CN112961213A - Depdc1衍生的肽和包含它们的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有诱导细胞毒性T细胞的能力的DEPDC1衍生的表位肽。本发明还提供编码所述肽的多核苷酸，呈递所述肽的抗原呈递细胞，和靶向所述肽的细胞毒性T细胞，以及诱导抗原呈递细胞或CTL的方法。本发明还提供了含有它们作为活性成分的组合物和药物组合物。此外，本发明提供了使用本发明的肽、多核苷酸、抗原呈递细胞、细胞毒性T细胞或药物组合物来治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法。还提供了诱导针对癌症的免疫应答的方法。

Description

DEPDC1衍生的肽和包含它们的疫苗
本申请是申请日为2016年8月10日，申请号为201680057709.2，发明名称为“DEPDC1衍生的肽和包含它们的疫苗”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
发明涉及生物科学领域，更具体的说涉及癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗非常有效的新肽，使用所述肽治疗和/或预防肿瘤的方法，以及包含所述肽的药物组合物。
背景技术
已经显示CD8-阳性细胞毒性T细胞(CTLs)可识别主要组织相容性复合物(MHC)I类分子上发现的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从发现黑素瘤抗原(MAGE)家族以来，已经通过免疫学方法发现了许多其它TAA(NPL1:Boon T,Int J Cancer1993 May 8,54(2):177-80；NPL2:Boon T&van der Bruggen P,J Exp Med 1996 Mar 1,183(3):725-9)。这些TAAs中的一些目前正在作为免疫治疗靶标进行临床开发。
在这些TAAs中的数个中，鉴定了可以被CTLs识别的表位肽，并且预期它们在用于各种类型的癌症的免疫治疗中的应用(NPL3:Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct16,88(20):1442-55；NPL4:Butterfield LH等人,Cancer Res 1999 Jul 1,59(13):3134-42；NPL5:Vissers JL等人,Cancer Res 1999 Nov 1,59(21):5554-9；NPL6:van der BurgSH等人,J Immunol 1996 May 1,156(9)3308-14；NPL7:Tanaka F等人,Cancer Res 1997Oct 15,57(20):4465-8；NPL8:Fujie T等人,Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2):169-72；NPL9:Kikuchi M等人,Int J Cancer 1999 May 5,81(3):439-66；NPL10:Oiso M等人,IntJ Cancer 1999 May 5,81(3):387-94)。到目前为止，已经报道了使用这些TAA衍生的CTL表位肽的几项临床试验。不幸的是，许多这些临床试验显示出低的客观反应率(NPL11:BelliF等人,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20):4169-80；NPL12:Coulie PG等人,Immunol Rev2002 Oct,188:33-42；NPL13:Rosenberg SA等人,Nat Med 2004 Sep,10(9):909-15)。因此，仍然需要鉴定可以用于癌症免疫治疗的新的CTL表位。
DEPDC1(含DEP结构域的蛋白1)；参考序列：GenBank登录号NM_001114120(SEQ IDNO:113)或GenBank登录号NM_017779(SEQ ID NO:115))通过全基因组cDNA基因表达谱分析鉴定为在膀胱癌中上调的基因(NPL14:Kanehira M et al.,Oncogene 2007,26(44):6448-55)。观察到DEPDC1特别在超过80％的膀胱癌患者的肿瘤细胞中上调，但在除睾丸外的其它正常重要器官均不表达。另外，显示了作为通过siRNA下调DEPDC1表达的结果，膀胱癌中的细胞增殖得到抑制(PTL1:WO2006/085684)。
最近，已经鉴定了DEPDC1衍生的HLA-A24-限制性CTL表位肽(PTL2:WO2008/047473)。这些肽在具有HLA-A24型或HLA-A2型的癌症患者中是有效的，但不能预期对不具有这些HLA型的癌症患者具有效果。
[引用列表]
[专利文献]
[PTL 1]WO2006/085684
[PTL 2]WO2008/047473
[非专利文献]
[NPL 1]Boon T,Int J Cancer 1993 May 8,54(2):177-80
[NPL 2]Boon T&van der Bruggen P,J Exp Med 1996 Mar 1,183(3):725-9
[NPL 3]Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20):1442-55
[NPL 4]Butterfield LH et al.,Cancer Res 1999 Jul 1,59(13):3134-42
[NPL 5]Vissers JL et al.,Cancer Res 1999 Nov 1,59(21):5554-9
[NPL 6]van der Burg SH et al.,J Immunol 1996 May 1,156(9):3308-14
[NPL 7]Tanaka F et al.,Cancer Res 1997 Oct 15,57(20):4465-8
[NPL 8]Fujie T et al.,Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2):169-72
[NPL 9]Kikuchi M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3):459-66
[NPL 10]Oiso M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3):387-94
[NPL 11]Belli F et al.,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20):4169-80
[NPL 12]Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002 Oct,188:33-42
[NPL 13]Rosenberg SA et al.,Nat Med 2004 Sep,10(9):909-15
[NPL 14]Kanehira M et al.,Oncogene 2007,26(44):6448-55
发明内容
本发明涉及肽，其可以诱导对表达DEPDC1的细胞特异性的CTL。当这些肽通过人白细胞抗原(HLA)呈递在抗原呈递细胞(APC)上时，诱导显示出针对表达DEPDC1的细胞的特异性细胞毒性活性的CTLs。迄今已经鉴定的具有CTL诱导能力(CTL诱导力)的DEPDC1衍生肽是HLA-A2限制性肽或HLA-A24限制性肽，其不能诱导针对不表达这些HLA的细胞的CTL。因此，因此，常规肽不适合在不具有这些HLA的受试者中进行免疫治疗。HLA-A11是亚洲人常见的等位基因(Sette A,Sidney J.,Immunogenetics 1999,50:201-12),而HLA-A01是在高加索人中常见的等位基因(Cao等人,Hum Immunol 2001；62(9):1009-30)。期望对HLA-A11阳性受试者施用HLA-A11限制性肽，和对HLA-A01阳性受试者施用HLA-A01限制性肽。因此，本发明涉及DEPDC1衍生肽，其具有对HLA-A11或HLA-A01限制性的CTL诱导能力。基于本文公开的结果，已经证明本发明的肽是表位肽，其能够诱导针对表达DEPDC1和HLA-A11或HLA-A01的细胞的强力和特异性的免疫应答。
因此，本发明的目的之一是提供能够以HLA-A11-或HLA-A01限制性方式诱导CTL的DEPDC1衍生肽。这些肽可以用于体外、离体或体内诱导CTL，或可用于施用至受试者用于诱导针对表达DEPDC1的癌细胞的免疫应答的目的。优选的肽是包含选自以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108；更优选的肽是九肽，十肽，或十一肽；和甚至更优选的肽是由选自以下的氨基酸序列组成的肽SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108。
本发明的肽包含以下肽，其中一个，两个或更多个氨基酸被取代，缺失，***和/或添加，只要所得修饰肽保留了原始肽的CTL诱导能力。
本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的任一种肽。与本发明的肽类似，这些多核苷酸可用于诱导具有CTL诱导能力的APC，并可施用至受试者用于诱导针对DEPDC1表达的癌细胞的免疫应答。
本发明还提供了组合物，其包含本发明的一种或多种类型的肽，编码本发明的一种或多种类型的肽的一种一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APCs，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTLs。本发明的组合物优选是药物组合物。本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防癌症，以及防止其手术后复发。它们还可以用于诱导针对癌症的免疫应答。当施用于受试者时，本发明的肽呈递于APC的表面上，结果诱导了靶向肽的CTL。因此，本发明的另一个目的是提供用于诱导CTLs的组合物，其中组合物包含一种或多种类型的本发明的肽，编码一种或多种类型的本发明的肽的一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APC，和/或呈递本发明的肽的外来体。
本发明的另一个目的是提供诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其中所述方法包括将本发明的一种或多种类型的肽与APC接触的步骤，或将编码本发明的任何一种肽的多核苷酸引入APC的步骤。
本发明还提供了诱导CTL的方法，包括将CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的APC共培养的步骤，将CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体共培养的步骤，或将载体引入CD8-阳性T细胞的步骤，所述载体包含编码T细胞受体(TCR)的每个亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合由细胞表面上的HLA抗原所呈递的本发明的肽。本发明中优选的HLA抗原是HLA-A11或HLA-A01。
本发明的另一个目的是提供分离的APC，在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物。本发明还提供靶向本发明肽的分离的CTL。这些APC和CTL可以用于针对表达DEPDC1的癌症的免疫治疗。在本发明中，经受免疫治疗的癌症是例如存在于具有HLA-A11或HLA-A01的纯合子或杂合子患者中的癌症。因此，APC是具有HLA-A11或HLA-A01的纯合子或杂合子的细胞。也就是说，本发明提供了用于表达DEPDC1和选自HLA-A11，和HLA-A01的HLA抗原的癌症的免疫治疗。
本发明的另一个目的是提供在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的肽，编码所述肽的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。本发明的另一个目的是提供在受试者中治疗和/或预防癌症以及预防其手术后复发的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的肽，编码所述肽的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。
除了上述之外，当结合附图和实施例阅读以下详细描述时，本发明的其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，本发明的前述概述和以下详细描述都是示例性实施方案，而对本发明或本发明的其它替代实施方案不是限制性的。特别地，尽管本文参照多个具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，该描述是本发明的说明，而不构成对本发明的限制。在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以想到各种修改和应用。同样地，本发明的其它目的，特征，益处和优点将从该概述和下面描述的某些实施方案中变得明显，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。从上述结合所附实施例，数据，附图和从其中得出的所有合理推断，单独或与并入本文的参考文献一同考虑，此类目的，特征，益处和优点将是显而易见的。
附图说明
图1由照片(a)至(b)组成，其显示了使用衍生自DEPDC1的肽诱导的CTL中的干扰素(IFN)-gamma酶联免疫点(ELISPOT)测定的结果。与对照相比，使用DEPDC1-A11-9-627(SEQID NO:1)的孔#4中(a)显示出强的IFN-gamma产生。在这些照片中，孔上的正方形显示繁殖来自相应孔的细胞用于建立CTL系。与此相反，DEPDC1-A11-9-558(SEQ ID NO:2)(b)显示为其中没有特异性IFN-gamma产生的典型阴性数据的实例。图中，“+”表示针对用合适的肽冲击(pulsed)的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。
图2的线形图显示了IFN-gamma酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，证实了在用DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)刺激的CTL系中IFN-gamma的产生。这些结果证明通过用DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)刺激建立的CTL系与对照相比显示出强的IFN-gamma产生。在图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图3的线形图显示了通过用DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)刺激的CTL系的有限稀释建立的CTL克隆中的IFN-gamma产生。该结果证明通过用DEPDC1-A11-9-627(SEQ IDNO:1)刺激建立的CTL系与对照相比显示出强的IFN-gamma产生。在图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图4的线形图显示了针对表达DEPDC1和HLA-A*1101两者的靶细胞的特异性CTL活性。制备用HLA-A*1101或全长DEPDC1基因转染的COS7细胞作为对照。使用DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)建立的CTL系表现出针对用DEPDC1和HLA-A*1101两者转染的COS7细胞的特异性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，未显示出针对用HLA-A*1101(白色三角形)和DEPDC1(白色圆形)中的任一种转染的靶细胞的显著的特异性CTL活性。
图5-1由照片(a)至(x)组成，显示了使用衍生自DEPDC1的肽诱导的CTL中的IFN-gamma ELISPOT测定的结果。与对照相比，在使用DEPDC1-A01-9-239(SEQ ID NO:81)的孔#6中(a)，使用DEPDC1-A01-9-46(SEQ ID NO:82)的孔#5中(b)，使用DEPDC1-A01-9-516(SEQID NO:21)的孔#3中(c)，使用DEPDC1-A01-9-781(SEQ ID NO:83)的孔#3中(d)，使用DEPDC1-A01-9-571(SEQ ID NO:84)的孔#7中(e)，使用DEPDC1-A01-9-96(SEQ ID NO:85)的孔#2中(f)，使用DEPDC1-A01-9-260(SEQ ID NO:86)的孔#4中(g)，使用DEPDC1-A01-9-767(SEQ ID NO:87)的孔#7中(h)，使用DEPDC1-A01-9-291(SEQ ID NO:88)的孔#8中(i)，使用DEPDC1-A01-9-311(SEQ ID NO:89)的孔#6中(j)，使用DEPDC1-A01-10-690(SEQ ID NO:90)的孔#3中(k)，使用DEPDC1-A01-10-2(SEQ ID NO:91)的孔#6中(l)，使用DEPDC1-A01-10-259(SEQ ID NO:58)的孔#3中(m)，使用DEPDC1-A01-10-45(SEQ ID NO:92)的孔#1中(n)，使用DEPDC1-A01-10-712(SEQ ID NO:96)的孔#6中(o)，使用DEPDC1-A01-10-188(SEQ ID NO:99)的孔#7中(p)，使用DEPDC1-A01-10-470(SEQ ID NO:101)的孔#6中(q)，使用DEPDC1-A01-10-456(SEQ ID NO:102)的孔#6中(r)，使用DEPDC1-A01-10-679(SEQ ID NO:103)的孔#4中(s)，使用DEPDC1-A01-10-341(SEQ ID NO:104)的孔#2中(t)，使用DEPDC1-A01-10-183(SEQ ID NO:106)的孔#3中(u)，使用DEPDC1-A01-10-286(SEQ ID NO:107)的孔#3中(v)，和使用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)的孔#8中(w)的CTLs中显示出强的IFN-gamma产生。在这些照片中，孔上的正方形显示繁殖来自相应孔的细胞用于建立CTL系。相反，DEPDC1-A01-10-780(SEQ ID NO:94)(x)显示为其中没有特异性IFN-gamma产生的典型阴性数据的实例。图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。
图5-2显示了图5-1的继续(照片(m)至(x))。
图6的线形图显示了IFN-gamma ELISA的结果，证实了用DEPDC1-A01-11-44(SEQID NO:108)刺激的CTL系中IFN-gamma产生。该结果证实了与对照相比通过用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)刺激所建立的CTL系显示出强的IFN-gamma产生。图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图7的线形图显示了通过用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)刺激的CTL系的有限稀释建立的CTL克隆中的IFN-gamma产生。该结果证实了与对照相比，通过用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)刺激所建立的CTL克隆显示出强的IFN-gamma生产。图中，“+”表示针对用合适的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma生产；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma生产。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图8的线形图显示了针对表达DEPDC1和HLA-A*0101两者的靶细胞的特异性CTL活性。制备了用HLA-A*0101或全长DEPDC1基因转化的COS7细胞用作对照。用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)建立的CTL克隆表现出针对用DEPDC1和HLA-A*0101两者转染的COS7细胞的特异性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，未显示出针对用HLA-A*0101(白色三角形)或DEPDC1(白色圆圈)之一转染的靶细胞的显著的特异性CTL活性。
具体实施方式
具体实施方式的说明
尽管在实施或检验本发明的实施方案中可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法、装置和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，应当理解，本发明不限于本文所描述的特定大小，形状，尺度，材料，方法学，方案等，因为这些可以根据常规实验和优化改变。还应当理解，本说明书中使用的术语仅用于描述特定版本或实施方案的目的，并且不旨在限定本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
I.定义
除非另有明确说明，如本文中使用的词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”。
术语“分离的”和“纯化的”与物质(例如肽、抗体、多核苷酸等)相关使用时，指该物质基本上不含至少一种可以包括在天然来源中的物质。因此，分离的或纯化的肽指基本上不含另一种细胞材料，例如来自所述肽的细胞或组织来源的碳水化合物、脂质或其它污染性蛋白质。当化学合成肽时，分离或纯化的肽是指基本上不含有前体物质或另一种化学物质的肽。短语“基本上不含细胞物质”包括肽制备物，其中所述肽与分离出该肽的或重组产生该肽的细胞的细胞组分是分离的。如此，基本上不含细胞材料的肽包括肽制备物，其含有小于约30％,20％,10％,或5％,3％,2％或1％(以干重计)的其它细胞材料。
当肽以重组方式生成时，分离或纯化的肽基本上不含有培养基，其包含肽制备物，所述肽制备物含有小于肽制备物体积的约20％,10％,或5％,或3％,2％或1％(以干重计)的培养基。
或者，当化学合成肽时，分离或纯化的肽基本上不含有前体物质或其它化学物质，并且所述基本上不含前体物质或其它化学物质的肽含有肽制备物，所述肽制备物包含小于约30％,20％,10％,5％,3％,2％或1％(以干重计)肽制备物体积的前体物质或其它化学物质。可以通过例如在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色或此类凝胶之后出现单一条带来确认肽制备物是分离的或纯化的。在优选的实施方案中，本发明的肽和多核苷酸是分离的或纯化的。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，并指氨基酸残基的聚合物。除天然存在的氨基酸聚合物外，这些术语也适用于非天然存在的氨基酸聚合物，其包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括氨基酸类似物，氨基酸模拟物，以及此类。
本文所用的术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在氨基酸是细胞中那些通过遗传密码编码的，以及那些翻译后修饰的(例如羟脯氨酸，gamma-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸等)。短语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(与氢结合的alpha碳，羧基，氨基和R基团)但具有修饰的R基团或修饰的骨架的化学化合物(如，高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍等)。短语“氨基酸模拟物”是指与一般氨基酸具有不同结构但具有相似功能的化合物。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸，并且本发明的肽优选是L-氨基酸聚合物。
术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指核苷酸的聚合物。
本说明书中使用的术语“组合物”旨在包括包含指定量的指定成分的产品，以及直接或间接由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。当组合物是药物组合物时，术语“组合物”旨在包括活性成分和惰性成分的产品，以及从任何两种或多种成分的组合，络合或聚集，从一种或多种成分的离解，或从一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产品。因此，本发明的药物组合物包括通过将本发明的化合物或细胞与药学上或生理学上可接受的载体混合而制备的任何组合物。不限于此，本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂和包封材料；并且是指药学或生理学上可接受的材料，组合物，物质或介质。
除非另有说明，术语“癌症”是指过表达DEPDC1基因的癌症；且其实例包括膀胱癌，乳腺癌，***，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，大肠癌，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，淋巴癌，骨肉瘤，***癌，小细胞肺癌(SCLC)，软组织瘤等,但不限于此。在示例性实施方案中，“癌症”是表达DEPDC1和HLA-A11和/或HLA-A01的癌症。
除非另有说明，术语“细胞毒性T淋巴细胞”和“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用。除非另有明确说明，它们是指可识别非自身细胞(例如肿瘤/癌细胞，病毒感染的细胞)并诱导此类细胞的死亡的T淋巴细胞亚群。
除非另有说明，术语“HLA-A11”是指包括诸如HLA-A*1101,HLA-A*1102,HLA-A*1103,和HLA-A*1104的亚型的HLA-A11型。
除非另有说明，术语“HLA-A01”是指包括诸如HLA-A*0101,HLA-A*0102,HLA-A*0103,和HLA-A*0104亚型的HLA-A01型。
在受试者或患者的语境中，短语“受试者(或患者)的HLA抗原是HLA-A11”是指受试者或患者具有纯合或杂合的HLA-A11抗原基因作为MHC(主要组织相容性复合物)I类分子,并且HLA-A11抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。类似地，本文所用的短语“受试者(或患者)的HLA抗原是HLA-A01”指受试者或患者具有纯合或杂合的HLA-A01抗原基因作为MHC(主要组织相容性复合物)I类分子，且HLA-A01抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。
只要本发明的方法和组合物在癌症“治疗”的语境中是有用的，则当其实现临床优势时，该治疗被认为是“有效的”，例如，在受试者中减少癌症的尺寸，扩散或转移能力，延缓癌症进展，减轻癌症的临床症状，延长存活期，抑制术后复发。当预防性地施用治疗时，“有效”是指治疗延迟或防止癌症形成，或防止或减轻癌症的临床症状。有效性是相对于任何公知的用于诊断或治疗特定肿瘤类型的方法来确定的。
只要本发明的方法和组合物用于癌症“预防(防范)”的语境中，本文中术语“预防(防范)”包括减轻与癌症相关的死亡率或发病率的负担的任何工作。预防(防范)可以在“初级，二级和三级预防(防范)水平”进行。尽管一级预防(防范)避免疾病的发展，在二级和三级水平的预防(防范)包括预防(防范)疾病进展和症状的出现，以及旨在通过恢复功能和减少疾病相关并发症来降低现有疾病的不良影响。或者，预防(防范)可以包括减轻特定病症的严重性，例如旨在减少肿瘤生长和转移的广泛的预防性治疗。
在本发明的语境中，癌症的治疗和/或预防(防范)和/或其手术后复发预防(防范)包括任一事件，例如抑制癌细胞增殖，肿瘤退化或消退，诱导癌症发展的缓解和抑制，肿瘤消退，以及减少或抑制转移，抑制癌症的术后复发和延长存活期。癌症的有效治疗和/或预防(防范)降低死亡率，改善患有癌症的个体的预后，降低肿瘤标志物的血液水平，并减轻与癌症相关的可检测的症状。例如，症状的缓解或改善构成有效的治疗和/或预防(防范)，并包括其中症状稳定或减轻10％,20％,30％或更多的病患。
在本发明的语境中，术语“抗体”是指与指定的蛋白质或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体，灵长类化抗体，嵌合抗体，双特异性抗体，人源化抗体，与其他蛋白或放射性标记融合的抗体，和抗体片段。此外，本文中的“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖完整单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体，由两个或多个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示所需的生物学活性。“抗体”可以是所有类别的抗体(例如IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)。
除非另有说明，本文使用的技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的术语相同的含义。
II.肽
HLA-A11是亚洲人常见的等位基因(Sette A,Sidney J.,Immunogenetics 1999,50:201-12)，且HLA-A01是在高加索人中常见的等位基因(Cao等人.,Hum Immunol 2001；62(9):1009-30)。因此，对于亚洲人或高加索人的大量群体，治疗表达DEPDC1的癌症的有效方法可以通过提供限制于HLA-A11或HLA-A01的DEPDC1衍生的CTL诱导肽来提供。因此本发明提供了DEPDC1衍生肽，其能够以HLA-A11-或HLA-A01限制性方式诱导CTL。
本发明的肽是DEPDC1衍生肽，其能够以HLA-A11-或HLA-A01限制性方式诱导CTL。能够以HLA-A11限制性方式诱导CTL的肽包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽。能够以HLA-A01限制性方式诱导CTL的肽包括具有选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽。
具有对这些肽特异的细胞毒性活性的CTLs可以通过用这些肽冲击(pulsed)的树突细胞(DC)对T细胞体外刺激来建立。建立的CTLs显示出针对用每种肽冲击的靶细胞的特异性细胞毒性活性。
DEPDC1基因在癌症细胞中过表达，例如在膀胱癌，乳腺癌，***，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，大肠癌，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，淋巴癌，骨肉瘤，***癌，小细胞肺癌(SCLC)，软组织瘤等中的癌细胞中，但在大多数正常器官中不表达。因此它是免疫治疗的极好的靶标。因此，本发明的肽可以适合用于癌症免疫治疗。优选的肽是九肽(由9个氨基酸残基组成的肽)，十肽(由10个氨基酸残基组成的肽)，或十一肽(由11个氨基酸残基组成的肽)，并且更为优选的是由选自以下氨基酸序列组成的组的肽：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108。例如具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽适于诱导显示针对表达HLA-A11和DEPDC1细胞的特异细胞毒性活性的CTL，并可以适合用于HLA-A11阳性患者的癌症免疫治疗。在更优选的实施方案中，本发明的肽是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽。或者，例如，具有选自SEQID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽适于诱导显示出针对表达HLA-A01和DEPDC1的细胞的特异性细胞毒性活性的CTL，并且可以适合用于针对HLA-A01-阳性患者的癌症免疫疗法。在更优选的实施方案中，本发明的肽是由SEQ ID NO:108的氨基酸序列组成的肽。
对于本发明的肽，可以值得另外的氨基酸残基以附加(adjoin)本发明的肽的氨基酸序列，只要得到的肽保留原始肽的CTL诱导能力即可。另外的氨基酸残基可以由任何类型的氨基酸组成，只要它们不损害原始肽的CTL诱导能力即可。另外的氨基酸残基可以由任何类型的氨基酸组成，只要它们不损害原始肽的CTL诱导能力即可。因此，本发明的肽包含具有CTL诱导能力的肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108。此类肽例如少于约40个氨基酸，在许多情况下少于约20个氨基酸，并通常少于约15个氨基酸。因此，如果原始肽是九肽，则本发明的肽包含10个氨基酸长或11-40个氨基酸长的肽，其通过将另外的氨基酸附加至所述肽产生。此外，如果原始肽是十肽，则本发明的肽包含11-40个氨基酸长的肽。另外，如果原始肽是十一肽，则本发明的肽包含12-40个氨基酸长的肽。此类肽可以是(例如)11-20个氨基酸长的肽或11-15个氨基酸长的肽。另外的氨基酸残基的优选实例为在DEPDC1的全长氨基酸序列中邻接本发明的肽的氨基酸序列的氨基酸残基(例如SEQ ID NO:114或116)。因此，本发明的肽包括含有选自以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108，且其中所述肽是DEPDC1的肽片段并具有CTL诱导活性。
一般而言，某些肽中一个，两个或更多个氨基酸的修饰不会影响肽的功能，或在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中一个、两个或数个氨基酸残基修饰(即取代、添加、缺失和/或***)的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark等人.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81:5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10:6487-500；Dalbadie-McFarland等人.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽可以是包含以下氨基酸序列的肽，其选自SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的一个，两个或数个氨基酸残基被取代，缺失，***和/或添加，并具有CTL诱导活性。
本领域技术人员可以认识到对氨基酸序列的个别取代(其改变了单个氨基酸或少数百分比的氨基酸)倾向于导致原始氨基酸侧链的特性的保留。其通常被称作“保守取代”或“保守修饰”；且通过“保守取代”或“保守修饰”对蛋白质的修饰可以导致修饰的蛋白具有与原蛋白相似的功能。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。功能上相似的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A,I,L,M,F,P,W,Y,V)、亲水性氨基酸(R,D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T)、和具有以下共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G,A,V,L,I,P)；含羟基侧链(S,T,Y)；含硫原子侧链(C,M)；含羧酸和酰胺侧链(D,N,E,Q)；含碱侧链(R,K,H)；和含芳香侧链(H,F,Y,W)。另外，以下八组各自含有本领域认可互为保守替代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins 1984)。
此类保守修饰肽也被包含在本发明的肽中。然而，本发明的肽不限于此，并可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不排除衍生自DEPDC1的多态性变体、种间同源物、和等位基因的可诱导CTL的肽。
只要肽保留原始肽的CTL诱导能力，可以修饰(即取代，缺失，***和/或添加)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指5个以下的氨基酸，如4个或3个或更少。被修饰的氨基酸的百分比优选为20％或更少，更优选15％或更少，进一步更优选10％或更少，例如1至5％。
当在癌症免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应当呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选的是本发明的肽拥有对HLA抗原的高结合亲和力。为此目的，可以对肽通过取代、缺失、***和/或添加氨基酸残基来修饰以产生具有改善结合亲和力的修饰肽。由于通过结合HLA抗原而被展示的肽的序列规律是已知的(Falk,等人,Immunogenetics 1994 40 232-41；Chujoh,等人,Tissue Antigens 1998:52:501-9；Takiguchi,等人,Tissue Antigens 2000:55:296-302.)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的肽。
例如，在具有对HLA I类分子具有结合亲和力的肽中，自N端起的第二个氨基酸和C末端氨基酸通常是参与结合至HLA I类的锚定残基(Rammensee HG,等人,Immunogenetics.1995；41(4):178-228.)。例如，对于HLA-A11，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸作为N末端的第二个氨基酸，赖氨酸和精氨酸作为C末端氨基酸被认为是对HLA-A11具有高结合亲和力的锚定残基(Falk,等人,Immunogenetics 1994,40:232-41；Chujoh,等人,Tissue Antigens 1998:52:501-9)。
此外，在HLA-A11中，在N末端的3和7位有辅助锚定残基；并且已知亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸和丙氨酸优选作为从N末端开始的第三个氨基酸，且亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸和苯丙氨酸优选作为从N末端开始的第七个氨基酸(Falk,等人,Immunogenetics 1994,40:232-41；Chujoh,等人,Tissue Antigens 1998:52:501-9)。因此，为了增强HLA-A11结合亲和力，有可能期望用苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸取代自N端起的第二个氨基酸，和/或用赖氨酸或精氨酸取代C末端的氨基酸。此外，还可能需要用亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸取代自N端起的第三个氨基酸，和/或用亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸取代自N端起的第七个氨基酸。因此，本发明的肽包含具有CTL诱导能力的包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽，其中在选自自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸；自N端起的第三个氨基酸被取代为亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸；自N端起的第七个氨基酸被取代为亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸；和/或用赖氨酸或精氨酸取代C末端的氨基酸。在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的肽，所述肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，该序列中自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸；自N端起的第三个氨基酸被取代为亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸；自N端起的第七个氨基酸被取代为亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸；和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。
即，本发明的肽包含具有CTL诱导能力的肽，其中将选自以下(a)至(d)的一个或多个取代引入SEQ ID NO:1的氨基酸序列中：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，或酪氨酸；
(b)自N端起的第三个氨基酸被取代为亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸；
(c)自N端起的第七个氨基酸被取代为亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸；和
(d)C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。
在优选的实施方式中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸组成的肽，其中将选自以上(a)至(d)的一个或多个取代引入SEQ ID NO:1的氨基酸序列中。在本发明中，优选的取代数目是选自以上(a)至(d)的1,2,3或4个取代。
本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的肽，其包含以下氨基酸序列，其中在SEQ IDNO:1的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。优选地，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的肽，其由以下氨基酸序列组成，其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。
即，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列肽，其中将选自以下(a)和(b)的一个或多个取代引入SEQ ID NO:1的氨基酸序列中：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，或酪氨酸；和
(b)C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中将选自以上(a)至(b)的一个或多个取代引入SEQ ID NO:1的氨基酸序列中。在更优选的实施方案中，自N端起的第二个氨基酸被苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或亮氨酸取代。
在HLA-A01中，对于自N端起的第三个氨基酸的天冬氨酸和谷氨酸，和对于C末端氨基酸的酪氨酸已知是对HLA-A01具有高结合亲和力的锚定残基。此外，已知在HLA-A01的自N端起的2位有辅助性锚定残基，以及已知苏氨酸和丝氨酸优选作为自N端起的第二个氨基酸(Kubo,R.T Journal of Immunology 1994,152:3913；Gambacorti-Passerini,C.ClinicalCancer Research 1997,3:675-83；Falk,K.Immunogenetics 1994,40:238-41)。因此，为了维持或增强HLA-A01结合亲和力，有可能需要用天冬氨酸或谷氨酸取代自N端起的第三个氨基酸，和/或用酪氨酸取代C-末端氨基酸。另一种可能性是需要用苏氨酸或丝氨酸取代自N端起的第二个氨基酸。因此，具有CTL诱导能力的包含以下氨基酸序列的肽包括在本发明的肽中：其中在选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸或丝氨酸，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸或丝氨酸，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。即，本发明的肽包括具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包含引入选自81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列中的选自以下(a)至(c)的一个或多个取代：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸或丝氨酸；
(b)自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；和
(c)C末端氨基酸被取代为酪氨酸(然而，在C末端包含酪氨酸的SEQ ID NOs:82,21,86,87,90,91,58,92,96,99,103,107,和108被排除在进行(c)的取代之外)。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列包含引入选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列中的以上(a)至(c)的一个或多个取代。在本发明中，优选的取代数目是选自以上(a)至(c)的1,2或3个取代。
此外，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中在选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列中，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。优选地，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108中，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。即，本发明的肽包括具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包含引入选自1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列中的选自以下(a)和(b)的一个或多个取代：
(a)自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；和
(b)C末端氨基酸被取代为酪氨酸(然而，在C末端包含酪氨酸的SEQ ID NOs:82,21,86,87,90,91,58,92,96,99,103,107,和108被排除在进行(c)的取代之外)。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列包含引入选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列中的选自以上(a)和(b)的一个或多个取代。
不仅可以在锚定位点处引入氨基酸取代，而且可以在肽的潜在T细胞受体(TCR)识别位置处引入取代。数项研究已证明了具有氨基酸取代的肽可等同于或好于原来功能的功能，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba等人.Cancer Res.57,4570-4577,1997,T.K.Hoffmann等人.J Immunol.(2002)；168(3):1338-47.,S.O.Dionne等人.Cancer Immunol immunother.(2003)52:199-206及S.O.Dionne等人.CancerImmunology,Immunotherapy(2004)53,307-314)。
本发明还考虑也可以向本发明的肽(例如,由选自以下氨基酸序列组成的肽：SEQID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108)的N末端和/或C末端添加1个、2个或数个氨基酸。更具体地，本发明提供了由氨基酸组成的肽，其中在SEQ ID NO各自所示的氨基酸序列N末端和C末端的任一个或两者添加一个、两个或数个氨基酸。此类保留CTL诱导能力的修饰肽也包括在本发明中。例如，当肽与APC接触时(其中在由SEQ ID NO:1或108的氨基酸序列组成的肽的N末端和/或C末端添加一个，两个或数个氨基酸时)，其掺入APC中并加工成由SEQ ID NO:1或108的氨基酸序列组成的肽。然后其可以通过经由抗原呈递途径呈递在APC的细胞表面上诱导CTL。更具体地，本发明的肽可以是其中在N末端和C末端的任一个或两者上添加一个，两个或数个氨基酸的肽。
此外，在本发明的另一个实施方案中，提供了由氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列在在SEQ ID NO各自所示的氨基酸序列中包含一个、两个或数个氨基酸取代，且其中将一个、两个或数个氨基酸添加到这些取代的氨基酸序列的N末端和C末端的任一个或两者。当本发明的肽包含氨基酸取代时，期望的取代位置例如可以是包含在本发明的肽中的由SEQ ID NO各自所示的的氨基酸序列中的选自以下的一个、两个、三个或四个位置：从N末端的第2个位置、从N末端的第3个位置，从N末端的第7个位置，以及C末端的位置。
然而，当肽的氨基酸序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可以诱导针对特定物质的自身免疫性疾病和/或过敏性症状等副作用。因此，优选使用可用的数据库进行同源性搜索，以避免肽的氨基酸序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了不存在与目标肽相比仅有1个或2个氨基酸差异的肽时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任何发生此类副作用的危险。
预测其中本发明的肽的一个，两个或数个氨基酸被修饰的肽能够保留原始肽的CTL诱导能力；然而优选验证修饰肽的CTL诱导能力。这里，“具有CTL诱导能力(CTL可诱导性(CTL inducibility))的肽”指肽，其通过用肽刺激的APC诱导CTLs。“CTL诱导”包括诱导分化成CTL，诱导CTL激活，诱导CTL增殖，诱导CTL的细胞毒活性，诱导CTL介导的靶细胞溶解，和诱导CTL的IFN-gamma产生增加。
CTL诱导能力的可通过如下来确认：用肽刺激表达感兴趣的HLA抗原的APC(例如B淋巴细胞，巨噬细胞或树突细胞)并将其与CD8阳性细胞混合；然后测量由CTL针对靶细胞所释放的IFN-gamma。对于APCs，可以优选使用人外周血单核细胞来源的树突细胞。作为反应***，可使用已经制成以表达HLA抗原的转基因动物。或者，例如可以用51Cr或此类放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算肽-诱导的CTLs的细胞毒性活性。或者，在肽刺激的APCs的存在下，可能通过以下评估CTL诱导能力：测量由CTLs生成和释放的IFN-gamma，并使用抗IFN-gamma单克隆抗体显现培养基上的抑制区。
除上述的修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它肽，只要所得的连接肽保留CTL诱导能力。与本发明的肽连接的适当肽的例子包括衍生自其它肿瘤相关抗原的CTL诱导肽。此外，本发明的肽也可以彼此连接。用于连接肽的合适的接头是本领域已知的，例如可以使用接头，如AAY(P.M.Daftarian等人,J Trans Med 2007,5:26),AAA,NKRK(SEQ ID NO:117)(R.P.M.Sutmuller等人,J Immunol.2000,165:7308-15)，或K(S.Ota等人,Can Res.62,1471-6,K.S.Kawamura等人,J Immunol.2002,168:5709-15)。肽可以以各种排列连接(例如，链状，重复等)，并且还可以连接三个或更多个肽。
本发明的肽还可连接至其它物质，只要所得的连接肽保留CTL诱导能力。与本发明的肽连接的适当物质的例子包括，例如，肽、脂质、糖或糖链、乙酰基，和天然的或合成的聚合物。本发明的肽可以进行如下修饰：糖基化、侧链氧化、或磷酸化等等，只要不破坏它们的CTL诱导能力。还可以实施此种类型的修饰以赋予额外的功能(例如，靶向功能和递送功能)或稳定所述肽。
例如，为了提高肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明的肽。肽的稳定性可以以多种方式测定。例如，可以通过使用肽酶以及各种生物介质例如人血浆和血清来测试稳定性(参见例如Verhoef等人,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302)。
此外，如上文所述，在上述取代、缺失、***和/或添加了1个、2个或数个氨基酸残基的修饰肽中，可以筛选或选择与原始肽相比活性相同或更高者。因此，本发明还提供由于筛选或选择与原始肽相比活性相同或更高的修饰肽的方法。具体地，本发明提供了筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)产生由对原始氨基酸序列通过取代、缺失、***和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基而修饰得到的氨基酸序列组成的候选序列，其中所述原始氨基酸序列选自SEQ IDNos：1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与DEPDC1之外的任何已知人基因产物的肽均无显著同源性(或序列同源性)的候选序列；
(c)使由(b)中选择的候选序列组成的肽与APCs接触；
(d)使(c)的APCs与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择具有与由原始氨基酸序列组成的肽相等或更高的CTL诱导能力的肽。
本文中，本发明的肽也被描述为“DEPDC1肽”。
III.本发明的肽的制备
本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，可以使用重组DNA技术或化学合成来制备本发明的肽。本发明的肽可独立地合成，或合成为包括两个或更多个肽的较长多肽。本发明的肽可以在使用重组DNA技术在宿主细胞中产生它们或者在化学合成它们之后从宿主细胞或合成反应产物分离。即，可以纯化或分离本发明的肽，以使其基本上不含其它宿主细胞蛋白质及其片段，或任何其它化学物质。
本发明的肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。其他示例性的修饰包括掺入一种或多种D-氨基酸或其他可用的氨基酸模拟物，以便例如增加肽的血清半寿期。
可以根据选定的氨基酸序列，通过化学合成来获得本发明的肽。可以适合于合成的常规肽合成方法的例子包括以下文献中描述的方法：
(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；
(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976；
(iii)“Peptide Synthesis”(in Japanese),Maruzen Co.,1975；
(iv)“Basics and Experiment of Peptide Synthesis”(in Japanese),MaruzenCo.,1985；
(v)“Development of Pharmaceuticals”(in Japanese),Continued Vol.14(peptide synthesis),Hirokawa,1991；
(vi)WO99/67288；和
(vii)Barany G.&Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,Solid Phase PeptideSynthesis,Academic Press,New York,1980,100-18。
或者，可适用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如MorrisonJ,J Bacteriology 1977,132:349-51；Clark-Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu等人)1983,101:347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转化入合适的宿主细胞。本发明还提供了此类载体和宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译***在体外生产本发明的肽。
IV.多核苷酸
本发明还提供编码任何本发明肽的多核苷酸。这些包括衍生自天然存在的DEPDC1基因(例如GenBank登录号NM_001114120(SEQ ID NO:113)或GenBank登录号NM_017779(SEQID NO:115))以及具有它们的保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。本文中，短语“保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或实质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也描述该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码肽的核酸的每一种沉默变异在每个公开的序列中隐含地描述。
本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。DNA由诸如A，T，C和G的碱基适当地组成，并且在RNA中T被U置换。
本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中有或无居间氨基酸序列(intervening amino acid sequence)。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。此外，多核苷酸可以包括编码本发明的肽的编码序列的任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(如质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。
重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过***在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成本发明的多核苷酸。或者，可使用PCR技术或在合适宿主中表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron 1992,48:2223-311；Matthes等人,EMBO J 1984,3:801-5中记载的。可根据需要来纯化能够以这种方式获得的几种肽的连接产物，并以该连接状态施用。在该情况下，连接的肽通过加工来产生可抗原呈递的肽并且引发每种肽的CTL诱导活性。因此，当连接肽时，优选组合具有相同HLA限制的肽。或者肽可以通过切割连接部分作为单个肽的混合物施用。
V.外来体(exosomes)
本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在JPH11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从作为治疗和/或预防(防范)对象的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。
上述复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防(防范)的受试者的类型匹配。例如，HLA-A11(例如HLA-A*1101)是在亚洲人群中广泛和普遍见到的等位基因，并且认为这些HLA抗原类型适合在亚洲患者中治疗。此外，HLA-A01(例如HLA-A*0101)是在白种人群体中广泛和普遍见到的等位基因，并且这些HLA抗原类型被认为适合在白种人患者中治疗。典型地，在临床上，通过预先研究需要治疗的患者的HLA抗原类型，可以选择合适的肽，其对特定HLA抗原具有高水平的结合亲和力，或者通过由特异性HLA抗原介导的抗原呈递的CTL诱导能力。
本发明的外来体在其表面上呈递本发明的肽与HLA-A11的复合物。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A11时，本发明的肽优选为具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选为由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽或其修饰的肽。
此外，当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A01时，本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列组成的肽或其修饰的肽。
VI.抗原呈递细胞(APC)
本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的APC。或者本发明提供了在其表面上具有在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的APC。本发明的APC可以是分离的APC。当在细胞(APC，CTL等)的语境中使用时，术语“分离的”意指细胞与另一类型的细胞分离。本发明的APC可以是从衍生自待经受治疗和/或预防(防范)的患者的APC诱导的APC，并且可以作为疫苗自身或与其他药物(包括本发明的肽，外来体或CTL)组合施用。
本发明的APCs不限于特定种类的细胞，并且可以是已知在其细胞表面呈递蛋白质性质的抗原的细胞以通过淋巴细胞(例如树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞)识别。由于DC是APCs中具有最强CTL诱导活性的代表性APC，可以优选使用DC作为本发明的APCs。本发明中，优选的DC是源自人的分离的DC。此外，本发明的APC可以是具有抗原呈递功能的多种类型的细胞的混合物，并且可以是APC的混合物，其中每种APC呈递不同类型的本发明的肽。
例如，可以通过从外周血单核细胞分离DC，然后在体外用本发明的肽刺激它们来获得本发明的APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。因此在将本发明的肽施用至受试者后，可以通过从受试者收集APC来获得本发明的APC。或者，可以通过使从受试者收集而来的APC与本发明的肽接触来获得本发明的APC。
为了在受试者中诱导针对表达DEPDC1的癌细胞的免疫应答，本发明的APC可以单独或者与其他药物(包括本发明的肽、外来体或CTL)组合施用给受试者。例如，离体施用可包括下述步骤：
(a)自第一受试者收集APC；
(b)使步骤(a)的APC接触本发明的肽；和
(c)对第二受试者施用步骤(b)的APC。
第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。当第一受试者和第二受试者是不同个体时，优选第一受试者和第二受试者的HLA是相同类型。获得自上述步骤(b)中的APC可以是用于癌症治疗和/或预防(防范)的疫苗。
获得自如上描述方法的本发明的APCs具有CTL诱导能力。用于APC的语境中的术语“CTL诱导能力(CTL可诱导性)”指APC与CD8阳性细胞接触时诱导CTL的能力。此外，“CTL诱导能力(CTL可诱导性)”包括APC诱导CTL活化的能力，APC诱导CTL增殖的能力，APC促进CTL介导的溶解靶细胞的能力，和APC提高CTL介导的IFN-gamma生成的能力。由本发明的APC所诱导的CTL是对DEPDC1特异性的CTL，并表现出对表达DEPDC1的细胞的特异性细胞毒活性。
除了上述方法之外，可以通过在体外将编码本发明肽的多核苷酸导入至APCs来制备本发明的APCs。待导入的多核苷酸可以是DNA或RNA的形式。导入的方法并不特别限制，且其例子包括本领域中常规实施的各种方法，例如脂质体转染、电穿孔和磷酸钙法。更具体的说，可以使用描述于Cancer Res 1996,56:5672-7；J Immunol 1998,161:5607-13；J ExpMed 1996,184:465-72,和JP2000-509281中的方法。通过将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC，多核苷酸在细胞中转录并翻译，然后产生的肽被MHC I类加工并通过呈递途径以将本发明的肽呈递在APC的细胞表面上。
在优选的实施方案中，本发明的APC在其细胞表面上呈递本发明的肽和以下形成的复合物：HLA-A11(更优选地HLA-A*1101)或HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A11时，本发明的肽优选为具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A01时，本发明的肽优选为选自具有SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列组成的肽。
本发明的APC优选是通过包括下述(a)或(b)的步骤的方法诱导的APC：
(a)将APC与本发明的肽接触，所述APC表达至少一种选自HLA-A11(更优选地HLA-A*1101)和HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)的HLA；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC，所述APC表达至少一种选自HLA-A11(更优选地HLA-A*1101)和HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)的HLA。
与表达HLA-A11的APC接触的本发明的肽优选是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽。
与表达HLA-A01的APC接触的本发明的肽优选是选自具有SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选选自由SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列组成的肽。
本发明提供了本发明的肽用于制备诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的用途。另外，本发明提供了制备诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的方法或过程。进一步地，本发明提供了用于诱导具有CTL诱导能力的APC的本发明的肽。
VII.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
由本发明的肽诱导的CTL可以与本发明的肽相似的方式用作疫苗用于在体内增强靶向表达DEPDC1的细胞的免疫应答。因此本发明提供了CTLs，其通过本发明的肽诱导或活化。本发明的CTLs是靶向本发明肽的CTLs，并且能够结合至本发明的肽和HLA抗原的复合物。CTL与所述复合物的结合是经由存在于CTL的细胞表面的T细胞受体(TCR)介导的。本发明的CTL可以是分离的CTL。优选的CTL是分离的人源CTL。本发明的CTL可以是CTL的混合物，其各自靶向不同类型的本发明肽。
本发明的CTL可以获得自(1)向受试者施用本发明的肽，(2)体外用本发明的肽刺激衍生自受试者的APC和CD8阳性T细胞，或外周血单核细胞(PBMC)，(3)体外将CD8阳性T细胞或PBMC与APC或外来体接触，所述APC或外来体在它们的表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物，或(4)将包含编码每种T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳性T细胞，所述TCR能够结合由细胞表面上HLA抗原所呈递的本发明的肽。用于上文(2)或(3)方法的外来体和APCs可以分别通过“V.外来体”和“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分中描述的方法制备，且上文(4)的方法的详情将在“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中描述。
本发明的CTLs可以单独施用至经受治疗和/或预防(防范)的患者，或与其他药物(包括本发明的肽、APC或外来体)组合施用以用于调节效果的目的。进一步地，本发明的CTLs可以是诱导自CD8阳性T细胞的CTLs，所述CD8阳性T细胞衍生自经受施用CTLs的患者。本发明的CTLs特异性作用于呈递本发明肽的靶细胞，例如，用于诱导本发明CTLs的相同的肽。靶细胞可以是内源表达DEPDC1的细胞，如癌细胞，或用DEPDC1基因转染的细胞。因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可成为本发明CTLs的攻击靶标。本发明的CTL靶向的细胞优选为对于HLA-A11(更优选地HLA-A*1101)和HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)中的至少一种为阳性的细胞。
在优选的实施方案中，本发明的CTLs特异性靶向表达DEPDC1和选自HLA-A11(更优选地HLA-A*1101)和HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)中至少一种的HLA的细胞。在本发明中，被CTLs靶向的细胞可以是纯合或杂合地具有HLA-A11和HLA-A01的等位基因的任一种的细胞。
本文中，CTL“靶向”细胞指CTL对在其细胞表面上呈递HLA和本发明肽的复合物的细胞的识别，和表现出对该细胞的细胞毒性活性。进一步地，“特异性靶向”指CTLs表现出对这些细胞的细胞毒性活性，但未显示对其他细胞的破坏活性。在CTL的语境中使用的表述“识别细胞”指经由其TCR结合至呈递在细胞表面的HLA和本发明的肽的复合物，并表现出对该细胞的特异性细胞毒性活性。因此，本发明的CTLs优选为能够经由TCR结合至呈递在细胞表面上的复合物的CTL，所述复合物在本发明的肽和HLA-A11(更优选地HLA-A*1101)或HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)之间形成。
此外，本发明的CTLs优选是通过包括以下(a)或(b)中所述步骤的方法诱导的CTL：
(a)体外将CD8阳性T细胞与在其表面上呈递复合物的APCs或外来体接触，所述复合物为本发明的肽和HLA-A11(更优选地HLA-A*1101)或HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)的复合物；或
(b)将包含编码每种TCR的亚基的多核苷酸导入CD8阳性T细胞，所述TCR能够结合通过HLA-A11(更优选地HLA-A*1101)或HLA-A01(更优选地HLA-A*0101)呈递在细胞表面的本发明的肽。通过该方法有道的CTL是具有特异性识别用于诱导的肽和HLA抗原的复合物的TCR的细胞。因此，它们是具有不同于其它CTL的结构差异的细胞，所述其它CTL由于TCR结构的差异具有不同的反应特异性。
VIII.T细胞受体(TCR)
本发明还提供组合物以及使用该组合物的方法，所述组合物包含编码每种TCR亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合通过HLA抗原呈递在细胞表面的本发明的肽。所述多核苷酸赋予CD8阳性T细胞针对表达DEPDC1的癌细胞的特异性，这是通过表达能够结合通过HLA抗原呈递在细胞表面的本发明的肽的TCR实现的。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出通过本发明的肽诱导的CTL中编码TCR亚基的alpha和beta链的多核苷酸(WO2007/032255及Morgan等人,J Immunol,171,3288(2003))。例如，优选PCR方法用于TCR分析。不限于此，用于分析的PCR引物可以是(例如)通过组合以下5'侧引物和3'侧引物的用于扩增的引物组：
5’侧引物:
5’-R引物(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID NO:109)
3’侧引物:
TCR-alpha-链C-区-特异性
3-TRa-C引物(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(SEQ ID NO:110)
TCR-beta-链C1-区-特异性
3-TRb-C1引物(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(SEQ ID NO:111)或TCR-beta-链C2-区-特异性
3-TR-beta-C2引物(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(SEQ ID NO:112)
通过将鉴定的多核苷酸导入CD8阳性T细胞而形成的TCRs能够以高亲合力结合呈递本发明的肽的靶细胞，并在体内和体外介导针对呈递本发明的肽的靶细胞的高效杀伤。
可以将编码每种TCR亚基的多核苷酸掺入合适的载体，例如逆转录病毒载体中。这些载体是本领域公知的。可以将所述多核苷酸或者包含它们的载体导入CD8阳性T细胞，例如衍生自患者的CD8阳性T细胞。本发明提供一种即配即用型组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或衍生自其他受试者的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。
本文中，特异性TCR是当TCR呈递于CD8阳性T细胞的表面上时，能够通过特异性识别呈递在靶细胞表面上的本发明的肽和HLA抗原的复合物,赋予针对靶细胞特异性细胞毒活性的TCR。上述复合物的特异性识别可以通过任何已知方法来确认，并且其优选的例子包括使用HLA分子和本发明的肽的HLA多聚体染色分析，和ELISPOT测定方法。通过实施ELISPOT测定法，可以确认由导入有上述多核苷酸的T细胞和细胞内信号转导的靶细胞的特异的TCR介导的识别。当上述TCR呈递于CD8阳性T细胞表面上时，也可以通过已知方法确认TCR是否能够赋予针对CD8阳性T细胞的靶细胞特异性细胞毒性活性。优选的方法包括例如通过铬释放测定法等测定针对HLA阳性靶细胞的细胞毒性活性。
在HLA-A11的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基(其例如结合由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽和HLA-A11抗原形成的复合物)的多核苷酸转化CD8阳性T细胞制备来CTL。
在HLA-A01的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基(其例如结合由具有选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽和HLA-A01抗原形成的复合物)的多核苷酸转化CD8阳性T细胞制备来CTL。
经转化的CTLs在体内能够归巢(homing)(从血液至淋巴组织的淋巴细胞移位(translocation))，并且可以利用公知的体外培养方法扩增(例如Kawakami等人,JImmunol.,142,3452-3461(1989))。可以利用本发明的CTLs来形成免疫原性组合物，所述组合物有用于在需要治疗和/或预防(防范)的患者中的疾病治疗或预防(防范)(对于参考文献WO2006/031221，其内容通过提述并入本文)。
IX.药物组合物
本发明还提供了组合物或药物组合物，包含选自以下的至少一种活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物可以根据需要包含载体，赋形剂或通常用于药物中的此类而没有特别限制。可用于本发明的药物组合物中的载体的例子包括无菌水，生理盐水，磷酸盐缓冲液，培养液等。因此，本发明还提供了药物组合物，包含选自以下(a)至(e)的至少一种活性成分和药学上可接受的载体：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
此外，本发明的药物组合物可以根据需要包含稳定剂，混悬剂，防腐剂，表面活性剂，增溶剂，pH调节剂，聚集抑制剂等。
与正常组织相比，癌细胞中DEPDC1表达显著上调。因此本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可以用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发。因此本发明提供了用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发的药物组合物，其包含作为活性成分的一种或多种类型的本发明的肽或多核苷酸。或者，可以制备本发明的肽以呈递在外来体或APCs的表面上用作为药物组合物的用途。此外，靶向任一种本发明肽的本发明的CTLs也可用作本发明药物组合物的活性成分。本发明的药物组合物可包含治疗有效量或药学有效量的上述活性成分。
本发明的药物组合物还可以用作疫苗。在本发明的语境中，术语“疫苗”(也称为“免疫原性组合物”)指当接种到动物时具有诱导导致抗肿瘤作用的免疫应答的功能的组合物。因此本发明的药物组合物可用于在受试者中诱导导致抗肿瘤作用的免疫应答。由本发明的肽，多核苷酸，APC，CTL和药物组合物诱导的免疫应答没有特别限制，只要其是导致抗肿瘤作用的免疫应答，并且例子包括诱导癌细胞特异的CTL和诱导癌细胞特异的细胞毒性活性。
本发明的药物组合物可用于在人类受试者或患者中治疗和/或预防的癌症，和/或预防其手术后复发。本发明的药物组合物可以优选用于对选自HLA-A11和HLA-A01中的至少一种HLA阳性的受试者。此外，本发明的药物组合物可优选用于治疗和/或预防表达DEPDC1和选自HLA-A11和HLA-A01的至少一种HLA的癌症和/或预防其术后复发。
在另一个实施方案中，本发明提供选自以下的活性成分在制备用于治疗或预防癌症的药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分，用于治疗或预防癌症：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供制备用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括用药学上或生理上可接受的载体配制至少一种选自以下活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明还提供了制备用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体混合的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了用于治疗或预防癌症的方法，其包括向受试者施用至少一种选自以下的活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明中，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A11限制性表位肽。因此，包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽的本发明的药物组合物特别适用于施用至具有HLA-A11(例如,HLA-A*1101)作为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)，呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽相关联的活性成分的药物组合物适合施用于具有HLA-A11的受试者(即HLA-A11阳性受试者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽的药物组合物。
类似地，在本发明中，具有选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A01限制性表位肽。因此，包含至少一种具有选自SEQ IDNOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的这些肽的本发明的药物组合物特别适用于施用至具有HLA-A01(例如,HLA-A*0101)作为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)，呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽相关联的活性成分的药物组合物适合施用于具有HLA-A01的受试者(即HLA-A01阳性受试者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含具有SEQ IDNO:108的氨基酸序列的肽的药物组合物。
通过本发明的药物组合物治疗和/或预防的癌症没有特别限制，只要它们是表达DEPDC1的癌症，并包含膀胱癌，乳腺癌，***，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，大肠癌，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，淋巴癌，骨肉瘤，***癌，小细胞肺癌(SCLC)，软组织瘤等。本发明中优选的癌症是纯合地或杂合地具有选自HLA-A11和HLA-A01的HLA等位基因的癌症。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物可以包含具有诱导针对癌细胞的CTL的能力的其他肽(例如，其它TAA衍生的CTL诱导肽)，编码其他肽的其他多核苷酸，呈递其他肽的其他细胞等。
本发明的药物组合物还可以任选地包含其它治疗物质作为活性成分，只要它们不抑制上述活性成分(例如本发明的肽)的抗肿瘤作用即可。例如，本发明的药物组合物可任选地包含抗炎组合物，镇痛药，化学治疗剂等。除了将其它治疗物质包括在本发明的药物组合物本身以外，还可以与一种或多种其它药物组合物顺序或同时施用本发明的药物组合物。本发明的药物组合物和其它药物组合物的剂量取决于例如所使用的药物组合物的类型和所治疗的疾病，以及施用时间安排(scheduling)和施用途径。
应当理解，考虑到制剂类型，除了本文明确提及的成分之外，本发明的药物组合物可以包含本领域常规的其它组分。
本发明还提供包含本发明的药物组合物的制品或试剂盒。本发明的制品或试剂盒可以包括容纳本发明的药物组合物的容器。适当的容器的例子包括瓶，小瓶或试管，但不限于此。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。标签可以附着于容器，并且可以在标签中描述本发明的药物组合物所应用的疾病或疾病状态。标签还可指明关于施用的指导等等。
除了容纳本发明的药物组合物的容器之外，优选地本发明的制品或试剂盒还可以任选包含容纳药学上可接受的稀释剂的第二容器。本发明的制品或试剂盒还可包括从商业立场和用户角度所需的其它材料，例如其它缓冲液，稀释剂，过滤器，注射针，注射器，和具有使用说明的包装插页。
根据需要，本发明的药物组合物可包装在药包或分配装置中提供，该药包或分配装置可装有一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，药包可包括例如金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配装置可附有施用说明书。
(1)包含肽作为活性成分的药物组合物
包含本发明的肽的药物组合物可以根据需要通过常规制剂方法配制。除了本发明的肽之外，本发明的药物组合物可以包含通常用于药物中的载体，赋形剂等，而没有特别限制。可用于本发明的药物组合物中的载体的例子包括灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，Tris缓冲盐水，0.3％甘氨酸，培养液，等等。此外，本发明的药物组合物可根据需要含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、增溶剂、pH调节剂、聚集抑制剂，等等。本发明的药物组合物可以诱导针对表达DEPDC1的癌细胞的特异性免疫，因此可以用于癌症治疗或预防(防范)的目的。
例如，可以通过以下制备本发明的药物组合物：在药学上或生理上可接受的水溶性载体中溶解，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水，并根据需要加入稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂，增溶剂，pH调节剂，聚集抑制剂等，然后灭菌肽溶液。对肽溶液进行灭菌的方法没有特别限定，优选通过过滤灭菌进行。过滤灭菌可以使用(例如)孔径为0.22μm或以下的过滤灭菌过滤器进行。过滤灭菌的肽溶液可以例如作为注射剂施用至受试者，但不限于此。
本发明的药物组合物可以通过冷冻干燥上述肽溶液制备为冷冻干燥制剂。冷冻干燥制剂可以通过以下制备：将如上所述制备的肽溶液装入适当的容器，如安瓿、小瓶或塑料容器中，随后冷冻干燥并用洗涤灭菌的橡胶塞等在压力回收之后包封入容器中。冷冻干燥制剂可以在其再溶解于药学上或生理学上可接受的水溶性载体后施用至受试者，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水等。本发明的药物组合物的优选实例包括此类过滤灭菌的肽溶液的注射物和由冻干该肽溶液所产生的冷冻干燥制剂。本发明还包括含有此类冷冻干燥制剂和再溶解溶液的试剂盒。本发明还包括容纳冷冻干燥制剂(其是本发明的药物组合物)的容器和容纳再溶解溶液的容器的试剂盒。
本发明的药物组合物可以包含两种或更多种类型的本发明肽的组合。肽的组合可以采取混合的肽的鸡尾酒形式，或可以使用标准技术彼此缀合。例如，可以将肽化学连接或表达成为单一融合多肽。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以从受试者分离APCs(例如DCs)，然后用本发明的肽刺激它们，来获得在其细胞表面上展示任何所述本发明肽的APC。将这些APC重新施用给受试者以在受试者中诱导CTLs，结果，可提高针对表达DEPDC1的癌细胞的攻击性。
本发明的药物组合物还可以包含已知用于有效建立细胞免疫的佐剂。佐剂是指当与抗原一起(或连续)施用时增强针对具有免疫学活性的抗原的免疫应答的化合物。可以使用描述于文献中的已知佐剂，例如Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89。合适佐剂的例子包括铝盐(磷酸铝，氢氧化铝，羟基氧化铝等),明矾,霍乱毒素,沙门氏菌毒素,IFA(不完全弗氏佐剂),CFA(完全弗氏佐剂),ISCOMatrix,GM-CSF和其他免疫刺激细胞因子，含有CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG7909等)，水包油乳液，皂苷或其衍生物(QS21等)，脂多糖例如脂质A或其衍生物(MPL,RC529,GLA,E6020等)，脂肽，乳铁蛋白，鞭毛蛋白，双链RNA或其衍生物(poli IC等)，细菌DNA，咪唑并喹啉(Imiquimod,R848等)，C型凝集素配体(海藻糖-6,6’-二山嵛酸/酯(TDB)等)，CD1d配体(alpha-半乳糖神经酰胺等)，角鲨烯乳液(MF59,AS03,AF03等),PLGA等，但不限于此。
在包含本发明的药物组合物的试剂盒中，佐剂可以包含在与包含本发明的肽的药物组合物分开的另一容器中。在这种情况下，佐剂和药物组合物可以连续地施用于受试者，或者在施用给受试者之前立即混合在一起。本发明还提供了包含含有本发明的肽药物组合物和佐剂的此类试剂盒。当本发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒还可以包含再溶解溶液。此外，本发明提供试剂盒，其包括容纳本发明的药物组合物的容器和存储佐剂的容器。试剂盒可以根据需要进一步包含储存再溶解溶液的容器。
当油佐剂用作佐剂时，本发明的药物组合物可以制备为乳液。例如，可以通过混合并搅拌如上所述制备的肽溶液和油佐剂来制备乳液。肽溶液可以是在冷冻干燥后再溶解的溶液。乳液可以是W/O型乳液和O/W型乳液，且W/O型乳液优选用于获得高免疫应答增强效果。IFA可优选用作油佐剂，但不限于此。乳剂的制备可以在施用受试者之前立即进行，且在这种情况下，本发明的药物组合物可以作为包含本发明的肽溶液和油性佐剂的试剂盒提供。当本发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒可以进一步包含再溶解溶液。
此外，本发明的药物组合物可以是其中包封了本发明肽的脂质体制剂、其中肽结合至具有几微米直径的珠子的颗粒配制剂，或其中脂质结合至肽的配制剂。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽还可以以药学上可接受的盐的形式施用。优选的盐的实例包括与碱金属(锂，钾，钠等)的盐，与碱土金属(钙，镁等)的盐，与其他金属(铜，铁，锌，锰等)的盐,与有机碱的盐,与胺的盐,与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸等等)的盐,和与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、硝酸等等)的盐。本文中所用的短语“药学上可接受的盐”是指保留所述化合物的药理学和药学上的有效性和性质的盐。因此，包含本发明的肽的药学上可接受的盐的药物组合物也包括在本发明内。此外，除了游离肽之外，“本发明的肽”还包括其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以进一步包括引发(prime)CTL的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的组分。例如，可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL响应的其他例子，大肠杆菌脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当与适宜的肽共价连接时，可用来引发CTL(参见例如Deres等人,Nature 1989,342:561-4)。
用于施用本发明的肽或药物组合物的合适方法的实例包括口服、皮内、皮下、肌肉内、骨内、腹膜内和静脉内注射，以及全身施用或局部施用至靶位点附近，但不限于此。优选的施用方法包括皮下注射到诸如腋窝或腹股沟的***附近。更具体地(例如)，当本发明的药物组合物包含作为活性成分的肽或外来体时，优选皮下施用。或者，可通过静脉注射等方式施用具有作为活性成分的APC或CTL的组合物。本发明的肽可以以治疗或药学有效量施用于受试者以治疗癌症，或以治疗或药学有效量以诱导针对表达DEPDC1的癌细胞的免疫(更具体地为CTLs)。本发明肽的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整。对于本发明的每种肽，剂量通常是0.001mg-1000mg,例如0.01mg-100mg，例如0.1mg-30mg，例如0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg。给药间隔可以是每几天至几个月一次，且例如，可以每周一次的间隔进行给药。本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量(dose)(剂量(dosage))。
在优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的肽和药学上或生理学上可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的肽，药学或生理学上可接受的载体和佐剂。本发明的药物组合物可以包含0.001mg-1000mg,优选0.01mg-100mg,更优选0.1mg-30mg，甚至更优选0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg的本发明的肽。当本发明的药物组合物是注射剂时，其可以包含以下浓度的本发明的肽：0.001mg/ml-1000mg/ml,优选0.01mg/ml-100mg/ml,更优选0.1mg/ml-30mg/ml,甚至更优选0.1mg/ml-10mg/ml,例如0.5mg/ml-5mg/ml。在这种情况下，例如，可以通过注射向受试者施用0.1至5ml,优选0.5ml至2ml的本发明的药物组合物。
此外，本发明提供了治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或本发明的药物组合物。如上所述，本发明的肽可以以通常为以下量的单一剂量施用于受试者：0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg,或例如,0.5mg-5mg。在优选的实施方案中，本发明的肽与佐剂一起施用于受试者。此外，给药间隔可以是每几天至几个月一次，优选每几天至每月一次，例如每周一次或每两周一次。
(2)含有多核苷酸作为活性成分的药物组合物
本发明的药物组合物也可含有以可表达的形式编码本发明公开的肽的多核苷酸。在本文中，短语“以可表达的形式”意味着多核苷酸在导入细胞时会表达作为本发明的肽。在示例性的实施方案中，本发明的多核苷酸的序列包括用于本发明的肽的表达所必需的调节元件。本发明的多核苷酸可具有为实现稳定***靶细胞的基因组所需的序列(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR&Capecchi MR,Cell 1987,51:503-12)。参见例如Wolff等人,Science 1990,247:1465-8；美国专利号5,580,859,5,589,466,5,804,566,5,739,118,5,736,524,5,679,647；和WO98/04720。基于DNA的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利号5,922,687)。
本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，诸如牛痘或禽痘。例如，可以使用牛痘病毒作为表达本发明的肽的载体。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利号4,722,848。另一种载体是BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG载体描述于Stover等人,Nature 1991,351:456-60。各种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体等等。参见例如Shata等人,Mol Med Today2000,6:66-71；Shedlock等人.,J Leukoc Biol 2000,68:793-806；Hipp等人.,In Vivo2000,14:571-85。
本发明的多核苷酸投递至患者中可以是直接的，在这种情况下患者可以直接暴露于携带本发明多核苷酸的载体，或者是间接的，在这种情况下首先在体外用携带本发明多核苷酸的载体转化细胞，然后将细胞移植入患者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。
关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel等人,Clinical Pharmacy 1993,12:488-505；Wu和Wu,Biotherapy 1991,3:87-95；Tolstoshev,Ann Rev PharmacolToxicol 1993,33:573-96；Mulligan,Science 1993,260:926-32；Morgan&Anderson,AnnRev Biochem 1993,62:191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5):155-215。在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY,1993；及Krieger,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990中描述了可应用于本发明的重组DNA技术领域的公知方法。
与肽的施用类似，多核苷酸的施用可以通过口服、皮内、皮下、静脉内、肌肉内、骨内、和/或腹膜内注射等等进行。施用可以是***施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明的多核苷酸可以以治疗或药学有效量施用于受试者，用于诱导针对表达DEPDC1的癌细胞的免疫(更具体地，CTL)，或以治疗或药学有效量用于治疗癌症。合适载体中的多核苷酸的剂量或使用编码本发明的肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等适当地调整，且通常是0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg,或例如0.5mg-5mg。给药间隔可以是每几天至几个月一次，例如，给药可以每周一次的间隔进行。本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量(dose)(剂量(dosage))。
X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法
本发明的肽和多核苷酸可用于诱导APCs和CTLs。也可以使用本发明的的外来体和APC来诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要其CTL诱导能力不被抑制。因此，可以使用包含本发明的任何肽，多核苷酸，APC和外来体的药物组合物来诱导本发明的CTL。此外，可以使用包含本发明的肽或多核苷酸的药物组合物来诱导本发明的APC。
(1)诱导APCs的方法
本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸诱导具有CTL诱导能力的APCs的方法。
本发明的方法包括在体外、离体或体内使APC与本发明的肽接触的步骤。例如，使APC与肽离体接触的方法可以包括以下步骤：
(a)从受试者收集APC；和
(b)使步骤(a)的APC与本发明的肽接触。
上述APC不限于特定种类的细胞，并且可以使用已知在其细胞表面上呈递蛋白质抗原以被淋巴细胞识别的细胞，例如DC，Langerhans细胞，巨噬细胞，B细胞，和活化的T细胞。DC在APC中具有最强的CTL诱导能力，因此优选使用DC。本发明的任何肽均可以单独或与本发明的其它肽组合使用。此外，本发明的肽可以与其它CTL诱导肽(例如，其它TAA衍生的CTL诱导肽)组合使用。
同时，当将本发明的肽施用给受试者时，APC在体内接触到所述肽，结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明的方法可包向受试者施用本发明的肽的步骤。类似地，当将可表达形式的本发明的多核苷酸施用于受试者时，本发明的肽在体内表达，表达的肽在体内与APCs接触，结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明还可以包括向受试者施用本发明的多核苷酸的步骤。
为了诱导具有CTL诱导能力的APC，本发明还包括将本发明的多核苷酸导入APC的步骤。例如，所述方法可以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APC；并
(b)将编码本发明肽的多核苷酸导入步骤(a)的APC。
步骤(b)可如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分中所述来实施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含以下步骤(a)或(b)：
(a)使APC与本发明的肽接触；并
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC中。
此外，本发明提供了制备具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含以下步骤(a)或(b)：
(a)使APCs与本发明的肽接触；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC中。
上述方法可以在体外、离体或体内实施，并优选在体外或离体实施它们。在上述方法中使用的APC可以衍生自计划施用诱导的APC的受试者，或者它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与计划施用的受试者不同的受试者(供体)的APC时，施用受试者和供体必须具有相同的HLA类型。
在本发明的方法中，当具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作本发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA类型优选为HLA-A11(更优选HLA-A*1101)。或者，在上述方法中使用的APC优选是表达HLA-A11(更优选HLA-A*1101)的APC。
类似地，当包含选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作本发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA类型优选为HLA-A01(更优选HLA-A*0101)。或者，在上述方法中使用的APCs优选是表达HLA-A01(更优选HLA-A*0101)的APCs。在通过特定重力离心法等从供体收集的血液中分离PBMC之后，可以使用已知方法从PBMC制备APC。
在另一个实施方案中，本发明还提供了包含本发明的肽或编码该肽的多核苷酸用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物。
或者，本发明还提供了本发明的肽或编码该肽的多核苷酸在制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物中的用途。
或者，本发明还提供本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸，用于诱导具有CTL诱导能力的APC。
或者，本发明进一步提供制备用于诱导APC的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将本发明的肽或本发明的多核苷酸与药学上或生理上可接受的载体进行配制的步骤。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将本发明的肽或本发明的多核苷酸与药学上或生理上可接受的载体相混合的步骤。
通过本发明的方法诱导的APC可诱导对DEPDC1特异性的CTL(即本发明的CTL)。
(2)诱导CTL的方法
本发明还提供了使用本发明的肽，多核苷酸，外来体或APC来诱导CTL的方法。本发明还提供了使用一种或多种编码能够形成T细胞受体(TCR)的多肽(即TCR亚基)的多核苷酸来诱导CTLs的方法，所述TCR能够识别本发明的肽和HLA抗原的复合物。优选地，诱导CTLs的方法包含选自以下至少一个步骤：
(a)使CD8阳性T细胞与抗原呈递细胞接触，所述抗原呈递细胞在其表面上呈递有HLA抗原与本发明的肽的复合物；
(b)使CD8阳性T细胞与外来体接触，所述外来体在其表面上呈递有HLA抗原与本发明的肽的复合物；和
(c)向CD8阳性T细胞导入一种或多种编码能够形成TCR的多肽的多核苷酸，所述TCR能够识别本发明的肽和HLA抗原的复合物。
当本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用至受试者后，在受试者的身体中诱导CTL，而且靶向表达DEPDC1的癌细胞的免疫应答的强度增强。因此，本发明的方法可包括将本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用于受试者的步骤。
或者，也可在体外或离体使用它们来诱导CTL。例如，本发明的方法可以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APC；
(b)将步骤(a)的APC与本发明的肽接触；和
(c)将步骤(b)的APC与CD8阳性T细胞共培养。
诱导的CTL可以随后返回到受试者。
上文步骤(c)中要与CD8阳性T细胞共培养的APC也可通过将编码本发明的肽的多核苷酸引入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分所述。然而，用于本发明的方法中的APC不限于此，并且可以使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的任何APC。
在本发明的方法中，除了此类APCs，也可以使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体。即，本发明的方法可以包括与在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的外来体共培养的步骤。此类外来体可通过上文“V.外来体”部分中描述的方法来制备。
此外，可通过将包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳性T细胞来诱导CTLs，所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的本发明的肽。此类转化可如上文“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中所述来实施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导CTLs的方法，包括选自以下的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APCs共培养，所述APCs在其表面呈递HLA抗原和本发明肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面呈递HLA抗原和本发明肽的复合物；和
(c)向CD8阳性T细胞导入包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体，所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的本发明的肽。
上述方法可以在体外，离体或体内实施，并且优选在体外或离体实施它们。在上述方法中使用的APCs或外来体和CD8阳性T细胞可以衍生自计划施用诱导的CTL的受试者，或者它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与计划施用的受试者不同的受试者(供体)的APC或外来体和CD8阳性T细胞时，施用对象和供体必须具有相同的HLA类型。例如，当具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作为本发明的肽时，在施用对象和供体中HLA类型优选为HLA-A11(更优选HLA-A*1101)。或者，上述方法中使用的APC或外来体优选是在其表面上呈递HLA-A11(更优选HLA-A*1101)和本发明的肽(具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽或其修饰肽)的复合物的APC或外来体。在这种情况下，诱导的CTLs显示出针对呈递HLA-A11和本发明的肽的复合物的细胞(例如，表达DEPDC1的HLA-A11阳性细胞)的细胞毒活性。
或者，例如当使用具有选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽或其修饰的肽作为本发明的肽时，施用受试者和供体两者中HLA类型优选为HLA-A01(更优选为HLA-A*0101)。
或者用于上述方法的APC和外来体优选为在其表面呈递HLA-A01(更优选为HLA-A*0101)和本发明的肽(具有选自SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽或其修饰的肽)的复合物的APC和外来体。在这种情况下，诱导的CTL显示出针对呈递HLA-A01和本发明的肽的复合物的细胞(例如，表达DEPDC1的HLA-A01阳性细胞)的细胞毒活性。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于诱导CTL的组合物或药物组合物，其包含至少一种选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱导CTL的组合物或药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分用于诱导CTL：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供了制备用于诱导CTLs的组合物或药物组合物的方法或过程，其是包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体进行配制的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导CTLs的组合物或药物组合物的方法或过程，其实包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体混合的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
XI.诱导免疫应答的方法
本发明还提供了诱导针对表达DEPDC1的癌症的免疫应答的方法。适用的癌症包括但不限于膀胱癌，乳腺癌，***，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，大肠癌，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，淋巴癌，骨肉瘤，***癌，小细胞肺癌(SCLC)，软组织瘤等,但不限于此。优选的是癌症表达选自HLA-A11和HLA-A01中至少一种HLA。
本发明还提供了诱导针对表达DEPDC1的癌细胞的免疫应答的方法。DEPDC1被认为在上述各种类型的癌症中过表达。因此，当诱导针对表达DEPDC1的癌细胞的免疫应答时，结果抑制了癌细胞的增殖。因此，本发明还提供了抑制表达DEPDC1的癌细胞增殖的方法。本发明的方法特别适用于抑制表达DEPDC1和选自HLA-A11和HLA-A01中至少一种HLA的癌细胞的增殖。
本发明的方法可以包括施用包含本发明的任何肽或编码所述肽的多核苷酸的组合物的步骤。本发明的方法还涵盖施用呈递任何本发明的肽的APC或外来体。关于详情参见“IX.药物组合物”部分，特别是描述本发明的药物组合物作为疫苗的用途的部分。另外，可用于本发明的诱导免疫应答的方法的外来体和APC详细描述于上文“V.外来体”、“VI.抗原呈递细胞(APC)”、和“X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法”的项(1)和(2)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于诱导针对表达DEPDC1的癌症的免疫应答的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于诱导针对表达DEPDC1的癌细胞的免疫应答的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于抑制表达DEPDC1的癌细胞增殖的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明提供了选自以下的活性成分在制备用于诱导针对表达DEPDC1的癌症的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱导针对表达DEPDC1的癌细胞的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分在制备用于抑制表达DEPDC1的癌细胞的增殖的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
本发明还提供了用于制备诱导针对表达DEPDC1的癌症的免疫应答的药物组合物的方法或过程，其中所述方法可以包括将本发明的肽或多核苷酸与药学上可接受的载体进行混合或配制的步骤。
或者，本发明提供了抑制表达DEPDC1的癌细胞增殖的方法或诱导针对表达DEPDC1的癌症的免疫应答的方法，其包括向受试者施用包含选自以下的活性成分的疫苗或药物组合物的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明的语境中，可以通过施用本发明的肽，多核苷酸，APC，外来体和/或CTL来治疗表达DEPDC1的癌症。或者通过施用本发明的肽，多核苷酸，APC，外来体和/或CTL可以诱导针对表达DEPDC1的癌症的免疫应答。此类癌症的例子包括但不限于膀胱癌，乳腺癌，***，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，大肠癌，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，淋巴癌，骨肉瘤，***癌，小细胞肺癌(SCLC)，软组织瘤等,但不限于此。此外，通过施用本发明的肽，多核苷酸，APC，外来体和/或CTL可以诱导针对表达DEPDC1的癌症的免疫应答。因此，在施用包含上述活性成分的疫苗或药物组合物之前，优选确认待治疗的受试者中患病部位的DEPDC1表达水平是否增加。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了在需要癌症治疗的患者中治疗表达DEPDC1的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的受试者的患病部位收集的生物样品中DEPDC1表达的水平；
(ii)基于(i)中测量的DEPDC1表达水平鉴定具有表达DEPDC1的癌症的受试者；和
(iii)向表达DEPDC1的癌症患者施用至少一种选自上述(a)至(e)组成的组的成分。
或者，本发明进一步提供了疫苗和药物组合物，其包含至少一种选自由以上(a)至(e)组成的组的活性成分，用于向具有表达DEPDC1的癌症患者施用。本发明还提供鉴定或选择要用至少一种选自上述(a)至(e)的活性成分治疗的受试者的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的受试者的患病部位收集的生物样品中DEPDC1表达的水平；
(ii)基于(i)中测量的DEPDC1表达水平鉴定具有表达DEPDC1的癌症的受试者；和
(iii)鉴定或选择(ii)中鉴定的受试者作为可以用至少一种选自由(a)至(e)组成的组的活性成分治疗的受试者。
在上述方法中从受试者收集的用于测量DEPDC1表达水平的生物样品没有特别限制，并且例如，可以优选使用通过活组织检查等收集的含有癌细胞的组织样品。生物样品中的DEPDC1表达水平可以通过已知方法测量，例如，可以使用通过探针或PCR方法检测DEPDC1基因的转录产物的方法(例如cDNA微阵列法，Northern印迹法，RT-PCR法等)、通过抗体等检测DEPDC1基因的翻译产物的方法(例如，Western印迹法，免疫染色法等)，等等。此外，生物样品可以是血液样品，在这种情况下，测量针对DEPDC1的抗体的血液水平，并且可以基于血液水平来评估患病部位的DEPDC1表达水平。可以使用已知方法测量针对DEPDC1的抗体的血液水平，例如，可以使用使用DEPDC1蛋白或本发明的肽作为抗原的酶免疫测定(EIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)等。
通常，在不表达DEPDC1的组织和细胞中，几乎没有检测到DEPDC1转录产物和翻译产物。因此，当在从受试者收集的癌细胞或含有癌细胞的组织样品中检测到DEPDC1的转录产物或翻译产物时，可以确定受试者的癌症表达DEPDC1。在没有表达DEPDC1的癌症的受试者的血液样品中，几乎没有检测到针对DEPDC1或其片段的抗体。因此，当在从受试者收集的血液样品中检测到针对DEPDC1或其片段的抗体时，可以确定受试者的癌症表达DEPDC1。受试者的癌症是否表达DEPDC1也可以通过与收集自受试者的非癌症部位的相同类型的生物材料的测量结果相比较或与收集自未患有癌症的受试者的相同类型的生物材料(正常对照样品)相比较。即，在与正常对照样品中的测量的靶水平(正常对照水平)进行比较中，当测试受试者的生物样品中的水平升高时，受试者的癌症被评估为表达DEPDC1。例如，当检测到的测量对象的量与正常对照水平相比增加至少10％或更高时，可以评估受试者的癌症表达DEPDC1。期望的是，检测到的测量目标的量优选地比正常对照水平高25％或更高，更优选50％或更高。此外，检测到的DEPDC1的转录产物或翻译产物的量可以通过相对于检测到的已知持家基因(例如β-肌动蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶或核糖体蛋白P1)的量标准化来评价。
在优选的实施方案中，优选在施用至少一种选自由上述(a)至(e)组成的组的活性成分之前确认受试者的HLA类型。例如，对于要施用与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽相关的活性成分的受试者，优选选择HLA-A11阳性受试者。对于要施用与具有选自SEQ IDNOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的氨基酸序列的肽相关的活性成分的受试者，优选选择HLA-A01阳性受试者。
本发明还提供了本发明的肽与HLA的复合物。上述本发明的复合物可以是单体或多聚体。当本发明的复合物为多聚体时，聚合的数目没有特别限制，且可以是任何聚合数目的多聚体。例子包括但不限于四聚体，五聚体，六聚体等。本发明的多聚体还包括dextramers(WO2002/072631)和streptamers(Knabel M等人,Nat Med.2002 Jun；8(6):631-7.)。本发明的肽和HLA的复合物可以根据已知方法制备(例如,Altman JD等人,Science.1996,274(5284):94-6；WO2002/072631；WO2009/003492；Knabel M,Nat Med.2002Jun；8(6):631-7等)。例如，本发明的复合物可用于定量对本发明的肽特异的CTLs。例如，从施用本发明的药物组合物的受试者收集血液样品，并且在分离PBMC之后制备CD4阴性细胞并与本发明的荧光染料-缀合的复合物接触。然后，可以通过流式细胞术分析测量对本发明的肽特异性的CTLs的百分比。例如，可以通过在施用本发明的药物组合物之前，期间和/或之后测量针对本发明的肽的特异性CTLs来监测本发明的药物组合物的免疫应答诱导作用。
XII.抗体
本发明进一步提供了与本发明的肽结合的抗体。优选的抗体特异性结合本发明的肽且不会结合(或会微弱结合)不是本发明的肽。在另一个实施方案中，此类抗体可以包括在HLA分子的背景下识别肽的抗体，即结合肽-MHC复合物的抗体。抗体的结合特异性可以通过抑制测定来确认。也就是说，如果在本发明的肽的存在下，待分析的抗体与全长DEPDC1多肽之间的结合被抑制，则该抗体显示出特异性结合本发明的肽。针对本发明的肽的抗体可用于疾病诊断和预后的测定，以及用于选择施用本发明的药物组合物的受试者选择和监测本发明的药物组合物。
本发明还提供了用于检测和/或定量本发明的肽或其片段的各种免疫测定。此类免疫测定包括但不限于放射免疫测定，免疫色谱，酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶联免疫荧光测定(ELIFA)等，并且在本领域熟知的各种免疫测定形式的范围内进行。
本发明的抗体可以用于可以检测表达DEPDC1癌症的免疫学成像方法，且其实例包括但不限于使用本发明的标记抗体的放射性闪烁照相成像。此类测定方法在临床上用于检测，监测和预后表达DEPDC1的癌症；且此类癌症的例子包括但不限于膀胱癌，乳腺癌，***，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，大肠癌，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，淋巴癌，骨肉瘤，***癌，小细胞肺癌(SCLC)，软组织瘤等，但不限于此。
本发明的抗体可以以任何任意形式使用，例如单克隆或多克隆抗体，而且还可包括通过用本发明的肽免疫动物(诸如家兔)而获得的抗血清，所有种类的多克隆和单克隆抗体，人抗体，及通过遗传重组生成的嵌合抗体和人源化抗体。
用作获得抗体的抗原的本发明的肽或其片段可以通过基于本文公开的氨基酸序列通过化学合成或基因工程技术获得。
用作免疫抗原的肽可以是本发明的肽或本发明的肽的片段。此外，该肽可以与载体结合或与载体缀合以增加免疫原性。匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体是公知的。用于将KLH结合至肽的方法也是本领域公知的。
可以用上述抗原免疫任何哺乳动物，且当产生单克隆抗体时优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常，可使用啮齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如家兔。灵长目动物包括例如狭鼻猿(旧大陆猴(old world monkey))诸如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴、狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射和皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬浮液与适量的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳动物。然后，优选的是使用每4至21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。可使用适宜的载体进行免疫。如上所述进行免疫后，可通过标准方法检验血清中所需抗体的量的增加。
可以如下制备针对本发明肽的多克隆抗体：从哺乳动物中收集血液(其已经在免疫后确认了所需抗体血清水平的增)，并通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体可以是包括含有多克隆抗体的血清，或可以从所述血清中分离的，含有该多克隆抗体的级分。可以使用例如偶联有本发明肽的亲和柱从仅识别本发明肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。
为了制备单克隆抗体，在确认免疫后所需抗体的血清水平增加时，从哺乳动物收集免疫细胞并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞可优选获自脾。对于其他与上述免疫细胞融合的亲本细胞，例如，可以使用哺乳动物骨髓瘤细胞，并且更优选为已获得融合细胞的药物选择性质的骨髓瘤细胞。
可根据已知的方法，例如Milstein等人(Galfre和Milstein,Methods Enzymol73:3-46(1981))的方法，将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。
对于由细胞融合得到的杂交瘤，可在标准选择培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养以进行选择。通常在HAT培养基中继续细胞培养足够的时间(例如，数天至数周)，以允许除了所需的杂交瘤之外的所有其他细胞(非融合细胞)死亡。然后，通过标准有限稀释(standard limiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用肽、表达肽的细胞或其溶胞物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了EB病毒的人淋巴细胞。然后，可以使经过免疫的淋巴细胞与永生化的衍生自人的骨髓瘤细胞诸如U266融合，以产生期望的生成能够与所述肽结合的人抗体的杂交瘤(JPS63-17688)。
然后将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明肽的亲和柱进行纯化。
或者，可以通过癌基因永生化抗体产生免疫细胞(如免疫的淋巴细胞)，并用于制备单克隆抗体。
如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,由MacMillanPublishers LTD在英国出版(1990))。例如，可以从免疫细胞诸如杂交瘤或经免疫淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA***合适的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。
此外，本发明的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它结合本发明的肽。例如，期望抗体片段含有抗体的抗原结合位点。具体来说，抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Huston等人.,ProcNatl Acad Sci USA 85:5879-83(1988))。更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其***表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见例如Co等人,J Immunol 152:2968-76(1994)；Better和Horwitz,Methods Enzymol 178:476-96(1989)；Pluckthun和Skerra,Methods Enzymol178:497-515(1989)；Lamoyi,Methods Enzymol 121:652-63(1986)；Rousseaux等人,Methods Enzymol 121:663-9(1986)；Bird和Walker,Trends Biotechnol 9:132-7(1991))。
抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合来修饰。本发明提供了经过此类修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。
或者，可以以衍生自非人抗体的可变区与衍生自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体或者包含衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体的形式来获得本发明的抗体。此类抗体可依照已知技术来制备。人源化可通过用非人抗体CDR序列取代人抗体的相应序列来进行(参见例如Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988))。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中人可变域的一小部分已被来自非人物种的相应序列所取代。
也可以使用完全的人抗体，这样的抗体除了人框架区和恒定区外还包含人可变区。此类抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。例如，体外方法包括使用展示在噬菌体上的人抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom&Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991))。类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠，来生成人抗体。该方法记载于例如美国专利号6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016。
可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦来分离和纯化抗体(Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow和David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如Hyper D、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了亲和色谱，示例性的色谱包括，例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification和Characterization:ALaboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等人,Cold Spring HarborLaboratory Press(1996))。可以通过液相层析来进行层析程序，诸如HPLC和FPLC。
例如，可通过使用吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光(IF)来测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定化在板上，将本发明的肽施加到该板上，然后施加含有所需抗体的样品，诸如生成抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的、识别第一抗体的第二抗体，并将板温育。接着，在洗涤后，向板中加入酶底物，诸如磷酸对硝基苯酯，并通过测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。为了评估抗体的结合活性，可以使用肽片段如C-末端或N-末端片段作为抗原。可以使用BIAcore(Pharmacia)来评估本发明抗体的活性。
通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明的肽的样品，并检测或测量在抗体和肽之间形成的免疫复合物，可以检测或测量使用以上方法的本发明的肽。
例如，本发明的抗体可用于检测受试者的血液样品(例如，血清样品)中存在的本发明的肽。或者，也可以使用本发明的肽来检测受试者血液样品(例如，血清样品)中存在的本发明的抗体。在受试者的血液样品中测量本发明的肽或本发明的抗体的结果可以用于受试者选择用于施用本发明的药物组合物或监测药物组合物的功效。此外，已报道具有抗体(其针对作为疫苗施用的肽)的患者可能对疫苗具有高的应答性。因此，当使用针对肽的抗体作为指标时，还可以利用本发明的肽作为免疫测定抗原用于在癌症患者中选择对包含所述肽的疫苗显示高应答性的患者。
XII.载体和宿主细胞
本发明提供包含编码本发明的肽的多核苷酸的载体和导入有所述载体的宿主细胞。本发明的载体可以用于将本发明的多核苷酸保持在宿主细胞中，以在宿主细胞中表达本发明的肽，或者以施用本发明的多核苷酸用于基因疗法。
当大肠杆菌为宿主细胞且在大肠杆菌(例如JM109、DH5-alpha、HB101或XL1-Blue)中大量扩增和生成载体时，载体需要具有用于在大肠杆菌中扩增的“复制起点”和用于选择经过转化的大肠杆菌的标志基因(例如通过药物诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等进行选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，pGEM-T，pDIRECT和pT7可用于克隆以及以上载体。当载体用于生产本发明的肽时，可以使用表达载体。例如，要在大肠杆菌中表达的表达载体应具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌诸如JM109、DH5-alpha、HB101或XL1-Blue作为宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中高效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward等人,Nature 341:544-6(1989)；FASEB J 6:2422-7(1989))、araB启动子(Better等人,Science 240:1041-3(1988))、T7启动子等。在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress***”(Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)来取代上述载体。另外，载体还可以包含用于肽分泌的信号序列。指导肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列有pelB信号序列(Lei等人,J Bacteriol169:4379(1987))。用于将载体导入靶宿主细胞的手段包括例如氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌外，还可以使用例如衍生自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17):5322(1990))、pEF、pCDM8)、衍生自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达***”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、衍生自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)来生成本发明的多肽。
为了在动物细胞诸如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人,Nature 277:108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1-alpha启动子(Mizushima等人,Nucleic Acids Res 18:5322(1990))、CMV启动子、等等，及优选用于选择转化子的标志基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
下面基于上述说明例示本发明的实施方案；然而本发明不限于这些实施方案。
[1]具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108；以及
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或添加了1、2或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108。
[2][1]的肽其选自下组(i)至(ii)：
(i)包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包含引入SEQ ID NO:1的氨基酸序列的选自下组(a)至(d)的一个或多个取代；
(a)用选自由苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；和
(c)用选自由亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第七个氨基酸；和
(d)用选自由赖氨酸和精氨酸组成的组的氨基酸取代C末端的氨基酸；
(ii)包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包含引入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108的选自以下组(a)至(c)的一个或多个取代：
(a)用选自由苏氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；
(c)用酪氨酸取代C末端的氨基酸。
[3][1]的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108。
[4]多核苷酸，其编码[1]至[3]中任一项的肽。
[5]组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[6][5]的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物。
[7][5]的组合物，其是药物组合物。
[8][7]的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途的药物组合物：(i)癌症治疗,(ii)癌症预防(防范(prophylaxis))和(iii)手术后癌症复发的预防(防范)。
[9][7]的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
[10][8]或[9]的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、乳腺癌、***、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、***癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤。
[11][5]至[10]中任一项的组合物，其配制为用于对至少一种选自下组的HLA阳性的受试者施用：HLA-A11和HLA-A01。
[12]诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)体外，离体或体内将APC与[1]至[3]中任一项的肽接触；和
(b)将编码[1]至[3]中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
[13]诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的[1]至[3]中任一项的肽。
[14]APC，其在其表面呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物。
[15][14]的APC，其通过[12]的方法诱导。
[16]CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[17][16]的CTL，其通过[13]的方法诱导。
[18]诱导针对癌症的免疫应答方法，其包含向受试者施用包含选自下组(a)至(e)的至少一种成分的组合物：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[19]治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物选自下组(a)至(e)的至少一种活性成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[20]抗体，其结合[1]至[3]中任一项的肽。
[21]筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自下组的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、***和/或添加一个，两个或数个氨基酸残基：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与除DEPDC1外的任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择出的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
[22]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在制备用于诱导针对癌症的免疫应答的组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[23]选自下组(a)至(e)中的至少一种活性成分在制备用于治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的药物组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[24]选自下组(a)至(e)中的至少一种活性成分在诱导针对癌症的免疫应答中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[25]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分，其用于治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[26]诱导针对表达DEPDC1的细胞的细胞毒性活性的方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至(e)中的至少一种成分的步骤：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[27]冷冻干燥制剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽。
[28]药物组合物，其通过包含如下的方法制备：将一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽溶解在水溶性载体中，并进行过滤灭菌。
[29]过滤灭菌水溶液，其是包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽和水溶性载体的水溶液。
[30]乳剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽，水溶性载体和油佐剂。
[31]试剂盒，其包含容纳[5]至[11]中任一项的药物组合物的容器和容纳佐剂的容器。
[32]试剂盒，其包含储存包含[1]至[3]中任一项的肽的冷冻干燥制剂的容器，储存佐剂的容器，和储存溶解液冷冻干燥制剂的容器。
本文参考其具体实施方案在此详细解释本发明。然而，应当理解，上述解释实际上是说明性和解释性解释，并且旨在解释本发明及其优选实施方式。通过常规实验，本领域技术人员将容易地认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行各种改变和修改。因此，本发明不限于上述说明，而是旨在由所附权利要求及其等同物限定。
在下文中，参照实施例更为详细地描述本发明。然而，虽然下述材料、方法和实施例可以用来帮助普通技术人员进行和使用本发明的某些实施方案，但是这些仅意图例示本发明的各方面，如此绝不限制本发明的范围。如本领域普通技术人员会容易认可与本文中描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试。
本文引用的所有现有技术文献通过引用并入本说明书。
实施例
[实施例1]
材料和方法
细胞系
C1R，HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系，和COS7，非洲绿猴肾细胞系购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*1101表达的刺激细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*1101的C1R(C1R-A11)作为刺激细胞。通过PCR扩增编码HLA-A*1101的开放阅读框的cDNA，并克隆到表达载体中。用表达载体转染C1R细胞，然后使用G418(Invitrogen)选择两周。将用G418选择的细胞接种到含有添加有G418的培养基的96孔板的孔中，并进一步培养30天。通过流式细胞术分析证实C1R细胞中外源的HLA-A*1101表达。
候选DEPDC1衍生肽的选择
使用结合预测软件"NetMHC3.2"(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus等人,Tissue Antigens.2003 Nov,62(5):378-84；Nielsen等人,Protein Sci.2003 May,12(5):1007-17,Bioinformatics.2004 Jun 12；20(9):1388-97)预测了结合HLA-A*1101分子的DEPDC1衍生的9聚体和10聚体肽。
肽合成
通过American Peptide Company(Sunnyvale,CA)根据标准固相合成法合成所述肽，并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。分别通过分析型HPLC和质谱分析法来分析肽的纯度(>90％)和身份。将肽以20mg/ml溶解在二甲基亚砜中并保存于-80℃。
体外CTL诱导
使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递在人白细胞抗原(HLA)上的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如在其他部分所述，体外制备DC(Nakahara S等人,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具体地说，用Ficoll-Paque Plus(Pharmacia)溶液从健康志愿者(HLA-A*1101阳性)分离的外周血单核细胞，通过粘附塑料组织培养盘(Becton Dickinson)加以分离，并作为单核细胞级分加以浓缩。将单核细胞富集的群体在含2％热灭活的自体血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中，在1000IU/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在3微克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一种合成肽于37℃冲激3小时。
接着，将这些经肽冲激的DC用X射线放射(20Gy)灭活，并以1:20比例与使用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)通过阳性选择获得的自体CD8+ T细胞混合。将这些培养产物接种于48孔板(Corning)中。制备每个孔，以在0.5ml AIM-V/2％AS培养基中含有1.5x104个经肽冲激的DC、3x105个CD8+ T细胞和10ng/ml IL-7(R&D System)。3天后，向这些培养物添加终浓度为20IU/ml的IL-2(CHIRON)。在第7天和第14天，将这些T细胞用经肽冲激的自体DC进一步刺激。DC每次通过与上文所述相同的方式来制备。在第21天在第三次肽刺激后，检测了针对肽冲击的C1R-A11的CTL活性(Tanaka H等人,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci2005,96(8):498-506)。
CTL扩增程序
使用与Riddell等人(Walter EA等人,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16):1038-44；Riddell SR等人,Nat Med 1996 Feb,2(2):216-23)公开的方法相似的方法在培养中扩增CTLs。将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系在总共25ml的AIM-V培养基中共培养(5x106细胞)，所述培养基含有含5％AS(AIM-V/5％AS)和40ng/ml抗-CD3抗体。开始培养后一天，向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天，向培养物中添加含有30IU/ml IL-2的新鲜AIM-V/5％AS培养基(Tanaka H等人,Br J Cancer2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N等人,ClinCancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
在96圆底微量滴定板(Nalge Nunc International)中接种CTL以制成1或10个细胞/孔。在含有30ng/ml的抗CD3抗体和125IU/ml的IL-2的总共150微升/孔的AIM-V/5％AS培养基中，将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系共培养(1x104细胞/孔)。10天后向培养基中加入50微升/孔的IL-2以达到125IU/ml的终浓度。在第14天测试CTL活性，并使用如上所述的相同方法扩增CTL克隆(Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci2005,96(8):498-506)。
特异性CTL活性
为了检查特异性CTL活性，实施了IFN-gamma ELISPOT测定法和IFN-gamma酶联免疫吸附测定法(ELISA)。具体地，制备经肽冲激的C1R-A11(1x104细胞/孔)作为刺激细胞。使用诱导的CTLs(即CTL系和CTL克隆)用作应答细胞。根据制造商的说明实施IFN-gammaELISPOT测定法和IFN-gamma ELISA。
强迫表达靶基因和HLA-A*1101的细胞的建立
通过PCR来扩增编码靶基因或HLA-A*1101的开放阅读框的cDNA。将PCR扩增产物克隆入表达载体。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)依照制造商的说明将表达靶基因的载体和表达HLA-A*1101的载体之一或两者转染入COS7细胞(其是靶基因和HLA阴性的细胞系)。转染两天后，用Versene(Invitrogen)收获经转染的细胞，并用作CTL活性测定法的靶细胞(5x104细胞/孔)。
结果
DEPDC1衍生的HLA-A*1101结合肽的预测
表1a和1b以结合亲和力的降序显示了已预测结合HLA-A*1101的DEPDC1衍生的9聚体肽和10聚体肽。选择并检查了总共80种潜在具有HLA-A*1101结合能力的肽以确定表位肽。
[表1a]
衍生自DEPDC1的HLA-A11结合9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
627 MSQNVDMPK 9 1
558 ATINKRLCK 18 2
644 SLMIHTFSR 27 3
73 IQLLRKFLK 27 4
332 HLNNLNSFK 36 5
206 SLEEVINPK 65 6
454 KLFLESKPK 79 7
726 SAQEFDEQK 82 8
796 KQPMLILRK 125 9
69 RQQTIQLLR 199 10
215 QVIPQYIMY 218 11
769 KEYPLIYQK 351 12
588 SLLQPHLER 359 13
70 QQTIQLLRK 439 14
222 MYNMANTSK 562 15
321 IQDDPQSSK 598 16
687 SYLQTAVEK 616 17
348 SLLHREKNK 630 18
109 TSPLKTLPR 764 19
439 SVFHQSFPN 812 20
516 RSSTRRNSY 828 21
367 ISNPGFQER 917 22
124 KNNIENFSK 955 23
711 GLFAPLPTY 980 24
141 RNLSRRTPK 1139 25
105 RFPATSPLK 1177 26
346 LLSLLHREK 1236 27
618 QLLMRMISR 1290 28
512 SLLLRSSTR 1478 29
753 RSLPLKEKR 1952 30
起始位置指示从DEPDC1的N端起的氨基酸残基的数目。解离常数[Kd(nM)]来源于″NetMHC3.2″。
[表1b-1]
衍生自DEPDC1的HLA-A11结合10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
626 RMSQNVDMPK 11 31
108 ATSPLKTLPR 17 32
221 IMYNMANTSK 20 33
72 TIQLLRKFLK 25 34
692 AVEKHLDYLK 51 35
643 RSLMIHTFSR 55 36
130 FSKDKDSIFK 57 37
526 NTPVAEIIMK 57 38
787 ALFGDKPTIK 64 39
749 IIKNRSLPLK 70 40
557 SATINKRLCK 71 41
311 VSDRSSGIHK 82 42
136 SIFKLRNLSR 91 43
69 RQQTIQLLRK 106 44
686 PSYLQTAVEK 118 45
22 TSFRAGMPLR 170 46
49 AVDWLYDLLR 174 47
587 QSLLQPHLER 179 48
345 LLLSLLHREK 188 49
320 KIQDDPQSSK 204 50
23 SFRAGMPLRK 212 51
512 SLLLRSSTRR 220 52
725 ISAQEFDEQK 304 53
426 IVDVPGNSSK 305 54
347 LSLLHREKNK 317 55
714 APLPTYSYCK 318 56
511 QSLLLRSSTR 334 57
259 RSNDMNNPTY 365 58
408 NMHDLSSNSK 366 59
96 NVDDNNQLFR 417 60
794 TIKQPMLILR 424 61
753 RSLPLKEKRK 431 62
475 IQKPFSAGFK 497 63
[表1b-2]
250 AMKCLANWPR 497 64
742 IAELLENIIK 524 65
607 LLLPPPNRRK 564 66
366 QISNPGFQER 611 67
109 TSPLKTLPRR 678 68
617 LQLLMRMISR 698 69
799 MLILRKPKFR 734 70
754 SLPLKEKRKK 791 71
60 NSNFGPEVTR 835 72
205 PSLEEVINPK 964 73
468 NLHSEENIQK 1259 74
3 SQGVPPGPYR 1616 75
104 FRFPATSPLK 1763 76
268 YVGFERDVFR 1875 77
214 KQVIPQYIMY 1920 78
496 ELCNGKCKSK 1988 79
783 ESEAALFGDK 2006 80
起始位置指示从DEPDC1的N端起的氨基酸残基的数目。解离常数[Kd(nM)]来源于″NetMHC3.2″。
通过预测的DEPDC1衍生的HLA-A*1101限制性肽来诱导CTLs
根据“材料和方法”中描述的方案来诱导CTL。通过IFN-gamma ELISPOT测定来测量肽特异性CTL活性(图1)。与对照相比，使用DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO：1)的孔#4中的CTL(a)显示出强的IFN-gamma生产。同时，尽管表1a和1b中所示的其它肽潜在地具有HLA-A*1101结合活性，没有检测到作为由这些肽刺激的结果的特异性CTL活性。典型阴性数据的实例是用DEPDC1-A11-9-558(SEQ ID NO：2)刺激的CTL中没有观察到特异性IFN-gamma产生(b)。结果，选择衍生自DEPDC1的DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO：1)作为能够诱导强的CTL的肽。
针对DEPDC1衍生的肽的CTL系和克隆的建立
通过在使用DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO：1)的孔中增殖细胞来建立CTL系，其在IFN-gamma ELISPOT测定法中显示出肽特异性CTL活性。通过IFN-gamma ELISA测量CTL系的CTL活性(图2)。与未用肽冲击的靶细胞相比，CTL系表现出针对用DEPDC1-A11-9-627(SEQID NO：1)冲击的靶细胞的强的IFN-gamma生成。此外，通过从如以上“材料和方法”部分中描述的CTL系的有限稀释建立CTL克隆，并通过IFN-gamma ELISA测量针对DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)冲击的C1R-A11细胞的CTL克隆的IFN-gamma生成。在用DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)刺激的CTL克隆中观察到强的IFN-gamma生成(图3)。
针对表达DEPDC1和HLA-A*1101的靶细胞的特异性CTL活性
研究了用DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)诱导的CTL系的识别表达DEPDC1和HLA-A*1101分子的靶细胞的能力。制备了转染有全长DEPDC1和HLA-A*1101基因的COS7细胞作为靶细胞。制备了转染有全长DEPDC1或HLA-A*1101的COS7细胞作为对照。DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)诱导的CTL系显示出针对表达DEPDC1和HLA-A*1101两者的COS7细胞强力的CTL活性(图4)。另一方面，未检测到针对对照细胞的显著特异性CTL活性。这些数据清晰地证明了DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)肽是产生自内源加工的DEPDC1，并且与HLA-A*1101分子呈递到靶细胞上并由CTL识别的肽。这些结果说明了DEPDC1衍生的DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)可以适合作为针对具有DEPDC1-表达肿瘤的患者的癌症疫苗的可能性。
抗原肽的同源性分析
用DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)诱导的CTL显示出显著的特异性CTL活性。这些结果可以是因为DEPDC1-A11-9-627(SEQ ID NO:1)序列与衍生自已知敏化人免疫***的其它分子的肽同源。为了排除此可能性，通过使用BLAST算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查询这些肽的序列来进行同源性分析。结果显示没有与DEPDC1-A11-9-627(SEQID NO:1)序列具有显着同源性的序列。因此，根据本发明人的知识，这些肽几乎不可能引发针对其他不相关分子的非预期免疫应答。总之，鉴定了新的DEPDC1衍生的HLA-A11限制性表位肽。证明了DEPDC1衍生的表位肽适用于癌症免疫治疗。
[实施例2]
材料和方法
细胞系
C1R，HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系，和COS7，非洲绿猴肾细胞系购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*0101表达的刺激细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*0101的C1R(C1R-A01)作为刺激细胞。通过PCR扩增编码HLA-A*0101的开放阅读框的cDNA，并克隆到表达载体中。用表达载体转染C1R细胞，然后使用G418(Invitrogen)选择两周。将用G418选择的细胞接种到含有添加有G418的培养基的96孔板的孔中，并进一步培养30天。通过流式细胞术分析证实C1R细胞中外源的HLA-A*0101表达。
衍生的DEPDC1肽候选者的选择
使用结合预测服务器“NetMHC 3.2”(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus等人,Tissue Antigens.2003Nov,62(5):378-84；Nielsen等人,Protein Sci.2003May,12(5):1007-17；Bioinformatics.2004Jun 12:20(9):1388-97)预测了结合HLA-A*0101分子的DEPDC1衍生的9聚体，10聚体和11聚体肽。
肽合成
通过American Peptide Company(Sunnyvale,CA)根据标准固相合成法合成这些肽，并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。分别通过分析型HPLC和质谱分析法来分析肽的纯度(>90％)和身份。将肽以20mg/ml溶解在二甲基亚砜中并保存于-80℃。
体外CTL诱导
使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递在人白细胞抗原(HLA)上的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如在其他部分所述，体外制备DC(Nakahara S等人,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具体地说，用Ficoll-Paque Plus(Pharmacia)溶液从健康志愿者((HLA-A*0101阳性)分离的外周血单核细胞，通过粘附塑料组织培养盘(Becton Dickinson)加以分离，并作为单核细胞级分加以浓缩。将单核细胞富集的群体在含2％热灭活的自体血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中，在1000IU/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在3微克/mlβ2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一种合成肽于37℃冲激3小时。所生成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如CD80、CD83、CD86和HLA II类(数据未显示)。接着，将这些经肽冲激的DC用X射线放射(20Gy)灭活，并以1:20比例与用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)通过阳性选择获得的自体CD8+ T细胞混合。将这些培养产物接种于48孔板(Corning)中。制备每个孔，以在0.5ml AIM-V/2％AS培养基中含有1.5x104个经肽冲激的DC、3x105个CD8+ T细胞和10ng/ml IL-7(R&D System)。3天后，向这些培养物添加终浓度为20IU/ml的IL-2(CHIRON)。在第7天和第14天，将这些T细胞用经肽冲激的自体DC进一步刺激。DC每次通过与上文所述相同的方式来制备。在第21天在第三次肽刺激后，针对肽冲击的C1R-A01细胞来检测CTL活性(Tanaka H等人,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,CancerSci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506).
CTL扩增程序
使用与Riddell等人(Walter EA等人,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16):1038-44；Riddell SR等人,Nat Med 1996 Feb,2(2):216-23)公开的方法相似的方法在培养中扩增CTL。将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系在总共25ml的AIM-V培养基中共培养(5x106细胞/烧瓶)，所述培养基含有含5％AS(AIM-V/5％AS)和40ng/ml抗-CD3抗体。开始培养后一天，向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天，向培养物中添加含有30IU/ml IL-2的新鲜AIM-V/5％AS培养基(Tanaka H等人,Br JCancer 2001,84(1):94-9；Umano Y等人,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N等人,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,Cancer Sci2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
在96圆底微量滴定板(Nalge Nunc International)中进行CTLs稀释以制成1或10个细胞/孔。在含有30ng/ml的抗CD3抗体和125IU/ml的IL-2的总共150微升/孔的AIM-V/5％AS培养基中，将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系共培养(1x104细胞/孔)。10天后向培养基中加入50微升的以500IU/ml溶于含5％AS的AIM-V培养基的IL-2。在第14天测试CTL活性，并使用如上所述的相同方法扩增CTL克隆(Uchida N等人,ClinCancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T等人,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T等人,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
特异性CTL活性
为了检查特异性CTL活性，实施了IFN-gamma ELISPOT测定法和IFN-gamma ELISA。具体地，制备经肽冲激的C1R-A01细胞(1x104细胞/孔)作为刺激细胞。使用诱导的CTL(即CTL系和CTL克隆)用作应答细胞。根据制造商的说明实施IFN-gamma ELISPOT测定法和IFN-gamma ELISA。强迫表达靶基因和HLA-A*0101的靶细胞的建立
通过PCR来扩增编码靶基因或HLA-A*0101的开放阅读框的cDNA。将PCR扩增产物克隆入表达载体。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)依照制造商的说明将表达靶基因的载体和表达HLA-A*0101的载体之一或两者转染入COS7(其是靶基因和HLA阴性的细胞系)。转染两天后，用Versene(Invitrogen)收获经转染的细胞，并用作CTL活性测定法的靶细胞(5x104细胞/孔)。
结果
DEPDC1衍生的HLA-A*0101结合肽的预测
表2a至2c以结合亲和力的降序显示了已预测结合HLA-A*0101的DEPDC1衍生的9聚体肽，10聚体肽和11聚体肽。选择并检查了总共30种潜在具有HLA-A*0101结合能力的肽以确定表位肽。
[表2a]
衍生自DEPDC1的HLA-A01结合9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
239 KSDDLPHWV 375 81
46 AGEAVDWLY 731 82
516 RSSTRRNSY 860 21
781 TTESEAALF 1017 83
571 LSENSLLPA 1309 84
96 NVDDNNQLF 1951 85
260 SNDMNNPTY 2149 86
767 FQKEYPLIY 2559 87
291 LTFEYYELF 3528 88
311 VSDRSSGIH 4643 89
起始位置指示从DEPDC1的N端起的氨基酸残基的数目，解离常数[Kd(nM)]来源于″NetMHC 3.2″。
[表2b]
衍生自DEPDCl的HLA-A01结合10聚体肽
Figure BDA0002944291680000711
起始位置指示从DEPDC1的N端起的氨基酸残基的数目，解离常数[Kd(nM)]来源于″NetMHC 3.2″。
[表2c]
衍生自DEPDC1的HLA-A01结合11聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
44 FTAGEAVDWLY 13 108
起始位置指示从DEPDC1的N端起的氨基酸残基的数目，解离常数[Kd(nM)]来源于″NetMHC 3.2″。
通过预测的DEPDC1衍生的HLA-A*0101限制性肽来诱导CTL
依照如“材料和方法”中描述的方案生成针对DEPDC1衍生的肽的CTL。通过IFN-gamma ELISPOT测定法测量肽特异性CTL活性(图5)。与对照相比，在以下孔中的CTL显示出强的IFN-gamma生成：
使用DEPDC1-A01-9-239(SEQ ID NO：81)的孔#6(a)
使用DEPDC1-A01-9-46(SEQ ID NO：82)的孔#5(b)，
使用DEPDC1-A01-9-516(SEQ ID NO：21)的孔#3(c)，
使用DEPDC1-A01-9-781(SEQ ID NO：83)的孔#3(d)，
使用DEPDC1-A01-9-571(SEQ ID NO：84)的孔#7(e)，
使用DEPDC1-A01-9-96(SEQ ID NO：85)的孔#2(f)，
使用DEPDC1-A01-9-260(SEQ ID NO：86)的孔#4(g)，
使用DEPDC1-A01-9-767(SEQ ID NO：87)的孔#7(h)，
使用DEPDC1-A01-9-291(SEQ ID NO：88)的孔#8(i)，
使用DEPDC1-A01-9-311(SEQ ID NO：89)的孔#6(j)，
使用DEPDC1-A01-10-690(SEQ ID NO：90)的孔#3(k)，
使用DEPDC1-A01-10-2(SEQ ID NO：91)的孔#6(1)，
使用DEPDC1-A01-10-259(SEQ ID NO：58)的孔#3(m)，
使用DEPDC1-A01-10-45(SEQ ID NO：92)的孔#1(n)，
使用DEPDC1-A01-10-712(SEQ ID NO：96)的孔#6(o)，
使用DEPDC1-A01-10-188(SEQ ID NO：99)的孔#7(p)，
使用DEPDC1-A01-10-470(SEQ ID NO：101)的孔#6(q)，
使用DEPDC1-A01-10-456(SEQ ID NO:102)的孔#6(r)，
使用DEPDC1-A01-10-679(SEQ ID NO:103)的孔#4(s)，
使用DEPDC1-A01-10-341(SEQ ID NO:104)的孔#2(t)，
使用DEPDC1-A01-10-183(SEQ ID NO:106)的孔#3(u)，
使用DEPDC1-A01-10-286(SEQ ID NO:107)的孔#6(v)，和
使用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)的孔#8(w)。与此同时，尽管示于表2a，2b和2c中的其他肽潜在具有HLA-A*0101结合活性，未检测到作为这些肽的刺激的结果的特异性CTL活性。典型阴性数据的实例是从用DEPDC1-A01-10-780(SEQ ID NO:94)刺激的CTL中未观察到特异性IFN-gamma产生(x)。结果，选择23种类型的DEPDC1衍生肽作为能够诱导有效CTL的肽。
针对DEPDC1衍生的肽的CTL系和克隆的建立
通过增殖使用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)的孔#8中的细胞来建立CTL系，其显示出肽特异性CTL活性。通过IFN-gamma ELISA测量CTL系的CTL活性(图6)。与没有用肽冲击的靶细胞相比，该CTL系表现出针对用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)冲击的靶细胞的强的IFN-gamma生成。体外CTL诱导之后，通过如上“材料和方法”部分中描述的限制性稀释来建立CTL克隆，并且通过IFN-gamma ELISA来测量来自针对DEPDC1-A01-11-44(SEQID NO:108)冲击的C1R-A01细胞的CTL的IFN-gamma生成。在用DEPDC1-A01-11-44(SEQ IDNO:108)刺激的CTL克隆中观察到强的IFN-gamma生成(图7)。
针对表达DEPDC1和HLA-A*0101的靶细胞的特异性CTL活性
研究用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)诱导的CTL克隆识别表达DEPDC1和HLA-A*0101分子的靶细胞的能力。制备用全长的DEPDC1和HLA-A*0101基因两者转染的COS7细胞作为靶细胞。制备用全长DEPDC1或HLA-A*0101转染的COS7细胞作为对照。用DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)肽诱导的CTL克隆显示出针对表达DEPDC1和HLA-A*0101两者的COS7细胞的强的CTL活性(图8)。另一方面，针对对照没有检出显著的特异性CTL活性。这些数据清楚证明DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)是产生自DEPDC1内源性加工的肽，并与HLA-A*0101分子呈递在靶细胞上，并被CTL识别。这些结果表明了以下可能性，即DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)作为癌症疫苗用于患有表达DEPDC1的癌症的患者可以是合适的。
抗原肽的同源性分析
用DEPDC1-A01-9-239(SEQ ID NO:81),DEPDC1-A01-9-46(SEQ ID NO:82),DEPDC1-A01-9-516(SEQ ID NO:21),DEPDC1-A01-9-781(SEQ ID NO:83),DEPDC1-A01-9-571(SEQ ID NO:84),DEPDC1-A01-9-96(SEQ ID NO:85),DEPDC1-A01-9-260(SEQ ID NO:86),DEPDC1-A01-9-767(SEQ ID NO:87),DEPDC1-A01-9-291(SEQ ID NO:88),DEPDC1-A01-9-311(SEQ ID NO:89),DEPDC1-A01-10-690(SEQ ID NO:90),DEPDC1-A01-10-2(SEQ IDNO:91),DEPDC1-A01-10-259(SEQ ID NO:58),DEPDC1-A01-10-45(SEQ ID NO:92),DEPDC1-A01-10-712(SEQ ID NO:96),DEPDC1-A01-10-188(SEQ ID NO:99),DEPDC1-A01-10-470(SEQ ID NO:101),DEPDC1-A01-10-456(SEQ ID NO:102),DEPDC1-A01-10-679(SEQ ID NO:103),DEPDC1-A01-10-341(SEQ ID NO:104),DEPDC1-A01-10-183(SEQ ID NO:106),DEPDC1-A01-10-286(SEQ ID NO:107)或DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)序列诱导的CTL显示出显著的特异性CTL活性。这些结果可能是因为DEPDC1-A01-9-239(SEQ ID NO:81),DEPDC1-A01-9-46(SEQ ID NO:82),DEPDC1-A01-9-516(SEQ ID NO:21),DEPDC1-A01-9-781(SEQ ID NO:83),DEPDC1-A01-9-571(SEQ ID NO:84),DEPDC1-A01-9-96(SEQ ID NO:85),DEPDC1-A01-9-260(SEQ ID NO:86),DEPDC1-A01-9-767(SEQ ID NO:87),DEPDC1-A01-9-291(SEQ ID NO:88),DEPDC1-A01-9-311(SEQ ID NO:89),DEPDC1-A01-10-690(SEQ IDNO:90),DEPDC1-A01-10-2(SEQ ID NO:91),DEPDC1-A01-10-259(SEQ ID NO:58),DEPDC1-A01-10-45(SEQ ID NO:92),DEPDC1-A01-10-712(SEQ ID NO:96),DEPDC1-A01-10-188(SEQID NO:99),DEPDC1-A01-10-470(SEQ ID NO:101),DEPDC1-A01-10-456(SEQ ID NO:102),DEPDC1-A01-10-679(SEQ ID NO:103),DEPDC1-A01-10-341(SEQ ID NO:104),DEPDC1-A01-10-183(SEQ ID NO:106),DEPDC1-A01-10-286(SEQ ID NO:107)和DEPDC1-A01-11-44(SEQID NO:108)序列与衍生自已知敏化人免疫***的其它分子的肽同源的这一事实。为了排除此可能性，通过使用BLAST算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查询这些肽的序列来进行同源性分析。这一结果显示出没有与DEPDC1-A01-9-239(SEQ ID NO:81),DEPDC1-A01-9-46(SEQ ID NO:82),DEPDC1-A01-9-516(SEQ ID NO:21),DEPDC1-A01-9-781(SEQ IDNO:83),DEPDC1-A01-9-571(SEQ ID NO:84),DEPDC1-A01-9-96(SEQ ID NO:85),DEPDC1-A01-9-260(SEQ ID NO:86),DEPDC1-A01-9-767(SEQ ID NO:87),DEPDC1-A01-9-291(SEQID NO:88),DEPDC1-A01-9-311(SEQ ID NO:89),DEPDC1-A01-10-690(SEQ ID NO:90),DEPDC1-A01-10-2(SEQ ID NO:91),DEPDC1-A01-10-259(SEQ ID NO:58),DEPDC1-A01-10-45(SEQ ID NO:92),DEPDC1-A01-10-712(SEQ ID NO:96),DEPDC1-A01-10-188(SEQ ID NO:99),DEPDC1-A01-10-470(SEQ ID NO:101),DEPDC1-A01-10-456(SEQ ID NO:102),DEPDC1-A01-10-679(SEQ ID NO:103),DEPDC1-A01-10-341(SEQ ID NO:104),DEPDC1-A01-10-183(SEQ ID NO:106),DEPDC1-A01-10-286(SEQ ID NO:107)和DEPDC1-A01-11-44(SEQ ID NO:108)序列具有显著同源性的序列。因此，根据本发明人的知识，这些肽几乎不可能引发针对其他不相关分子的非预期免疫应答。总之，鉴定了新的DEPDC1衍生的HLA-A01限制性表位肽。证明了DEPDC1衍生的表位肽适用于癌症免疫治疗。
[实施例3]
乳液制剂的制备
将肽溶解在注射用溶剂或无菌生理盐水中，使其为1.0mg/ml至10.0mg/ml，并收集到注射器中。这经由连接器连接至装有与注射溶剂或无菌生理盐水等量的IFA的注射器，然后通过交替地推动两个连接的注射器的注射器柱塞来混合。混合几分钟后，通过滴落试验法(drop test method)评价乳液的完成。滴落试验法可以通过将一滴混合样品滴在水上进行。当滴在水上的样品不立即在水中扩散时，评估乳液完成；并且当滴在水上的样品立即在水中扩散时，该乳液被评估为未完成。当乳液被评估为不完全时，进行进一步混合以完成乳液。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。经受施用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者：膀胱癌，乳腺癌，***，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，大肠癌，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，淋巴癌，骨肉瘤，***癌，小细胞肺癌(SCLC)，软组织瘤等。
冷冻干燥制剂的制备
将肽溶解在注射用溶剂中，使其为1.0mg/ml至10.0mg/ml，并过滤灭菌。将其装入灭菌的小瓶中，并用无菌橡胶塞半封闭。将该小瓶冷冻干燥后，将其完全封闭并用铝盖缝合以产生冷冻干燥的制剂。当使用时，将注射溶剂或无菌生理盐水注入小瓶中以重新溶解冷冻干燥的粉末。使用注射器收集小瓶中的再溶解溶液，并且通过连接器将注射器与填充有与收集的再溶解溶液的量相同量的IFA的注射器连接。通过交替地推动两个连接的注射器的注射器柱塞来混合重新溶解的溶液和IFA。混合几分钟后，通过滴落试验法(drop testmethod)评价乳液的完成。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。经受施用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者：膀胱癌，乳腺癌，***，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，大肠癌，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，淋巴癌，骨肉瘤，***癌，小细胞肺癌(SCLC)，软组织瘤等。
工业应用性
本发明提供了DEPDC1衍生的新型HLA-A11限制性，HLA-A33限制性，HLA-A03限制性和HLA-A01限制性表位肽，其诱导强而特异性的抗肿瘤免疫应答，并且因此具有广泛的癌症类型的可用性。本发明的肽，组合物，APCs和CTLs可用作针对表达DEPDC1癌症的肽疫苗，例如：膀胱癌，乳腺癌，***，胆管细胞癌，慢性骨髓性白血病(CML)，大肠癌，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，淋巴癌，骨肉瘤，***癌，小细胞肺癌(SCLC)，软组织瘤等。
尽管本文详细地并且关于其具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，前述描述本质上是示例性和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由所附权利要求来限定。
本发明包括
1.具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108；以及
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或添加了1、2或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108。
2.项1的肽，其选自下组(i)至(ii)：
(i)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(d)的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NO:1：
(a)用选自由苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；和
(c)用选自由亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第七个氨基酸；和
(d)用选自由赖氨酸和精氨酸组成的组的氨基酸取代C末端的氨基酸；
(ii)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(c)的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108：
(a)用选自由苏氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；
(c)用酪氨酸取代C末端的氨基酸。
3.项1的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108。
4.多核苷酸，其编码项1至3中任一项的肽。
5.组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的项1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码项1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向项1至3中任一项的肽。
6.项5的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的项1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码项1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物。
7.项5的组合物，其是药物组合物。
8.项7的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：(i)癌症治疗,(ii)癌症预防(防范(prophylaxis))和(iii)手术后癌症复发的预防(防范)。
9.项7的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
10.项8或9的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、乳腺癌、***、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、***癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤。
11.项5至10中任一项的组合物，其配制为用于对至少一种选自下组的HLA阳性的受试者施用：HLA-A11和HLA-A01。
12.诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)在体外，离体或体内将APC与项1至3中任一项的肽接触；和
(b)将编码项1至3中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
13.诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与项1至3中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与项1至3中任一项的肽的复合物；和
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的项1至3中任一项的肽。
14.APC，其在其表面呈递HLA抗原与项1至3中任一项的肽的复合物。
15.项14的APC，其通过项12的方法诱导。
16.CTL，其靶向项1-3中任一项的肽。
17.项16的CTL，其通过项13的方法诱导。
18.诱导针对癌症的免疫应答方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的项1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码项1至3中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向项1至3中任一项的肽。
19.治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物选自下组(a)至(e)的至少一种活性成分：
(a)一种或多种类型的项1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码项1至3中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递项1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向项1至3中任一项的肽。
20.抗体，其结合项1至3中任一项的肽。
21.筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自下组的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、***和/或添加一个，两个或数个氨基酸残基：SEQ ID NOs:1,81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与除DEPDC1外的任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择出的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
22.乳剂，其包含一种或多种类型的项1至3中任一项的肽，水溶性载体和油佐剂。
23.试剂盒，其包含容纳项5至11中任一项的组合物的容器和容纳佐剂的容器。
序列表
<110> 肿瘤疗法科学股份有限公司
<120> DEPDC1衍生的肽和包含它们的疫苗
<130> ONC-A1602P
<150> JP 2015-159291
<151> 2015-08-12
<150> JP 2015-165779
<151> 2015-08-25
<160> 117
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
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<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 14
Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 15
Met Tyr Asn Met Ala Asn Thr Ser Lys
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 16
Ile Gln Asp Asp Pro Gln Ser Ser Lys
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 17
Ser Tyr Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 18
Ser Leu Leu His Arg Glu Lys Asn Lys
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 19
Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro Arg
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 20
Ser Val Phe His Gln Ser Phe Pro Asn
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 21
Arg Ser Ser Thr Arg Arg Asn Ser Tyr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 22
Ile Ser Asn Pro Gly Phe Gln Glu Arg
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<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 23
Lys Asn Asn Ile Glu Asn Phe Ser Lys
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 24
Gly Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 25
Arg Asn Leu Ser Arg Arg Thr Pro Lys
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 26
Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu Lys
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 27
Leu Leu Ser Leu Leu His Arg Glu Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 28
Gln Leu Leu Met Arg Met Ile Ser Arg
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 29
Ser Leu Leu Leu Arg Ser Ser Thr Arg
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 30
Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg
1 5
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 31
Arg Met Ser Gln Asn Val Asp Met Pro Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 32
Ala Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro Arg
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 33
Ile Met Tyr Asn Met Ala Asn Thr Ser Lys
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 34
Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu Lys
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 35
Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu Lys
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<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 36
Arg Ser Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg
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<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 37
Phe Ser Lys Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 38
Asn Thr Pro Val Ala Glu Ile Ile Met Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 39
Ala Leu Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 40
Ile Ile Lys Asn Arg Ser Leu Pro Leu Lys
1 5 10
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 41
Ser Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu Cys Lys
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 42
Val Ser Asp Arg Ser Ser Gly Ile His Lys
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 43
Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser Arg
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 44
Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 45
Pro Ser Tyr Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys
1 5 10
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 46
Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg
1 5 10
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 47
Ala Val Asp Trp Leu Tyr Asp Leu Leu Arg
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 48
Gln Ser Leu Leu Gln Pro His Leu Glu Arg
1 5 10
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 49
Leu Leu Leu Ser Leu Leu His Arg Glu Lys
1 5 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 50
Lys Ile Gln Asp Asp Pro Gln Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 51
Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 52
Ser Leu Leu Leu Arg Ser Ser Thr Arg Arg
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 53
Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu Gln Lys
1 5 10
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 54
Ile Val Asp Val Pro Gly Asn Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 55
Leu Ser Leu Leu His Arg Glu Lys Asn Lys
1 5 10
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 56
Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser Tyr Cys Lys
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 57
Gln Ser Leu Leu Leu Arg Ser Ser Thr Arg
1 5 10
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 58
Arg Ser Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 59
Asn Met His Asp Leu Ser Ser Asn Ser Lys
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 60
Asn Val Asp Asp Asn Asn Gln Leu Phe Arg
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 61
Thr Ile Lys Gln Pro Met Leu Ile Leu Arg
1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 62
Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 63
Ile Gln Lys Pro Phe Ser Ala Gly Phe Lys
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 64
Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn Trp Pro Arg
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 65
Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ile Lys
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 66
Leu Leu Leu Pro Pro Pro Asn Arg Arg Lys
1 5 10
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 67
Gln Ile Ser Asn Pro Gly Phe Gln Glu Arg
1 5 10
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 68
Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro Arg Arg
1 5 10
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 69
Leu Gln Leu Leu Met Arg Met Ile Ser Arg
1 5 10
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 70
Met Leu Ile Leu Arg Lys Pro Lys Phe Arg
1 5 10
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 71
Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys
1 5 10
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 72
Asn Ser Asn Phe Gly Pro Glu Val Thr Arg
1 5 10
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 73
Pro Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn Pro Lys
1 5 10
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 74
Asn Leu His Ser Glu Glu Asn Ile Gln Lys
1 5 10
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 75
Ser Gln Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg
1 5 10
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 76
Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu Lys
1 5 10
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 77
Tyr Val Gly Phe Glu Arg Asp Val Phe Arg
1 5 10
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 78
Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr
1 5 10
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 79
Glu Leu Cys Asn Gly Lys Cys Lys Ser Lys
1 5 10
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 80
Glu Ser Glu Ala Ala Leu Phe Gly Asp Lys
1 5 10
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 81
Lys Ser Asp Asp Leu Pro His Trp Val
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 82
Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp Leu Tyr
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 83
Thr Thr Glu Ser Glu Ala Ala Leu Phe
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 84
Leu Ser Glu Asn Ser Leu Leu Pro Ala
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 85
Asn Val Asp Asp Asn Asn Gln Leu Phe
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 86
Ser Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 87
Phe Gln Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 88
Leu Thr Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 89
Val Ser Asp Arg Ser Ser Gly Ile His
1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 90
Gln Thr Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 91
Glu Ser Gln Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr
1 5 10
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 92
Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp Leu Tyr
1 5 10
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 93
Gln Phe Gln Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr
1 5 10
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 94
Pro Thr Thr Glu Ser Glu Ala Ala Leu Phe
1 5 10
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 95
Phe Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp Leu
1 5 10
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 96
Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 97
Phe Val Asn Ile Leu Val Val Cys Gly Tyr
1 5 10
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 98
Ser Thr Ser Gln Ala Ala Ile Ala Glu Leu
1 5 10
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 99
Glu Val Trp Arg Tyr Val Ile Leu Ile Tyr
1 5 10
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 100
Leu Leu Thr Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe
1 5 10
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 101
His Ser Glu Glu Asn Ile Gln Lys Pro Phe
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 102
Phe Leu Glu Ser Lys Pro Lys Gln Glu Phe
1 5 10
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 103
His Gln Glu Ile Leu Gln Val Pro Ser Tyr
1 5 10
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 104
Ser Thr Glu Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu
1 5 10
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 105
Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn Trp
1 5 10
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 106
Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr
1 5 10
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 107
Leu Pro Glu Pro Leu Leu Thr Phe Glu Tyr
1 5 10
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自DEPDC1的肽
<400> 108
Phe Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp Leu Tyr
1 5 10
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 109
gtctaccagg cattcgcttc at 22
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 110
tcagctggac cacagccgca gcgt 24
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 111
tcagaaatcc tttctcttga c 21
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 112
ctagcctctg gaatcctttc tctt 24
<210> 113
<211> 5459
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (223)..(2658)
<400> 113
agctactgga gccccaggac gcagccgagc ggccctcgcc gactccttcc cgagcctggc 60
tgtggcgtca cgtgacccgc ggcgcggcca atccgcgcag ccctctatgc tattcaaatc 120
ggcggcgggg ccaacggttg tgccgagact cgccactgcc gcggccgctg ggcctgagtg 180
tcgccttcgc cgccatggac gccaccgggc gctgacagac ct atg gag agt cag 234
Met Glu Ser Gln
1
ggt gtg cct ccc ggg cct tat cgg gcc acc aag ctg tgg aat gaa gtt 282
Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg Ala Thr Lys Leu Trp Asn Glu Val
5 10 15 20
acc aca tct ttt cga gca gga atg cct cta aga aaa cac aga caa cac 330
Thr Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys His Arg Gln His
25 30 35
ttt aaa aaa tat ggc aat tgt ttc aca gca gga gaa gca gtg gat tgg 378
Phe Lys Lys Tyr Gly Asn Cys Phe Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp
40 45 50
ctt tat gac cta tta aga aat aat agc aat ttt ggt cct gaa gtt aca 426
Leu Tyr Asp Leu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Phe Gly Pro Glu Val Thr
55 60 65
agg caa cag act atc caa ctg ttg agg aaa ttt ctt aag aat cat gta 474
Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu Lys Asn His Val
70 75 80
att gaa gat atc aaa ggg agg tgg gga tca gaa aat gtt gat gat aac 522
Ile Glu Asp Ile Lys Gly Arg Trp Gly Ser Glu Asn Val Asp Asp Asn
85 90 95 100
aac cag ctc ttc aga ttt cct gca act tcg cca ctt aaa act cta cca 570
Asn Gln Leu Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro
105 110 115
cga agg tat cca gaa ttg aga aaa aac aac ata gag aac ttt tcc aaa 618
Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Lys Asn Asn Ile Glu Asn Phe Ser Lys
120 125 130
gat aaa gat agc att ttt aaa tta cga aac tta tct cgt aga act cct 666
Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser Arg Arg Thr Pro
135 140 145
aaa agg cat gga tta cat tta tct cag gaa aat ggc gag aaa ata aag 714
Lys Arg His Gly Leu His Leu Ser Gln Glu Asn Gly Glu Lys Ile Lys
150 155 160
cat gaa ata atc aat gaa gat caa gaa aat gca att gat aat aga gaa 762
His Glu Ile Ile Asn Glu Asp Gln Glu Asn Ala Ile Asp Asn Arg Glu
165 170 175 180
cta agc cag gaa gat gtt gaa gaa gtt tgg aga tat gtt att ctg atc 810
Leu Ser Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr Val Ile Leu Ile
185 190 195
tac ctg caa acc att tta ggt gtg cca tcc cta gaa gaa gtc ata aat 858
Tyr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Val Pro Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn
200 205 210
cca aaa caa gta att ccc caa tat ata atg tac aac atg gcc aat aca 906
Pro Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr Asn Met Ala Asn Thr
215 220 225
agt aaa cgt gga gta gtt ata cta caa aac aaa tca gat gac ctc cct 954
Ser Lys Arg Gly Val Val Ile Leu Gln Asn Lys Ser Asp Asp Leu Pro
230 235 240
cac tgg gta tta tct gcc atg aag tgc cta gca aat tgg cca aga agc 1002
His Trp Val Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn Trp Pro Arg Ser
245 250 255 260
aat gat atg aat aat cca act tat gtt gga ttt gaa cga gat gta ttc 1050
Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr Val Gly Phe Glu Arg Asp Val Phe
265 270 275
aga aca atc gca gat tat ttt cta gat ctc cct gaa cct cta ctt act 1098
Arg Thr Ile Ala Asp Tyr Phe Leu Asp Leu Pro Glu Pro Leu Leu Thr
280 285 290
ttt gaa tat tac gaa tta ttt gta aac att ttg gtt gtt tgt ggc tac 1146
Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe Val Asn Ile Leu Val Val Cys Gly Tyr
295 300 305
atc aca gtt tca gat aga tcc agt ggg ata cat aaa att caa gat gat 1194
Ile Thr Val Ser Asp Arg Ser Ser Gly Ile His Lys Ile Gln Asp Asp
310 315 320
cca cag tct tca aaa ttc ctt cac tta aac aat ttg aat tcc ttc aaa 1242
Pro Gln Ser Ser Lys Phe Leu His Leu Asn Asn Leu Asn Ser Phe Lys
325 330 335 340
tca act gag tgc ctt ctt ctc agt ctg ctt cat aga gaa aaa aac aaa 1290
Ser Thr Glu Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu His Arg Glu Lys Asn Lys
345 350 355
gaa gaa tca gat tct act gag aga cta cag ata agc aat cca gga ttt 1338
Glu Glu Ser Asp Ser Thr Glu Arg Leu Gln Ile Ser Asn Pro Gly Phe
360 365 370
caa gaa aga tgt gct aag aaa atg cag cta gtt aat tta aga aac aga 1386
Gln Glu Arg Cys Ala Lys Lys Met Gln Leu Val Asn Leu Arg Asn Arg
375 380 385
aga gtg agt gct aat gac ata atg gga gga agt tgt cat aat tta ata 1434
Arg Val Ser Ala Asn Asp Ile Met Gly Gly Ser Cys His Asn Leu Ile
390 395 400
ggg tta agt aat atg cat gat cta tcc tct aac agc aaa cca agg tgc 1482
Gly Leu Ser Asn Met His Asp Leu Ser Ser Asn Ser Lys Pro Arg Cys
405 410 415 420
tgt tct ttg gaa gga att gta gat gtg cca ggg aat tca agt aaa gag 1530
Cys Ser Leu Glu Gly Ile Val Asp Val Pro Gly Asn Ser Ser Lys Glu
425 430 435
gca tcc agt gtc ttt cat caa tct ttt ccg aac ata gaa gga caa aat 1578
Ala Ser Ser Val Phe His Gln Ser Phe Pro Asn Ile Glu Gly Gln Asn
440 445 450
aat aaa ctg ttt tta gag tct aag ccc aaa cag gaa ttc ctg ttg aat 1626
Asn Lys Leu Phe Leu Glu Ser Lys Pro Lys Gln Glu Phe Leu Leu Asn
455 460 465
ctt cat tca gag gaa aat att caa aag cca ttc agt gct ggt ttt aag 1674
Leu His Ser Glu Glu Asn Ile Gln Lys Pro Phe Ser Ala Gly Phe Lys
470 475 480
aga acc tct act ttg act gtt caa gac caa gag gag ttg tgt aat ggg 1722
Arg Thr Ser Thr Leu Thr Val Gln Asp Gln Glu Glu Leu Cys Asn Gly
485 490 495 500
aaa tgc aag tca aaa cag ctt tgt agg tct cag agt ttg ctt tta aga 1770
Lys Cys Lys Ser Lys Gln Leu Cys Arg Ser Gln Ser Leu Leu Leu Arg
505 510 515
agt agt aca aga agg aat agt tat atc aat aca cca gtg gct gaa att 1818
Ser Ser Thr Arg Arg Asn Ser Tyr Ile Asn Thr Pro Val Ala Glu Ile
520 525 530
atc atg aaa cca aat gtt gga caa ggc agc aca agt gtg caa aca gct 1866
Ile Met Lys Pro Asn Val Gly Gln Gly Ser Thr Ser Val Gln Thr Ala
535 540 545
atg gaa agt gaa ctc gga gag tct agt gcc aca atc aat aaa aga ctc 1914
Met Glu Ser Glu Leu Gly Glu Ser Ser Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu
550 555 560
tgc aaa agt aca ata gaa ctt tca gaa aat tct tta ctt cca gct tct 1962
Cys Lys Ser Thr Ile Glu Leu Ser Glu Asn Ser Leu Leu Pro Ala Ser
565 570 575 580
tct atg ttg act ggc aca caa agc ttg ctg caa cct cat tta gag agg 2010
Ser Met Leu Thr Gly Thr Gln Ser Leu Leu Gln Pro His Leu Glu Arg
585 590 595
gtt gcc atc gat gct cta cag tta tgt tgt ttg tta ctt ccc cca cca 2058
Val Ala Ile Asp Ala Leu Gln Leu Cys Cys Leu Leu Leu Pro Pro Pro
600 605 610
aat cgt aga aag ctt caa ctt tta atg cgt atg att tcc cga atg agt 2106
Asn Arg Arg Lys Leu Gln Leu Leu Met Arg Met Ile Ser Arg Met Ser
615 620 625
caa aat gtt gat atg ccc aaa ctt cat gat gca atg ggt acg agg tca 2154
Gln Asn Val Asp Met Pro Lys Leu His Asp Ala Met Gly Thr Arg Ser
630 635 640
ctg atg ata cat acc ttt tct cga tgt gtg tta tgc tgt gct gaa gaa 2202
Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg Cys Val Leu Cys Cys Ala Glu Glu
645 650 655 660
gtg gat ctt gat gag ctt ctt gct gga aga tta gtt tct ttc tta atg 2250
Val Asp Leu Asp Glu Leu Leu Ala Gly Arg Leu Val Ser Phe Leu Met
665 670 675
gat cat cat cag gaa att ctt caa gta ccc tct tac tta cag act gca 2298
Asp His His Gln Glu Ile Leu Gln Val Pro Ser Tyr Leu Gln Thr Ala
680 685 690
gtg gaa aaa cat ctt gac tac tta aaa aag gga cat att gaa aat cct 2346
Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu Lys Lys Gly His Ile Glu Asn Pro
695 700 705
gga gat gga cta ttt gct cct ttg cca act tac tca tac tgt aag cag 2394
Gly Asp Gly Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser Tyr Cys Lys Gln
710 715 720
att agt gct cag gag ttt gat gag caa aaa gtt tct acc tct caa gct 2442
Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu Gln Lys Val Ser Thr Ser Gln Ala
725 730 735 740
gca att gca gaa ctt tta gaa aat att att aaa aac agg agt tta cct 2490
Ala Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ile Lys Asn Arg Ser Leu Pro
745 750 755
cta aag gag aaa aga aaa aaa cta aaa cag ttt cag aag gaa tat cct 2538
Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys Leu Lys Gln Phe Gln Lys Glu Tyr Pro
760 765 770
ttg ata tat cag aaa aga ttt cca acc acg gag agt gaa gca gca ctt 2586
Leu Ile Tyr Gln Lys Arg Phe Pro Thr Thr Glu Ser Glu Ala Ala Leu
775 780 785
ttt ggt gac aaa cct aca atc aag caa cca atg ctg att tta aga aaa 2634
Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys Gln Pro Met Leu Ile Leu Arg Lys
790 795 800
cca aag ttc cgt agt cta aga taa ctaactgaat taaaaattat gtaatacttg 2688
Pro Lys Phe Arg Ser Leu Arg
805 810
tggaactttg ataaatgaag ccatatctga gaatgtagct actcaaaagg aagtctgtca 2748
ttaataaggt atttctaaat aaacacatta tgtaaggaag tgccaaaata gttatcaatg 2808
tgagactctt aggaaactaa ctagatctca attgagagca cataacaata gatgatacca 2868
aatacttttt gtttttaaca cagctatcca gtaaggctat catgatgtgt gctaaaattt 2928
tatttacttg aattttgaaa actgagctgt gttagggatt aaactataat tctgttctta 2988
aaagaaaatt tatctgcaaa tgtgcaagtt ctgagatatt agctaatgaa ttagttgttt 3048
ggggttactt ctttgtttct aagtataaga atgtgaagaa tatttgaaaa ctcaatgaaa 3108
taattctcag ctgccaaatg ttgcactctt ttatatattc tttttccact tttgatctat 3168
ttatatatat gtatgtgttt ttaaaatatg tgtatatttt atcagatttg gttttgcctt 3228
aaatattatc cccaattgct tcagtcattc atttgttcag tatatatatt ttgaattcta 3288
gttttcataa tctattagaa gatggggata taaaagaagt ataaggcaat catatattca 3348
ttcaaaagat atttatttag caactgctat gtgcctttcg ttgttccaga tatgcagaga 3408
caatgataaa taaaacatat aatctcttcc ataaggtatt tattttttaa tcaagggaga 3468
tacacctatc agatgtttaa aataacaaca ctacccactg aaatcagggc atatagaatc 3528
attcagctaa agagtgactt ctatgatgat ggaacaggtc tctaagctag tggttttcaa 3588
actggtacac attagactca cccgaggaat tttaaaacag cctatatgcc cagggcctaa 3648
cttacactaa ttaaatctga attttgggga tgttgtatag ggattagtat tttttttaat 3708
ctaggtgatt ccaatattca gccaactgtg agaatcaatg gcctaaatgc tttttataaa 3768
catttttata agtgtcaaga taatggcaca ttgactttat tttttcattg gaagaaaatg 3828
cctgccaagt ataaatgact ctcatcttaa aacaaggttc ttcaggtttc tgcttgattg 3888
acttggtaca aacttgaagc aagttgcctt ctaattttta ctccaagatt gtttcatatc 3948
tattccttaa gtgtaaagaa atatataatg catggtttgt aataaaatct taatgtttaa 4008
tgactgttct catttctcaa tgtaatttca tactgtttct ctataaaatg atagtattcc 4068
atttaacatt actgattttt attaaaaacc tggacagaaa attataaatt ataaatatga 4128
ctttatcctg gctataaaat tattgaacca aaatgaattc tttctaaggc atttgaatac 4188
taaaacgttt attgtttata gatatgtaaa atgtggatta tgttgcaaat tgagattaaa 4248
attatttggg gttttgtaac aatataattt tgcttttgta ttatagacaa atatataaat 4308
aataaaggca ggcaactttc atttgcacta atgtacatgc aattgagatt acaaaataca 4368
tggtacaatg ctttaataac aaactctgcc agtcaggttt gaatcctact gtgctattaa 4428
ctagctagta aactcagaca agttacttaa cttctctaag ccccagtttt gttatctata 4488
aaatgaatat tataatagta cctcttttta ggattgcgag gattaagcag gataatgcat 4548
gtaaagtgtt agcacagtgt ctcacataga ataagcactc tataaatatt ttactagaat 4608
cacctaggat tatagcacta gaagagatct tagcaaaaat gtggtccttt ctgttgcttt 4668
ggacagacat gaaccaaaac aaaattacgg acaattgatg agccttatta actatctttt 4728
cattatgaga caaaggttct gattatgcct actggttgaa attttttaat ctagtcaaga 4788
aggaaaattt gatgaggaag gaaggaatgg atatcttcag aagggcttcg cctaagctgg 4848
aacatggata gattccattc taacataaag atctttaagt tcaaatatag atgagttgac 4908
tggtagattt ggtggtagtt gctttctcgg gatataagaa gcaaaatcaa ctgctacaag 4968
taaagagggg atggggaagg tgttgcacat ttaaagagag aaagtgtgaa aaagcctaat 5028
tgtgggaatg cacaggtttc accagatcag atgatgtctg gttattctgt aaattatagt 5088
tcttatccca gaaattactg cctccaccat ccctaatatc ttctaattgg tatcatataa 5148
tgacccactc ttcttatgtt atccaaacag ttatgtggca tttagtaatg gaatgtacat 5208
ggaatttccc actgacttac ctttctgtcc ttgggaagct taaactctga atcttctcat 5268
ctgtaaaatg tgaattaaag tatctaccta actgagttgt gattgtagtg aaagaaaggc 5328
aatatattta aatcttgaat ttagcaagcc cacgcttgat ttttatgtcc tttcctcttg 5388
ccttgtattg agtttaagat ctctactgat taaaactctt ttgctatcaa aaaaaaaaaa 5448
aaaaaaaaaa a 5459
<210> 114
<211> 811
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Met Glu Ser Gln Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg Ala Thr Lys Leu
1 5 10 15
Trp Asn Glu Val Thr Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys
20 25 30
His Arg Gln His Phe Lys Lys Tyr Gly Asn Cys Phe Thr Ala Gly Glu
35 40 45
Ala Val Asp Trp Leu Tyr Asp Leu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Phe Gly
50 55 60
Pro Glu Val Thr Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu
65 70 75 80
Lys Asn His Val Ile Glu Asp Ile Lys Gly Arg Trp Gly Ser Glu Asn
85 90 95
Val Asp Asp Asn Asn Gln Leu Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu
100 105 110
Lys Thr Leu Pro Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Lys Asn Asn Ile Glu
115 120 125
Asn Phe Ser Lys Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser
130 135 140
Arg Arg Thr Pro Lys Arg His Gly Leu His Leu Ser Gln Glu Asn Gly
145 150 155 160
Glu Lys Ile Lys His Glu Ile Ile Asn Glu Asp Gln Glu Asn Ala Ile
165 170 175
Asp Asn Arg Glu Leu Ser Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr
180 185 190
Val Ile Leu Ile Tyr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Val Pro Ser Leu Glu
195 200 205
Glu Val Ile Asn Pro Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr Asn
210 215 220
Met Ala Asn Thr Ser Lys Arg Gly Val Val Ile Leu Gln Asn Lys Ser
225 230 235 240
Asp Asp Leu Pro His Trp Val Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn
245 250 255
Trp Pro Arg Ser Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr Val Gly Phe Glu
260 265 270
Arg Asp Val Phe Arg Thr Ile Ala Asp Tyr Phe Leu Asp Leu Pro Glu
275 280 285
Pro Leu Leu Thr Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe Val Asn Ile Leu Val
290 295 300
Val Cys Gly Tyr Ile Thr Val Ser Asp Arg Ser Ser Gly Ile His Lys
305 310 315 320
Ile Gln Asp Asp Pro Gln Ser Ser Lys Phe Leu His Leu Asn Asn Leu
325 330 335
Asn Ser Phe Lys Ser Thr Glu Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu His Arg
340 345 350
Glu Lys Asn Lys Glu Glu Ser Asp Ser Thr Glu Arg Leu Gln Ile Ser
355 360 365
Asn Pro Gly Phe Gln Glu Arg Cys Ala Lys Lys Met Gln Leu Val Asn
370 375 380
Leu Arg Asn Arg Arg Val Ser Ala Asn Asp Ile Met Gly Gly Ser Cys
385 390 395 400
His Asn Leu Ile Gly Leu Ser Asn Met His Asp Leu Ser Ser Asn Ser
405 410 415
Lys Pro Arg Cys Cys Ser Leu Glu Gly Ile Val Asp Val Pro Gly Asn
420 425 430
Ser Ser Lys Glu Ala Ser Ser Val Phe His Gln Ser Phe Pro Asn Ile
435 440 445
Glu Gly Gln Asn Asn Lys Leu Phe Leu Glu Ser Lys Pro Lys Gln Glu
450 455 460
Phe Leu Leu Asn Leu His Ser Glu Glu Asn Ile Gln Lys Pro Phe Ser
465 470 475 480
Ala Gly Phe Lys Arg Thr Ser Thr Leu Thr Val Gln Asp Gln Glu Glu
485 490 495
Leu Cys Asn Gly Lys Cys Lys Ser Lys Gln Leu Cys Arg Ser Gln Ser
500 505 510
Leu Leu Leu Arg Ser Ser Thr Arg Arg Asn Ser Tyr Ile Asn Thr Pro
515 520 525
Val Ala Glu Ile Ile Met Lys Pro Asn Val Gly Gln Gly Ser Thr Ser
530 535 540
Val Gln Thr Ala Met Glu Ser Glu Leu Gly Glu Ser Ser Ala Thr Ile
545 550 555 560
Asn Lys Arg Leu Cys Lys Ser Thr Ile Glu Leu Ser Glu Asn Ser Leu
565 570 575
Leu Pro Ala Ser Ser Met Leu Thr Gly Thr Gln Ser Leu Leu Gln Pro
580 585 590
His Leu Glu Arg Val Ala Ile Asp Ala Leu Gln Leu Cys Cys Leu Leu
595 600 605
Leu Pro Pro Pro Asn Arg Arg Lys Leu Gln Leu Leu Met Arg Met Ile
610 615 620
Ser Arg Met Ser Gln Asn Val Asp Met Pro Lys Leu His Asp Ala Met
625 630 635 640
Gly Thr Arg Ser Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg Cys Val Leu Cys
645 650 655
Cys Ala Glu Glu Val Asp Leu Asp Glu Leu Leu Ala Gly Arg Leu Val
660 665 670
Ser Phe Leu Met Asp His His Gln Glu Ile Leu Gln Val Pro Ser Tyr
675 680 685
Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu Lys Lys Gly His
690 695 700
Ile Glu Asn Pro Gly Asp Gly Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser
705 710 715 720
Tyr Cys Lys Gln Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu Gln Lys Val Ser
725 730 735
Thr Ser Gln Ala Ala Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ile Lys Asn
740 745 750
Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys Leu Lys Gln Phe Gln
755 760 765
Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr Gln Lys Arg Phe Pro Thr Thr Glu Ser
770 775 780
Glu Ala Ala Leu Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys Gln Pro Met Leu
785 790 795 800
Ile Leu Arg Lys Pro Lys Phe Arg Ser Leu Arg
805 810
<210> 115
<211> 4607
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (223)..(1806)
<400> 115
agctactgga gccccaggac gcagccgagc ggccctcgcc gactccttcc cgagcctggc 60
tgtggcgtca cgtgacccgc ggcgcggcca atccgcgcag ccctctatgc tattcaaatc 120
ggcggcgggg ccaacggttg tgccgagact cgccactgcc gcggccgctg ggcctgagtg 180
tcgccttcgc cgccatggac gccaccgggc gctgacagac ct atg gag agt cag 234
Met Glu Ser Gln
1
ggt gtg cct ccc ggg cct tat cgg gcc acc aag ctg tgg aat gaa gtt 282
Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg Ala Thr Lys Leu Trp Asn Glu Val
5 10 15 20
acc aca tct ttt cga gca gga atg cct cta aga aaa cac aga caa cac 330
Thr Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys His Arg Gln His
25 30 35
ttt aaa aaa tat ggc aat tgt ttc aca gca gga gaa gca gtg gat tgg 378
Phe Lys Lys Tyr Gly Asn Cys Phe Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp
40 45 50
ctt tat gac cta tta aga aat aat agc aat ttt ggt cct gaa gtt aca 426
Leu Tyr Asp Leu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Phe Gly Pro Glu Val Thr
55 60 65
agg caa cag act atc caa ctg ttg agg aaa ttt ctt aag aat cat gta 474
Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu Lys Asn His Val
70 75 80
att gaa gat atc aaa ggg agg tgg gga tca gaa aat gtt gat gat aac 522
Ile Glu Asp Ile Lys Gly Arg Trp Gly Ser Glu Asn Val Asp Asp Asn
85 90 95 100
aac cag ctc ttc aga ttt cct gca act tcg cca ctt aaa act cta cca 570
Asn Gln Leu Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro
105 110 115
cga agg tat cca gaa ttg aga aaa aac aac ata gag aac ttt tcc aaa 618
Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Lys Asn Asn Ile Glu Asn Phe Ser Lys
120 125 130
gat aaa gat agc att ttt aaa tta cga aac tta tct cgt aga act cct 666
Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser Arg Arg Thr Pro
135 140 145
aaa agg cat gga tta cat tta tct cag gaa aat ggc gag aaa ata aag 714
Lys Arg His Gly Leu His Leu Ser Gln Glu Asn Gly Glu Lys Ile Lys
150 155 160
cat gaa ata atc aat gaa gat caa gaa aat gca att gat aat aga gaa 762
His Glu Ile Ile Asn Glu Asp Gln Glu Asn Ala Ile Asp Asn Arg Glu
165 170 175 180
cta agc cag gaa gat gtt gaa gaa gtt tgg aga tat gtt att ctg atc 810
Leu Ser Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr Val Ile Leu Ile
185 190 195
tac ctg caa acc att tta ggt gtg cca tcc cta gaa gaa gtc ata aat 858
Tyr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Val Pro Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn
200 205 210
cca aaa caa gta att ccc caa tat ata atg tac aac atg gcc aat aca 906
Pro Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr Asn Met Ala Asn Thr
215 220 225
agt aaa cgt gga gta gtt ata cta caa aac aaa tca gat gac ctc cct 954
Ser Lys Arg Gly Val Val Ile Leu Gln Asn Lys Ser Asp Asp Leu Pro
230 235 240
cac tgg gta tta tct gcc atg aag tgc cta gca aat tgg cca aga agc 1002
His Trp Val Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn Trp Pro Arg Ser
245 250 255 260
aat gat atg aat aat cca act tat gtt gga ttt gaa cga gat gta ttc 1050
Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr Val Gly Phe Glu Arg Asp Val Phe
265 270 275
aga aca atc gca gat tat ttt cta gat ctc cct gaa cct cta ctt act 1098
Arg Thr Ile Ala Asp Tyr Phe Leu Asp Leu Pro Glu Pro Leu Leu Thr
280 285 290
ttt gaa tat tac gaa tta ttt gta aac att ttg ggc ttg ctg caa cct 1146
Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe Val Asn Ile Leu Gly Leu Leu Gln Pro
295 300 305
cat tta gag agg gtt gcc atc gat gct cta cag tta tgt tgt ttg tta 1194
His Leu Glu Arg Val Ala Ile Asp Ala Leu Gln Leu Cys Cys Leu Leu
310 315 320
ctt ccc cca cca aat cgt aga aag ctt caa ctt tta atg cgt atg att 1242
Leu Pro Pro Pro Asn Arg Arg Lys Leu Gln Leu Leu Met Arg Met Ile
325 330 335 340
tcc cga atg agt caa aat gtt gat atg ccc aaa ctt cat gat gca atg 1290
Ser Arg Met Ser Gln Asn Val Asp Met Pro Lys Leu His Asp Ala Met
345 350 355
ggt acg agg tca ctg atg ata cat acc ttt tct cga tgt gtg tta tgc 1338
Gly Thr Arg Ser Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg Cys Val Leu Cys
360 365 370
tgt gct gaa gaa gtg gat ctt gat gag ctt ctt gct gga aga tta gtt 1386
Cys Ala Glu Glu Val Asp Leu Asp Glu Leu Leu Ala Gly Arg Leu Val
375 380 385
tct ttc tta atg gat cat cat cag gaa att ctt caa gta ccc tct tac 1434
Ser Phe Leu Met Asp His His Gln Glu Ile Leu Gln Val Pro Ser Tyr
390 395 400
tta cag act gca gtg gaa aaa cat ctt gac tac tta aaa aag gga cat 1482
Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu Lys Lys Gly His
405 410 415 420
att gaa aat cct gga gat gga cta ttt gct cct ttg cca act tac tca 1530
Ile Glu Asn Pro Gly Asp Gly Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser
425 430 435
tac tgt aag cag att agt gct cag gag ttt gat gag caa aaa gtt tct 1578
Tyr Cys Lys Gln Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu Gln Lys Val Ser
440 445 450
acc tct caa gct gca att gca gaa ctt tta gaa aat att att aaa aac 1626
Thr Ser Gln Ala Ala Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ile Lys Asn
455 460 465
agg agt tta cct cta aag gag aaa aga aaa aaa cta aaa cag ttt cag 1674
Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys Leu Lys Gln Phe Gln
470 475 480
aag gaa tat cct ttg ata tat cag aaa aga ttt cca acc acg gag agt 1722
Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr Gln Lys Arg Phe Pro Thr Thr Glu Ser
485 490 495 500
gaa gca gca ctt ttt ggt gac aaa cct aca atc aag caa cca atg ctg 1770
Glu Ala Ala Leu Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys Gln Pro Met Leu
505 510 515
att tta aga aaa cca aag ttc cgt agt cta aga taa ctaactgaat 1816
Ile Leu Arg Lys Pro Lys Phe Arg Ser Leu Arg
520 525
taaaaattat gtaatacttg tggaactttg ataaatgaag ccatatctga gaatgtagct 1876
actcaaaagg aagtctgtca ttaataaggt atttctaaat aaacacatta tgtaaggaag 1936
tgccaaaata gttatcaatg tgagactctt aggaaactaa ctagatctca attgagagca 1996
cataacaata gatgatacca aatacttttt gtttttaaca cagctatcca gtaaggctat 2056
catgatgtgt gctaaaattt tatttacttg aattttgaaa actgagctgt gttagggatt 2116
aaactataat tctgttctta aaagaaaatt tatctgcaaa tgtgcaagtt ctgagatatt 2176
agctaatgaa ttagttgttt ggggttactt ctttgtttct aagtataaga atgtgaagaa 2236
tatttgaaaa ctcaatgaaa taattctcag ctgccaaatg ttgcactctt ttatatattc 2296
tttttccact tttgatctat ttatatatat gtatgtgttt ttaaaatatg tgtatatttt 2356
atcagatttg gttttgcctt aaatattatc cccaattgct tcagtcattc atttgttcag 2416
tatatatatt ttgaattcta gttttcataa tctattagaa gatggggata taaaagaagt 2476
ataaggcaat catatattca ttcaaaagat atttatttag caactgctat gtgcctttcg 2536
ttgttccaga tatgcagaga caatgataaa taaaacatat aatctcttcc ataaggtatt 2596
tattttttaa tcaagggaga tacacctatc agatgtttaa aataacaaca ctacccactg 2656
aaatcagggc atatagaatc attcagctaa agagtgactt ctatgatgat ggaacaggtc 2716
tctaagctag tggttttcaa actggtacac attagactca cccgaggaat tttaaaacag 2776
cctatatgcc cagggcctaa cttacactaa ttaaatctga attttgggga tgttgtatag 2836
ggattagtat tttttttaat ctaggtgatt ccaatattca gccaactgtg agaatcaatg 2896
gcctaaatgc tttttataaa catttttata agtgtcaaga taatggcaca ttgactttat 2956
tttttcattg gaagaaaatg cctgccaagt ataaatgact ctcatcttaa aacaaggttc 3016
ttcaggtttc tgcttgattg acttggtaca aacttgaagc aagttgcctt ctaattttta 3076
ctccaagatt gtttcatatc tattccttaa gtgtaaagaa atatataatg catggtttgt 3136
aataaaatct taatgtttaa tgactgttct catttctcaa tgtaatttca tactgtttct 3196
ctataaaatg atagtattcc atttaacatt actgattttt attaaaaacc tggacagaaa 3256
attataaatt ataaatatga ctttatcctg gctataaaat tattgaacca aaatgaattc 3316
tttctaaggc atttgaatac taaaacgttt attgtttata gatatgtaaa atgtggatta 3376
tgttgcaaat tgagattaaa attatttggg gttttgtaac aatataattt tgcttttgta 3436
ttatagacaa atatataaat aataaaggca ggcaactttc atttgcacta atgtacatgc 3496
aattgagatt acaaaataca tggtacaatg ctttaataac aaactctgcc agtcaggttt 3556
gaatcctact gtgctattaa ctagctagta aactcagaca agttacttaa cttctctaag 3616
ccccagtttt gttatctata aaatgaatat tataatagta cctcttttta ggattgcgag 3676
gattaagcag gataatgcat gtaaagtgtt agcacagtgt ctcacataga ataagcactc 3736
tataaatatt ttactagaat cacctaggat tatagcacta gaagagatct tagcaaaaat 3796
gtggtccttt ctgttgcttt ggacagacat gaaccaaaac aaaattacgg acaattgatg 3856
agccttatta actatctttt cattatgaga caaaggttct gattatgcct actggttgaa 3916
attttttaat ctagtcaaga aggaaaattt gatgaggaag gaaggaatgg atatcttcag 3976
aagggcttcg cctaagctgg aacatggata gattccattc taacataaag atctttaagt 4036
tcaaatatag atgagttgac tggtagattt ggtggtagtt gctttctcgg gatataagaa 4096
gcaaaatcaa ctgctacaag taaagagggg atggggaagg tgttgcacat ttaaagagag 4156
aaagtgtgaa aaagcctaat tgtgggaatg cacaggtttc accagatcag atgatgtctg 4216
gttattctgt aaattatagt tcttatccca gaaattactg cctccaccat ccctaatatc 4276
ttctaattgg tatcatataa tgacccactc ttcttatgtt atccaaacag ttatgtggca 4336
tttagtaatg gaatgtacat ggaatttccc actgacttac ctttctgtcc ttgggaagct 4396
taaactctga atcttctcat ctgtaaaatg tgaattaaag tatctaccta actgagttgt 4456
gattgtagtg aaagaaaggc aatatattta aatcttgaat ttagcaagcc cacgcttgat 4516
ttttatgtcc tttcctcttg ccttgtattg agtttaagat ctctactgat taaaactctt 4576
ttgctatcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 4607
<210> 116
<211> 527
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Met Glu Ser Gln Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg Ala Thr Lys Leu
1 5 10 15
Trp Asn Glu Val Thr Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys
20 25 30
His Arg Gln His Phe Lys Lys Tyr Gly Asn Cys Phe Thr Ala Gly Glu
35 40 45
Ala Val Asp Trp Leu Tyr Asp Leu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Phe Gly
50 55 60
Pro Glu Val Thr Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu
65 70 75 80
Lys Asn His Val Ile Glu Asp Ile Lys Gly Arg Trp Gly Ser Glu Asn
85 90 95
Val Asp Asp Asn Asn Gln Leu Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu
100 105 110
Lys Thr Leu Pro Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Lys Asn Asn Ile Glu
115 120 125
Asn Phe Ser Lys Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser
130 135 140
Arg Arg Thr Pro Lys Arg His Gly Leu His Leu Ser Gln Glu Asn Gly
145 150 155 160
Glu Lys Ile Lys His Glu Ile Ile Asn Glu Asp Gln Glu Asn Ala Ile
165 170 175
Asp Asn Arg Glu Leu Ser Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr
180 185 190
Val Ile Leu Ile Tyr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Val Pro Ser Leu Glu
195 200 205
Glu Val Ile Asn Pro Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr Asn
210 215 220
Met Ala Asn Thr Ser Lys Arg Gly Val Val Ile Leu Gln Asn Lys Ser
225 230 235 240
Asp Asp Leu Pro His Trp Val Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn
245 250 255
Trp Pro Arg Ser Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr Val Gly Phe Glu
260 265 270
Arg Asp Val Phe Arg Thr Ile Ala Asp Tyr Phe Leu Asp Leu Pro Glu
275 280 285
Pro Leu Leu Thr Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe Val Asn Ile Leu Gly
290 295 300
Leu Leu Gln Pro His Leu Glu Arg Val Ala Ile Asp Ala Leu Gln Leu
305 310 315 320
Cys Cys Leu Leu Leu Pro Pro Pro Asn Arg Arg Lys Leu Gln Leu Leu
325 330 335
Met Arg Met Ile Ser Arg Met Ser Gln Asn Val Asp Met Pro Lys Leu
340 345 350
His Asp Ala Met Gly Thr Arg Ser Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg
355 360 365
Cys Val Leu Cys Cys Ala Glu Glu Val Asp Leu Asp Glu Leu Leu Ala
370 375 380
Gly Arg Leu Val Ser Phe Leu Met Asp His His Gln Glu Ile Leu Gln
385 390 395 400
Val Pro Ser Tyr Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu
405 410 415
Lys Lys Gly His Ile Glu Asn Pro Gly Asp Gly Leu Phe Ala Pro Leu
420 425 430
Pro Thr Tyr Ser Tyr Cys Lys Gln Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu
435 440 445
Gln Lys Val Ser Thr Ser Gln Ala Ala Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn
450 455 460
Ile Ile Lys Asn Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys Leu
465 470 475 480
Lys Gln Phe Gln Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr Gln Lys Arg Phe Pro
485 490 495
Thr Thr Glu Ser Glu Ala Ala Leu Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys
500 505 510
Gln Pro Met Leu Ile Leu Arg Lys Pro Lys Phe Arg Ser Leu Arg
515 520 525
<210> 117
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 117
Asn Lys Arg Lys
1

Claims (23)

1.具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108；以及
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或添加了1、2或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108。
2.权利要求1的肽，其选自下组(i)：
(i)包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组(a)至(c)的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108：
(a)用选自由苏氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；
(c)用酪氨酸取代C末端的氨基酸。
3.权利要求1的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108。
4.多核苷酸，其编码权利要求1至3中任一项的肽。
5.组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
6.权利要求5的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物。
7.权利要求5的组合物，其是药物组合物。
8.权利要求7的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：(i)癌症治疗,(ii)癌症预防(防范(prophylaxis))和(iii)手术后癌症复发的预防(防范)。
9.权利要求7的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
10.权利要求8或9的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、乳腺癌、***、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、***癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤。
11.权利要求5至10中任一项的组合物，其配制为用于对至少一种选自下组的HLA阳性的受试者施用：HLA-A11和HLA-A01。
12.诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)在体外，离体或体内将APC与权利要求1至3中任一项的肽接触；和
(b)将编码权利要求1至3中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
13.诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；和
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的权利要求1至3中任一项的肽。
14.APC，其在其表面呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物。
15.权利要求14的APC，其通过权利要求12的方法诱导。
16.CTL，其靶向权利要求1-3中任一项的肽。
17.权利要求16的CTL，其通过权利要求13的方法诱导。
18.诱导针对癌症的免疫应答方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
19.治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物选自下组(a)至(e)的至少一种活性成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
20.抗体，其结合权利要求1至3中任一项的肽。
21.筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自下组的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、***和/或添加一个，两个或数个氨基酸残基：SEQ ID NOs:81,82,21,83,84,85,86,87,88,89,90,91,58,92,96,99,101,102,103,104,106,107,和108；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与除DEPDC1外的任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择出的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
22.乳剂，其包含一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽，水溶性载体和油佐剂。
23.试剂盒，其包含容纳权利要求5至11中任一项的组合物的容器和容纳佐剂的容器。
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