CN112969500A - 纳秒脉冲突发的兆赫压缩 - Google Patents

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microsecond
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pulsed electric
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A·G·帕霍莫夫
肖舒
O·N·帕霍尔莫瓦
M·卡肖拉
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Old Dominion University Research Foundation
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Abstract

用于处理生物组织以使用在亚微秒范围内的在极低电场强度(例如，小于1kV/cm)但高(例如，兆赫)频率下的脉冲电场诱发一种或多种期望的生物和/或生理效应的方法和设备(***、装置等)。

Description

纳秒脉冲突发的兆赫压缩
相关申请的交叉引用
本专利要求于2018年11月8日提交的题为“纳秒脉冲突发的兆赫压缩(MEGAHERTZCOMPRESSION OF NANOSECOND PULSE BURSTS)”的美国临时专利申请第62/757,739号的优先权，所述美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
通过引用并入
本说明书中提到的所有出版物和专利申请都通过引用以其整体并入本文，其程度就如同明确且单独地指明了每个单独的出版物或专利申请通过引用并入。
关于联邦资助研究的声明
本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH/NIHLBI)授予的授权号R01HL128381和空军科学研究处(Air Force Office of ScientificResearch，AFOSR)的授权号FA9550-15-1-0517在政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本文描述的设备和方法涉及用于施加在低电压(例如，<20V)和高频率(例如，兆赫)在的纳秒电脉冲串的生物处理设备和方法。
背景技术
使用纳秒范围内的脉冲的电处理在医学、研究和生物技术中具有许多应用。所述应用包含例如，细胞和组织的电刺激和激活、细胞分化和死亡的诱导、肿瘤和组织消融、除颤等。通常，使用纳秒范围内的电脉冲的处理使用高压以超过期望生物效应的局部电场阈值。例如，根据期望的生物效应，单个纳秒脉冲的阈值对于单个脉冲可以近似若干kV/cm，对于较短的脉冲阈值可以更大。例如，2.5kV/cm是用于通过200纳秒脉冲激活心肌细胞的典型阈值；1.8kV/cm是用于以300纳秒脉冲诱导HEK293细胞中的钙瞬变的典型阈值；6kV/cm和1kV/cm是用于分别通过60纳秒脉冲和600纳秒脉冲使CHO细胞透化的典型阈值。此外，以1Hz-1kHz的重复率递送多个纳秒电脉冲通常通过以加法的方式增加效应，但不会减少阈值电场或者最多使阈值的适度降低(例如，2-3倍)。
期望提供电脉冲以使用在低电压下的纳秒脉冲来实现期望的生物效应，这可以允许更安全且成本更低的处理。
发明内容
传统上，亚微秒电疗法被认为需要通常为1到50kV/cm以上的高电场，以引发生物效应。如本文所述，发明人已经发现，当使用显著较低的电场将脉冲压缩到高速率突发(例如，高达若干MHz)中时，可以通过进行时间求和来克服此要求。使用强纳秒脉冲电场(nsPEF)的此技术可以用于细胞激活、纳米电穿孔和电激发细胞，所述细胞具体地包含神经，如心室心肌细胞和周围神经纤维，以用于膜电穿孔和/或用于杀死细胞。亚微秒电突发(100-1000个脉冲)的兆赫压缩使得能够以显著较低的能量密度(例如，介于约0.01-0.15kV/cm之间)激发，和/或可以允许以比先前的能量密度较低的能量密度(例如，介于约0.4-0.6kV/cm之间)进行的电穿孔。在一些变型中，由于激发阈值和电穿孔阈值的分离，可以执行多个激发循环而不会使膜破损。能量的这些亚微秒突发的效率可以例如通过增加脉冲持续时间或重复率而随着占空比的增加而增加，和/或可以通过增加“接通”总时间，例如通过增加脉冲持续时间或脉冲数而增加。在一些变型中，电能的亚微秒突发的效率可以与幅度和持续时间大约等于突发的时间-平均幅度和持续时间的单个“长”脉冲的效率匹配。高频率(例如，5kHz或更高、10kHz或更高、100kHz或更高、200kHz或更高、500kHz或更高、1MHz或更高等)和具有亚微秒电突发的低电场的使用因此可以提供用于降低激发阈值和/或促进电穿孔的有效方式。
因此，本文描述了可以使用亚微秒范围内的脉冲电场以极低的电场值(例如，靶组织处小于1kV/cm)但很高(例如，兆赫)的频率诱发一种或多种期望生物和/或生理效应的方法和设备(例如，***、装置等)。
例如，本文描述了用于处理生物组织的靶区域以诱发生物效应的方法，所述方法包括：使亚微秒脉冲电场穿过生物组织，其中生物组织的靶区域处的脉冲电场的幅度小于1kV/cm，并且脉冲电场以等于或大于0.1兆赫(例如，0.2MHz或更大、0.5MHz或更大、1MHz或更大等)进行脉冲。亚微秒脉冲电场可以包括纳秒范围内(例如，1000纳秒或更小)的脉冲。
生物效应可以是以下之一：电刺激(例如，诱发动作电位、激活电压敏感性离子通道、引起带电离子中的流入，使一个或多个细胞去极化等)、穿孔、诱发免疫应答、使材料传输通过细胞等。
任何适当的生物组织可以是靶向性的，包含以下中的任何一个或多个：皮肤、肝、肾、神经元、脑、脊柱、肺、肌肉、脂肪、呼吸道、胃肠道、膀胱和生殖***。具体地，组织可以是疾病组织，包含但不限于癌症。
本文还描述了用于处理生物组织的设备(例如，***)，所述设备被配置成执行本文所述方法中的任何方法。例如，***可以包含：控制器；施加器，所述施加器包括适于放置在生物组织附近的一组电极；以及一个或多个脉冲发生器，其中每个脉冲发生器被配置成产生亚微秒脉冲(例如，持续时间为1000纳秒或更小)；其中所述控制器被配置成施加频率大于0.1兆赫(例如，0.2MHz或更大、0.5MHz或更大、1MHz或更大等)的亚微秒脉冲串。***可以被配置成产生小于1kV/cm(例如，介于0.01与0.15kV/cm之间)或小于0.6kV/cm的电场强度。施加器施加的电压的幅度可以等于或小于20V。所述控制器被配置成协调所述多个脉冲发生器以将来自所述多个脉冲发生器中的每个脉冲发生器的纳秒脉冲组合。
例如，用于处理生物组织的***可以包含：多个脉冲发生器；以及控制器，所述控制器包括一个或多个处理器，所述控制器包含存储使所述一个或多个处理器执行用于以下的操作的指令的机器可读有形介质：使纳秒脉冲电场穿过生物组织，其中脉冲电场的幅度小于1kV/cm，其中脉冲电场以等于或大于0.1兆赫(例如，0.2MHz或更大、0.5MHz或更大、1MHz或更大等)进行脉冲。
本文还描述了在组织的靶区域中诱发生物效应的方法，其中同时驱动多个空间上分开的脉冲电能来源以将脉冲(例如，亚微秒脉冲)的电能施加到组织。例如，用于处理生物组织以诱发生物效应的方法可以包含：将第一纳秒脉冲电场递送到靶区域，其中所述第一纳秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间等于或小于1微秒；与所述第一纳秒脉冲电场同时，将第二纳秒脉冲电递送到靶区域，其中所述第二纳秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间等于或小于1微秒；以及在靶区域中形成经过求和的脉冲电场，经过求和的脉冲电场包括第一纳秒脉冲电场和第二纳秒脉冲电场的叠加，并且所述经过求和的脉冲电场的幅度小于1kV/cm，其中经过求和的脉冲电场包括脉冲频率等于或大于0.1兆赫(例如，0.2MHz或更大、0.5MHz或更大、1MHz或更大等)的脉冲。
本文还描述了脉冲发生器的操作方法。在一些实施例中，所述方法包括产生高频率亚微秒脉冲电场，其中所述高频率亚微秒脉冲电场的场强小于1kV/cm，频率为0.1兆赫或更大(例如，0.2MHz或更大、0.5MHz或更大、1MHz或更大等)，并且其中每个脉冲的持续时间小于1000纳秒。在一些实施例中，一个或多个脉冲发生器的操作方法包括：递送第一纳秒脉冲电场，其中每个脉冲的持续时间小于1微秒；与所述第一纳秒脉冲电场同时，递送第二纳秒脉冲电场，其中每个脉冲的持续时间小于1微秒；以及对所述第一脉冲电场和所述第二脉冲电场求和以递送包括所述第一亚微秒脉冲电场和所述第二亚微秒脉冲电场的叠加的高频率亚微秒脉冲电场，所述高频率亚微秒脉冲电场的场强小于1kV/cm并且频率为0.1MHz或更大(例如，0.5MHz或更大、1MHz或更大等)。
在这些方法中的任何方法中，所述第一纳秒脉冲电场和所述第二纳秒脉冲电场中的至少一个(并且优选地，两者均)包括双极性脉冲，所述双极性脉冲可以减小所发射电场的来源附近(例如，电极、天线等)的效应。
本文还描述了用于处理生物组织的可以包含以下的***：多个脉冲发生器；以及控制器，所述控制器包括一个或多个处理器，所述控制器包含存储使所述一个或多个处理器执行用于以下的操作的指令的机器可读有形介质：使第一纳秒脉冲电场穿过所述生物组织到达靶区域，其中所述第一纳秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间等于或小于1000纳秒；与所述第一纳秒脉冲电场同时，使第二纳秒脉冲电场穿过所述生物组织到达所述靶区域，其中所述第二纳秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间等于或小于1000纳秒；以及在靶区域中形成经过求和的脉冲电场，经过求和的脉冲电场包括第一纳秒脉冲电场和第二纳秒脉冲电场的叠加，并且所述经过求和的脉冲电场的幅度小于1kV/cm，其中经过求和的脉冲电场包括脉冲频率等于或大于0.1兆赫的单极脉冲，进一步地其中每个脉冲的持续时间等于或小于1000纳秒。
附图说明
本发明的新颖特征在以下权利要求具体地阐述。通过参考阐述了说明性实施例的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本发明的原理，并且在附图中：
图1是如本文所述的亚微秒(例如，纳秒)电脉冲串的实例，所述亚微秒电脉冲串在脉冲之间(例如，在连续的纳秒脉冲之间具有通常小于500纳秒的间隔)具有低峰值电压(例如，小于20V)和高频率(例如，兆赫)。本文所述的方法和设备是指亚微秒脉冲，所述亚微秒脉冲通常包含持续时间约等于或小于1微秒的脉冲，但是在一些变型中可以包含10微秒或更小(例如，10000纳秒或更小)的脉冲。例如，在一些应用中，亚微秒脉冲可以各自介于0.1纳秒与1000纳秒之间(例如，介于50-500纳秒之间、介于100-400纳秒之间等)。
图2A是示出了频率为10kHz的100纳秒脉冲串(底部)的实例，在脉冲之间具有100微秒的间隔。每个脉冲都诱发细胞中跨膜电位的增加(以任意单位在上部迹线中示出)，并诱发放电；在此实例中，细胞的放电时间为8微秒。阈值水平由顶部处的虚线示出。
图2B类似于图2A，但以200kHz的频率或每个脉冲之间的5微秒进行脉冲。
图2C类似于图2A和2B，但以1MHz的频率或每个脉冲之间的1微秒进行脉冲。如所示出的，在此频率下，在下一个纳秒脉冲之前，细胞膜未完全放电，从而导致膜电位在仅几个脉冲后超过阈值(阈值1)并且在另外的脉冲之后接近或超出第二阈值(阈值2)。
图3是用于施加在低能量(例如，低电场)和高频率(例如，兆赫范围内)下的在纳秒范围内的电脉冲的设备的一个实例的示意图。例如，设备可以被配置成包含控制器以及一个或多个纳秒脉冲发生器，所述控制器控制电源，所述一个或多个纳秒脉冲发生器被配置成施加脉冲宽度介于约0.1纳秒与1000纳秒之间、幅度介于0.1V与20V之间并且频率介于0.1MHz与30MHz之间的脉冲。
图4A展示了用于如图3中示出的一个装置等装置的脉冲发生器的电路示意图的一个实例。
图4B是用于施加在低电场和高(例如，兆赫)频率下的纳秒电脉冲的设备的示意图的实例，所述设备包含可以由控制器控制以递送间隔小于1000纳秒(例如，频率大于或等于0.1MHz)的纳秒脉冲串的多个脉冲发生器。
图4C是由如图4B所示的一个装置等装置形成的纳秒串的实例；在图4C中，指示了负责产生脉冲串中的每个脉冲的脉冲发生器(来自图4B)。
图5是被配置成产生在低电场和高(例如，兆赫)频率下的纳秒脉冲的脉冲发生器设备的另一个实例。在图5中，脉冲发生器可以用于产生双极性脉冲。
图6是被配置成控制和/或协调(例如，从不同的施加器和/或统一施加器的不同电极)施加在兆赫范围内的在低电压下的空间上分开的纳秒脉冲的脉冲发生器设备(例如，***)的另一个变型的示意性图示。此施加器可能对于如本文所述的双极性纳秒脉冲可能特别有用。
图7是用于将在低电场和兆赫频率下的纳秒脉冲施加到细胞的实验设置的实例。图7中的设置还允许细胞的成像。
图8A展示了通过在低电场(例如，85V/cm)和兆赫频率(例如，3.33MHz)下的纳秒脉冲来激发小鼠心室心肌细胞的实例。在图8A中，在10秒时施加在3.33MHz的200纳秒脉冲的脉冲串(脉冲之间间隔100纳秒)。图8A示出了钙激活(Fluo-4染料发射，左列)和所产生的细胞收缩(DIC，右列)的时间推移的记录。从上到下以0.24秒的间隔拍摄图像。在同一实验中拍摄的下一张图像(最长48秒，未显示)未揭示任何另外的变化。指示了突发参数和突发递送的开始(箭头)。
图8B展示了通过施加在低电场(例如，150V/cm)和兆赫频率(例如，3.33MHz)下的纳秒电脉冲的不可逆的细胞损伤(例如，细胞穿孔，从而导致细胞死亡)的实例。在图8B中，将纳秒电脉冲串施加到小鼠心室细胞上；在10秒的时间点时，以3.33MHz施加200纳秒脉冲的脉冲串(脉冲之间间隔100纳秒)。图8B示出了由较高幅度突发导致的不可逆的细胞膜损伤和细胞重塑的所选时间推移。在图的右侧指示拍摄每对图像的时间。
图9展示了通过在160-340V/cm之间的1000纳秒脉冲(例如，3.33MHz，200纳秒宽度)的突发来重复激发心室心肌细胞的效应。在由竖直线指示的时间处应用激发。激发导致胞质钙浓度中的尖峰，所述尖峰使用Fluo-4染料成像。在160V/cm下达到激发的第一阈值，从而导致钙的非破坏性流入。高于400V/cm，细胞破损发生。100V/cm下的相同突发没有产生影响，而在400V/cm下，激发之后Ca2+增加延长(电穿孔损坏细胞膜的迹象)。
图10是示出了类似于图9中所示的重复激发心室心肌细胞的另一个实例。尽管激发的阈值略有不同，但是看到了类似的效应。
图11A是示出了用于在暴露于1000纳秒脉冲串(3.33MHz，200纳秒宽度脉冲下)(例如，突发)的鼠心室心肌细胞中的激发、可能的电穿孔和明确的电穿孔的阈值的条形图。通过胞质Ca2+浓度中的如用Fluo-4染料成像的短暂尖峰来证明激发。刺激后出现低幅度的自发Ca2+波动被认为是电穿孔膜破损的可能迹象(“可能是电穿孔”)。钙2+的失控增加而在40秒的观察内没有回到静止水平(如在图9中的底部迹线中)被认为是电穿孔的证据。
图11B-11E展示了用FluoVolt染料测量的分离心室心肌细胞(VCM)的动作电位阈值。图11B是示出了用于100纳秒、200纳秒或400纳秒脉冲(所有脉冲的间隔都为100纳秒)的突发的脉冲数的效应的图，所述图示出了对于所有持续时间，增加脉冲数会类似地降低阈值。图11C是示出了相对于“接通”总时间绘制的阈值不取决于脉冲持续时间的图。图11D是示出了在较低的时间-平均电场下的高频率亚微秒低电场脉冲激发的VCM的突发的图。对于图11B-11D中的所有图，平均值±s.e.，n＝6-10。
图11E是示出了对于1000个脉冲的50纳秒到600纳秒持续时间的突发的与图11D中的结果相同的结果的图。脉冲间隔在0.09到4.8微秒间变化。平均值±s.e.，n＝25-30。
图12A是总结了将在2MHz下的纳秒脉冲串施加到CHO细胞的效应的图(在此实例中，纳秒脉冲在580V/cm下的持续时间为300纳秒)。包含了示出所检查的所有8个细胞的平均值的包含误差条的线。图12A示出了通过300纳秒脉冲的压缩串(例如，突发)进行的CHO细胞的电穿孔，并且具体地，在突发之后(箭头)在8个CHO细胞的代表性组中的胞质Ca2+应答的时间过程。黑色实线是来自单独细胞的数据，并且具有点的曲线是其平均值+/-s.e.。
图12B展示了在基于如图12A所示的相同数据来施加纳秒脉冲之后CHO细胞随时间推移的电穿孔(左侧为DIC图像，右侧为Fluo-4发射)。此图示出了在指示时间点处相同细胞的代表性DIC(左侧)图像和Fluo-4发射(右侧)图像。
图13展示了双极性抵消(bipolar cancellation)。图13(底部)示出了在CHO细胞中通过双极性和单极性纳秒脉冲进行的Ca2+激活(平均值+/-s.e.，n＝20-28)。图13的顶部示出了双极性和单相脉冲的形状和幅度。
图14A展示了偏移和重叠的双极性纳秒脉冲串(例如，突发)的兆赫压缩，所述兆赫压缩可以通过将两个在高(例如，兆赫)频率下的双极性纳秒脉冲串叠加成一个在高(例如，兆赫)频率下的单极性电纳秒脉冲串来提供远程刺激。针对矩形双极性脉冲串和刺激电极的线性阵列展示了所述方法。两对独立的接地绝缘电极(a-a'和b-b')递送两个同步的纳秒双极性电脉冲串，如右侧所示。由于至少部分的双极性抵消，纳秒双极性脉冲中的每个纳秒双极性脉冲对于电刺激是本质上效率低下，但是通过调节a-a'与b-b'之间的脉冲串的频率，所述纳秒双极性脉冲在重叠靶区域(c-c')中的重叠形成在高频率(例如，以兆赫率)在的局部生物学有效的纳秒单极性脉冲串。在c-c'区域中形成单极性纳秒脉冲串可以通过控制在电极a-a'与b-b'之间的时序和施加的能量幅度来完成。值得注意的是，双极性抵消在电极处或附近相关，因为其可以减小电极附近的脉冲电场的效应。在远程靶区域中，当在重叠的靶区域中使用非常快速(例如，兆赫)的脉冲时，单极场可能受益于因电荷积聚而导致的阈值降低。
图14B类似于图14A，但展示了在靶区域c-c'中组合的脉冲串(例如，亚微秒脉冲串)的使用。
图15A示出了示意图，所述示意图展示了根据一个实施例的CANCAN概念。顶部：A-A'和B-B'是两对独立的电极。A与B之间的线表示从每对电极递送电场的区域，所述每对电极在区域C-C'中重叠并彼此消除。底部：每对电极都会递送本身生物学上效率低下的阻尼正弦波(DSW)。当来自B-B'的DSW发生相移时，所述两个DSW在C-C'区域中叠加为生物学上有效的单极性脉冲。在此区域，存在“抵消的抵消(cancellation of cancellation)”或CANCAN。
图15B类似于图15A，但展示了在靶区域c-c'中组合的脉冲串(例如，亚微秒脉冲串)的使用。
图16A示出了在60％占空比下施加的脉冲电能的实例。
图16B是示出了脉冲重复率对340纳秒脉冲的突发(5或100个脉冲/突发)的激发阈值的效应的图。
图16C是展示了阈值时间-平均电场随突发持续时间而减小的图，所述阈值时间-平均电场与指示的亚微秒脉冲持续时间(在此实例中，11-18纳秒是最短设置的持续时间范围)无关。
图16D是示出了指示持续时间和高频率、亚微秒、低电场突发的单脉冲的激发阈值的比较的条形图。在图16B-16D中，平均值±s.e.，n＝5-9，以及使用分离的蛙坐骨神经收集的数据。
图17A-17F展示了通过由Ca2+摄取或YO-PRO-1染料摄取证明的高频率亚微秒低电场突发进行的CHO细胞和HEK细胞的电穿孔的一个实例。图17A是示出了(在CHO细胞中)100脉冲、400纳秒突发愈发变得更有效(在0.1-0.3MHz以上)的图。标签指示以kV/cm为单位的电场；每数据点20-30个细胞。图17B是示出了以指示的占空比通过500纳秒、0.64kV/cm脉冲(箭头)中的1000个脉冲诱发的YO-PRO-1摄取(HEK细胞中)的时间过程的图。图17C是示出了相对于重复率绘制的来自图17B的最后数据点的图，其示出了在1MHz以下没有效应。图17D是示出了在HEK细胞中通过相同的突发(箭头)诱发的Ca2+瞬变的图。图17E是示出了以指示的电场通过一个500微秒脉冲诱发的类似的Ca2+瞬变的图。图17F示出了来自图17D和17E的图的相对于单个500微秒脉冲的电场(并且相对于高频率亚微秒低电场突发的占空比)绘制的Ca2+瞬变的最大幅度。对于所有组，平均值±s.e.，n＝11-27。在低电导率溶液中刺激HEK细胞。
图18A-18D是展示了在暴露于高频率亚微秒低电场突发之后24小时的EL-4细胞的活力的图。图18A展示了递送到电穿孔比色皿的高频率亚微秒低电场脉冲的形状。虚线表示时间-平均幅度。图18B展示了对于约1.9kV/cm的低电场的100-Hz突发和3-MHz突发的脉冲数的效应。图18C是示出了对5kV/cm的高电场的相同依赖性的图。图18D是展示了在指示参数下的高频率亚微秒低电场突发杀死约50％的细胞的条形图，而单个脉冲(其持续时间等于突发持续时间并且幅度等于突发的平均值)具有较小的效应。平均值±s.e.，n＝5-6。*p<0.0001，t测试。
具体实施方式
本文描述了可以使用在0.1兆赫及以上(MHz)的频率下的在亚微秒(例如，纳秒)范围内的电脉冲来诱发一种或多种期望生物效应和/或生理效应的方法和设备(***、装置等)，与其它技术相比，所述方法和设备可以允许使用基本上较低的电场。为方便起见，根据本公开的此电脉冲可以被称为兆赫压缩，纳秒脉冲的兆赫压缩或纳秒脉冲串的兆赫压缩(例如，突发)。与通常是指非常短的高强度脉冲(例如，高电场，通常远大于1kV/cm)的传统的纳秒脉冲电场处理不同，纳秒脉冲的兆赫压缩可以使用远远更低的强度，例如减小5到10倍或更多。例如，纳秒脉冲的兆赫压缩可以使用小于1kV/cm(例如，小于900V/cm、小于800V/cm、小于750V/cm、小于700V/cm、小于600V/cm、小于500V/cm等)的极低的电场值(例如，在靶部位处)，这可以通过施加在非常快的速率(例如，在兆赫(MHz)范围内)下的纳秒电脉冲来实现。兆赫范围可以包含0.1MHz或更大(例如，0.2MHz或更大、0.4MHz或更大、0.5MHz或更大、0.7MHz或更大、1MHz或更大等)。令人惊讶的是，本文描述的设备和方法已经示出了产生纳秒电脉冲以极低的电场值诱导生物效应的生物效率；具体地，以先前据信没有效应的场值诱导生物效应的生物效率。本文描述的设备具体地被配置成递送兆赫范围内的低幅度纳秒电脉冲的脉冲串(例如，突发)，例如，所述低幅度纳秒电脉冲的脉冲串在连续的纳秒电脉冲之间具有通常等于或小于1微秒(例如，小于约900纳秒、小于约800纳秒、小于约700纳秒、小于约600纳秒、小于约500纳秒、小于约450纳秒、小于约400纳秒、小于约350纳秒、小于约300纳秒等)的间隔。
如上所述，传统的高强度亚微秒脉冲已经被限制为高脉冲电压，以便在短脉冲持续时间内(例如，在施加亚微秒脉冲时)超过电场(EF)阈值。此阈值随着脉冲缩短而增加，高达数十kV/cm。用于在纳秒范围内进行神经刺激的强度-持续时间曲线对于100纳秒和1纳秒脉冲分别通常需要介于约1与240kV/cm之间的阈值。例如，单个高强度亚微秒脉冲电场刺激的报告的阈值包含介于1.4-2.4kV/cm之间(例如，用于通过200纳秒脉冲激活心肌细胞)，大于1.8kV/cm(例如，用于在具有300纳秒脉冲的HEK293细胞中诱导钙瞬变)，介于6kV/cm与1kV/cm之间(例如，用于通过60纳秒和600纳秒脉冲使CHO细胞透化)。因此，长期以来认为，达到这些阈值所需的脉冲电压过高。例如，达到要消融间隙为2cm的两个平行板电极之间的肿瘤的10kV/cm通常需要施加到电极的20kV。此类电压超出了大多数脉冲发生器的能力，并可能带来高压危害。本文描述的方法和设备可以避免这些问题。
例如，本文描述的方法设备可以使用较低的电场强度，同时提供可比较的或优越的效应。例如，本文所述的方法和设备可以在先前已经示出，高强度亚微秒脉冲电场有效地用于例如神经肌肉刺激的情况下使用，所述神经肌肉刺激包含激活离子选择性纳米孔(例如，在可激发细胞和不可激发细胞两者中动员胞质Ca2+，并且在细胞膜中向内打开整流和离子选择性稳定的纳米孔)，以非化学激活各种细胞和组织类型，并且通过坏死和/或凋亡途径以较高的剂量杀死高度选择性的细胞。因此，本文描述的方法和设备还可以用于除颤、周围神经和脑深部刺激以及组织或细胞消融(例如，癌症消融)。
递送多种刺激可以导致电压在靶细胞的膜上的逐步积聚，从而当脉冲间隔短于感应跨膜电位的释放时，最终达到激发或电穿孔阈值。哺乳动物细胞中的充电时间常数通常为0.1-1微秒。可以仅以小于3-5个时间常数的脉冲间隔(其对应于连续脉冲之间的95％和99％放电)期望时间求和，这意味着数十kHz到大于1MHz的重复率。如本文所述，以1Hz-5kHz的重复速率递送多个亚微秒脉冲电能可以在不降低阈值或适度降低阈值的情况下比单个脉冲产生更强的效应。
例如，本文描述了亚微秒电脉冲突发的MHz压缩，其促进在例如介于10-150V/cm之间的电场水平下的激发和电穿孔。如所描述的，所述效率可能取决于脉冲和突发参数，所述脉冲和突发参数还与常规(“长”)亚微秒电刺激不同。
图1展示了施加的在低电压(或以V/cm为单位的低电密度)和高频率(例如，兆赫)下的纳秒脉冲串(例如，纳秒电脉冲串)的一个实例。在图1中，脉冲串可以包含多个纳秒脉冲101，每个纳秒脉冲的持续时间在纳秒范围108内(例如，介于约0.1纳秒持续时间与1000纳秒之间、例如，介于约0.1纳秒与约950纳秒之间、介于约1纳秒与约900纳秒之间、介于约1纳秒与约800纳秒之间、介于约1纳秒与约750纳秒之间、介于约1纳秒与约700纳秒之间、介于约1纳秒与约600纳秒之间、小于约1000纳秒、小于约900纳秒、小于约800纳秒、小于约750纳秒、小于约600纳秒、小于约500纳秒等)。纳秒脉冲可以间隔小于约1000纳秒、小于约900纳秒、小于约800纳秒、小于约750纳秒、小于约700纳秒、小于约600纳秒、小于约500纳秒等的脉冲间隔106。因此，纳秒电脉冲的频率可以在兆赫范围内，如介于约0.1MHz与约50MHz之间、介于约0.1MHz与约40MHz之间、介于约0.1MHz与约30MHz之间、介于约0.1MHz与约25MHz之间、介于约0.1MHz与约20MHz之间、介于约1MHz与约50MHz之间、介于约1MHz与约40MHz之间、介于约1MHz与约30MHz之间、介于约1MHz与约25MHz之间、介于约1MHz与约20MHz之间、大于0.1MHz、大于0.2MHz、大于0.5MHz、大于0.1MHz、大于1.5MHz、大于2MHz、大于2.5MHz等。
通过脉冲串中的纳秒脉冲(如图1中所示的纳秒脉冲)施加的能量可能相对低。例如，通过每个纳秒脉冲施加的峰值电压可以小于约500V、小于约100V、小于约50V、小于约40V、小于约30V、小于约25V、小于约20V、介于约0.5V与50V之间、介于约1V与25V之间等。类似地，所施加的纳秒脉冲(例如，组织处)的所产生的电场可以例如小于约1000V/cm、小于约900V/cm、小于约800V/cm、小于约700V/cm、小于约600V/cm、小于约550V/cm、介于约1V/cm与约1000V/cm之间、介于约10V/cm与900V/cm之间等。
通常，可以将纳秒脉冲的兆赫压缩直接或间接地施加到生物细胞和/或组织。例如，可以通过一个或多个组织穿透电极和/或通过表面电极施加到患者的身体中。在一些变型中，可以将使用纳秒脉冲的兆赫压缩的电刺激施加到分离的细胞和/或分离的组织。
在不受任何特定行为理论的束缚下，使用纳秒脉冲的兆赫压缩来施加纳秒脉冲可以使施加的电能在靶细胞或细胞区中积累，从而使多个小幅度(例如，小于约500V、小于约100V、小于约50V、小于约40V、小于约30V、小于约20V、介于约0.1V与50V之间、介于约1V与30V之间、介于约1V与20V之间等)脉冲共计超过生物效应的阈值的水平。例如，施加的频率比活细胞的有效放电时间短的在兆赫范围内的纳秒电脉冲可能会导致电荷共计达到期望效应的阈值以上。对于不同的哺乳动物细胞，细胞(例如，细胞膜)的放电时间常数(τ)通常从小细胞的约100纳秒变化到较大细胞的约1微秒(并且对于紧密包装在组织中的细胞可能甚至更长)，由此当放电持续时间等于1τ、2τ、3τ和4τ时，感应膜电位分别降低到大约37％、15％和5％、2％。当在脉冲串中施加速率大于放电速率的纳秒电脉冲时(例如，当膜未完全放电时)，感应电位可能会加在剩余电位上。通过全部施加具有足够短的脉冲间隔的多个脉冲，感应膜电位可以逐渐上升并超过阈值电位以诱导生物效应。参见，例如，图2A-2C。例如，如果假设4τ是脉冲之间实现感应电位的时间求和的最长时间间隔，则对于较小的细胞，脉冲间隔可能不会超过400纳秒，并且对于大细胞，脉冲间隔可能不会超过2,500纳秒(对于形状不规则的仍较大的细胞，也许高达10,000)。较短的脉冲间隔可以允许阈值跨膜电位的较快积累。实际上，这意味着可以压缩纳秒电脉冲串，从而以高达0.1-2MHz的重复率递送刺激，其中仍较高的速率(高达1,000MHz)可用于进一步降低较短的纳秒电脉冲和较小细胞的幅度阈值。
在图2A的实例中，在频率为10kHz的脉冲串(例如，每个脉冲件间隔约100微秒)中，将纳秒脉冲施加到细胞或组织。单独的脉冲的持续时间为10纳秒，如底部迹线所示。上部迹线示出了由每个脉冲产生的施加的膜电位(以任意单位计)。对于此示例组织或细胞，放电时间为大约8微秒。水平虚线203表示当膜的电位(其可以包含外细胞膜和/或一个或多个内部细胞膜)达到阈值时可以触发的生物效应(例如，刺激、穿孔等)的最小阈值。组织或细胞可以具有多个阈值，其对应于不同或增加的效应。
图2B和2C展示了纳秒脉冲突发的兆赫压缩，这表明兆赫压缩允许细胞或组织达到并超过生物效应的一个或多个阈值而不增加脉冲幅度。例如，在图2B中，每个100纳秒脉冲(底部迹线)感应出跨膜电位(上部迹线，以任意单位计)。因为能量不如脉冲间隔那样快地释放，所以能量会积累，直到持续施加纳秒脉冲导致施加的膜电位超过阈值203(如所示出的)，这可能会产生对应的生物效应。在图2B中，边际高速率(例如，每个脉冲之间大约5微秒的100纳秒脉冲)导致较小的时间求和，所述时间求和有助于达到可能诱导某种生物效应的低阈值203。在图2C中，当施加高重复率(例如，1MHz，在脉冲之间具有1微秒)时，施加的膜电位可以更快地积累并达到远远更高的阈值205。
用于施加纳秒脉冲的兆赫压缩的***
图3-5展示了可以用于提供纳秒脉冲的兆赫压缩的***的实例。例如，图3是用于使用纳秒脉冲的兆赫压缩来施加纳秒脉冲的***301的一个实例的示意图。在图3中，所述***可以至少包含控制器303、一个或多个脉冲发生器305、电源以及一个或多个施加器309。所述***可以是便携式的，并且电源可以包含从电池和/或壁式来源(例如，插座)接收电力的功率调节电路***。电池可以是可再充电的。所述***可以至少部分地包封。在一些变型中，可以通过一条或多条电缆连接施加器。可替代地，施加器可以以紧凑、手持的配置与***的剩余部分集成在一起。
控制器可以被配置成施加固定的或可调节的纳秒脉冲串，其中单独的脉冲间隔固定或可调节的脉冲间隔，使得所述频率在兆赫范围(例如，介于约0.9MHz与100MHz之间)内。脉冲间间隔可以例如介于1200纳秒与50纳秒之间(例如，在兆赫频率范围内)，如介于约1000纳秒与50纳秒之间、介于约1000纳秒与75纳秒之间、介于约1000纳秒与80纳秒之间、介于约1000纳秒与90纳秒之间、介于约1000纳秒与100纳秒之间等。在一些变型中，控制器被配置用于或适于将所施加的刺激限制在此频率范围内；在一些变型中，所述设备可以包含与控制器连通以使用户在此兆赫范围内调节施加的频率/脉冲间隔的一个或多个用户输入(旋钮、拨盘、触摸屏等)。可替代地或另外，控制器可以被配置成允许用户调节脉冲数、施加脉冲的持续时间和/或施加的电压。施加的电压通常可以在预定范围内(例如，电压幅度介于约0.1V与约50V之间、介于约0.1V与40V之间、介于约0.5V与30V之间、介于约1V与约20V之间、小于约50、小于约40V、小于约30V、小于约25V、小于约20V等)。在一些变型中，可以选择电场的强度(例如，介于约1V/cm与约900V/cm之间、介于约1V/cm与约800V/cm之间、介于约10V/cm与约750V/cm之间、介于约10V/cm与约700V/cm之间、介于约50V/cm与约650V/cm之间、小于1000V/cm、小于900V/cm、小于800V/cm、小于750V/cm、小于700V/cm、小于600V/cm、小于500V/cm)。这些范围中的任何范围都可以被视为在低电压范围内。如所提及的，在一些变型中，控制器可以使用户(例如，医生、外科医生、技术人员等)从预定的一组值或范围中进行选择，所述预定的一组值或范围包含本文所述的范围中的任何范围。在一些变型中，可以为用户提供以下中的一个或多个的预设值：脉冲数、脉冲持续时间(在纳秒范围内)、脉冲幅度(例如，预定低电压范围内的峰值电压)、脉冲间隔和/或频率(例如，在兆赫范围内)等。在一些变型中，所述设备可以预设或可以自动选择适当的参数，并且用户可以仅选择开始或结束，或者可以在有限的参数状态数量之间进行选择。
控制器可以包含硬件、软件和/或固件，以允许其控制***的操作和/或从用户接收控制输入。例如，控制器可以包含电路***，其包含一个或多个处理器、一个或多个定时电路、一个或多个存储器等。如所提及的，所述***可以包含一个或多个输入(例如，控制件)和/或可以(例如，通过有线或无线连接)从另一个装置接收输入。所述***可以包含一个或多个输出(例如，监测器、显示器，LED等)，包含装置操作(例如，准备就绪、待机等)的指示器和/或设置(脉冲数、频率、电压幅度等)。
如所提及的，本文描述的***中的任何***可以包含一个或多个施加器。施加器可以包含两个或更多个电极，包含电极阵列。电极可以是组织穿透的或非组织穿透的。例如，组织穿透电极可以是针电极；非组织穿透物可以是一个或多个表面电极。
在本文描述的设备中的任何设备中，控制器可以协调脉冲发生器中的一个或多个(例如，多个)脉冲发生器的激活，如图3所示。n个脉冲发生器中的每个脉冲发生器可以被配置成以协调的时间施加纳秒脉冲，并且这些脉冲可以组合成单个刺激。如上所述，单独的脉冲发生器可以被配置成以在低电压范围内的峰值电压递送具有在纳秒范围内(例如，介于约0.1纳秒与约1000纳秒之间)的脉冲持续时间的脉冲。虽然图3展示了多个脉冲发生器，但是应当理解，在各种应用中，仅可以使用一个脉冲发生器。
例如，图4A示意性地展示了可以使用的脉冲发生器电路的实例。在图4A中，电路400包含由N型(n沟道)MOSFET开关(M1)切换的预充电电容器(C1)。所述开关可以由一个或多个低电压MOSFET驱动器触发。在此实例中，可以将齐纳二极管(Zener diode)403放置在变压器输出处以夹持电压。可以设定输出电压(例如，在上述低电压范围内)。可以通过选择R、L和C以及值来修改设置，从而产生有利于超快脉冲的临界阻尼模式。
如图4B所展示，在一些实施例中，多个脉冲发生器电路，如图4A中示意性地示出的脉冲发生器电路可以耦接在一起并且由控制器控制，如上所提及。在图4B中，每个块(1、2、3和4)表示脉冲发生器，所述脉冲发生器可以由控制器控制，并且用于形成具有低电场(例如，低电压范围)在兆赫脉冲频率内的脉冲的复合/组合纳秒脉冲串。在图4B中，单个脉冲发生器不需要产生高频率(例如，在多MHz范围内)的纳秒持续时间脉冲；反而，将脉冲发生器中的若干脉冲发生器分组以产生脉冲。当在脉冲状态下使用相对低的电压(例如，<1kV，包含上述低电压范围)时，可以侧向组合RC开关模块以产生任意幅度、宽度和间隔的多相脉冲。每个模块可以用不同的DC源充电，因此提供不同的输出电压。每个模块可以单独地触发，从而允许各种脉冲宽度(PW)和延迟。可替代地，模块中的所有或一些模块可以产生相同的脉冲，所述脉冲可以如上所述地进行组合。图4C展示了源自四个单独但如图4B所示的连接的脉冲发生器的组合的纳秒持续时间脉冲串的一个实例。在此实例中，脉冲是非极性的(例如，全部为正向或全部为负向)，并且示出为等效脉冲；如所提及的，在一些变型中，可以在同一脉冲串内施加具有不同持续时间和/或不同电压的脉冲。在一些变型中，如将在下文更详细地描述的，纳秒持续时间的双极性脉冲可以在兆赫频率范围内递送。
例如，图5展示了被配置成提供双极性刺激的脉冲发生器的示意图的另一个实例。在图5中，脉冲发生器500组合正脉冲电路***和负脉冲电路***以产生双极性脉冲发生器。在图5中，负脉冲电路***中的开关连接是漏极接地(和源极到负)充电，这与正脉冲电路***中所示的相反。相同的负载电阻器可以用于正脉冲电路***和负脉冲电路***两者。电压和脉冲持续时间可以进行差分调节。还可以仅触发正脉冲电路***或负脉冲电路***之一，使得递送正脉冲或负脉冲。可以在任何间隔中***任何长度的延迟。多个双极性刺激器(如图5中所示的双极性刺激器)可以如图4B所示进行组合，从而允许兆赫频率刺激。图4A-5B所示的脉冲发生器仅表示可以用于执行本文描述的方法的脉冲发生器的非限制性实例。其它脉冲发生器可以用于或被配置成产生在所述频率下的纳秒脉冲串。
本文描述的***中的任何***还可以如图6所示进行配置，其中单个控制器控制可以用于从不同的位置(例如，在身体上或中)施加纳秒电脉冲的两组或更多组脉冲发生器。在图6中，***601包含单个控制器603(在一些变型中，其可以是两个或更多个连接的控制器)通过从脉冲发生器605、605'和615、615'中的两个(或两组)脉冲发生器中的每一个施加在低电压下的在兆赫频率范围内的纳秒脉冲来控制并协调电刺激。如将在下文在双极性脉冲的上下文中更详细描述的，这可以允许具有最小的近电极效应的非侵入性电刺激。可以使用相同的电源607或不同的电源来(例如，向脉冲发生器)提供电力。可以使用一个或多个施加器609、609'，每个施加器包含用于施加纳秒脉冲的电极。在一些变型中，可以使用具有不同电极组的单个施加器，所述电极组可以以已知的或预定的距离和/或几何形状分开。在图7所示的实例的一个变型中，在电极的尖端之间的约140um处，施加约16V的脉冲相当于约570V/cm。
使用体外模型验证所述效应来检查纳秒脉冲突发的兆赫压缩的施加，其中以高(例如，兆赫)频率施加低电压纳秒脉冲。例如，图7展示了测试设置700的一种布置，其中光学(例如，使用耦接到显微镜成像***705的激光器703)来检查一个或多个培养或外植的细胞，同时通过耦接到如图5所示的***等***的一对电极707、707'来施加在高频率下的低电压纳秒脉冲。使用类似于图7所示的***的***，在若干种类型的哺乳动物细胞(例如，CHO、HEK 293和酶分离的鼠原发性心室心肌细胞，VCM)中体外验证了兆赫突发压缩的使用。纳秒范围内的电脉冲的效应通过随时间记录用Fluo-4荧光指示剂进行的胞质Ca2+激活并且透照记录细胞形状变化进行记录。根据细胞类型和其它条件以及纳秒范围内的电脉冲的强度，这些观察结果反映了细胞膜透化、电压门控钙通道的开放、收缩活性和/或细胞重塑或由于膜破损导致的其它类型的生物效应。
图8A-8B、9、10、11A和12A-12B展示了测试亚微秒(例如，纳秒)脉冲的实例，所述亚微秒脉冲例如具有50纳秒到300纳秒的脉冲持续时间，主要集中于200纳秒和300纳秒的刺激。以介于约1.6与3.33MHz之间的重复率在100到5,900个脉冲的突发时递送脉冲，所述重复率对应于约150到450纳秒的脉冲间隔。脉冲幅度在约2到17V之间变化，在细胞位置处的所产生的电场分别为约70到570V/cm。在26个单独的VCM中的纳秒范围处理中，总共检查了约200个电刺激脉冲，并且在其它类型的细胞(>120个单独的细胞)中的处理中，检查了大于80纳秒脉冲。尽管脉冲幅度极低(与使用纳秒范围内的脉冲电场的标准处理相比)，仍一致地记录了细胞应答(如图8A-12B所示)。引起VCM激活和收缩的最低电场仅为85V/cm(例如，图8A示出了1,000个脉冲，200纳秒脉冲持续时间，3.33MHz的突发)。与200纳秒脉冲(包含单个200纳秒脉冲)的公开阈值(约2.5kV/cm)相比，电场降低>30倍。稍微较高的电场(约160V/cm)在18个VCM中的17个中引起钙激活(激发)和细胞收缩，这已经过测试并证明有功能的并且能够产生这种类型的反应。所述阈值并未示出对细胞是否平行于电场、垂直于电场或与电场成任何其它角度定向的显著依赖性。在使用在兆赫频率范围内的纳秒脉冲的此低电场下，单独VCM中的激发可以重复多次(参见例如图8B)，而没有电穿孔或损坏的迹象。将电场增加到高于激发阈值约2倍会导致观察到适度的膜破损，如自发的小火花和胞质Ca2+的静息水平升高。电场进一步增加到仅约400+/-18V/cm导致不可逆的VCM电穿孔，其中胞质Ca2+没有恢复，并且VCM从健康的“砖形”转变为“肉丸形”，这是公认的永久性VCM损坏的表现。参见，例如，图8B和11A以及图9中的最后一条迹线。通常，在较短的脉冲串(如0.16kV/cm下的400或500个脉冲，3.33MHz)以及较短的100纳秒脉冲(570V/cm下的3900个脉冲，2MHz)下还观察了激发反应。通过每2秒施加数十个压缩的纳秒电脉冲串突发来重复激发VCM(数据未示出)。
如图8A-8B所示，高频率亚微秒低电场电能的突发可以用于鼠心室心肌细胞(VCM)的刺激和/或电穿孔。在一些变型中，可以使用高频率亚微秒低电场刺激以用于除颤。如本文所述，可以通过施加高速率突发来抵消对高电压的先前限制的需求。例如，将1000个200纳秒的脉冲压缩成3.33MHz突发能够仅以80-200V/cm(其比单个200纳秒冲击低10-20倍)进行激发，如图8A、9和11A所示。通过此类高频率亚微秒低电场刺激突发进行的激发(如图8A和9所示)与由于较强电场诱发的膜损坏(如图8B所述)后持续的Ca2+升高和细胞缩小明显不同。通过单个低频率(例如，<1MHz)亚微秒高电场(例如，大于1kV/cm)刺激脉冲进行的VCM激发在激发阈值处受损，从而产生异常的动作电位和持久的Ca2+升高。这种现象通常是正确的；与低频率亚微秒高电场刺激相比，本文所述的高频率亚微秒低电场刺激基本上损坏性较小，同时非常有效。
例如，如图9所示，通过MHz突发进行的重复刺激不会造成损坏。在350-400V/cm下观察到电穿孔的初始迹象(参见例如图8B和11A)，也就是说，高于激发阈值2-3倍(p<0.001)，从而允许大的安全窗口。在亚微秒脉冲刺激之间存在固定的100纳秒间隔的情况下，作为脉冲宽度的幂函数，阈值从100纳秒降低到400纳秒(参见例如图11B)。所述阈值由突发内的“接通”总时间决定，而单独的高频率亚微秒低电场脉冲持续时间无关紧要(例如，参见图11C)。对于较短的脉冲，相对于突发持续时间绘制的阈值时间-平均电场较小(图11D)。
此非预期结果在单独的一组实验中得到了验证，其中VCM通过1000个脉冲的突发而激发；脉冲持续时间从50纳秒变为600纳秒，并且脉冲间隔从90纳秒变为4.8微秒。对于较短的脉冲，相对于突发持续时间绘制时间-平均阈值电场值产生显著较小的值(图11E)，这与先前在VCM中的实验一致，但是与神经激发相反(参见例如下面的图16A-16D)。这可能指示亚微秒脉冲的与常规脉冲明显不同的具体效应。
在HEK293细胞和CHO细胞中，纳秒范围内的脉冲突发的兆赫压缩引发Ca2+瞬变，在刺激后40秒内观察到完全或部分恢复，如图12A-12B所示。与一次作为一个细胞经受在纳秒范围的脉冲的VCM相比，这些培养的细胞以小组的形式暴露。对于更高的电场(测试范围：130-570V/cm)、更高的脉冲数(测试范围：100-1,000)和更短的脉冲间隔(测试范围：150-300纳秒)，反应的可能性和幅度会增加。脉冲持续时间保持恒定在300纳秒，以促进与出版工作进行比较。较低频率下的典型纳秒脉冲(包含单个脉冲)响应于一个或多个300纳秒脉冲的阈值为约1.8kV/cm。CHO细胞不表达任何电压门控的Ca2+通道，并且因此可以认为Ca2+瞬变是电穿孔的结果。
基于这项实验工作，纳秒突发的兆赫压缩(例如，施加兆赫频率范围内的低电压纳秒脉冲)能够大幅降低激发和电穿孔两者的电能阈值。令人惊讶的是，还存在激发阈值和电穿孔阈值的清晰分离(参见例如图11A)和无损坏的重复激发，当使用纳秒范围内的传统电脉冲场时，这是有问题的。
纳秒突发的兆赫压缩的施加
如上文简要讨论的，本文描述的方法和设备中的任何方法和设备(例如，装置、***、施加器等)可以用于处理组织。可以处理任何适当的组织，包含但不限于：皮肤、肝、肾、神经元(脑、脊柱、外周)、肺、肌肉、脂肪、呼吸道、胃肠道、膀胱、生殖***等组织，包含肿瘤组织。本文所述的在低电场(例如，低电压)和高(例如，兆赫)频率下的纳秒脉冲可以用于操纵生物功能和治疗疾病。对此类电刺激的反应可以包含多种生物效应，包含但不限于：神经和肌肉激发、免疫激活(或以其它方式刺激免疫应答)和内分泌细胞、细胞分化、电穿孔、坏死细胞和凋亡细胞死亡。因此，实际上，在低电场和兆赫频率下的纳秒脉冲的用途可以在可以施加电刺激的任何适应症中使用。通常，本文描述的高频率纳秒脉冲发生器和其使用方法中的任何高频率纳秒脉冲发生器和其使用方法都可以用于医学疗法。
例如，本公开的方法和设备可以用于心脏起搏、除颤、肌肉训练和康复、疼痛控制、减轻帕金森病症状、精神病状和癌症消融。所述方法和设备还可以用于神经肌肉和精神疾病的诊断和研究。
例如，本文描述的装置、***和方法可以用于各种消融程序(例如，基于辐射的)、皮肤病学程序(例如，治疗各种皮肤病学的病况，如皮肤癌)、普通外科手术程序(例如，胰切除术)、心脏病学(例如，瓣膜修复)、妇科(例如，子宫切除术)、神经外科(例如，肿瘤切除术)等。
本文所述的方法中的任何方法都可以应用于可激发组织(包含但不限于神经元组织)以进行激发和/或消融或其它组织处理。例如，本文描述了用于刺激诸如神经和心肌等可激发组织，治疗如癫痫、帕金森氏病(Parkinson's disease)和中风等的神经病症的方法和设备。心脏病症可能包含心房颤动和心室纤颤。如上文所证明的，可以使用本文所述的方法直接激发一个或一组细胞的膜电位。本文所述的方法和设备可以用于刺激如血小板等细胞中的分泌。
本文描述的方法和设备可以发现具体用于治疗脑、外周神经、肌肉和心脏。如上所提及，这些方法可以用于帕金森氏病中的心脏起搏、除颤、脑深部刺激、用于恢复骨骼肌的功能的功能纳秒电脉冲以及对在纤维肌痛、抑郁症、痴呆、癫痫、糖尿病性神经病和许多其它疾病中的新出现的应用的疼痛控制。具体地，本文描述的在低电场(例如，低电压)和高(例如，兆赫)频率下的纳秒脉冲可以用于治疗任何可能有益于在神经和肌肉靶标中调制或引入动作电位(AP)的适应症。例如，本文描述的方法和设备可以用于调制(例如，转移)静息电位，从而改变突触效率。通过在靶标处通过***或植入的电极或从表面非侵入性地产生瞬变电压梯度来实现AP感应。可替代地或另外，本文描述的方法和设备中的任何方法和设备可以用于电穿孔。
可以使用通过施加在兆赫频率范围内的低电压纳秒脉冲串来施加纳秒脉冲的兆赫压缩来选择性地调制本文所述的组织中的任何组织。在一些变型中，本文描述的方法可以至少部分地基于细胞的大小和/或细胞的膜含量来调制细胞。例如，这些方法可能会影响与其它细胞相比具有较高放电时间常数(例如，较高电容)的细胞，这可能是细胞组成和/或大小的函数。
例如，在低电场和兆赫频率下的纳秒电脉冲可以用于治疗患者的皮肤，包含治疗以下中的一种或多种：痤疮、脂溢性角化病、瘢痕疙瘩、接触***、软垂疣、银屑病、***状瘤、人***瘤病毒(HPV)、黑素瘤、肝斑、皮脂腺增生、汗管瘤、先天性毛细血管畸形(葡萄酒色斑)、肝斑、光化性角化病、黑色丘疹性皮肤病、血管纤维瘤、皮肤肿瘤、皮肤老化、皮肤褶皱、樱桃状血管瘤、表皮/皮脂腺囊肿、基底细胞癌、皮肤老化、良性肿瘤、癌前肿瘤、癌症和疣。这些方法和设备还可以用于美容皮肤治疗，包含去除纹身、毛囊破坏、疤痕/瘢痕疙瘩减少、脂肪减少和皱纹减少。例如，本文所述的方法和设备可用于通过使黑素瘤自毁而用于治疗黑素瘤。通常，这些方法可以用于皮肤病变的体外治疗。
本文所述的用于施加在低电场(例如，低电压)和高(例如，兆赫)频率下的纳秒电脉冲的方法和设备可以用于纳米电消融和疫苗接种。
因此，本文描述的方法和装置可以用于治疗各种疾病。“疾病”包含受试者的或受试者上的与组织异常、不受控制的生长有关的任何异常病况，包含癌性、癌前和良性的组织生长或本领域已知的其它疾病。本发明的方法和装置可以用于治疗任何类型的癌症，无论其特征是恶性、良性、软组织还是实体，以及所有阶段和等级的癌症，包含转移前和转移后的癌症。不同类型的癌症的实例包含但不限于消化道癌和胃肠道癌，如胃癌(gastriccancer)(例如，胃癌(stomach cancer))、结肠直肠癌、胃肠道间质瘤、胃肠道类癌瘤、结肠癌、直肠癌、***癌、胆管癌、小肠癌和食管癌；乳腺癌；肺癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；***癌、卵巢癌；肾癌(例如，肾细胞癌)；中枢神经***癌症；皮肤癌(例如，黑素瘤)；淋巴瘤；胶质瘤；绒毛膜癌；头颈癌；骨原性肉瘤；和血癌。
这些方法和设备还可以用于或可替代地可用于消融癌症并产生对新的癌症生长的抵抗力，包含***。肿瘤的实例包含良性***增生(BPH)、子宫肌瘤、胰腺癌、肝癌、肾癌、结肠癌、前基底细胞癌以及与巴雷特氏食管(Barrett's esophagus)相关的组织。
本文所述的方法和设备可以用于基因电转移或“GET”。在一些变型中，可以通过(例如，在一种或多种对可以刺激免疫应答的基因进行编码的质粒中)将基因转移引入到肿瘤中来治疗疾病，包含癌症。例如，可以使用含有白介素12(IL-12)基因的质粒治疗黑素瘤，所述质粒可以刺激初始T细胞分化为Th1细胞以及干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的产生。可替代地，本文描述的方法和设备中的任何方法和设备都可以用于穿透组织的细胞，特别地包含肿瘤细胞。这样可以通过产生足够大的孔以允许小分子跨质膜转运来使细胞透化。如图8A-8B所示，可以实现可逆电穿孔和不可逆电穿孔两者。例如，本文描述的方法和设备可以用于电化学疗法(ECT)，可以用于治疗若干皮肤肿瘤靶标，包含黑素瘤、基底细胞癌、乳腺癌和卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)(其可以包含使用博来霉素(bleomycin)、顺铂或其它药物)。本文描述的方法和设备可以用于引起可能导致坏死的不可逆电穿孔(IRE)。例如，本文描述的方法和设备在其它适应症中可以有效用于治疗***、脑肿瘤消融(包含胶质瘤)、胰腺癌、结肠直肠肝转移、不可切除的肾肿瘤和直肠肿瘤。
本文描述的纳秒脉冲串的兆赫压缩在治疗包含癌症的疾病中可能特别有效，因为所述纳秒脉冲串可能会渗透到一个或多个细胞的细胞内区域中。穿透到质膜之外的能力(可能是由于脉冲上升时间达到纳秒范围内的全幅度)通常比细胞内电荷和细胞器内电荷重新分布以消除施加的场所需的时间快得多。这可以允许本文所述的方法和设备通过施加纳秒范围内的电脉冲来使小细胞器(例如，包含囊泡、线粒体、内质网和细胞核)透化。
本文描述的方法和设备还可以用于血小板激活(在不存在凝血酶的情况下)；例如，这些方法可以用于在富含血小板的血浆的纳秒范围内施加电脉冲，以改善伤口愈合并增强血液流动。
如上所提及，本文描述的纳秒脉冲突发的兆赫压缩可以用于影响肿瘤的生长；例如，在低电场和高频率(例如，兆赫)下用纳秒范围内的电脉冲***，使得肿瘤在数天到数周内消失，并且可以表现出免疫原性细胞死亡(ICD)的特性，例如释放DAMP，如从ER到细胞表面的钙网蛋白移位、ATP释放和HMGB1释放。这些方法还可以用于抑制转移。
类似于使用高压(例如，30kV/cm)使用纳秒范围内的脉冲电场，本文描述的方法还可以提供无药物、非常快速且不留疤痕的治疗，并且可以仅使用一种或几种治疗来治疗。然而，与其它脉冲状态不同，本文描述的方法和设备不需要大电场来实现期望的效应(包含免疫原性细胞死亡效应)。因此，消融区的大小可以更大，并且可以更容易被组织施加和/或耐受。
应当注意，本文给出的实例仅出于说明和实例的目的，所阐述的描述并非旨在是详尽的或限制性的。
使用双极性脉冲靶向的纳秒突发的兆赫压缩
通常，本文描述的用于纳秒突发的兆赫压缩(例如，提供在低电场和高(例如，兆赫)频率下的纳秒脉冲)的方法和设备可以与施加电能的多个来源(例如，电极、天线等)一起使用。例如，可以使用两组电极从组织上、中或周围的单独的区域以及施加的能量(例如，通过叠加)共计产生在兆赫范围(例如，大于或等于约1兆赫)内的频率的亚微秒脉冲的脉冲串，从而可能导致电荷在一个或多个细胞膜处积累，与以较低速率(包含单个脉冲)脉冲的所施加电场相比，所产生的兆赫压缩可能会导致以基本上较低的阈值出发生物效应。如上所述，参考所施加的能量的量，这可以看作明显降低用于触发生物效应的阈值。
在本申请的一些实施例中，本文描述的用于纳秒突发的兆赫压缩(例如，提供在低电场和高(例如，兆赫)频率下的纳秒脉冲)的方法和设备可以结合双极性脉冲的使用来施加，以便在距电脉冲施加一定距离处特异性靶向处理区，同时最大程度地减小电脉冲在电极处或附近(在非靶向区域中)的效应。2018年8月16日提交的美国申请第16/104,089号(“通过干扰双极性纳秒脉冲进行靶向远程电刺激(TARGETED REMOTE ELECTROSTIMULATIONBY INTERFERENCE OF BIPOLAR NANOSECOND PULSES)”)描述了来自组织的不同但重叠区域的在高电压下的双极性纳秒脉冲用于特异性靶向重叠区域(被称为CANCAN)的用途。有趣的是，如图13所示，使用在高电压(例如，高电场强度)下的双极性纳秒脉冲的纳秒脉冲激活不会导致细胞膜中生物效应的激活。如图13所示在下面更详细地描述，使用双极性纳秒脉冲似乎抵消纳秒脉冲对组织的效应，这可能是因为脉冲的双极性质，其中由于脉冲的第一半(例如，正向)部分，第二半(例如，脉冲的负向部分)消除了任何电荷移动。但是，当两个双极性脉冲重叠并且不同步时(这可能在例如从组织的两个不同的区域并且在不同时间施加脉冲时发生)，重叠区域中的电场可能会叠加并导致重叠区域中的单极性脉冲。因此，即使组织的其余部分不受双极性纳秒脉冲的影响，重叠区域也可能会受到所产生的单极性纳秒脉冲的影响。
纳秒突发的兆赫压缩可以与此CANCAN效应组合，以提供甚至深层组织区域的高效电脉冲(例如，包含但不限于电刺激)。这种兆赫压缩的CANCAN技术可能特别有效，因为在使用纳秒脉冲的兆赫压缩时诱发效应所需的能量显著低于没有兆赫压缩的情况下所需的能量。通过使用天线以高频(例如，在兆赫范围内)发射纳秒突发，甚至可以进一步增强这种效应。
因此，本文还描述了从不同位置以高(例如，兆赫)速率发射不同的双极性纳秒电脉冲串以形成重叠区域的方法和设备(参见例如图7)，在所述重叠区域中，所述多个双极性纳秒脉冲串叠加以在低电场下形成局部的单极性纳秒脉冲串。在低电场下的所产生的叠加的单极性纳秒脉冲可能高于用于在局部重叠区域中诱发生物效应(例如，刺激、穿孔等)的阈值。
使用利用CANCAN的纳秒突发的兆赫压缩可能会导致CANCAN效应尖锐。将CANCAN的双极性抵消与纳秒突发的兆赫压缩的使用组合是有点反直觉的，因为兆赫压缩不太可能对来自单个来源的双极性脉冲(例如，在低电场强度下的单个双极性纳秒脉冲串)产生任何效应。由于每个脉冲处有立即放电(与传统的双极性纳秒脉冲一样)，因此双极性脉冲串不适于兆赫压缩，这可能会通过暂时地对脉冲之间的电荷求和来增强膜处的电压效应。另外，由于使用兆赫重复率允许施加显著更低的电场强度以实现相当的生物效应，因此这些方法和设备可以补偿由于组织厚度诱发的衰减。另外，双极性脉冲与单极性脉冲之间可能存在远更强烈(例如，更尖锐)的差异，从而可以改善靶向。这样可以进一步实现来自电脉冲的增强的生物效应(例如，刺激)而不会例如在可激发组织(例如，神经元组织)中产生电穿孔损坏。例如，在一些变型中，可以从四对电极产生两个同步的“CANCAN”脉冲串，所述四对电极可以在组织深度内重叠到更长的脉冲中。
尽管本文描述的兆赫压缩方法和设备可以与双极性抵消结合使用，以减少在发射脉冲的多组电极处的脉冲电能的效应，但是应该理解，这些方法和设备不需要使用双极性抵消。如上所提及，这些方法和设备可以与施加脉冲亚微秒能量以产生生物效应的任何方法或设备一起使用，所述方法或设备包含从可能在组织内通过叠加进行组合的多个位置施加脉冲电场的方法和设备。
因此，本文描述了用于从偏移的多个不同位置中的每个位置以高(例如，兆赫)频率执行纳秒双极性电脉冲的方法和设备，以便在距多个不同位置一定距离处靶向重叠区域，其中在高频下的多个偏移的纳秒双极性电脉冲之间的重叠会产生定位到重叠的靶向区域的具有高(例如，兆赫)频率的纳秒单极性电脉冲串。为方便起见，用于执行的这些方法和设备在本文中可以被称为偏移和重叠的双极性纳秒突发的兆赫压缩。
例如，本文描述了偏移和重叠的双极性纳秒突发的兆赫压缩，以在距施加电脉冲一定距离处特异性靶向纳秒电脉冲的施加，以在不***电极的情况下在深层组织和器官中选择性地诱发生物效应。纳秒持续时间(和以兆赫重复率)的双极性刺激的局部叠加可能会增加穿透深度以及利用纳秒电脉冲的治疗和诊断治疗的精确度。这些方法和设备的示例性应用可以包含上文提及的示例性应用中的任何示例性应用，包含但不限于精神病症、帕金森氏病和深部肿瘤的靶向消融的疼痛控制等。
偏移和重叠的双极性纳秒突发的兆赫压缩可以实现对深层靶标的选择性、非侵入性、局部电刺激。在某些实施例中，本公开涉及使用纳秒电脉冲的独特性质，以在刺激极性反转以及可以降低用于诱发期望的生物反应的阈值的高频率(兆赫)刺激之后消除所述纳秒电脉冲的刺激效应。在一些实施例中，双极性纳秒电脉冲的第二相消除第一相的刺激效应，因此整个双极性刺激变得比其一半更弱，如图13所示。进而，将两个双极性刺激叠加成一个单极性刺激会取消抵消(“CANCAN”)并恢复刺激效率。图14A中的实例示出了两个双极性脉冲串如何能够在远离电极的区域c-c'中产生单极性刺激。双极性脉冲可以以兆赫频率重复。即使所产生的电场很低(例如，小于1kV/cm)，此技术也可以在远离电极的位置处实现选择性的电刺激。
用于偏移和重叠的双极性纳秒突发的兆赫压缩的方法和设备可以具有最小程度的破坏性(例如，非侵入性)。与预先存在的方法相比，本文公开的方法和设备通常还涉及更少的程序步骤、更低的成本和更少的细胞。另外，本文公开的方法和相关方面还可以涉及使用一致且精确定义的电场、有效的介质交换和药物的应用/去除以及添加到无菌条件中。
在图14A中，元件a-a'之间的第一纳秒脉冲序列和元件b-b'之间的第二纳秒脉冲序列可以被配置为彼此的谐波，使得两个脉冲串在区域c-c'中的求和产生足够高的频率，使得求和的脉冲串满足电场触发生物效应(例如，去极化、穿孔等)的阈值。图14B展示了类似的效应，其示出了在组织的靶标c-c'区中组合以形成大于约1兆赫频率的单极性脉冲串的脉冲串的用途；电场可以相对低(例如，<1kV/cm)但是仍可以触发如本文描述的生物效应。
本文描述的用于偏移和重叠的双极性纳秒突发的兆赫压缩的方法和设备可以克服双极性纳秒电脉冲用于靶向非侵入性电穿孔或电刺激的固有效率低下。本文描述的偏移和重叠的双极性纳秒突发的兆赫压缩利用以下事实：双极性电脉冲本身具有低生物效率。如图15A所示，施加在一对电极(A-A')之间的阻尼波(例如，示出为阻尼正弦波，DSW)是生物学无效的。相移的第二DSW(施加在电极B-B'之间)同样无效。然而，两个DSW的叠加和同步在远离两对电极(C-C')的区域中产生了生物学有效的单极脉冲。换句话说，叠加两个生物学无效的DSW的效应会消除双极性纳秒电脉冲的抵消效应，从而产生单极性脉冲。此概念称为“抵消的抵消”或CANCAN效应。图15B是类似的实例，其示出了在靶标c-c'区中组合以形成等于或大于约0.1兆赫频率(例如，0.2MHz或更大、0.5MHz或更大、1MHz或更大等)的单极性脉冲串的脉冲串的用途；电场可以相对低(例如，<1kV/cm)但是仍可以触发如本文描述的生物效应。
本身无效的两个适当形状的双极性纳秒电脉冲串的叠加和同步远程恢复生物学有效的单极性脉冲串。这是因为，在远离电极的某个位置处，在每个随后的相位期间产生的在时间上重合的电场使彼此无效，使得仅剩下作为单极性脉冲的第一相位。当来自两个独立的纳秒脉冲穿的电场分量的方向相反时，会产生这种无效化，从而在所述区域中产生的|E|强度为0kV/cm。
与纳秒电脉冲递送电极附近的单极性脉冲相比，成功的CANCAN的主要目标之一是具有较低的效应，同时远程产生与单极性的效应等同的效应。电场建模结果预测，70％的第二相位幅度可以在第二相位幅度大于50％的电极附近提供较小的电场无效化。这种情况进而可以在同步递送两个纳秒电脉冲串时在电极附近产生更好的双极性抵消。因此，在一些变型中，仅第一脉冲串的第二相位的幅度可以是相位A的70％，而第三相位的幅度保持在25％处。在第二相位幅度为70％的情况下，电极附近的电场无效化较小，从而导致双极性抵消效应占主导地位。相比之下，在电极之间的中心，效应与异步递送存在最大的不同，这指示最大的电场无效化和CANCAN。
通过将两个生物学无效的双极性纳秒脉冲串叠加成一个生物学有效的单极性脉冲串进行远程电穿孔。此效应(称为抵消的抵消或CANCAN)发生于当在每个双极性纳秒脉冲的重合相期间产生的电场在方向上相反并且使彼此无效时，仅在远离电极的区中留下单极性暴露，而在其它地方保留双极性。因此，CANCAN依赖于双极性纳秒电脉冲用于靶向电穿孔的固有效率低下。预期CANCAN的效率与所实现的双极性抵消程度直接成比例。
通过偏移和重叠的双极性纳秒突发的兆赫压缩来远程形成单极性脉冲呈现了非侵入性地进入深层靶标的潜力。偏移和重叠的双极性纳秒突发的兆赫压缩同样可以延伸到电刺激。
即使没有双极性脉冲，也可以应用利用如上所述的兆赫压缩和空间求和的类似效应。例如，在一些变型中，可以发射低于千兆赫频率的多个低电场单极性脉冲串，所述多个低电场单极性脉冲串本身具有很少(如果有的话)的生物效应，然而在靶区域中进行空间求和时，可能会产生足以导致纳秒突发的兆赫压缩的高频率(例如，在兆赫范围内)脉冲串，从而在经过求和的区中触发生物效应。
实例
如上所述，使用组织或细胞(例如，在一些情况下是分离的组织或细胞，例如从身体去除)以确认本文描述的方法和设备可以用于有效地治疗细胞和组织。应当理解，分离的组织和细胞的实例仅用于说明，并且本文描述的这些技术、方法和设备(例如，装置、***等)也可以与活的人或动物中的完整或半完整的组织(例如，器官等)一起使用。
例如，如以上参考图7-13所述，使用细胞展示本文描述的方法和设备。例如，包含粘附细胞系的细胞：HEK 293(人肾上皮)、CHO-K1(中国仓鼠卵巢)和小鼠心室心肌细胞(VCM)用于随时间的荧光成像测定，并且基于悬浮液的EL-4细胞(例如，小鼠淋巴瘤)用于活力研究。在Langendorff灌注期间通过酶消化从成年DBA/2J小鼠中分离VCM。VCM接种在层粘连蛋白涂覆的10-mm玻璃盖玻片上，并在48小时内用于实验中。
本文描述的方法和设备可以用于刺激电可激发细胞。例如，由来自牛蛙Ranacatesbiana的神经(坐骨神经(n.ischiadicus)+腓总神经(n.Peroneus))诱发神经复合动作电位(CAP)，并且执行CAP记录。在两端处使分离神经结扎并浸没在含有以下的冷冻生理溶液(mM)中：140NaCl、5.4KCl、1.5MgCl2、2CaCl2、10葡萄糖和10HEPES(pH 7.3，290-300mOsm/kg，1.6S/m)。CAP用下文描述的不同的生成器引发，并且用MP160数据采集***(BIOPAC***公司(BIOPAC Systems)，加利福尼亚州戈利塔(Goleta,CA))记录。
在一些实验中，使用以1Hz到3-4MHz的重复率的5到1000个脉冲的突发，其中单独的亚微秒脉冲持续时间的范围为11到500纳秒。使用持续时间长达1毫秒的单个脉冲来比较在各个时序和强度参数下用亚微秒突发的生物效应。为了将此类多样的刺激递送到不同的生物负载中(阻抗为8到200ohm)，使用如本文所述的若干高功率亚微秒发生器，并且在一些情况下，使用低功率577模型数字延迟发生器(伯克利原子工程公司(BerkleyNucleonics)，加利福尼亚州圣拉斐尔(San Rafael,CA))以进行比较(尽管可灵活用于设定脉冲参数，但在200-ohm负载中，577模型脉冲幅度的输出仅限制为20V)。如本文描述配置的脉冲发生器可能会限制突发持续时间和最小脉冲持续时间，但在100-200ohm负载(如盖玻片上的粘附细胞)中可以递送高达约3kV、或在8-10ohm负载(如带有细胞生长培养基的电穿孔比色皿)中递送高达500V。除了比色皿暴露外，这些实验中的脉冲通常是单极性的并且几乎是矩形的，其上升时间和下降时间是脉冲持续时间的<15％(参见例如图16A)。对于比色皿暴露，在200纳秒持续时间(在50％高度处)采用的设置下，很长的上升时间和下降时间会产生三角形脉冲形状。在一些实例中，产生单个接近矩形的单极性长脉冲(例如，数百微秒的脉冲持续时间)利用S88模型刺激器或定制的基于MOSFET的发生器。在一些实例中，使用TDS3052示波器(泰克公司(Tektronix)，俄勒冈州比佛顿(Beaverton,OR))控制脉冲形状和幅度。
在示出了细胞模拟和透化的实例中，通过随时间的荧光成像来监测对亚纳秒脉冲的细胞应答，以检测膜电位的变化(例如，使用FluoVolt染料)或胞质Ca2+中的增加(例如，通过Fluo-4或Fluo-8染料，或YO-PRO-1染料摄取)。在整个实验过程中，将膜电位和Ca2+指示剂预装到细胞中，而将YO-PRO-1以1μM添加到浴溶液中。在一些实例中，浴溶液是以上定义的生理溶液，或(在指示时)与等渗蔗糖溶液以1:9混合的相同溶液，以降低电导率并促进电穿孔。将一对与脉冲发生器相连的钨棒电极(直径为100um，间隙为140-170urn)放置在显微镜的视野内，使得所选细胞(或一小组细胞)在其尖端之间居中；然后将电极精确地提起到盖玻片表面上方的50μm。例如通过使用Digidata 1440A板和Clampex软件(美谷分子仪器公司(Molecular Devices)，加利福尼亚州福斯特城(Foster City,CA))的TLL脉冲方案来触发脉冲电力***，并使其与图像采集同步。使用有限元求解器COMSOL Multiphysics(瑞典斯德哥尔摩(Stockholm,Sweden))通过3D数值模拟计算电场。
在一些实例中，执行细胞活力测定。将EL-4细胞以1.2 106/ml重新悬浮于生长培养基(含10％FBS的DMEM)中，并将100-μl等分试样置于1mm间隙电穿孔比色皿中。在室温下施加亚微秒脉冲突发；如其它地方所述计算来自暴露的最大(绝热)热量，且不超过6℃。将细胞放回培养箱，并通过Presto Blue代谢测定(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))在24小时内测量活力。
外周神经刺激
本文描述的方法设备可以用于刺激可激发细胞。例如，使用上述方法和设备刺激外周神经。神经纤维可以通过高频率(例如，兆赫)亚微秒低电场(例如，小于1kV/cm)刺激反复激发，而不损坏神经。例如，如图16B-16D所示，使用亚微秒刺激(类似于图16A中所示的亚微秒刺激)来激发神经。在图16B中，在5脉冲和100脉冲突发中施加重复率为1Hz到2MHz的340纳秒脉冲。在此实例中，在高达约7kHz的速率下没有求和，因此突发的阈值可能等于单个340纳秒脉冲的阈值。阈值降低遵循幂函数，并且以100脉冲突发的速度更快，可以看到以10kHz以上的速率进行求和，这可以从大量较小的脉冲中累积跨膜电位。在约2MHz处，这些细胞的100脉冲突发的阈值从400-500V/cm降到10V/cm。在0.3MHz处，5脉冲突发的阈值已经降到理论最小值(对于单个脉冲是阈值的1/5)，这表明脉冲之间没有任何明显的放电。
通过亚微秒突发感应的膜电位可以由突发期间的时间-平均电场决定。此值可以计算为阈值电场乘以占空比。如图16C所示，相对于突发持续时间绘制的时间-平均电的阈值大约相同，无论亚微秒脉冲持续时间如何。因此，可以预测持续时间等于突发持续时间的单个“长”脉冲的阈值。如图16D所展示，在3.3MHz处的1000个200纳秒脉冲的突发(占空比为67％，突发持续时间为300微秒)将神经激发阈值从360±4V/cm(对于单个200纳秒脉冲)降到1.63±0.2V/cm。在此类突发期间的时间-平均电场大约为1.63x 0.67＝1.1V/cm。这是单个300微秒脉冲(1.04±0.2V/cm)的测量阈值。一个200微秒脉冲的测量阈值(脉冲持续时间等于突发中的“接通”总时间)仅略高一些，例如，1.21+/-0.17V/cm。但是，高频率亚微秒低电场突发的效率与单个长脉冲之间的简单关系并不总是有效。通常，产生效应所需的电场(例如，在图16B-16D中，激发电可激发的细胞膜)通常随着脉冲突发内的重复率的增加(例如，减少相邻脉冲之间的延迟)而减小。尽管脉冲参数的精确值(例如，频率，重复率/脉冲间隔等)对于不同的组织类型或细胞类型可能有所不同，但可以相同的总趋势适用。
如上所述，用于高频率(例如，兆赫)亚微秒低电场(例如，小于1kV/cm)的脉冲刺激的方法和设备可以用于可激发细胞和不可激发细胞的电穿孔。例如，图17A-17F展示了通过高频率亚微秒低电场脉冲突发的不可激发细胞的电穿孔。在图17A-17F中，在不表达任何电压门控通道的CHO细胞和HEK细胞中测量电透化。在图17A中，将100个400纳秒脉冲的突发递送到装载有Ca2+指示剂Fluo-4的CHO细胞。对于不同的电场强度，从1kHz到1MHz测试了脉冲重复率，并计算对可检测到的Ca2+上升做出应答和未做出应答的细胞的数量。图17A中的每个数据点都表示来自3个或更多个独立实验的总共20-30个细胞的应答分数。在约0.96与1.47kV/cm之间的电场值在低重复率下不会引起Ca2+应答，但是在约0.3MHz和更高的频率下变得越来越有效率。此频率比神经刺激(例如，与图16B相比)的频率高约两个数量级，并且与约1微秒的估计充电时间常数一致。在1kHz下，在70％的细胞中，约1.83kV/cm的较高电场是有效的；应答分数仅在10和100kHz下的增加没有被完全理解，并且可能是更好的检测的结果，因为Ca2+瞬变也变得更强。
在约0.64kV/cm的低电场下，1000个500纳秒的脉冲突发不会导致HEK细胞透化到约0.8-1MHz以下的Ca2+离子或YO-PRO-1中(参见例如图17B-17D)。在此实例中，在此频率之上，电透化急剧增加。由MHz突发(图17D)和单个长脉冲(图17E)诱发的Ca2+瞬变的时间过程和形状类似，这表明电穿孔的基本机制相同。MHz突发诱导的Ca2+应答的幅度可以与持续时间等于突发期间的“接通”总时间(不是总突发持续时间)的单个“长”脉冲的幅度相匹配，如图17F所示。发现诱发应答的匹配条件为：
Elp＝(EnsPEF)x(占空比)+0.05 [1]
Elp和EnsPEF分别是由长脉冲(500微秒)和亚微秒脉冲(500纳秒)在细胞位置处产生的电场值(kV/cm)。此类关系表明，亚微秒突发和匹配的单个脉冲应具有相当的生理后果，如严重电穿孔细胞中的活力降低。但是，实验并未证实这一点。还检查了通过高频率亚微秒低电场脉冲而电穿孔的EL4细胞的活力。例如，执行了电穿孔比色皿中相对大的细胞群的高频率亚微秒低电场脉冲处理的活力实验；高频率亚微秒低电场脉冲突发具有矩形形状，在50％的高度处具有200纳秒的宽度，并且施加的电压在脉冲之间并不总是完全下降到零(图18A)。以两个不同的峰值幅度(190和500V，在细胞悬浮液中转译成1.9和5kV)并且以低重复率或高重复率(100Hz和3MHz)施加1000个高频率亚微秒低电场脉冲的突发。1.9kV/cm的电场低于用于施加在100Hz下的200纳秒脉冲的电穿孔阈值，因此高达4000个脉冲的突发不会降低细胞活力。对于所有测试数量的脉冲，施加的在3MHz下的相同脉冲均高于阈值，并且活力降低约两倍(图18B，与100Hz相比，p<0.001，t测试)。在约5kV/cm下，对于100Hz突发和3MHz突发两者，更少数量的脉冲降低了活力，但是3MHz突发显著更有效(图18C，p<0.001)。
在不规则的脉冲形状的情况下，无法通过使高频率亚微秒低电场脉冲幅度乘以占空比来计算在突发期间时间-平均的电压和电场。相反，在突发期间以0.2纳秒的分辨率使电压数字化，并且计算其平均值，当突发中的高频率亚微秒低电场脉冲的峰值电压为190V(1.9kV/cm)时，所述平均值等于108V(1.08kV/cm)。在一系列单独的实验中(图18D)，通过高频率亚微秒低电场脉冲突发(1000个脉冲，400纳秒，3MHz，1.9kV/cm)处理的细胞的活力与单个脉冲并排比较，所述单个脉冲的持续时间等于突发持续时间(333微秒)并且电场等于突发中的时间-平均值(1.08kV/cm)。在高频率亚微秒低电场脉冲突发之后的活力为约50％，这与先前设置(图17B)一致，而“等效”单脉冲的效率显著较低，并且将活力降到仅87.6±1.4％，p<0.0001。因此，高频率亚微秒低电场脉冲的MHz突发的效率高于通过其时间-平均的幅度预测的效率，这可能是由于未知的高频率亚微秒低电场脉冲具体效应。
这些实验说明，通过以高达MHz重复率的高频率亚微秒低电场脉冲突发的激发和电穿孔既有效又高效。各种靶标和端点全部示出高频率亚微秒低电场脉冲效率增加并且阈值降低。高频率亚微秒低电场脉冲突发的效率通常随每个突发的脉冲数、其幅度和占空比而增加。效率可能与单个长脉冲显著不同，所述单个长脉冲的持续时间和幅度分别等于高频率亚微秒低电场脉冲突发的持续时间和时间-平均的幅度。
本文描述的方法中的任何方法(包含用户界面)都可以实施为软件、硬件或固件，并且可以被描述为存储能够由处理器(例如，计算机、平板计算机、智能电话等)执行的一组指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述一组指令在由处理器执行时使处理器控制步骤中的任何步骤的执行，包含但不限于：显示、与用户进行通信、分析、修改参数(包含定时、频率、强度等)、确定、发出警报等。
当特征或元件在本文中被称为位于另一特征或元件“上”时，其可以直接位于另一特征或元件上，或者也可以存在中间特征和/或元件。相反，当特征或元件被称为“直接位于”另一特征或元件“上”时，则不存在中间特征或元件。还应理解，当特征或元件被称为“连接”、“附接”或“耦接”到另一特征或元件时，其可以直接连接、附接或耦接到另一特征或元件或者可以存在中间特征或元件。相反，当特征或元件被称为与另一特征或元件“直接连接”、“直接附接”或“直接耦接”时，则不存在中间特征或元件。尽管关于一个实施例进行了描述或示出，但是如此描述或示出的特征和元件可以应用于其它实施例。本领域的技术人员还将理解，提及与另一特征“相邻”安置的结构或特征可以具有与相邻特征重叠或位于其下的部分。
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在限制本发明。例如，除非上下文另外清楚地说明，否则如本文所使用的，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”旨在包含复数形式。如本文所使用的，术语“和/或”包含相关联列举项中的一个或多个的任何和全部组合并且可以缩写为“/”。
为了便于描述，在本文中可以使用空间相对术语，例如“之下”、“下方”、“下部”、“之上”、“上部”等，以描述一个元件或特征与另一个或多个元件或另一个或多个特征的关系，如图所展示的。将理解的是，除了在附图中描绘的朝向之外，空间相对术语还旨在涵盖装置在使用时或操作时的不同朝向。例如，如果附图中的装置是倒置的，则描述为在其它元件或特征“之下”或“下面”的元件将被朝向为位于其它元件或特征“之上”。因此，示例性术语“之下”可以涵盖“之上”和“之下”两个朝向。可以以其它方式朝向装置(旋转90度或处于其它朝向)，并且以相应的方式解释本文中使用的空间相对描述语。类似地，除非另外特别指出，否则在本文中仅出于解释的目的而使用术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等。
尽管本文中可以使用术语“第一”和“第二”来描述各种特征/元件(包含步骤)，但是除非上下文另外指示，否则这些特征/元件不应受这些术语的限制。这些术语可以用来将一个特征/元件与另一特征/元件区分开。因此，在不脱离本发明的教导的情况下，下文讨论的第一特征/元件可以被称为第二特征/元件，并且类似地，下文讨论的第二特征/元件可以被称为第一特征/元件。
在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”以及如“包括”和“包括”的变体意指可以在方法和制品中共同采用的各种组件(例如，包含装置和方法的组合物和设备)。例如，术语“包括”将被理解为暗示包含任何陈述的元件或步骤，但是不排除任何其它元件或步骤。
通常，本文描述的任何设备和方法中的任何设备和方法都应被理解为是包含性的，但是组件和/或步骤的全部或子集可以可替代地是排他的，并且可以表示为“由各种组件、步骤、子组件或子步骤组成”或可替代地“基本上由各种组件、步骤、子组件或子步骤组成”。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，包含如在实例中所使用的，并且除非另有明确规定，否则所有数字，即使术语没有明确出现，也可以解读为以词语“约(about)”或“大约(approximately)”开头。当描述幅度和/或定位时，可以使用短语“约”或“大约”来指示所描述的值和/或定位处于值和/或定位的合理预期范围内。例如，数值的值可以是所述值(或值的范围)的+/-0.1％、所述值(或值的范围)的+/-1％、所述值(或值的范围)的+/-2％、所述值(或值的范围)的+/-5％、所述值(或值的范围)的+/-10％等。除非上下文另外指出，否则本文给出的任何数值也应理解为包含约或大约所述值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。本文中所叙述的所有数值范围旨在包含所有其中纳入的子范围。还应理解，如本领域技术人员适当理解的，当公开的值“小于或等于”所述值时，还公开了“大于或等于所述值”以及值之间的可能范围。例如，如果公开了值“X”，则还公开了“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，其中X是一个数值)。还应当理解，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且此数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应当理解，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及介于10与15之间。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
尽管上文描述了各个说明性实施例，但是在不脱离如权利要求所描述的本发明的范围的情况下，可以对各个实施例进行多种改变中的任何一种。例如，在替代性实施例中，可以经常改变执行所描述的各种方法步骤的顺序，而在其它替代实施例中，可以完全跳过一个或多个方法步骤。各个装置和***实施例的任选的特征可以包含在一些实施例中，并且不包含在其它实施例中。因此，前述描述主要是为了示例性目的而提供的，并且不应解释为限制权利要求中所阐述的本发明的范围。
本文包含的实例和说明通过说明而非限制的方式示出了可以实践主题的具体实施例。如所提及的，可以利用其它实施例并由其得到其它实施例，使得可以在不脱离本公开的范围的情况下进行结构和逻辑替代和改变。本文可以单独地或共同地通过术语“本发明”提及本发明主题的此类实施例，这仅仅是为了方便起见，并且如果实际上公开了多于一个发明或发明概念，则不旨在有意将本申请的范围限制于任何单个发明或发明概念。因此，尽管本文已经对具体实施例进行了说明和描述，但是任何适合用于实现相同目的的布置都可以替代所示的具体实施例。本公开旨在覆盖各个实施例的任何和所有改编或变型。在阅读以上描述后，上述实施例的组合以及本文未具体描述的其它实施例对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。

Claims (38)

1.一种用于递送电脉冲的***，所述***包括：
控制器；
施加器，所述施加器包括适于放置在细胞或生物组织附近的多个电极；以及
一个或多个脉冲发生器，其中所述一个或多个脉冲发生器各自被配置成产生持续时间小于1000纳秒的亚微秒脉冲；
其中所述控制器被配置成从所述施加器施加频率等于或大于0.1兆赫(MHz)的亚微秒脉冲串。
2.根据权利要求1所述的***，其中所述控制器被配置成施加等于或大于1MHz的所述亚微秒脉冲串。
3.根据权利要求1或2所述的***，其中其中所述亚微秒脉冲串的场强小于1kV/cm。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的***，其中所述控制器被配置成施加所述亚微秒脉冲串，其中所述亚微秒脉冲串的电场强度为800V/cm或更小。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的***，进一步地其中所述一个或多个脉冲发生器包括多个脉冲发生器，进一步地其中所述控制器被配置成协调所述多个脉冲发生器以组合来自所述多个脉冲发生器中的每个脉冲发生器的亚微秒脉冲以形成所述亚微秒脉冲串。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的***，其中所述控制器被配置成控制所述一个或多个脉冲发生器，使得所述亚微秒脉冲串中的所述亚微秒脉冲的电压幅度等于或小于20V。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的***，其中所述控制器被配置成接收用于设定或选择所述亚微秒脉冲串的所述频率的一个或多个用户输入。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的***，其中所述控制器被配置成接收用于设定或选择所述亚微秒脉冲串中的所述亚微秒脉冲的电压幅度的一个或多个用户输入。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的***，其中所述控制器被配置成接收用于选择所述亚微秒脉冲串中的所述亚微秒脉冲的持续时间的一个或多个用户输入。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的***，其中所述多个电极包括针电极。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的***，其中所述施加器被配置为手持式施加器。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的***，其中所述一个或多个脉冲发生器被配置成产生持续时间介于1纳秒与900纳秒之间的亚微秒脉冲。
13.一种用于处理生物组织的***，所述***包括：
多个脉冲发生器；以及
控制器，所述控制器包括一个或多个处理器，所述控制器包含存储使所述一个或多个处理器执行用于以下的操作的指令集的机器可读有形介质：
将高频率亚微秒脉冲电场递送到所述生物组织，其中所述脉冲电场的场强小于1kV/cm，其中所述脉冲电场以0.1MHz或更大进行脉冲，进一步地其中所述脉冲电场的每个脉冲的持续时间小于1000纳秒。
14.一种用于处理生物组织的***，所述***包括：
多个脉冲发生器；以及
控制器，所述控制器包括一个或多个处理器，所述控制器包含存储使所述一个或多个处理器执行用于以下的操作的指令集的机器可读有形介质：
将第一亚微秒脉冲电场递送到所述生物组织，其中所述第一亚微秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间小于1000纳秒；
与递送所述第一亚微秒脉冲电场同时，将第二亚微秒脉冲电场递送到所述生物组织，其中所述第二亚微秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间小于1000纳秒；以及
对所述生物组织中的靶区域处的所述第一脉冲电场和所述第二脉冲电场求和以递送包括所述第一亚微秒脉冲电场和所述第二亚微秒脉冲电场的叠加的高频率亚微秒脉冲电场，所述高频率亚微秒脉冲电场的场强小于1kV/cm并且频率为0.1MHz或更大，其中所述高频率亚微秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间小于1000纳秒。
15.根据权利要求13或14所述的***，其中所述指令集被进一步配置成使所述一个或多个处理器递送所述高频率亚微秒脉冲电场的大于100个脉冲。
16.根据权利要求13或14所述的***，其中所述指令集被进一步配置成使所述一个或多个处理器协调所述多个脉冲发生器以产生所述高频率亚微秒脉冲电场。
17.根据权利要求13或14所述的***，其中所述高频率亚微秒脉冲电场的场强为800V/cm或更小。
18.根据权利要求13或14所述的***，其中所述高频率亚微秒脉冲电场的频率为1兆赫或更大。
19.根据权利要求13或14所述的***，其中所述高频率亚微秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间为600纳秒或更小。
20.根据权利要求13或14所述的***，其中所述指令集被配置成使所述控制器接收用于设定或选择所述高频率亚微秒脉冲电场的频率的用户输入。
21.根据权利要求13或14所述的***，其中所述指令集被配置成使所述控制器接收用于设定或选择所述高频率亚微秒脉冲电场的幅度的用户输入。
22.根据权利要求13或14所述的***，其中所述指令集被配置成使所述控制器接收用于设定或选择所述高频率亚微秒脉冲电场的持续时间的用户输入。
23.根据权利要求13或14所述的***，其进一步包括具有多个电极的施加器。
24.根据权利要求13或14所述的***，其中所述多个脉冲发生器中的每个脉冲发生器被配置成产生具有正相和负相的亚微秒双极性脉冲。
25.根据权利要求13或14所述的***，其中所述多个脉冲发生器中的每个脉冲发生器被配置成叠加所述第一电场和所述第二电场以在所述靶区域处产生单极脉冲场。
26.一种用于处理生物组织以诱发生物效应的方法，所述方法包括将高频率亚微秒脉冲电场递送到生物组织，其中所述高频率亚微秒脉冲电场的场强小于1kV/cm，频率为0.1兆赫或更大，并且其中所述高频率亚微秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间小于1000纳秒。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物效应是以下之一：电刺激和穿孔。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物效应是杀死所述组织的细胞。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物组织是以下中的一个或多个：皮肤、肝、肾、神经元、脑、脊柱、肺、肌肉、脂肪、呼吸道、胃肠道、膀胱和生殖***。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物组织包括分离的细胞。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述高频率亚微秒脉冲电场被脉冲大于100次。
32.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物组织包括肿瘤。
33.一种脉冲发生器的操作方法，所述方法包括：
产生第一纳秒脉冲电场，其中所述第一纳秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间小于1微秒；
与所述第一纳秒脉冲电场同时产生第二纳秒脉冲电场，其中所述第二纳秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间等于或小于1微秒；以及
对所述第一脉冲电场和所述第二脉冲电场求和以递送包括所述第一亚微秒脉冲电场和所述第二亚微秒脉冲电场的叠加的高频率亚微秒脉冲电场，所述高频率亚微秒脉冲电场的场强小于1kV/cm并且频率为0.1MHz或更大。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一纳秒脉冲电场和所述第二纳秒脉冲电场中的至少一个包括双极性脉冲。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述高频率亚微秒脉冲电场包括大于100个脉冲。
36.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述高频率亚微秒脉冲电场的幅度为800V/cm或更小。
37.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述高频率亚微秒脉冲电场以大于1兆赫进行脉冲。
38.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述高频率亚微秒脉冲电场的每个脉冲的持续时间小于600纳秒。
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