CN112957533A - 一种仿皮质骨修复材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种仿皮质骨修复材料的制备方法，包括以下步骤，将洁净后的异种骨骨材经充分去除软组织、骨髓和软骨后清洗，再经过进行脱脂、脱钙，将骨块浸泡于戊二醛溶液进行交联处理，将其放入胃蛋白酶的蛋白水解酶中浸泡经脱蛋白处理，将异种骨骨材与纳米银明胶溶液进行复合，最后经冷冻干燥后制得皮质骨植骨材料。通过对异种骨脱脂、脱钙、冷冻干燥协助降低抗原性，保留了成骨活性，提高异种骨的成骨活性，通过胃蛋白酶进行脱蛋白处理，可减少对植骨材料中的胶原蛋白和成骨因子的破坏，采用的纳米银微粉作为抗菌成份，可对多种致病微生物都有强烈的抑制和杀灭作用，使植骨材料形成缓释膜，同时能进一步提高异种骨植骨材料的抗感染效力。

Description

一种仿皮质骨修复材料的制备方法
技术领域
本发明涉及骨组织再造技术领域，尤其涉及一种仿皮质骨修复材料的制备方法。
背景技术
由于创伤、骨病等造成骨缺损，骨缺损的修复一直是骨科治疗的一个难题。自体骨存在着来源受限，影响供区功能，增加手术创伤及感染等缺点；同种异体骨来源也受到限制，且有感染艾滋病病毒、肝炎病毒等疾病的危险。
异种骨作为一种生物组织，具有来源广泛，且易于大量获取等优点，具备天然的多孔网状结构和较好的生物力学强度，比人工合成骨材料更易于吸收、替代。异种骨包括牛骨、猪骨、鹿骨,羊骨等,因其尺寸和力学强度更符合骨移植材料的要求。作为异种骨具有较强的抗原性，植入人体后能够诱发免疫排斥反应,因此必须通过各种处理方式来减弱其抗原性。
目前用于实验和临床的异种骨植骨材料是通过高温煅烧、冷冻和冻干、物理化学等处理,植骨后效果多不理想。煅烧骨是将异种骨经高温煅烧除去骨中有机质而成,虽能彻底消除抗原性,但对材料的力学性能和降解性能有影响，且破坏了骨中的天然活性诱导成分。如何对异种骨进行加工处理，使其在降低抗原性的同时也能很大程度地保留成骨诱导活性和适当的生物力学强度，这对本领域技术人员开发出新型的植骨材料具有重要的意义。
对于开放性骨折和严重的骨缺损的治疗，一直成为医学界难以解决的问题。难度在于手术植骨存在发生感染的可能，所以常规解决方法是在骨折后的感染、慢性骨髓炎遗留的大骨缺损伤口愈合至少十个月后才进行手术植骨，尽管如此，骨移植还常常因为感染的复发而失败。
发明内容
本发明的目的是针对以上问题提供一种仿皮质骨修复材料的制备方法，以提高异种骨的成骨活性和骨的抗感染能力。
为达到上述目的，本发明公开了一种仿皮质骨修复材料的制备方法，包括以下步骤，将洁净后的异种骨骨材经充分去除软组织、骨髓和软骨后清洗，再经过进行脱脂、脱钙，将骨块浸泡于戊二醛溶液进行交联处理，然后将其放入胃蛋白酶的蛋白水解酶中浸泡经脱蛋白处理，将异种骨骨材与纳米银明胶溶液进行复合，最后经冷冻干燥后制得皮质骨植骨材料。
所述去除软组织、骨髓和软骨过程是将异种骨骨材置入蒸馏水洗涤去除表面杂物，并对骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物，最后将处理好的骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物且进行干燥处理。
所述脱脂过程主要是指将洁净后的异种骨骨材放入氯仿-甲醇混合溶液中浸泡脱脂，不断更换新的氯仿-甲醇混合溶液直至其颜色不再变浑浊，所述氯仿-甲醇混合溶液是由体积比为2∶1的氯仿和甲醇配制而成，异种骨骨材与氯仿-甲醇混合溶液的体积比控制在1∶2。
所述脱钙过程主要是指将异种骨骨材放入盐酸中浸泡脱钙，浸泡时间为24～30小时，所述盐酸的浓度为0.7～0.8mol/L，在盐酸中浸泡时的温度控制在4℃。
所述交联处理为用0.03％～0.05％戊二醛在4℃环境下浸泡异种骨骨材8～10小时。
所述脱蛋白处理主要是指将异种骨骨材浸泡于胃蛋白酶溶液中进行脱蛋白，每克异种骨骨材需要400～800U/mg胃蛋白酶进行处理， 所述胃蛋白酶溶液的pH值控制在6.0～7.0，异种骨骨材与胃蛋白酶液的体积比控制在 1∶(3～5)。
所述纳米银明胶溶液为将明胶、无水甘油、蒸馏水按3∶1∶6的比例混合后，80℃水浴 45分钟溶解成明胶水溶液；
按1ml明胶水溶液∶纳米银微粉5～7mg的比例，将纳米银微粉加入明胶水溶液，搅拌混合。
所述冷冻干燥过程为将与纳米银明胶溶液复合的异种骨骨材放入-72℃～-80℃冻干机内冻结干燥12小时，得到本发明的牛皮质骨植骨材料。
所述异种骨骨材可以为牛骨、猪骨、鹿骨，羊骨。
综上所述，本发明的有益效果在于：在本发明方法中，通过对异种骨脱脂、脱钙、冷冻干燥协助降低抗原性，最大限度地保留了成骨活性，提高了异种骨的成骨活性，而通过胃蛋白酶进行脱蛋白处理，可以极大限度的减少对植骨材料中的胶原蛋白和成骨因子的破坏，进一步采用纳米银微粉作为抗菌成份，可对多种致病微生物都有强烈的抑制和杀灭作用，使植骨材料形成缓释膜，进一步提高异种骨植骨材料的抗感染效力。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明技术方案的可实施性，而不是将本发明的保护范围限制在以下的具体实施例上。
实施例1
取新宰杀的牛、猪、羊的长管状骨，用电锯锯去两侧干骺端，骨刀去净周围软组织、骨膜及骨髓。骨松质锯成 6.0CM×4.0CM×1.0CM块状；骨皮质锯成8.0CM×4.0CM×0.80CM骨板；也可以加工成0.5CM ×0.5CM×0.5CM小块状，将骨材置入蒸馏水洗涤去除表面杂物，并对骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物，最后将处理好的骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物且进行干燥处理。
在可密闭的玻璃容器中盛入氯仿与甲醇体积比为2∶1的氯仿-甲醇混合溶液 (简称脱脂液)，将洁净处理后的异种骨骨材按骨液体积比约1∶2放入玻璃容器内并在室温下浸泡，浸泡脱脂过程中每隔4小时用无菌玻棒搅拌3～5分钟，每12小时更换一次脱脂液， 直到更换后的脱脂液经一段时间脱脂后颜色仍然澄清为止(浸泡时间约为72小时)；更换脱脂液时用蒸馏水冲洗净容器内的软组织残渣，并将骨块置入离心机内离心约30分钟(3000 转/分)以清除骨块内脂滴；脱脂完毕后用蒸馏水反复冲洗异种骨骨材至无氯仿、甲醇气味，再用蒸馏水透析24小时，以去除残留的有机溶剂，最后沥干。
将脱脂后的异种骨骨材放入盛有盐酸浓度为0.75mol/L的可密闭容器中浸泡脱钙，一般浸泡24～30小时即可，浸泡过程中可对盐酸进行更换，浸泡时的温度优选控制在4℃；浸泡脱钙完毕后可用蒸馏水漂洗至pH值接近中性，以使其接近人体生理的pH值水平，漂洗后沥干；
脱钙后的异种骨骨材用0.04％戊二醛在4℃环境下浸泡8小时，用于促进骨材中胶原成分的交联，且提高骨材的强度和韧性。
将交联处理后的异种骨骨材放入盛有木瓜蛋白酶(papain)溶液的密闭容器中进行脱蛋白，每克异种骨骨材需要600U/mg胃蛋白酶进行处理， 胃蛋白酶溶液的pH值控制在6.0～7.0，异种骨骨材与木瓜蛋白酶溶液的体积比控制在 1∶4；在胃蛋白酶溶液中浸泡的温度控制50℃～60℃，浸泡时间一般不短于18小时；脱蛋白后可用蒸馏水冲洗、沥干；
按1mg明胶水溶液∶纳米银微粉6mg的比例，将纳米银微粉加入明胶水溶液，搅拌混合，该纳米银明胶溶液为将明胶、无水甘油、蒸馏水按3∶1∶6的比例混合后，80℃水浴 45分钟溶解成的明胶水溶液；
将与纳米银明胶溶液复合的异种骨骨材放入-72℃～-80℃冻干机内冻结干燥12小时，装入双层聚乙烯塑料袋，封口得到本发明的皮质骨植骨材料。
实施例2
取新宰杀的牛、猪、羊的长管状骨，用电锯锯去两侧干骺端，骨刀去净周围软组织、骨膜及骨髓。骨松质锯成 6.0CM×4.0CM×1.0CM块状；骨皮质锯成8.0CM×4.0CM×0.80CM骨板；也可以加工成0.5CM ×0.5CM×0.5CM小块状，将骨材置入蒸馏水洗涤去除表面杂物，并对骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物，最后将处理好的骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物且进行干燥处理。
在可密闭的玻璃容器中盛入氯仿与甲醇体积比为2∶1的氯仿-甲醇混合溶液 (简称脱脂液)，将洁净处理后的异种骨骨材按骨液体积比约1∶2放入玻璃容器内并在室温下浸泡，浸泡脱脂过程中每隔4小时用无菌玻棒搅拌3～5分钟，每12小时更换一次脱脂液， 直到更换后的脱脂液经一段时间脱脂后颜色仍然澄清为止(浸泡时间约为72小时)；更换脱脂液时用蒸馏水冲洗净容器内的软组织残渣，并将骨块置入离心机内离心约30分钟(3000 转/分)以清除骨块内脂滴；脱脂完毕后用蒸馏水反复冲洗异种骨骨材至无氯仿、甲醇气味，再用蒸馏水透析24小时，以去除残留的有机溶剂，最后沥干。
将脱脂后的异种骨骨材放入盛有盐酸浓度为0.7mol/L的可密闭容器中浸泡脱钙，一般浸泡24～30小时即可，浸泡过程中可对盐酸进行更换，浸泡时的温度优选控制在4℃；浸泡脱钙完毕后可用蒸馏水漂洗至pH值接近中性，以使其接近人体生理的pH值水平，漂洗后沥干；
用0.03％戊二醛在4℃环境下浸泡异种骨骨材8小时，用于促进骨材中胶原成分的交联，且提高骨材的强度和韧性。
将交联处理后的异种骨骨材放入盛有木瓜蛋白酶(papain)溶液的密闭容器中进行脱蛋白，每克异种骨骨材需要400U/mg胃蛋白酶进行处理， 胃蛋白酶溶液的pH值控制在6.0～7.0，异种骨骨材与木瓜蛋白酶溶液的体积比控制在 1∶3；在胃蛋白酶溶液中浸泡的温度控制在控制在50℃～60℃，浸泡时间一般不短于18小时；脱蛋白后可用蒸馏水冲洗、沥干；
按1mg明胶水溶液∶纳米银微粉5mg的比例，将纳米银微粉加入明胶水溶液，搅拌混合，该纳米银明胶溶液为将明胶、无水甘油、蒸馏水按3∶1∶6的比例混合后，80℃水浴 45分钟溶解成的明胶水溶液；
将与纳米银明胶溶液复合的异种骨骨材放入-72℃～-80℃冻干机内冻结干燥12小时，装入双层聚乙烯塑料袋，封口得到本发明的皮质骨植骨材料。
实施例3
取新宰杀的牛、猪、羊的长管状骨，用电锯锯去两侧干骺端，骨刀去净周围软组织、骨膜及骨髓。骨松质锯成 6.0CM×4.0CM×1.0CM块状；骨皮质锯成8.0CM×4.0CM×0.80CM骨板；也可以加工成0.5CM ×0.5CM×0.5CM小块状，将骨材置入蒸馏水洗涤去除表面杂物，并对骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物，最后将处理好的骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物且进行干燥处理。
在可密闭的玻璃容器中盛入氯仿与甲醇体积比为2∶1的氯仿-甲醇混合溶液 (简称脱脂液)，将洁净处理后的异种骨骨材按骨液体积比约1∶2放入玻璃容器内并在室温下浸泡，浸泡脱脂过程中每隔4小时用无菌玻棒搅拌3～5分钟，每12小时更换一次脱脂液， 直到更换后的脱脂液经一段时间脱脂后颜色仍然澄清为止(浸泡时间约为72小时)；更换脱脂液时用蒸馏水冲洗净容器内的软组织残渣，并将骨块置入离心机内离心约30分钟(3000 转/分)以清除骨块内脂滴；脱脂完毕后用蒸馏水反复冲洗异种骨骨材至无氯仿、甲醇气味，再用蒸馏水透析24小时，以去除残留的有机溶剂，最后沥干。
将脱脂后的异种骨骨材放入盛有盐酸浓度为0.8mol/L的可密闭容器中浸泡脱钙，一般浸泡24～30小时即可，浸泡过程中可对盐酸进行更换，浸泡时的温度优选控制在4℃；浸泡脱钙完毕后可用蒸馏水漂洗至pH值接近中性，以使其接近人体生理的pH值水平，漂洗后沥干；
用0.05％戊二醛在4℃环境下浸泡异种骨骨材8小时，用于促进骨材中胶原成分的交联，且提高骨材的强度和韧性。
将交联处理后的异种骨骨材放入盛有木瓜蛋白酶(papain)溶液的密闭容器中进行脱蛋白，每克异种骨骨材需要800U/mg胃蛋白酶进行处理， 胃蛋白酶溶液的pH值控制在6.0～7.0，异种骨骨材与木瓜蛋白酶溶液的体积比控制在 1∶5；在胃蛋白酶溶液中浸泡的温度控制在39～68℃，浸泡时间一般不短于18小时(优选18～36小时)；脱蛋白后可用蒸馏水冲洗、沥干；
按1mg明胶水溶液∶纳米银微粉7mg的比例，将纳米银微粉加入明胶水溶液，搅拌混合，该纳米银明胶溶液为将明胶、无水甘油、蒸馏水按3∶1∶6的比例混合后，80℃水浴 45分钟溶解成的明胶水溶液；
将与纳米银明胶溶液复合的异种骨骨材放入-72℃～-80℃冻干机内冻结干燥12小时，装入双层聚乙烯塑料袋，封口得到本发明的皮质骨植骨材料。
这样通过对异种骨脱脂、脱钙、冷冻干燥协助降低抗原性，最大限度地保留了成骨活性，提高了异种骨的成骨活性，而通过胃蛋白酶进行脱蛋白处理，可以极大限度的减少对植骨材料中的胶原蛋白和成骨因子的破坏，进一步采用纳米银微粉作为抗菌成份，可对多种致病微生物都有强烈的抑制和杀灭作用，使植骨材料形成缓释膜，进一步提高异种骨植骨材料的抗感染效力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种仿皮质骨修复材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤，将洁净后的异种骨骨材经充分去除软组织、骨髓和软骨后清洗，再经过进行脱脂、脱钙，将骨块浸泡于戊二醛溶液进行交联处理，然后将其放入胃蛋白酶的蛋白水解酶中浸泡经脱蛋白处理，将异种骨骨材与纳米银明胶溶液进行复合，最后经冷冻干燥后制得皮质骨植骨材料。
2.如权利要求1所述的仿皮质骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述去除软组织、骨髓和软骨过程是将异种骨骨材置入蒸馏水洗涤去除表面杂物，并对骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物，最后将处理好的骨块做超声洗涤，去除表面及骨孔内的杂物且进行干燥处理。
3.如权利要求1所述的仿皮质骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述脱脂过程主要是指将洁净后的异种骨骨材放入氯仿-甲醇混合溶液中浸泡脱脂，不断更换新的氯仿-甲醇混合溶液直至其颜色不再变浑浊，所述氯仿-甲醇混合溶液是由体积比为2∶1的氯仿和甲醇配制而成，异种骨骨材与氯仿-甲醇混合溶液的体积比控制在1∶2。
4.如权利要求1所述的仿皮质骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述脱钙过程主要是指将异种骨骨材放入盐酸中浸泡脱钙，浸泡时间为24～30小时，所述盐酸的浓度为0.7～0.8mol/L，在盐酸中浸泡时的温度控制在4℃。
5.如权利要求1所述的仿皮质骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述交联处理为用0.03％～0.05％戊二醛在4℃环境下浸泡异种骨骨材8～10小时。
6.如权利要求1所述的仿皮质骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述脱蛋白处理主要是指将异种骨骨材浸泡于胃蛋白酶溶液中进行脱蛋白，每克异种骨骨材需要400～800U/mg胃蛋白酶进行处理， 所述胃蛋白酶溶液的pH值控制在6.0～7.0，异种骨骨材与胃蛋白酶液的体积比控制在 1∶(3～5)。
7.如权利要求1所述的仿皮质骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述纳米银明胶溶液为将明胶、无水甘油、蒸馏水按3∶1∶6的比例混合后，80℃水浴 45分钟溶解成明胶水溶液；
按1毫升明胶水溶液∶纳米银微粉5～7mg的比例，将纳米银微粉加入明胶水溶液，搅拌混合。
8.如权利要求1所述的仿皮质骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥过程为将与纳米银明胶溶液复合的异种骨骨材放入-72℃～-80℃冻干机内冻结干燥12小时，得到本发明的牛皮质骨植骨材料。
9.如权利要求1所述的仿皮质骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述异种骨骨材为牛骨、猪骨、鹿骨、羊骨中的一种或几种。
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