其他配置对于本领域技术人员将是已知的。在一些情况下，为了防止在随后的扩增和杂交步骤中例如第一寡核苷酸从靶上解离，可以在杂交后(诸如通过甲醛)固定例如第一寡核苷酸。
此外，杂交链式反应(HCR)可用于扩增RNA信号(参见，例如Choi等人，2010，Nat.Biotech，28:1208-1210)。Choi解释说，一个HCR扩增器由两种核酸发夹物质组成，它们在没有引发剂的情况下不会聚合。每个HCR发夹均由带有裸露单链立足点(toehold)的输入域和隐藏在折叠发夹中的单链立足点的输出域。引发剂与两个发夹之一的输入域的杂交打开了发夹以暴露其输出域。将此(先前隐藏的)输出域与第二个发夹的输入域进行杂交，将打开该发夹，以将序列相同的输出域暴露至引发剂。引发剂序列的再生为交替进行的第一和第二发夹聚合步骤的链式反应奠定了基础，导致形成带切口的双链“聚合物”。在本文公开的方法和设备的应用中，第一发夹和第二发夹中的一个或两个可以用元素标签标记。由于扩增过程依赖于特定序列的输出域，因此可以在同一过程中独立进行使用不同发夹组的各种离散扩增反应。因此，这种扩增还允许在多种RNA种类的多重分析中进行扩增。正如Choi指出的那样，HCR是等温触发的自组装过程。因此，发夹应在进行触发的原位自组装之前先渗透样本，这表明深层样本渗透和高信噪比的潜力。
杂交可以包括使细胞与一种或多种寡核苷酸(诸如靶杂交寡核苷酸、扩增寡核苷酸和/或带质量标签的寡核苷酸)接触，并提供可发生杂交的条件。杂交可以在缓冲溶液中进行，诸如柠檬酸钠(SCC)缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、盐水-磷酸钠-EDTA(SSPE)缓冲液、TNT缓冲液(具有Tris-HCl、氯化钠和吐温20)或任何其他合适的缓冲液。杂交可以在一种或多种寡核苷酸的杂交的解链温度附近或以下的温度进行。
通过杂交后进行一次或多次洗涤可以改善特异性，以去除未结合的寡核苷酸。洗涤的严格性提高可能会改善特异性，但会降低总体信号。可以通过增加或减少洗涤缓冲液的浓度、增加温度和/或增加洗涤时间来增加洗涤的严格性。RNA酶抑制剂可用于任何或所有杂交培养和随后的洗涤中。
包括一个或多个靶杂交寡核苷酸、扩增寡核苷酸和/或质量标记的寡核苷酸的第一组杂交探针可用于标记第一靶核酸。可以使用另外的杂交探针组来标记另外的靶核酸。每组杂交探针可以对不同的靶核酸具有特异性。可以设计、杂交和洗涤另外的杂交探针组，以减少或防止不同组的寡核苷酸之间的杂交。另外，每组的带质量标签的寡核苷酸可以提供独特的信号。这样，可以使用多组寡核苷酸来检测2、3、5、10、15、20或更多个不同的核酸靶标。
有时，检测到的不同核酸是单个基因的剪接变体。带质量标签的寡核苷酸可以设计为在外显子序列内杂交(直接或间接通过其他寡核苷酸，如下所述)，以检测含有该外显子的所有转录物，或者可以设计为桥接剪接点以检测特定变体，例如，如果一个基因具有三个外显子和两个剪接变体——外显子1-2-3和外显子1-3——则可以区分两者：可以通过与外显子2杂交特异性检测出变体1-2-3，并且通过跨外显子1-3连接进行杂交可以特异性检测变体1-3。
组织化学染色剂
具有一个或多个固有金属原子的组织化学染色剂可以与本文所述的其他试剂和使用方法结合。例如，组织化学染色剂可以与含金属的药物、金属标记的抗体和/或积累的重金属共定位(例如，以细胞或亚细胞分辨率)。在某些方面，一种或多种组织化学染色剂可以以比其他成像方法(例如荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜)更低的浓度(例如，少于一半、四分之一、十分之一等)使用。
为了可视化和识别结构，可以使用多种组织学染色剂和指示剂并对其进行充分表征。含金属的染色剂可能会影响病理学家对成像质量细胞计数仪的接受程度。众所周知，某些含金属的染色剂可揭示细胞成分，并且适用于本发明。此外，可以在数字图像分析中使用定义明确的染色剂，从而为特征识别算法提供对比度。这些特征对于成像质量细胞计数仪的发展具有战略意义。
通常，可以使用诸如抗体的亲和产物来对比组织切片的形态结构。与使用组织化学染色剂相比，它们很昂贵，并且需要使用含金属的标签进行附加的标记程序。这种方法被用于成像质量细胞计数仪的开创性工作中，使用标记有可用镧系元素同位素的抗体，从而耗尽了功能性抗体的质量(例如金属)标签来回答生物学问题。
本发明扩展了包括诸如Ag、Au、Ru、W、Mo、Hf、Zr等元素的可用同位素的目录(包括诸如用于识别粘液基质的钌红、用于识别胶原纤维的三色染色剂、作为细胞复染的四氧化锇的化合物)。银染用于核型分析。硝酸银对核仁组织区域(NOR)相关蛋白进行染色，产生深色区域，其中沉积了银，并指示NOR中rRNA基因的活性。适用于IMC可能需要修改方案(例如，用高锰酸钾氧化、在过程中用1％的银浓度)以使用较低浓度的银溶液，例如小于0.5％、0.01％或0.05％的银溶液。
在某些方面，同一组织的两个切片(例如，连续组织切片)都可以被含有金属的组织化学染色剂染色，并且可以通过两种以上不同的成像模式进行分析。这些成像模式之一可能是原子质谱法。
自金相扩增技术已发展成为组织化学中的重要工具。许多内源性和有毒的重金属形成硫化物或硒化物纳米晶体，可以通过与Ag离子反应自动催化放大。然后，IMC可以很容易地看到较大的Ag纳米簇。目前，已经建立了用于Zn-S/Se纳米晶体的银放大检测以及通过形成银-硒纳米晶体检测硒的鲁棒方案。此外，市售的量子点(检测Cd)也具有自催化活性，可用作组织化学标记。
本发明的方面可以包括组织化学染色剂及其在通过元素质谱法成像中的用途。通过元素质谱法可分辨的任何组织化学染色剂均可用于本发明。在某些方面，组织化学染色剂包括一个或多个质量原子，其大于用于对样本成像的元素质谱仪的截止值，诸如大于60amu、80amu、100amu或120amu。例如，组织化学染色剂可以包括本文所述的金属标签(例如，金属原子)。金属原子可以被螯合到组织化学染色剂上，或者被共价结合在组织化学染色剂的化学结构内。在某些方面，组织化学染色剂可以是有机分子。组织化学染色剂可以是极性的、疏水的(例如亲脂的)、离子的或可以包含具有不同性质的基团。在某些方面，组织化学染色剂可以包含多于一种化学剂。
组织化学染色包括小于2000、1500、1000、800、600、400或200amu的小分子。组织化学染色剂可以通过共价或非共价(例如离子或疏水)相互作用与样本结合。组织化学染色剂可以提供对比度，以解决生物样本的形态问题，例如，帮助识别单个细胞、细胞内结构和/或细胞外结构。可以通过组织化学染色剂分辨的细胞内结构包括细胞膜、细胞质、细胞核、高尔基体、内质网、线粒体和其他细胞器。组织化学染色剂可能对某种生物分子具有亲和力，诸如核酸、蛋白质、脂质、磷脂或碳水化合物。在某些方面，组织化学染色剂可以结合DNA以外的分子。合适的组织化学染色剂还包括结合细胞外结构(例如，细胞外基质的结构)的染色剂，包括基质(例如粘膜基质)、基底膜、间质基质、蛋白质(例如胶原蛋白或弹性蛋白)、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、细胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等。
在某些方面，组织化学染色剂和/或代谢探针可以指示细胞或组织的状态。例如，组织化学染色剂可包括活体染色剂，诸如顺铂、曙红和碘化丙锭。其他组织化学染色剂可能会染色用于缺氧，例如可能仅在缺氧条件下结合或沉积。诸如碘脱氧尿苷(IdU)或其衍生物的探针可能会染色用于细胞增殖。在某些方面，组织化学染色剂可能不指示细胞或组织的状态。检测细胞状态(例如生存力、低氧和/或细胞增殖)但在体内(例如对活体动物或细胞培养物)施用的探针可用于任何本方法中，但不适合作为组织化学染色剂。
组织化学染色剂可能对一种类型的生物分子具有亲和力，诸如核酸(例如DNA和/或RNA)、蛋白质、脂质、磷脂、碳水化合物(例如糖，诸如单糖或二糖或多元醇；寡糖；和/或多糖(诸如淀粉或糖原)、糖蛋白和/或糖脂。在某些方面，组织化学染色剂可以是复染色。
以下是特定组织化学染色剂及其在本方法中的用途的实例：
钌红染色剂可作为粘液基质检测中的一种含金属的染色剂，其可如下使用：免疫染色的组织(例如，脱石蜡的FFPE或冷冻切片)可以用0.0001-0.5％、0.001-0.05％、少于0.1％、少于0.05％或约0.0025％的钌红处理(例如，在4-42℃或室温下至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟或约30分钟)。可以例如用水或缓冲溶液冲洗生物样本。然后可以在通过元素质谱仪成像之前将组织干燥。
磷钨酸(例如，作为三色染色剂)可以用作胶原纤维的含金属的染色剂。载玻片上的组织切片(脱石蜡的FFPE或冷冻切片)可以固定在布安氏(Bouin's)液中(例如，在4-42℃或约室温下至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟或约30分钟)。然后可将切片用0.0001％-0.01％、0.0005％-0.005％或约0.001％的磷酸肌酸处理(例如，在4-42℃或约室温下至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟或约15分钟)。然后，在通过元素质谱仪成像之前，可以用水和/或缓冲溶液冲洗样本，并可选地干燥。与通过光学(例如荧光)显微镜成像所使用的浓度相比，可以以稀释度(例如5倍、10倍、20倍、50倍或更大的稀释度)使用三色染色剂。
在一些实施例中，组织化学染色剂是有机分子。在一些实施例中，第二金属是共价键合的。在一些实施例中，第二金属被螯合。在一些实施例中，组织化学染色剂特异性结合细胞膜。在一些实施例中，组织化学染色剂是四氧化锇。在一些实施例中，组织化学染色剂是亲脂的。在一些实施例中，组织化学染色剂特异性结合细胞外结构。在一些实施例中，组织化学染色剂特异性结合细胞外胶原蛋白。在一些实施例中，组织化学染色剂是包含磷钨/磷钼酸的三色染色剂。在一些实施例中，在样本与抗体接触后使用三色染色剂，诸如以比用于光学成像的浓度更低的浓度，例如其中浓度是三色染色剂的50倍稀释以上。
含金属药物
医学中的金属是药理学中一个令人兴奋的新领域。对于在金属离子掺入金属蛋白、核酸金属配合物或含金属的药物或蛋白质之前暂时存储金属离子所涉及的细胞结构或者药物降解后金属离子的命运，了解较少。揭示痕量金属的运输、储存和分配所涉及的调控机制的重要第一步是对金属进行识别和定量，理想情况下是根据其在组织、细胞甚至单个细胞器和亚细胞区室中的天然生理环境。组织学研究通常在组织的薄切片或培养的细胞上进行。
许多含金属的药物被用于治疗各种疾病，但是对于它们的作用或生物分布机理还了解较少：顺铂、咪唑钌、带Mo的基于金属茂的抗癌药、带W的钨茂化合物(tungstenocene)、带Hf或Zr的B-二酮配合物、带Au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物。许多金属配合物用作MRI造影剂(Gd(III)螯合物)。金属基抗癌药物的摄取和生物分布特征对于理解和最小化潜在毒性至关重要。
药物中存在的某些金属的原子质量属于质量细胞计数仪的范围。具体而言，顺铂和其他具有Pt配合物的化合物(异丙酚、洛铂)被广泛用作治疗广泛癌症的化学治疗药物。铂基抗癌药的肾毒性和骨髓毒性是众所周知的。利用本文所述的方法和试剂，现在可以检查它们在组织切片内的亚细胞定位，以及与带质量(例如金属)标签的抗体和/或组织化学染色剂的共定位。化学治疗药物可能通过直接DNA损伤、DNA损伤修复途径抑制、放射性等对某些细胞(例如增殖细胞)有毒。在某些方面，化学治疗药物可以通过抗体中间体靶向肿瘤。
在某些方面，含金属的药物是化学治疗药物。本方法可以包括在获得生物学样本之前，将含金属的药物施用于活体动物，诸如动物研究模型或人类患者，如前所述。生物学样本可以是例如癌组织或原代细胞的活检。可替代地，可以将含金属的药物直接添加到生物样本中，该生物样本可以是永生细胞系或原代细胞。当动物是人类患者时，本方法可包括基于检测含金属药物的分布来调节包括含金属药物的治疗方案。
检测含金属药物的方法步骤可以包括通过元素质谱对含金属药物进行亚细胞成像，并且可以包括检测含金属药物在细胞内结构(诸如细胞膜、细胞质、细胞核、高尔基体、内质网、线粒体和其他细胞器)和/或细胞外结构(诸如包括基质、粘膜基质、基底膜、间质基质、诸如胶原蛋白或弹性蛋白的蛋白质、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、细胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等)。
解析(例如结合)上述结构中的一个或多个的组织化学染色剂和/或质量(例如金属)标记的SBP可以与含金属的药物共定位，以检测到药物保留在特定的细胞内或细胞外结构。例如，化学治疗药物诸如顺铂可以与结构诸如胶原蛋白共定位。可替代地或另外地，药物的定位可以与细胞生存力、细胞增殖、缺氧、DNA损伤反应或免疫反应的标记物的存在有关。
在一些实施例中，含金属的药物包含非内源性金属，诸如其中非内源性金属是铂、钯、铈、镉、银或金。在某些方面，所述含金属的药物是顺铂、咪唑钌、带Mo的基于金属茂的抗癌药、带W的钨茂化合物(tungstenocene)、带Hf或Zr的B-二酮配合物、带Au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物、带Pd的N-肉豆蔻酰基转移酶-1抑制剂(三(二亚苄基丙酮)二铝)或其衍生物。例如，药物可以包含Pt，并且可以是例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、异丙基铂、洛巴铂或其衍生物。含金属的药物可以包括非内源性金属，诸如铂(Pt)、钌(Ru)、钼(Mo)、钨(W)、铪(Hf)、锆(Zr)、金(Au)、钆(Gd)、钯(Pd)或其同位素。可以在组织切片中识别出用于光热疗法治疗癌症的金化合物(例如金诺芬)和金纳米颗粒生物缀合物。
多元分析
本公开的一个特征是其能够检测样本中的多个(例如10个以上、甚至多达100个以上)不同的目标SBP成员，例如检测多种不同的蛋白质和/或多种不同的核酸序列。为了允许差异检测这些目标SBP成员，它们各自的SBP成员应带有不同的标记原子，以便可以区分其信号。例如，在检测到十种不同的蛋白质的情况下，可以使用十种不同的抗体(每种抗体对不同的靶蛋白质具有特异性)，每个抗体带有唯一的标记，从而可以区分来自不同抗体的信号。在一些实施例中，期望使用针对单个靶标的多种不同抗体，例如识别相同蛋白质上的不同表位。因此，由于这种类型的冗余，一种方法可以使用比靶标更多的抗体。然而，通常，本公开将使用多个不同的标记原子来检测多个不同的靶标。
如果本公开使用了不止一种标记的抗体，则优选的是，抗体应对其各自的抗原具有相似的亲和力，因为这有助于确保检测到的标记原子的数量与靶抗原的丰度之间的关系。组织样本在不同的SBP之间(尤其是在高扫描频率下)将更加一致。类似地，优选的是，各种抗体的标记具有相同的效率，从而使每个抗体携带相当量的标记原子。
在一些情况下，SBP可能带有荧光标记以及元素标签。然后可以使用样本的荧光来确定样本的区域，例如组织切片，其包含受关注材料，然后可以对其进行采样以检测标记原子。例如，可以将荧光标记物与抗体缀合，该抗体与癌细胞上丰富的抗原结合，然后可以将任何荧光细胞作为靶标，以确定与标记原子缀合的SBP所引起的其他细胞蛋白的表达。
如果目标SBP成员位于细胞内，则通常需要在样本与标记物接触之前或过程中透化细胞膜。例如，当靶标是DNA序列但标记的SBP成员不能穿透活细胞的膜时，组织样本的细胞可以被固定和透化。然后，标记的SBP成员可以进入细胞并与目标SBP成员形成SBP。在这方面，可以利用与IHC和FISH一起使用的已知方案。
可以使用一种方法来检测至少一个细胞内靶标和至少一个细胞表面靶标。然而，在一些实施例中，本发明可用于检测多个细胞表面靶标，而忽略细胞内靶标。总体而言，靶标的选择将由该方法所需的信息来确定，因为本公开将提供样本中所选靶标的位置的图像。
如本文进一步所述，包含标记原子的特异性结合对象(即，亲和试剂)可用于染色(接触)生物样本。合适的特异性结合对象包括抗体(包括抗体片段)。标记原子可以通过质谱区分(即，可以具有不同的质量)。当标记原子包括一个或多个金属原子时，本文可将其称为金属标签。金属标签可以包括具有碳主链和各自结合金属原子的多个侧基的聚合物。可替代地或另外地，金属标签可以包括金属纳米颗粒。可以通过共价或非共价相互作用用金属标签来标记抗体。
抗体染色剂可用于以细胞或亚细胞分辨率对蛋白质成像。本发明的各方面包括使样本与一种或多种特异性结合由生物样本的细胞表达的蛋白质的抗体接触，其中该抗体被第一金属标签标记。例如，可以使样本与5种以上、10种以上、15种以上、20种以上、30种以上、40种以上、50种以上抗体接触，每种抗体均具有可区分的金属标签。样本可以在用抗体染色样本之前、期间(例如，为了简化工作流程)或之后(例如，避免改变抗体的抗原靶标)进一步与一种或多种组织化学染色剂接触。样本可以进一步包含本文所述的一种或多种含金属的药物和/或累积的重金属。
用于本发明的金属标记的抗体可以特异性结合不包含金属的代谢探针(例如，EF5)。其他金属标记的抗体可以特异性结合荧光和光学显微镜中使用的传统染色剂的靶标(例如，上皮组织、基质组织、细胞核等)。此类抗体包括抗钙粘着蛋白、抗胶原蛋白、抗角蛋白、抗EFS、抗组蛋白H3抗体、以及本领域已知的许多其他抗体。
组织化学染色剂
具有一个或多个固有金属原子的组织化学染色剂可以与本文所述的其他试剂和使用方法结合。例如，组织化学染色剂可以与含金属的药物、金属标记的抗体和/或积累的重金属共定位(例如，以细胞或亚细胞分辨率)。在某些方面，一种或多种组织化学染色剂可以以比其他成像方法(例如荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜)更低的浓度(例如，少于一半、四分之一、十分之一等)使用。
为了可视化和识别结构，可以使用多种组织学染色剂和指示剂并对其进行充分表征。含金属的染色剂可能会影响病理学家对成像质量细胞计数仪的接受程度。众所周知，某些含金属的染色剂可揭示细胞成分，并且适用于本发明。此外，可以在数字图像分析中使用定义明确的染色剂，从而为特征识别算法提供对比度。这些功能对于成像质量细胞计数仪的发展具有战略意义。
通常，可以使用诸如抗体的亲和产物来对比组织切片的形态结构。与使用组织化学染色剂相比，它们很昂贵，并且需要使用含金属的标签进行附加的标记程序。这种方法被用于成像质量细胞计数仪的开创性工作中，使用标记有可用镧系元素同位素的抗体，从而耗尽了功能性抗体的质量(例如金属)标签来回答生物学问题。
本发明扩展了包括诸如Ag、Au、Ru、W、Mo、Hf、Zr等元素的可用同位素的目录(包括诸如用于识别粘液基质的钌红、用于识别胶原纤维的三色染色剂、作为细胞复染的四氧化锇的化合物)。银染用于核型分析。硝酸银对核仁组织区域(NOR)相关蛋白进行染色，产生深色区域，其中沉积了银，并指示NOR中rRNA基因的活性。适用于IMC可能需要修改方案(例如，用高锰酸钾氧化、在过程中用1％的银浓度)以使用较低浓度的银溶液，例如小于0.5％、0.01％或0.05％的银溶液。
自金相扩增技术已发展成为组织化学中的重要工具。许多内源性和有毒的重金属形成硫化物或硒化物纳米晶体，可以通过与Ag离子反应自动催化放大。然后，IMC可以很容易地看到较大的Ag纳米簇。目前，已经建立了用于Zn-S/Se纳米晶体的银放大检测以及通过形成银-硒纳米晶体检测硒的鲁棒方案。此外，市售的量子点(检测Cd)也具有自催化活性，可用作组织化学标记。
本发明的方面可以包括组织化学染色剂及其在通过元素质谱法成像中的用途。通过元素质谱法可分辨的任何组织化学染色剂均可用于本发明。在某些方面，组织化学染色剂包括一个或多个质量原子，其大于用于对样本成像的元素质谱仪的截止值，诸如大于60amu、80amu、100amu或120amu。例如，组织化学染色剂可以包括本文所述的金属标签(例如，金属原子)。金属原子可以被螯合到组织化学染色剂上，或者被共价结合在组织化学染色剂的化学结构内。在某些方面，组织化学染色剂可以是有机分子。组织化学染色剂可以是极性的、疏水的(例如亲脂的)、离子的或可以包含具有不同性质的基团。在某些方面，组织化学染色剂可以包含多于一种化学剂。
组织化学染色剂包括小于2000、1500、1000、800、600、400或200amu的小分子。组织化学染色剂可以通过共价或非共价(例如离子或疏水)相互作用与样本结合。组织化学染色剂可以提供对比度，以解决生物样本的形态问题，例如，帮助识别单个细胞、细胞内结构和/或细胞外结构。可以通过组织化学染色剂分辨的细胞内结构包括细胞膜、细胞质、细胞核、高尔基体、内质网、线粒体和其他细胞器。组织化学染色剂可能对某种生物分子具有亲和力，诸如核酸、蛋白质、脂质、磷脂或碳水化合物。在某些方面，组织化学染色剂可以结合DNA以外的分子。合适的组织化学染色剂还包括结合细胞外结构(例如，细胞外基质的结构)的染色剂，包括基质(例如粘膜基质)、基底膜、间质基质、蛋白质(例如胶原蛋白或弹性蛋白)、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、细胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等。
组织化学染色剂和/或代谢探针可以指示细胞或组织的状态。例如，组织化学染色剂可包括活体染色剂，诸如顺铂、曙红和碘化丙锭。其他组织化学染色剂可能会染色用于缺氧，例如可能仅在缺氧条件下结合或沉积。诸如碘脱氧尿苷(IdU)或其衍生物的探针可能会染色用于细胞增殖。在某些方面，组织化学染色剂可能不指示细胞或组织的状态。检测细胞状态(例如生存力、低氧和/或细胞增殖)但在体内(例如对活体动物或细胞培养物)施用的探针可用于任何本方法中，但不适合作为组织化学染色剂。
组织化学染色剂可能对一种类型的生物分子具有亲和力，诸如核酸(例如DNA和/或RNA)、蛋白质、脂质、磷脂、碳水化合物(例如糖，诸如单糖或二糖或多元醇；寡糖；和/或多糖(诸如淀粉或糖原)、糖蛋白和/或糖脂。在某些方面，组织化学染色剂可以是复染色。
可用于本文的常见组织化学染色剂包括钌红和磷钨酸(例如，三色染色剂)。
除了对样本进行特殊染色外，有时，由于向组织或生物体中施以含金属的药物，或由于环境中积累的金属，样本可能含有金属原子。有时，可以在基于脉冲追赶实验策略使用此技术的方法中对组织或动物进行测试，以观察含金属材料的保留和清除情况。
例如，医学中的金属是药理学中一个令人兴奋的新领域。对于在金属离子掺入金属蛋白、核酸金属配合物或含金属的药物或蛋白质之前暂时存储金属离子所涉及的细胞结构，或者药物降解后金属离子的命运，了解较少。揭示痕量金属的运输、储存和分配所涉及的调控机制的重要第一步是对金属进行识别和定量，理想情况下是根据其在组织、细胞甚至单个细胞器和亚细胞区室中的天然生理环境。组织学研究通常在组织的薄切片或培养的细胞上进行。
许多含金属的药物被用于治疗各种疾病，但是对于它们的作用或生物分布机理还了解较少：顺铂、咪唑钌、带Mo的基于金属茂的抗癌药、带W的钨茂化合物(tungstenocene)、带Hf或Zr的B-二酮配合物、带Au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物。许多金属配合物用作MRI造影剂(Gd(III)螯合物)。金属基抗癌药物的摄取和生物分布特征对于理解和最小化潜在毒性至关重要。
药物中存在的某些金属的原子质量属于质量细胞计数仪的范围。具体而言，顺铂和其他具有Pt配合物的化合物(异丙酚、洛铂)被广泛用作治疗广泛癌症的化学治疗药物。铂基抗癌药的肾毒性和骨髓毒性是众所周知的。利用本文所述的方法和试剂，现在可以检查它们在组织切片内的亚细胞定位，以及与带质量(例如金属)标签的抗体和/或组织化学染色剂的共定位。化学治疗药物可能通过直接DNA损伤、DNA损伤修复途径抑制、放射性等对某些细胞(例如增殖细胞)有毒。在某些方面，化学治疗药物可以通过抗体中间体靶向肿瘤。
在某些方面，含金属的药物是化学治疗药物。本方法可以包括在获得生物学样本之前，将含金属的药物施用于活体动物，诸如动物研究模型或人类患者，如前所述。生物学样本可以是例如癌组织或原代细胞的活检。可替代地，可以将含金属的药物直接添加到生物样本中，该生物样本可以是永生细胞系或原代细胞。当动物是人类患者时，本方法可包括基于检测含金属药物的分布来调节包括含金属药物的治疗方案。
检测含金属药物的方法步骤可以包括通过元素质谱对含金属药物进行亚细胞成像，并且可以包括检测含金属药物在细胞内结构(诸如细胞膜、细胞质、细胞核、高尔基体、内质网、线粒体和其他细胞器)和/或细胞外结构(诸如包括基质、粘膜基质、基底膜、间质基质、诸如胶原蛋白或弹性蛋白的蛋白质、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、细胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等)。
解析(例如结合)上述结构中的一个或多个的组织化学染色剂和/或金属标记的SBP可以与含金属的药物共定位，以检测到药物保留在特定的细胞内或细胞外结构。例如，化学治疗药物诸如顺铂可以与结构诸如胶原蛋白共定位。可替代地或另外地，药物的定位可以与细胞生存力、细胞增殖、缺氧、DNA损伤反应或免疫反应的标志物的存在有关。
在某些方面，含金属的药物是顺铂、咪唑钌、带Mo的基于金属茂的抗癌药、带W的钨茂化合物(tungstenocene)、带Hf或Zr的B-二酮配合物、带Au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物、带Pd的N-肉豆蔻酰基转移酶-1抑制剂(三(二亚苄基丙酮)二铝)或其衍生物。例如，药物可以包含Pt，并且可以是例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、异丙基铂、洛巴铂或其衍生物。含金属的药物可以包括非内源性金属，诸如铂(Pt)、钌(Ru)、钼(Mo)、钨(W)、铪(Hf)、锆(Zr)、金(Au)、钆(Gd)、钯(Pd)或其同位素。可以在组织切片中识别出用于光热疗法治疗癌症的金化合物(例如金诺芬)和金纳米颗粒生物缀合物。
摄入食物或水、通过皮肤接触或吸入气溶胶，可能会导致暴露于重金属。重金属可能会积聚在人体的软组织中，因此长时间暴露会对健康产生严重影响。在某些方面，通过在动物研究模型中的受控暴露或通过在人类患者中的环境暴露，可以在体内积累重金属。重金属可以是有毒的重金属，诸如砷(As)、铅(Pb)、锑(Sb)、铋(Bi)、镉(Cd)、锇(Os)、铊(Tl)或汞(Hg)。
单细胞分析
本公开的方法包括激光消融样本中的多个细胞，因此分析来自多个细胞的羽状物，并将其内容映射到样本中的特定位置以提供图像。在大多数情况下，使用该方法的用户将需要将信号定位到样本中的特定细胞，而不是整个样本中。为此，可以标定样本中细胞的边界(例如质膜或某些情况下的细胞壁)。
可以通过多种方式来标定细胞边界。例如，可以使用可标定细胞边界的常规技术来研究样本，例如如上所述的显微镜检查。因此，当执行这些方法时，包含如上所述的相机的分析***特别有用。然后可以使用本公开的方法制备该样本的图像，并且可以将该图像叠加在较早的结果上，从而允许将检测到的信号定位在特定细胞上。实际上，如上所述，在一些情况下，激光消融可以仅针对样本中的细胞子集，通过基于显微镜的技术，该细胞子集被确定为受关注的。
然而，为了避免使用多种技术的需要，标定细胞边界可以作为本公开的成像方法的一部分。此类边界标定策略是IHC和免疫细胞化学所熟悉的，并且可以通过使用可检测到的标记来适用这些方法。例如，该方法可以包括标记已知位于细胞边界的目标分子，然后可以将来自这些标记的信号用于边界标定。合适的目标分子包括细胞边界的丰富或通用标志物，诸如粘附配合物的成员(例如β-连环蛋白或E-钙粘蛋白)。一些实施例可以标记一种以上的膜蛋白以增强标定。
除了通过包括合适的标记来标定细胞边界外，还可以以此方式标定特定的细胞器。例如，诸如组蛋白(例如H3)的抗原可以用于识别细胞核，并且还可以标记线粒体特异性抗原、细胞骨架特异性抗原、高尔基体特异性抗原、核糖体特异性抗原等，从而允许通过本公开的方法分析细胞超微结构。
标定细胞(或细胞器)边界的信号可以用肉眼评估，也可以通过计算机使用图像处理进行分析。此类技术在本领域中对于其他成像技术是已知的，例如参考文献xxv描述了一种分割方案，该方案使用空间滤波由荧光图像确定细胞边界，参考文献xxvi公开了一种根据明场显微镜图像确定边界的算法，参考文献xxvii公开了CellSeT方法以从共聚焦显微镜图像提取细胞几何形状，以及参考文献xxviii公开了用于荧光显微镜图像的CellSegmMATLAB工具箱。对于本公开有用的方法使用分水岭变换和高斯模糊。这些图像处理技术可以单独使用，也可以先使用这些技术然后再用肉眼检查。
一旦标定了细胞边界，就可以将信号从特定的目标分子分配给单个细胞。也可以量化单个细胞中目标分析物的量，例如通过根据定量标准对方法进行校准。
元素标准
在某些方面，样本载体可以包括元素标准。本公开的方法可以包括将元素标准应用于样本载体。可替代地或附加地，本公开的方法可以包括基于元素标准进行校准和/或基于元素标准对从样本获得的数据进行归一化，如进一步所讨论的。包括元素标准的样本载体和方法可以进一步包括本公开中其他地方描述的其他方面或步骤。
元素标准可以包括颗粒(例如，聚合物珠)，该颗粒包含已知数量的多种同位素。在某些方面，颗粒可以具有不同的尺寸，每个尺寸包含一定数量的多个同位素。可以将颗粒施加到保持样本的载体上。例如，当样本是细胞涂片时，可以将元素标准颗粒施加到支撑物上(例如，与细胞涂片一起)。
当元素标准如本文所述包含不同的颗粒时，本***和方法可允许在颗粒表面扫描激光，以提供连续的羽状物，以供ICP-MS分析。可以以这种方式获取所有颗粒，从而从具有已知数量的多个同位素的颗粒中提供积分信号。从颗粒获取的信号可以随时间积分并用于本文所述的归一化或校准。
取决于***和应用，仪器灵敏度漂移可能由多种因素引起，包括离子光学器件漂移、表面电荷、检测器漂移(例如老化)、影响扩散的温度和气体漂移以及电子性能(例如等离子功率、离子光学电压等)。可以通过使用如本文所述的元素标准进行归一化或校准来适应这样的仪器灵敏度。
元素标准可以包括包含一种或多种元素或同位素的颗粒、薄膜和/或聚合物。元素标准可以包括整个元素标准中一致的元素或同位素丰度。可选地，元素标准可以包括单独的区域，每个区域具有不同量的一种或多种元素或同位素(例如，提供标准曲线)。元素标准的不同区域可以包含元素或同位素的不同组合。
如本文所述，可以将已知元素或同位素组成的元素标准颗粒(即参考颗粒)添加到样本(或样本支撑物或样本载体)中，以在检测样本中的目标元素离子期间用作参考。在某些实施例中，参考颗粒包含金属元素或同位素，诸如过渡金属或镧系元素。例如，参考颗粒可以包含质量大于60amu、大于80amu、大于100amu或大于120amu的元素或同位素。一种或多种元素或同位素的数量可能是已知的。例如，相同元素或同位素组成的参考颗粒中原子数的标准偏差可以是平均原子数的50％、40％、30％、20％或10％。
在某些情况下，参考颗粒可以是光学可分辨的(例如，可以包括一种或多种荧光团)。
在某些情况下，参考颗粒可以包括质量大于100amu的元素或元素同位素(例如，镧系元素或过渡元素系列中的元素)。可替代地或附加地，参考颗粒可以包括多种元素或元素同位素。例如，参考颗粒可以包括与样本中所有、部分标记原子的元素或元素同位素相同的元素或元素同位素或可以包括与与样本中标记原子的元素或元素同位素不相同的元素或元素同位素。可替代地，参考颗粒可包括在至少一个标记原子的质量之上和之下的质量的元素或元素同位素。参考颗粒可以具有已知量的一种或多种元素或同位素。参考颗粒可以包括具有与目标元素不同的元素或同位素的参考颗粒、或可以包括目标元素不同的元素或同位素的不同组合的参考颗粒。
元素标准颗粒(即参考颗粒)的直径范围可以与本文通常描述的颗粒相似，诸如直径在1nm和1um之间、10nm和500nm之间、20nm和200nm之间、50nm和100nm之间、小于1um、小于800nm、小于600nm、小于400nm、小于200nm、小于100nm、小于50nm、小于20nm、小于10nm或小于1nm。在某些方面，元素标准颗粒可以是纳米颗粒。元素标准颗粒可具有与本文通常在例如可具有金属纳米晶体核和/或聚合物表面中描述的颗粒相似的组成。
本发明的各方面包括用于在通过成像质谱法进行的样本运行期间归一化的方法、样本和参考颗粒。归一化可以通过检测单个参考颗粒来进行。参考颗粒可以用作成像质谱法中的标准，以例如根据以下描述的实施例的任何方面来校正样本成像期间的仪器灵敏度漂移。
在某些方面，使样本的质谱成像的方法包括在固体支撑物上提供样本，其中样本包括一个或多个目标元素，并且其中参考颗粒分布在样本上或样本内，使得多个参考颗粒可以单独分辨。可以执行样本上的电离和雾化位置以产生目标元素离子和参考颗粒元素离子。可以检测到目标元素离子和来自各个参考颗粒的元素离子(例如，在样本上的不同位置)。目标元素离子可以是在检测到的目标元素离子附近检测到的一个或多个单独参考颗粒的归一化元素离子。可替代地或附加地，可以将在第一和第二位置处检测到的目标元素离子归一化为从不同的单个参考颗粒检测到的元素离子。然后可以通过本领域中已知或描述的任何方式来产生标准化目标元素离子的图像。
本发明的方面包括在固体支撑物上的生物样本，其包括多个(例如，共价或非共价地)附着于标记原子(例如，包括标记原子的元素标签)的特异性结合伙伴。生物样本可进一步包括分布在固体支撑物上的生物样本之上或之内的参考颗粒，使得多个参考颗粒可被单独分辨。
本发明的各方面包括通过在固体支撑物上提供样本来制备这样的生物样本，其中样本是固体支撑物上的生物样本，用附着于标记原子的特异性结合伙伴标记生物样本，并将参考颗粒分布在生物样本上或内，使得多个参考颗粒可单独分辨。在某些方面，样本是生物学样本，其可以包括一种或多种目标元素，诸如本文所描述的标记原子。
本发明的各方面包括使用参考颗粒或参考颗粒的组合物作为成像质谱法中的标准，以校正样本成像期间仪器灵敏度的漂移。在某些方面，样本是生物学样本，其可以包括一种或多种目标元素，诸如本文所描述的标记原子。
如上所述，上述方法和用途可包括其他要素，如下所述。
元素标准可以沉积在样本或其一部分上或之中。可替代地或附加地，元素标准可以位于在样本载体上与样本不同的位置、或与样本待放置的位置不同的位置。
在另一个实例中，在一部分样本的时间附近，诸如在6小时、3小时、1小时、30分钟、10分钟、1分钟、30秒、10秒、1秒、500us、100us、50us或10us之内、或在一定数量的激光或离子束脉冲之内(诸如1000个脉冲、500个脉冲、100个脉冲或50个脉冲之内)，从检测目标元素离子来检测到元素标准颗粒，可以用于归一化或校准。
可以基于从各个参考颗粒中检测到的元素离子，对样本元素中的目标元素(诸如标记原子)进行归一化处理。例如，本方法可以包括在从单个参考颗粒检测元素离子与仅检测目标元素离子之间切换。
可以将目标元素离子检测为强度值，例如离子峰下的面积或同一质量通道内的离子事件(脉冲)数。在某些情况下，可以将检测到的目标元素离子归一化为从各个参考颗粒中检测到的元素离子。在某些情况下，在同一样本运行期间，将不同位置的目标元素离子归一化为不同的参考颗粒。
归一化可以包括目标元素离子的定量。在参考颗粒具有已知数量的一种或多种元素或同位素的情况下(例如，如上所述，具有一定的确定性)，从参考颗粒的元素离子中检测到的信号可用于量化目标元素离子。
在样本运行过程中对参考颗粒进行归一化，可以补偿仪器灵敏度的漂移，其中在不同位置检测到的相同数量的目标元素可能会有所不同。取决于***和应用，仪器灵敏度漂移可能由多种因素引起，包括离子光学器件漂移、表面电荷、检测器漂移(例如老化)、影响扩散的温度和气体漂移以及电子性能(例如等离子功率、离子光学电压等)。
本发明的各方面包括一种或多种元素膜，其可以被施加到或存在于诸如样本载体的支撑物上作为元素标准。元素膜可以是粘合元素膜和/或聚合物膜。例如，如图10所示，元素膜可以是聚酯标签上的薄层聚合物膜(例如，用元素或同位素(例如Y、In、Ce、Eu、Lu)的组合来编码)。在某些实施例中，元素膜可以包括可被安装在支撑物上的聚合物(例如，塑料)层。支撑物可以是样本载玻片，如本文所述。在其他实施例中，可以将元素膜预印在样本载玻片上。如本文所讨论的，样本载玻片可具有一个或多个用于结合样本中的细胞和/或游离分析物的区域。
在某些方面，聚合物膜可以是聚酯塑料膜。该聚合物可以是长链聚合物，当与金属溶液和挥发性溶剂混合时，在蒸发溶剂后，可以形成包裹金属的膜。例如，聚合物膜可以是聚(甲基丙烯酸甲酯)聚合物，并且溶剂可以是甲苯。可以将聚合物旋涂以使其均匀分布。
元素膜可以包含至少1、2、3、4、5、10或20种不同的元素。元素膜可以包含至少1、2、3、4、5、10、20、30、40或50种不同的元素同位素。元素或元素同位素可包括金属，诸如镧系元素和/或过渡元素。一些或全部元素同位素的质量可为60amu以上、70amu以上、80amu以上、90amu以上、或100amu以上。在某些情况下，元素膜可包含与一个或多个标记原子相同的元素、元素同位素或元素同位素质量。例如，元素膜可以包含与用于在相同支撑物上标记样本的质量标签相同的质量标签。元素膜可以包含与聚合物键合的元素原子(共价或通过螯合)，或可以包含直接与膜键合的元素原子(游离的、成簇的或螯合的)。元素膜可以包含在其整个表面上均匀地覆盖元素或元素同位素，尽管单独的同位素可以相同或不同的量存在。可替代地，可以在膜的整个表面上以已知的分布图案化不同量的相同同位素。元素膜可以为至少0.01、0.1、1、10或100平方毫米。
在某些方面，可以在用质量标签进行标记之后(并且可能在冲洗未结合的质量标签之后)将元素膜施加到样本载玻片上。这可以减少来自元素膜的样本的交叉污染。例如，使用元素膜可能会导致样本采集过程中背景增加少于50％、25％、10％或5％。背景可以是元素膜中存在的一种或多种(例如大部分)同位素质量的信号强度。
在某些方面，整个元素膜上的每个元素同位素(或大多数元素同位素)的平均数(或平均强度)可具有小于20％、小于15％、小于20％、或小于5％或2％的变异系数(CV)。例如，CV可能小于6％。可以在至少2、5、10、20或40个受关注区域处测量CV，其中每个区域至少为100、500、1000、5000或10000平方微米。类似地，元素膜之间的每个元素同位素(或大多数元素同位素)的平均值(或平均强度)的CV可以小于20％、15％、10％、5％或2％。
元素膜可用于标记原子的调谐、信号归一化和/或定量(例如，在样本运行内和/或样本运行之间)。例如，可以在长的样本运行中(例如，超过1、2、4、12、24或48小时)使用元素膜。
在某些方面，粘合元素膜可用于在样本采集之前、在单个固体支撑物上从不同区域(或在不同时间)采集样本之间、或两者之间对设备进行调谐。在调谐期间，可以对粘合元素膜进行激光消融，并且可以将所得的消融羽状物(例如瞬态)转移到质量检测器中，如本文所述。然后可以读出空间分辨率、瞬态串扰和/或信号强度(例如，一次或多次推动中的离子计数数量，诸如在给定瞬态中的所有推动中)。可以基于读数来调整一个或多个参数。此类参数可以包括气体流量(例如，鞘、载体和/或补充气体流量)、电压(例如，施加到放大器或离子检测器的电压)和/或光学参数(例如，消融频率、消融能量、消融距离等)。例如，可以调节施加到离子检测器的电压，以使信号强度返回到期望值(例如，预设值或从从相同或相似的粘合元素膜获得的较早信号强度获得的值)。
在某些方面，粘合元素膜可用于归一化来自不同固体支撑物上的样本之间检测到的标记原子，来自单个固体支撑物上的样本在区域之间(或在不同时间)检测到的标记原子或两者的信号强度。归一化在样本采集后执行，并允许比较从不同样本、区域、时间或操作条件获得的信号强度。从样本或其区域的给定元素同位素(例如，与质量标签相关联)获取的信号强度(例如，离子数)可以归一化为从以下位置获取的相同(或相似)元素同位素的信号强度：在空间或时间上接近的元素膜。例如，可以使用在空间上接近的元素膜(诸如在检测到的目标元素离子的100um、50um、25um、10um或5um之内)进行归一化。在另一实例例中，在时间接近范围内(诸如在1分钟、30秒、10秒、1秒、500us、100us、50us或10us之内)或一定数量的激光或离子束脉冲之内(诸如1000个脉冲、500个脉冲、100个脉冲或50个脉冲)，来自目标元素粒子的检测的元素膜可用于归一化。
归一化可以包括目标元素离子(例如，电离的元素同位素)的定量。在元素膜具有已知数量的一种或多种元素或同位素的情况下(例如，如上所述，具有一定的确定性)，从元素膜中的元素离子检测到的信号可用于量化目标元素离子。
在样本运行过程中对元素膜进行归一化可以补偿仪器灵敏度的漂移，其中在不同位置检测到的相同数量的目标元素可能会有所不同。取决于***和应用，仪器灵敏度漂移可能由多种因素引起，包括离子光学器件漂移、表面电荷、检测器漂移(例如老化)、影响扩散的温度和气体漂移以及电子性能(例如等离子功率、，离子光学电压等)。作为归一化的替代或补充，可以基于从元素膜获取的信号，来调整影响上述仪器灵敏度漂移因子的参数。
如下所述，元素(例如元素同位素)标准可用于产生标准曲线，以量化质量标签的数量(例如标记原子的数量)或由给定质量标签结合的分析物的数量。具有已知元素或元素同位素的不同已知量的多个元素膜(或单个元素膜的多个区域)可用于产生此类标准曲线。
在某些情况下，元素膜可以是胶带上的含金属标准品。长时间采集图像时，可以将这种胶带粘贴到染色的组织玻片上。这些长时间的采集可受益于定期采样以采集数据以主动监视仪器性能的过程。这进一步实现了纵向研究的标准化和/或归一化。
如本文所述，元素标准可包括已知元素或同位素组成的参考颗粒，可将其添加到样本(或样本载体)中，用作检测样本中目标元素离子时的参考。在某些情况下，参考颗粒包含金属元素或同位素，诸如过渡金属或镧系元素。例如，参考颗粒可包含质量大于60amu、大于80amu、大于100amu或大于120amu的元素或同位素。
目标元素(诸如标记原子)可以在样本运行中基于从单个参考颗粒中检测到的元素离子进行归一化。例如，本方法可以包括在从单个参考颗粒检测元素离子与仅检测目标元素离子之间切换。
使用水凝胶进行分析前样本扩展
常规的光学显微术被限制在照明光源波长的一半左右，最小可行分辨率为约200nm。扩展显微术是一种样本制备方法(特别是对于生物样本)，该方法使用聚合物网络物理地扩展样本，从而将样本的光学可视化分辨率提高至20nm左右(WO2015127183)。扩展过程可用于制备用于成像质谱和成像细胞计数仪的样本。通过此过程，在未扩展的样本上，直径为1μm的消融斑点将提供1μm的分辨率，但是在扩展后，1μm的消融斑点可表示～100nm的分辨率。
扩展显微镜可以提供扩展的样本，其中粘附组织中的单个细胞(或其他特征)可以通过激光扫描***和其中描述的方法分别进行采样。
生物样本的扩展显微术通常包含以下步骤：固定、锚定准备、胶凝、机械均质化和扩展。
在固定阶段，将样本化学固定并清洗。但是，特定的信号传导功能或酶促功能(诸如蛋白质-蛋白质相互作用)作为生理状态的函数，可以使用扩展显微术检查而无需固定步骤进行检查。
接下来，制备样本，使得它们可以附接(“锚定”)到在随后的凝胶化步骤中形成的水凝胶。在此，将本文中其他地方讨论的SBP(例如可以特异性结合样本中受关注目标分子的抗体、纳米抗体、非抗体蛋白、肽、核酸和/或小分子)与样本一起温育，从而与样本中存在的目标SBP结合。可选地，可以用可用于成像的可检测化合物标记(有时称为“锚定”)样本。对于光学显微术，可检测的化合物可以包含例如由荧光标记的抗体、纳米抗体、非抗体蛋白质、肽、核酸和/或可以特异性结合样本中受关注目标分子的小分子而提供的化合物(US2017276578)。对于质量细胞计数，包括成像质量细胞计数，可检测标记可以由例如被元素标签标记的抗体、纳米抗体、非抗体蛋白质、肽、核酸和/或可以特异性结合样本中受关注目标分子的小分子提供。在一些情况下，与靶标结合的SBP不含有标记，而是含有可以与第二SBP结合的特征(例如，与靶标结合的一抗以及与一抗结合的二抗，如在免疫组织化学技术中很常见)。如果仅使用第一SBP，则其本身可以连接至将样本附着或交联到随后的凝胶化步骤中形成的水凝胶的部分上，从而可以将样本束缚到水凝胶上。可替代地，如果使用第二SBP，则该第二SBP可能包含将样本附着或交联到水凝胶的部分。在一些情况下，使用第三SBP，则该第三SBP结合到第二SBP。Chen等人，2015(Science 347:543-548)中提出了一种示例性实验方案，其使用一抗结合至靶标，二抗结合至一抗，其中二抗附接至寡核苷酸序列，然后是与附接至第二抗体的序列互补的寡核苷酸作为第三SBP，其中第三SBP包含可以掺入丙烯酰胺水凝胶的甲基丙烯酰基。在一些情况下，包含掺入水凝胶中的部分的SBP也包括标记。这些标记可以是荧光标记或元素标记，因此可用于随后的分析，例如通过流式细胞术、光学扫描和荧光法(US2017253918)、或质量细胞计数或成像质量细胞计数。
通过将包含紧密交联的、带高电荷的单体的水凝胶注入样本中，胶凝阶段在样本中产生基质。例如，丙烯酸钠与共聚单体丙烯酰胺和交联剂N-N’亚甲基双丙烯酰胺已被引入到固定的和可渗透的脑组织中(参见Chen等人，2015)。当聚合物形成时，它结合了在锚固步骤中与靶标连接的部分，从而使样本中的靶标连接到凝胶基质上。
然后用均质剂处理样本以使样本的机械特性均质化，使得样本不抵抗扩展(WO2015127183)。例如，可以通过用酶(诸如蛋白酶)降解、通过化学蛋白水解(例如通过溴化氰)、通过将样本加热到70-95摄氏度或通过物理破坏(诸如超声处理)来使样本均质化(US2017276578)。
然后，通过在低盐缓冲液或水中渗析配合物，使样本/水凝胶配合物扩展，以使样本在3维方向上扩展至其原始大小的4倍或5倍。随着水凝胶的扩展，样本以及特别连接到靶标的标记物和水凝胶也扩展，同时保持标记物的原始三维布置。由于样本扩展是在低盐溶液或水中扩展的，因此扩展后的样本是透明的，允许深入样本进行光学成像，并且在进行质量细胞计数(例如通过使用蒸馏水或通过其他工艺纯化，包括电容性去离子、反渗透、碳过滤、微滤、超滤、紫外线氧化或电去离子)时，无需显著引入污染元素即可进行成像。
然后可以通过成像技术分析扩展后的样本，从而提供伪改进的分辨率。例如，荧光显微术可以与荧光标记一起使用，并且成像质量细胞计数可以与元素标记一起使用、任选地组合使用。由于水凝胶的溶胀和扩展样本中的标记之间的距离相对于天然样本的增加，以前无法单独分辨的标记(由于光学显微镜中可见光的衍射极限或IMC中的斑点直径而导致)。
存在扩展显微术(ExM)的变体，其也可以使用本文公开的设备和方法来应用。这些变体包括：蛋白质保留ExM(proExM)、扩展荧光原位杂交(ExFISH)、迭代ExM(iExM)。迭代扩展显微术涉及在已经使用上述技术进行了初步扩展的样本中形成第二种可扩展聚合物凝胶。溶解第一扩展凝胶，然后扩展第二可扩展的聚合物凝胶以使总扩展达到约20倍。例如，Chang等人，2017(Nat Methods 14:593-599)将该技术基于以上讨论的Chen等人(2015)的方法，替代的是用可裂解的交联剂(例如，可在高pH下裂解其二醇键的市售交联剂N,N'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺(DHEBA)制作第一凝胶)。在第一凝胶的锚定和扩展之后，将标记的寡核苷酸(包含用于掺入第二凝胶的部分)和与掺入到第一凝胶中的寡核苷酸互补的寡核苷酸被添加到扩展样本中。形成了第二凝胶，其掺入了标记的寡核苷酸的部分，并且第一凝胶通过可裂解的接头的裂解而分解。然后以与第一凝胶相同的方式使第二凝胶扩展，从而使标记物进一步在空间上分离，但相对于原始样本中靶标的排列，仍保持其空间布置。在一些情况下，在第一凝胶扩展之后，使用中间的“重新包埋凝胶”以将扩展的第一凝胶保持在适当的位置，同时进行实验步骤，例如使标记的SBP与第一凝胶基质杂交。在第一水凝胶和再包埋凝胶被分解以允许第二水凝胶扩展之前，形成未扩展的第二水凝胶。如前所述，所使用的标记可以是荧光或元素标签，并且因此在随后的分析中适当地通过例如流式细胞术、光学扫描和荧光术、或质量细胞计数或成像质量细胞计数使用。
定义
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可能仅由X组成，也可能包括另外的其他内容，例如X+Y。
与数值x有关的术语“约”是可选的，并且是指例如x+10％。
词语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在必要时，本公开的定义可以省略词语“基本上”。
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Claims (69)

1.一种用于分析生物样本的设备，所述设备包含：
(i)采样和电离***，用于从样本去除材料并使所述材料电离以形成元素离子，所述采样和电离***包含激光源、激光扫描***和样本台。
2.根据权利要求1所述的设备，还包含：
(ii)检测器，从所述采样和电离***接收所述元素离子并检测所述元素离子。
3.根据权利要求1或2所述的设备，其中，所述采样和电离***包含采样***和电离***，其中，所述采样***包含所述激光源、所述激光扫描***和所述样本台，并且其中所述电离***适于接收通过激光***从所述样本去除的所述材料，并电离所述材料以形成所述元素离子。
4.根据权利要求1、2或3所述的设备，其中，所述激光扫描***包含***，所述***能够赋予所述激光源发射的激光束相对于所述样本台的第一相对移动。
5.根据权利要求4所述的设备，其中，所述激光扫描***的所述***还能够赋予所述激光束相对于所述样本台的第二相对移动，其中，所述第一相对移动和所述第二相对移动不平行，诸如其中相对移动是正交的。
6.根据权利要求4所述的设备，其中，所述激光扫描***还包含第二***，所述第二***能够赋予所述激光束相对于所述样本台的第二相对移动，其中所述第一相对移动和所述第二相对移动不平行，诸如其中相对移动是正交的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中，所述激光扫描***的响应时间快于1ms、快于500μs、快于250μs、快于100μs、快于50μs、快于10μs、快于5μs、快于1μs、快于500ns、快于250ns、快于100ns、快于50ns、快于10ns或约1ns。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的设备，其中，所述***和/或所述第二***是：(i)基于镜的***，诸如检流计镜、MEMS镜、多边形扫描仪、压电器件镜和/或(ii)固态***，诸如声光器件(AOD)或电光器件(EOD)。
9.根据权利要求8所述的设备，其中，所述激光扫描***包含：
(i)为EOD的所述***，诸如其中两组电极已经正交地连接到折射介质上的EOD；或
(ii)为两个正交排列的AOD形式的所述***和所述第二***；或(iii)为检流计镜对形式的所述***和所述第二***。
10.根据权利要求8或9所述的设备，其中，所述激光扫描***包含：
(i)为所述检流计镜的所述***和为AOD的所述第二***；
(ii)为所述检流计镜的所述***和为EOD的所述第二***；
(iii)为检流计镜对形式的所述***和所述第二***，并且还包含AOD；或
(iv)为检流计镜对形式的所述***和所述第二***，并且还包含EOD。
11.根据权利要求8、9或10所述的设备，其中，AOD折射介质由选自以下项的材料形成：二氧化碲、熔融二氧化硅、铌酸锂、三硫化砷、碲酸盐玻璃、硅酸铅、Ge55As12S33、一价汞氯化物和二价铅溴化物。
12.根据权利要求8、9或10所述的设备，其中，EOD折射介质由选自以下项的材料形成：KTN(KTaxNb1-xO3)、LiTaO3、LiNbO3、BaTiO3、SrTiO3、SBN(Sr1-xBaxNb2O6)、BSKNN(Ba2-xSrxK1- yNayNb5O15)和PBN(Pb1-xBaxNb2O6)。
13.根据权利要求4至12中任一项所述的设备，还包含：在所述***和/或所述第二***与所述样本之间的至少一个色散补偿器，所述色散补偿器适于当所述***为AOD时和/或当所述第二***是AOD时补偿由所述***引起的任何色散，可选地，其中所述色散补偿器是(i)具有适合于补偿由所述***引起的色散的线间距的衍射光栅；(ii)适用于补偿由所述***和/或所述第二***引起的色散的棱镜；(iii)包含所述衍射光栅(i)和所述棱镜(ii)的组合；和/或(iv)另一声光器件。
14.根据权利要求4至13中任一项所述的设备，其中，所述样本台至少在x轴上是能移动的，并且其中所述***适于将至少在y轴上的偏转引入到所述激光束至所述样本台上的路径中。
15.根据权利要求14所述的设备，其中：
(i)所述***还适于将x轴上的偏转引入到所述激光束至所述样本台上的路径中；或
(ii)所述设备包含所述第二***，所述第二***适于将x轴上的偏转引入到所述激光束至所述样本台上的路径上；
可选地，其中所述激光扫描***的所述***由控制模块控制，所述控制模块还控制所述样本台的移动。
16.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中，所述激光源是皮秒激光器或飞秒激光器，特别是所述飞秒激光器，可选地包含脉冲拾取器，诸如其中所述脉冲拾取器由控制模块控制，所述控制模块还控制所述样本台和/或所述激光扫描***的所述***的移动。
17.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中：
(i)消融速率为200Hz以上，诸如500Hz以上、750Hz以上、1kHz以上、1.5kHz以上、2kHz以上、2.5kHz以上、3kHz以上、3.5kHz以上、4kHz以上、4.5kHz以上、5kHz以上、或者10kHz以上、约100kHz、100kHz以上、1MHz以上、10MHz以上、或100MHz以上；和/或
(ii)激光重复频率为至少1kHz，诸如至少10kHz、至少100kHz、至少1MHz、至少10MHz、约50MHz、或至少100MHz，可选地其中所述采样***还包含脉冲拾取器，诸如其中所述脉冲拾取器由控制模块控制，所述控制模块还控制所述样本台和/或所述激光扫描***的所述***的移动。
18.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中，所述激光源适于产生直径为或小于10μm、小于5μm、小于2μm、约1μm或小于1μm的斑点尺寸。
19.根据前述权利要求中任一项所述的设备，还包含相机。
20.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中，所述电离***是ICP。
21.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中，所述检测器是TOF质谱仪。
22.一种分析样本的方法，所述方法包含：
(i)在样本台上进行样本的激光消融，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到所述样本上，并且其中在多个位置处进行消融以形成多个羽状物；以及
(ii)对所述羽状物进行电离和质谱分析，从而检测所述羽状物中的原子以允许构建所述样本的图像，可选地其中所述多个位置是多个已知位置。
23.一种对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，所述方法包含：
(i)用一个或多个不同的标记原子来标记所述样本中的多个不同的目标分子，以提供标记的样本；
(ii)在样本台上进行所述样本的激光消融，其中使用激光扫描***将激光辐射引导到所述样本上，并且其中在多个位置处进行消融以形成多个羽状物；以及
(iii)对所述羽状物进行电离和质谱分析，从而检测所述羽状物中的原子以允许构建所述样本的图像，可选地其中所述多个位置是多个已知位置。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中：
a.将一个或多个所述羽状物分别进行所述电离和质谱分析；和/或
b.从已知位置处产生一个或所述多个羽状物。
25.根据权利要求22或23所述的方法，其中，将来自相邻已知位置的所述羽状物作为单个事件进行分析，诸如其中在所述样本的一个或多个受关注特征处执行消融，并且来自所述相邻已知位置的所述羽状物全部来自于一个或多个所述受关注特征，例如单细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，相邻的斑点小于用于消融所述样本的激光辐射的斑点尺寸的直径的10倍，诸如小于间隔的所述斑点尺寸的直径的8倍、小于5倍、小于2.5倍、小于2倍、小于1.5倍、约1倍、或小于1倍。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中，所述方法包含控制所述激光扫描***中的***，以赋予激光器发射的激光束相对于所述样本台的第一相对移动。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述方法包含控制所述激光扫描***中的所述***，以赋予所述激光束相对于所述样本台的第二相对移动，其中所述第一相对移动和所述第二相对移动不平行，诸如其中相对移动是正交的。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述方法包含控制所述激光扫描***中的第二***，以赋予所述激光束相对于所述样本台的第二相对移动，其中所述第一相对移动和所述第二相对移动不平行，诸如其中相对移动是正交的。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，包含：通过控制所述样本台的移动，在第一方向上移动所述样本；以及通过控制所述激光扫描***的所述***，与所述样本相比在激光辐射束中引入第二方向上的相对移动，其中所述第一方向和所述第二方向不平行，可选地，所述第一方向和所述第二方向是正交的，并且可选地，其中被扫描的区域大于不移动所述样本台而能被扫描的区域。
31.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，包含：通过控制所述样本台的移动来使所述样本在X轴上移动；以及通过控制所述激光扫描***的所述***，与所述样本相比在激光辐射束中引入在Y轴上的相对移动。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，与所述样本相比，所述激光扫描***还在所述激光辐射中引入在X轴上的相对移动，诸如其中所述激光扫描***补偿所述样本台的相对移动，从而保持所述样本上的消融斑点的规则网格图案。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，包含执行所述样本的3D成像，其中使用激光消融将所述样本的至少一部分消融至第一深度，然后通过消融暴露至所述第一深度的样本，将所述样本的一部分消融至第二深度。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，控制焦距以实现消融深度的改变，和/或其中，所述样本台使所述样本在Z轴上移动以影响样本深度的改变。
35.根据权利要求26至33中任一项所述的方法，其中，所述***和/或所述第二***是：(i)基于镜的***，诸如检流计镜、MEMS镜、多边形扫描仪、压电器件镜和/或(ii)固态***，诸如声光器件(AOD)或电光器件(EOD)。
36.根据权利要求22、23和25至35中任一项所述的方法，包含控制产生激光辐射的激光器和所述激光扫描***的所述***，以产生被引导到所述样本上的位置的激光辐射脉冲的猝发，其中由所述激光辐射脉冲的所述猝发产生的羽状物被电离并作为连续事件进行检测，可选地，其中所述猝发中的脉冲的脉冲持续时间短于10-12s。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述激光辐射的所述猝发包括至少三个激光脉冲，其中，每个激光脉冲之间的持续时间短于1ms、诸如短于500μs、短于250μs、短于100μs、短于50μs、短于10μs、短于1μs、短于500ns、短于250ns、短于100ns、短于50ns或约10ns以下。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述激光辐射的所述猝发包含至少10个、至少20个、至少50个或至少100个激光脉冲。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中，所述***是：(i)EOD，诸如其中已经将两组电极正交地连接到折射介质的EOD；或(ii)所述***是两个正交布置的AOD，可选地，其中所述方法还包含通过AOD控制激光辐射束的强度。
40.根据权利要求22至39中任一项所述的方法，其中，所述方法包含以下步骤：识别所述样本上的一个或多个受关注特征，记录所述样本上的一个或多个所述受关注特征的位置信息，以及对所述样本进行消融，其中使用一个或多个所述受关注特征的位置信息，使用所述激光扫描***将所述激光辐射引导到所述样本上，以形成一个或多个所述羽状物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，来自所述受关注特征的所述羽状物被分析为连续事件。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中，通过检查所述样本的光学图像来识别特征，可选地其中所述样本已经用荧光标记物标记，并且在所述荧光标记物发荧光的条件下照射所述样本。
43.一种分析样本的方法，所述方法包含：
(i)使用激光辐射解吸样本材料的块，其中使用激光扫描***将所述激光辐射引导到样本台上的样本上；以及
(ii)电离所述样本材料的块，并通过质谱法检测所述块中的原子。
44.一种对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，所述方法包含：
(i)用一个或多个不同的标记原子来标记样本中的多个不同目标分子，以提供标记的样本；
(ii)用激光辐射解吸样本材料的块，其中使用激光扫描***将所述激光辐射引导到样本台上的所述样本上；以及
(iii)电离所述样本材料的块，并通过质谱法检测所述块中的原子。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中通过将所述激光辐射的一系列脉冲引导到待解吸的所述样本材料上来实现解吸，可选地，其中：
a.所述激光辐射的一系列脉冲以螺旋的形式到所述样本材料上，诸如，其中所述一系列脉冲作为猝发被传递，例如其中所述猝发中的脉冲的脉冲持续时间短于10-12s；和/或
b.所述一系列脉冲在所述样本上的已知位置内。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述激光辐射的所述猝发包括至少三个激光脉冲，其中，每个激光脉冲之间的持续时间短于1ms、诸如短于500μs、短于250μs、短于100μs、短于50μs、短于10μs、短于1μs、短于500ns、短于250ns、短于100ns、短于50ns或约10ns以下。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述激光辐射的所述猝发包含至少10个、至少20个、至少50个或至少100个激光脉冲。
48.根据权利要求43或47中任一项所述的方法，其中在将受关注特征处的所述样本材料从样本载体解吸作为材料块之前，使用激光消融来消融所述受关注特征周围的材料以清除周围区域。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的方法，其中，所述方法包含控制所述激光扫描***中的***，以赋予由所述激光器发射的激光束相对于所述样本台的第一相对移动。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述方法包含控制所述激光扫描***中的所述***，以赋予所述激光束相对于所述样本台的第二相对移动，其中所述第一相对移动和所述第二相对移动不平行，诸如其中相对移动是正交的。
51.根据权利要求49所述的方法，其中，所述方法包含控制所述激光扫描***中的第二***，以赋予所述激光束相对于所述样本台的第二相对移动，其中所述第一相对移动和所述第二相对移动不平行，诸如其中相对移动是正交的。
52.根据权利要求43至51中任一项所述的方法，其中，所述***和/或所述第二***是：(i)基于镜的***，诸如检流计镜、MEMS镜、多边形扫描仪、压电器件镜和/或(ii)固态***，诸如声光器件(AOD)或电光器件(EOD)，诸如其中所述激光扫描***包含：
(a)为所述检流计镜的所述***和为AOD的所述第二***；
(b)为所述检流计镜的所述***和为EOD的所述第二***；
(c)为检流计镜对形式的所述***和所述第二***，并且还包含AOD；或者
(d)为检流计镜对形式的所述***和所述第二***，并且还包含EOD。
53.根据权利要求43至51中任一项所述的方法，其中，所述方法包含以下步骤：识别所述样本上的一个或多个所述受关注特征，记录所述样本上的一个或多个所述受关注特征的位置信息，以及从所述样本解吸样本材料，其中使用所述激光扫描***将所述激光辐射引导到所述样本上，使用一个或多个所述受关注特征的位置信息，从一个或多个所述受关注特征解吸材料块。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，通过检查所述样本的光学图像来识别特征，可选地其中所述样本已经用荧光标记物标记，并且在所述荧光标记物发荧光的条件下照射所述样本。
55.根据权利要求43至54中任一项所述的方法，其中，所述样本在样本载体上，所述样本载体包含在所述样本和所述样本载体之间的解吸膜层，并且所述激光辐射被引导到解吸膜上以解吸样本材料。
56.根据权利要求43至55中任一项所述的方法，还包含根据权利要求22至42中任一项所述的方法。
57.根据权利要求22至55中任一项所述的方法，包含使用根据权利要求1至21中任一项所述的设备。
58.一种用于方法22至57中任一项的激光扫描***。
59.一种共配准图像的方法，所述方法包含：
a)通过除成像质量细胞计数之外的成像模式，从组织样本的第一组织切片获得第一图像；
b)通过成像质量细胞计数获得所述组织样本的第二组织切片的第二图像；
c)共配准所述第一图像和所述第二图像。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，除了成像质量细胞计数之外，所述成像模式是非线性显微术。
61.根据权利要求2所述的设备，其中，所述设备被配置为选择性地检测多个质量标签的存在，其中，所述质量标签包括镧系元素同位素。
62.一种成像质量细胞计数的方法，所述方法包含：
通过光学显微术识别样本中的特征；
扫描穿过所述特征的辐射以产生材料的羽状物；
将所述材料的羽状物输送到质量分析仪。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述特征是细胞。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述样本包含带质量标签的SBP。
65.根据权利要求63或64所述的方法，还包含每秒分析超过100个单细胞。
66.根据权利要求62至65中任一项所述的方法，其中，所述辐射是激光辐射。
67.根据权利要求66所述的方法，还包含通过ICP电离所述材料。
68.根据权利要求62至67中任一项所述的方法，其中，所述质量分析仪包含TOF检测器。
69.一种用于执行根据权利要求62至68中任一项所述的方法的设备。
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