CN112955473B - 特异性结合vegf和ang2的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其包含特异性结合VEGF的抗VEGF抗体或其抗原结合片段和特异性结合ANG2的抗ANG2单域抗体，其中所述的抗ANG2单域抗体直接地或间接地连接至抗VEGF抗体或其抗原结合片段。本公开还提供了抗ANG2单域抗体及其抗原结合片段，以及上述抗体的制备和应用。

Description

特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体
技术领域
本公开属于生物制药领域，具体地，本公开涉及抗ANG2单域抗体或其抗原结合片段、抗VEGF抗体或其抗原结合片段，以及抗ANG2单域抗体与抗VEGF抗体融合形成的双特异性抗体的制备和应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
新血管的生成为肿瘤细胞提供氧气和养料，使得肿瘤细胞获得生长优势，从无血管的慢速生长期到有血管的快速增长期。因此，通过抑制血管生成来抑制肿瘤的生长是一个较有潜力的有效策略。在众多促进血管生成的相关因子中，血管内皮生长因子VEGF是非常关键和重要的促进血管生成的因子。VEGF可以通过与VEGF受体结合来促进细胞的增殖、迁移、增加血管通透性等来促进肿瘤细胞的新生血管生成。因此通过阻断VEGF可抑制肿瘤血管的生成，进而达到抑制肿瘤生长和转移的目的。临床上有很多通过不同策略阻断VEGF的生物制剂，诸如针对VEGF的单抗阿瓦斯汀(Avastin)，中和VEGF的可溶性VEGF受体，针对VEGF受体的单抗等都显示出较好的活性。但肿瘤血管的生成是由众多分子、多信号通路参与的复杂过程，通过阻断一条通路仍不能达到完全抑制肿瘤的目的，需要同时阻断其他血管生成相关因子。
Tie2是第二个被鉴定出的血管内皮细胞特异的酪氨酸激酶受体，其与配体血管生成素-1(ANG1)和血管生成素-2(ANG2)的结合对于血管生成也起着重要作用。ANG1与ANG2都结合Tie2，其中ANG1支持内皮细胞(EC)存活并促进血管的完整性和稳定性，而ANG2具有相反效应，可以使周边细胞从内皮细胞脱落下来，导致内皮细胞通透性提高，使VEGF发挥促进新生血管形成的作用。ANG2和VEGF在肿瘤的血管形成过程中互补协调，共同作用。因此，同时阻断VEGF和ANG2可以更有效抑制血管的生成，促进血管的正常化，达到抑制肿瘤生长和转移的目的。
目前本领域内报道了四种同时阻断VEGF和ANG2信号通路的双特异抗体，其中罗氏的针对VEGF和ANG2的crossmab Vanucizumab进展最快，处于临床2期阶段。
目前，在专利申请WO1998045332、WO2007095338A2、WO201004058、CN102250247A、WO2011117329等中公开了ANG2-VEGF的双特异性抗体或VEGF抗体，但仍有待于研发新的高效的ANG2-VEGF的双特异性抗体及***的方法。
发明内容
本公开提供一种特异性结合ANG2和VEGF的双特异性抗体。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体包含特异性结合VEGF的抗VEGF抗体或其抗原结合片段和特异性结合ANG2的抗ANG2单域抗体，其中所述的抗ANG2的单域抗体直接地通过肽键或间接地通过接头共价连接至抗VEGF抗体，优选地，所述抗VEGF抗体是单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体中的抗ANG2单域抗体连接至抗VEGF的抗体或其抗原结合片段的重链氨基端、重链羧基端、轻链氨基端或轻链羧基端。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体中的抗ANG2单域抗体连接至抗VEGF抗体或其抗原结合片段的重链羧基端。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体的抗ANG2单域抗体包含如SEQ ID NO：5所示或与其具有至多3个、至多2个或1个氨基酸替换突变的CDR1，如SEQ ID NO：6所示或与其具有至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或1个氨基酸替换突变的CDR2和如SEQID NO：7所示或与其具有至多3个、至多2个、或1个氨基酸替换突变的CDR3区，示例性地，SEQID NO：5(DFGMS)中的第一位D被S取代，第二位的F被Y取代。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体中的抗ANG2单域抗体包含如SEQ ID NO：14所示的CDR1，如SEQ ID NO：15所示的CDR2和如SEQ ID NO：7所示的CDR3，其序列分别如下所示：
Figure GPA0000304212110000031
其中，X1选自D或S；X2选自F或Y；X3选自G或A；X4选自S或T；X5选自T或N；X6选自W或S；X7选自N，G或S；X8选自R或S；X9选自Y或G。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体中的抗ANG2单域抗体包含分别如下所示的CDR1、CDR2和CDR3：
i)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：6所示和所述CDR3如SEQID NO：7所示；
ii)所述CDR1如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2如SEQ ID NO：9所示和所述CDR3如SEQID NO：7所示；
iii)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：10所示和所述CDR3如SEQ ID NO：7所示；或
iv)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：11所示和所述CDR3如SEQ ID NO：7所示。
在一些实施方式中，其中所述的双特异性抗体中的抗ANG2单域抗体为羊驼抗体或人源化抗体。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体中的抗ANG2单域抗体包含或由如SEQ IDNO：16所示的VHH组成，优选地，包含或由如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12或SEQID NO：13所示的VHH组成，其中所述的SEQ ID NO：16如下所示：
Figure GPA0000304212110000041
其中，X1选自D或S；X2选自F或Y；X3选自G或A；X4选自S或T；X5选自T或N；X6选自W或S；X7选自N，G或S；X8选自R或S；X9选自Y或G；X10选自D或N，X11选自V或L。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体中的抗ANG2单域抗体的序列与SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在另一些实施方式中，其中所述的双特异性抗体中的人源化抗体或其抗原结合片段包含来源自人抗体的重链框架区或其框架区变体，所述框架区变体为在人抗体的重链框架区上分别具有至多10个氨基酸的回复突变，
优选地，所述回复突变选自5Q、30N、83K、84P、93N和94A中的一个或更多个，其中5Q表示，按照kabat编号规则，VHH的第5位氨基酸是Q(Gln，谷氨酰胺)，其他类推。
在一些实施方式中，其中所述双特异性抗体中的抗ANG2单域抗体包含如下所示的CDR1、CDR2和CDR3：
i)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：6所示和所述CDR3如SEQID NO：7所示；
ii)所述CDR1如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2如SEQ ID NO：9所示和所述CDR3如SEQID NO：7所示；
iii)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：10所示和所述CDR3如SEQ ID NO：7所示；或
iv)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：11所示和所述CDR3如SEQ ID NO：7所示；且
其框架区包含选自5Q、30N、83K、84P、93N和94A中的一个或更多个回复突变。
在一些实施方式中，其中所述的双特异性抗体中的抗ANG2人源化抗体或其抗原结合片段包含或由如SEQ ID NO：27所示的序列组成，优选地，包含或由如SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的序列组成，其中所述的SEQ ID NO：27的序列如下所示：
Figure GPA0000304212110000051
其中，X1选自D或S；X2选自F或Y；X3选自G或A；X4选自S或T；X5选自T或N；X6选自W或S；X7选自N，G或S；X8选自R或S；X9选自Y或G，X12选自V或Q，X13选自S或N，X14选自R或K，X15选自A或P，X16选自A或N，X17选自K或A。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体中的抗ANG2单域抗体的序列与SEQ IDNO：17、18、19、20、21、22、23、24、25或26分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在一些实施方式中，其中所述的双特异性抗体中的抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含：
分别如SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和分别如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方式中，其中所述的双特异性抗体中的抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：28所示的轻链可变区和如SEQ ID NO：30所示的重链可变区。
在一些实施方式中，其中所述的双特异性抗体中的抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：29所示的轻链和SEQ ID NO：31或54所示的重链。
在一些实施方式中，所述的双特异性抗体包含选自SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、55或56任一所示的第一多肽链，和/或如SEQ ID NO：29所示的第二多肽链。
本公开还提供一类抗ANG2的单域抗体。
在一些实施方式中，其中所述的抗ANG2单域抗体包含如SEQ ID NO：5所示或与其具有至多3、至多2个或1个氨基酸突变的CDR1，如SEQ ID NO：6所示或与其具有至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或1个氨基酸突变的CDR2和如SEQ ID NO：7所示或与其具有至多3个、至多2个或1个氨基酸突变的CDR3区。
在一些实施方式中，所述的抗ANG2单域抗体包含如SEQ ID NO：14所示的CDR1，如SEQ ID NO：15所示的CDR2和如SEQ ID NO：7所示的CDR3，其中所述的CDR序列如下所示：
Figure GPA0000304212110000052
其中，X1选自D或S；X2选自F或Y；X3选自G或A；X4选自S或T；X5选自T或N；X6选自W或S；X7选自N，G或S；X8选自R或S；X9选自Y或G。
在一些实施方式中，所述的抗ANG2单域抗体包含分别如下所示的CDR1、CDR2和CDR3区：
i)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：6所示和所述CDR3如SEQID NO：7所示；
ii)所述CDR1如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2如SEQ ID NO：9所示和所述CDR3如SEQID NO：7所示；
iii)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：10所示和所述CDR3如SEQ ID NO：7所示；或
iv)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：11所示和所述CDR3如SEQ ID NO：7所示。
在一些实施方式中，其中所述的抗ANG2单域抗体选自羊驼抗体或人源化抗体。
在一些实施方式中，其中所述的抗ANG2单域抗体包含或由如SEQ ID NO：16所示的序列组成，优选地，包含或由如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的序列组成，其中所述的SEQ ID NO：16具有如下所示的序列：
Figure GPA0000304212110000061
其中，X1选自D或S；X2选自F或Y；X3选自G或A；X4选自S或T；X5选自T或N；X6选自W或S；X7选自N，G或S；X8选自R或S；X9选自Y或G；X10选自D或N，X11选自V或L。
在一些实施方式中，所述的抗ANG2单域抗体的序列与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在一些实施方式中，其中所述的抗ANG2人源化抗体包含来源自人抗体的重链框架区或其框架区变体，所述框架区变体为在人抗体的重链框架区上分别具有至多10个氨基酸的回复突变，
优选地，所述回复突变选自5Q、30N、83K、84P、93N和94A中的一个或更多个。
在一些实施方式中，其中所述的抗ANG2人源化抗体的序列如SEQ ID NO：22所示，或者在SEQ ID NO：22上包含5Q、30N、84P、93N和94A中的一个或更多个突变。
在一些实施方式中，其中所述的抗ANG2单域抗体包含如下所示的CDR1、CDR2和CDR3：
i)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：6所示和所述CDR3如SEQID NO：7所示；
ii)所述CDR1如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2如SEQ ID NO：9所示和所述CDR3如SEQID NO：7所示；
iii)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：10所示和所述CDR3如SEQ ID NO：7所示；或
iv)所述CDR1如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2如SEQ ID NO：11所示和所述CDR3如SEQ ID NO：7所示；且
其框架区包含选自5Q、30N、83K、84P、93N和94A中的一个或更多个回复突变。
在一些实施方式中，其中所述的抗ANG2单域抗体或其抗原结合片段包含或由如SEQ ID NO：27所示的序列组成，优选地，包含或由如SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的序列组成，其中所述的SEQ ID NO：27具有如下所示的序列：
Figure GPA0000304212110000071
其中，X1选自D或S；X2选自F或Y；X3选自G或A；X4选自S或T；X5选自T或N；X6选自W或S；X7选自N，G或S；X8选自R或S；X9选自Y或G，X12选自V或Q，X13选自S或N，X14选自R或K，X15选自A或P，X16选自A或N，X17选自K或A。
在一些实施方式中，所述的抗ANG2单域抗体的序列与SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23、24、25或26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
本公开还提供一种抗ANG2单域抗体，其与上述的抗ANG2单域抗体竞争结合人ANG2。
本公开还提供一种抗ANG2单域抗体，其中所述的单域抗体包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示单域抗体具有相同序列的CDR1、CDR2和CDR3区。
本公开还提供一种单克隆抗体，其包含如上所述的抗ANG2单域抗体。
本公开还提供一种双特异性抗体，其包含上述中任一项所述的抗ANG2单域抗体。
本公开提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述双特异性抗体，或上述抗ANG2单域抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
本公开还提供一种分离的核酸分子，其编码如前所述的双特异性抗体或抗ANG2单域抗体或包含上述抗ANG2单域抗体的单克隆抗体。
本公开还提供一种载体，其包含如上所述的核酸分子。
本公开还提供一种转化有前述载体的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞或昆虫细胞。
本公开还提供用于生产如前所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体的方法，所述方法包括将如前所述宿主细胞在培养基中进行培养以形成并积累如前所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体，以及从培养物回收所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体或其抗原结合片段的过程。
本公开提供用于体外检测或测定人ANG2的方法，所述方法包括使用如前所述的抗ANG2单域抗体或上述双特异性抗体。
本公开提供如前所述的抗ANG2单域抗体或双特异性抗体在制备用于检测或测定人ANG2的试剂中的用途。
本公开还提供一种试剂盒，其包含如上所述的抗ANG2单域抗体或双特异性抗体。
本公开还提供一种治疗与VEGF介导的和/或ANG2介导的血管生成作用相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如前所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体，或包含如前所述的抗ANG2单域抗体的单克隆抗体，或如前所述的药物组合物；优选地，所述治疗有效量为单位剂量的组合物中含有0.1-3000mg的如前所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体，或包含如前所述的抗ANG2单域抗体的单克隆抗体。
本公开还提供一种治疗癌症或血管生成性眼病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如前所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体，或包含如前所述的抗ANG2单一可变域抗体的单克隆抗体，或如前所述的药物组合物；优选地，所述的癌症选自乳腺癌、肾上腺肿瘤、输卵管癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胆管癌、膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌和肝癌；其中所述的血管生成性眼病选自新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、房角的新血管生成(虹膜发红)、眼部新生血管性疾病、血管再狭窄和动静脉畸形(AVM)。
本公开还提供如前所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体，或包含如前所述的抗ANG2单域抗体的单克隆抗体，或如前所述的药物组合物在制备用于治疗与VEGF介导的和/或ANG2介导的血管生成作用相关的疾病的药物中的用途。
本公开还提供所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体，或包含如前所述的抗ANG2单域抗体的单克隆抗体，或如前所述的药物组合物在制备用于治疗癌症或血管生成性眼病中的用途；优选地，所述的癌症选自乳腺癌、肾上腺肿瘤、输卵管癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胆管癌、膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌和肝癌；其中所述的血管生成性眼病选自新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、房角的新血管生成(虹膜发红)、眼部新生血管性疾病、血管再狭窄和动静脉畸形(AVM)。
本公开提供一种用于体外测定或检测人ANG2的方法，所述方法包含使用如前所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体，或包含如前所述的抗ANG2单域抗体的单克隆抗体的步骤。
本公开还提供一种用作药物的如前所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体，或包含如前所述的抗ANG2单域抗体的单克隆抗体，所述药物用于治疗与VEGF介导的和/或ANG2介导的血管生成作用相关的疾病，优选治疗癌症或血管生成性眼病。
本公开还提供一种用作药物的如前所述的双特异性抗体，或如前所述的抗ANG2单域抗体，或包含如前所述的抗ANG2单域抗体的单克隆抗体，所述药物用于治疗癌症或血管生成性眼病。
附图说明
图1为本公开的双特异性抗体的结构示意图。
图2A为显示单域抗体与人ANG2的结合活性的图；图2B为显示单域抗体与人ANG1的结合活性的图。
图3为显示双特异性抗体阻断ANG2结合细胞表面Tie2的活性的图。
图4为显示双特异性抗体抑制ANG2诱导的Tie2磷酸化结果的图。
图5为显示双特异性抗体抑制VEGF诱导的VEGFR的磷酸化的活性的图。
图6为显示双特异性抗体抑制VEGF诱导的HUVEC的增殖的活性的图。
图7为显示双特异性抗体抑制人结肠癌细胞皮下移植瘤生长效果的图。
图8A为显示抗体抑制非小细胞肺癌皮下移植瘤生长效果的图；图8B为显示小鼠非小细胞肺癌肝转移结果的图。
图9A为显示抗体抑制人A431小鼠移植瘤模型药效的图；图9B为显示抗体抑制人PC-3小鼠移植瘤模型药效的图。
图10A为显示双特异性抗体对恒河猴眼部荧光渗漏面积改善率的图；图10B为显示双特异性抗体对恒河猴眼部四级荧光斑点数的效果的图。
图11为显示恒河猴眼部给药28天后房水中VEGF浓度的图。
具体实施方式
发明详述
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“ANG-2”指血管生成素-2(ANG-2)(或缩写为ANGPT2或ANG2)，其记载于例如Maisonpierre，P.C.等，Science 277(1997)55-60和Cheung，A.H.等，Genomics 48(1998)389-91。发现血管生成素-1和-2为Tie(即，一种在血管内皮内选择性表达的酪氨酸激酶家族)的配体，Yancopoulos，G.D.等，Nature 407(2000)242-48。目前血管生成素家族有四种确定的成员。血管生成素-3和-4(ANG-3和ANG-4)可以代表小鼠和人中相同基因基因座的广泛区域的对应物。Kim，I.等，FEBS Let，443(1999)353-56；Kim，I.等，J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG1和ANG2最初是在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂鉴定的(对于ANG1，参见，Davis，S.等，Cell 87(1996)1161-69；和对于ANG2，参见Maisonpierre，P.C.等，Science 277(1997)55-60)。所有已知的血管生成素主要结合Tie2，而ANG1和2两者都以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2，Maisonpierre，P.C.等，Science 277(1997)55-60。
术语“VEGF”指人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)，其记载于例如Leung，D.W等，Science 246(1989)1306-9；Keck，P.J.等，Science 246(1989)1309-12和Connolly，D.T.等，J.Biol.Chem.264(1989)20017-24。VEGF参与调节正常的和异常的血管发生和与肿瘤和眼内病症有关的新血管化(Ferrara，N.，Endocr.Rev.18(1997)4-25；Berkman，R.A.，J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown，L.F.等，HumanPathol.26(1995)86-91；Brown，L.F.等，Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern，J.等，Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；及Dvorak，H.F.等，Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是一种同二聚体糖蛋白，VEGF可促进对内皮细胞的促有丝***。
“双特异性抗体”是具有两种不同抗原(或同一抗原的不同表位)结合活性的抗体。本公开的抗体对两种不同抗原，即作为第一抗原的VEGF和作为第二抗原的ANG2是特异性的。
术语“结合位点”或“抗原结合位点”指抗体分子中配体实际结合的区域。术语“抗原结合位点”包含抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)，或仅包含抗体重链可变域或轻链可变结构域。
“单域抗体”系由单一结构域Fv单元组成的抗体片段。如同全抗体一样，其能够选择性、特异性地结合抗原。单域抗体的分子量仅为12-15kDa，远小于由两条重链及两条轻链构成的常见抗体(150-160kDa)，且甚至小于Fab片段(约50kDa，一条轻链及重链的一半)及单链可变片段(约25kDa，两个可变域，一个来自轻链，一个来自重链)。本公开中的单域抗体包括但不限于重链抗体(天然缺失轻链的抗体，如VHH)、衍生自常规4-链抗体的单域抗体、工程改造型抗体以及不同于衍生自抗体的那些的单域抗体。单域抗体可以是本领域中存在的任一种或将来发现的任何单域抗体。单域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人类、骆驼、美洲驼、羊驼、原驼、山羊、兔、牛、鲨鱼等。
“单域抗体”的抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成。这使“单域抗体”区别于“常规”免疫球蛋白或其片段(如Fab，scFv等)(其中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域相互作用形成抗原结合位点)。通常，在常规免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL两者的互补决定区(CDR)都将有助于抗原结合位点，即总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。相反，单域抗体的结合位点由单个VH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不超过三个CDR形成。
“VHH域”，也称为VHH或VHH抗体片段，最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC，AtarhouchT，MuyldermansS，RobinsonG，HamersC，SongaEB，BendahmanN，HamersR.：“Naturally occurring antibodiesdevoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。术语“VHH域”将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“VH域”或“VH”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“VL域”或“VL”)进行区分。VHH域可在无其他抗原结合域的情况下特异性结合表位(此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
在本公开的上下文中，术语VHH域、VHH、VHH抗体片段、VHH抗体以及“纳米抗体(Nanobody)”、“单域抗体”可互换使用，且表示免疫球蛋白单可变结构域，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，并且特异性结合表位而无需存在另一免疫球蛋白可变域。
术语“抗体(antibody，Ab)”包含任何包括至少一个与具体抗原(例如ANG2)特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的抗原结合分子或分子复合物。
术语“抗体”包含：包括通过二硫键相互连接的四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)。这一重链恒定区包含三个区(结构域)，CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守性区域，称为框架区(framework region，FR，也称骨架区、构架区)。各VH和VL是由三个CDR和四个FR所组成，按照以下列顺序由氨基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本公开的不同实施例中，抗ANG2抗体(或其抗原结合片段)的FR可与人种系序列相同，或可经自然或人工修饰。抗体可以是不同亚类(subclass)的抗体，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚类)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
术语“抗体”还包含完全抗体分子的抗原结合片段。术语抗体的“抗原结合部分”、“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”等，如文中所用，包含任何与抗原特异性结合形成复合物的天然生成、酶制得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术，例如蛋白质水解消化作用或涉及编码抗体可变区和(视需要)恒定区的DNA操作和表达的重组基因工程技术，来源于例如全抗体分子。这一DNA是已知的和/或可容易地从例如市售来源、DNA资料库(包含，例如噬菌体-抗体资料库)取得或可经合成。这一DNA可用化学或通过使用分子生物技术来定序和操作，例如将一个或多个可变和/或恒定区排列成适合的配置，或导入密码子，产生半胱氨酸残基、修饰、增添或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限定示例包含：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基所组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。其它工程改造分子，例如区域特异性抗体、单域抗体、区域删除抗体、嵌合抗体、CDR-植入抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫医药(SMIP)和鲨可变IgNAR区，也涵盖在文中所用的“抗原结合片段”的词语内。
抗原结合片段典型地将包含至少一个可变区。可变区可以是任何大小或氨基酸组成的区域且一般将包含与一个或多个框架序列相邻或在其框架内的CDR。
在某些实施例中，抗原结合片段在任何可变区和恒定区的配置中，可变区和恒定区可直接彼此相连接或可通过完整或部分的绞链或连接子区相连接。绞链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸所组成，使其在单一多肽分子中于相邻的可变和/或恒定区之间产生柔性和半柔性连结。“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的来源于小鼠或大鼠的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤，当所注射的试验对象为小鼠时，所产生的抗体为小鼠来源抗体，当所注射的试验对象为大鼠时，所产生的抗体为大鼠来源抗体。
“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将第一物种(如：鼠)抗体的可变区与第二物种(如：人)抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻第一物种性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌第一物种性特异性单抗的杂交瘤，然后从杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆第二物种抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与第二物种恒定区基因连接成嵌合基因后***表达载体中，最后在真核***或原核***中表达嵌合抗体分子。术语“人源化抗体(humanized antibody)”，包括CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将动物来源抗体，例如鼠源抗体的CDR序列移植到人的抗体可变区框架区(或构架区，framework region)中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量异源蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网http：//www.vbase2.org/获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行尽量少的反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。
由于抗原的接触残基，CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查动物单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚类共有序列或具有高相似性百分数的动物抗体序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。
在本公开一个的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段，可进一步包含人源或鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
人抗体重链恒定区和人抗体轻链恒定区的“常规变体”是指现有技术已公开的来源于人的不改变抗体可变区结构和功能的重链恒定区或轻链恒定区的变体，示例性变体包括对重链恒定区进行定点改造和氨基酸替换的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区变体，具体替换如现有技术已知的YTE突变，L234A和/或L235A突变，或S228P突变，或获得knob-into-hole结构的突变(使得抗体重链具有knob-Fc和hole-Fc组合)，这些突变已被证实使得抗体具有新的性能，但不改变抗体可变区的功能。
“人抗体”与“人源抗体”可以互换使用，可以是源于人的抗体或者是从一种转基因生物体中获得的抗体，该转基因生物体经“改造”以响应于抗原刺激而产生特异性人抗体并且可以通过本领域已知的任何方法产生。在某些技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入到源于胚胎干细胞系的生物体的细胞株中，这些细胞系中的内源性重链和轻链基因座被靶向破坏。转基因生物可以合成对人抗原特异的人抗体，并且该生物可以用于产生人抗体-分泌杂交瘤。人抗体还可以是一种抗体，其中重链和轻链是由源于一个或多个人DNA来源的核苷酸序列编码的。完全人抗体还可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，或者由体外活化的B细胞构建，所有的这些都是本领域已知的。
“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体，即除可能的变体抗体(例如含有天然存在的突变或在制造单克隆抗体制剂的期间产生的突变，这些变体通常以少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体识别相同和/或结合相同表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物(制剂)的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示如从基本上均质抗体群体获得的抗体的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来制造抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法以及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中进行描述。本公开单克隆抗体是全长抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、“完全抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，与下文定义的抗原结合片段相区分。该术语特别指重链由氨基端至羧基端依次包含VH区、CH1区、铰链区和Fc区，轻链由氨基端至羧基端依次包含VL区和CL区的抗体。
此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功能性筛选的片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。
抗原结合片段还可并入至包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，该对串联Fv片段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人，1995 ProteinEng.8(10)：1057-1062；及美国专利US5641870)。
Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000Da的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
F(ab′)2是通过用胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000Da并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000Da并具有抗原结合活性的抗体片段。Fab′可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理特异性识别并结合抗原的F(ab′)2来生产。
此外，可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个(包括1个、2个、3个或4个)重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc Natl Acad Sci USA.90：6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur J Immuno.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J Mol Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol Immunother.50：51-59.描述。
“接头”或“连接子”指用于连接多肽(如蛋白质结构域)的多肽序列，通常具有一定的柔性，接头的使用不会使多肽原有结构和功能丧失。
双抗体(diabody)是指scFv被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。
dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering.7：697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。
本公开一些实施例中抗原结合片段可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别并结合抗原的单克隆抗体的VH和/或VL及所需的其他结构域的编码cDNA，构建编码抗原结合片段的DNA，将所述DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达抗原结合片段。
″Fc区″可以是天然序列Fc区或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成从位置Cys226上的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基端。Fc区中的残基的编号为如Kabat中的EU索引的编号。Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.，1991。免疫球蛋白的Fc区通常具有两个恒定区结构域CH2和CH3本公开“knob-Fc”指在抗体Fc区包含T366W的点突变，以形成类似knob的空间结构。相对应地，“hole-Fc”指在抗体Fc区包含T366S，L368A，Y407V的点突变，以形成类似hole的空间结构。Knob-Fc和hole-Fc由于空间位阻的原因，更易形成异二聚体。为进一步地促进异二聚体的形成，还可在knob-Fc和hole-Fc分别引入S354C和Y349C的点突变，通过二硫键进一步促进异二聚体的形成。同时，为消除或减弱抗体Fc引起的ADCC效应，还可向Fc引入的234A和235A的取代突变。例如，本公开优选的knob-Fc和hole-Fc分别如SEQ ID NO：69和70所示。在双特异性抗体中，knob-Fc或hole-Fc既可以作为第一多肽链的Fc区域，也可以作为第二多肽链的Fc区域，在同一双特异性抗体中，第一多肽链和第二多肽链的Fc区不同时为knob-Fc或hole-Fc。
术语“氨基酸差异”或“氨基酸突变”是指相较于原蛋白质或多肽，变体蛋白质或多肽存在氨基酸的改变或突变，包括在原蛋白质或多肽的基础上发生1个或数个氨基酸的***、缺失或替换。
抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区(VL)或抗体重链的可变区(VH)。如在本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过3个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的4个框架区(FR)组成。每一条链中的CDR通过FR紧密地保持在一起并且与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合部位的形成。存在至少2个用于确定CDR的技术：(1)基于跨种序列变异性的方法(即，Kabat等Sequences of Proteins ofImmunological Interest，(第5版，1991，National Institutes of Health，BethesdaMD))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-Lazikani等，J.Molec.Biol.273：927-948(1997))。如本文中所用，CDR可指由任一方法或由两种方法的组合确定的CDR。
术语“抗体框架”或“FR区”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的高变区。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界，包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则(Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003))等。例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGapAlign确定。
“HCDR1、HCDR2和HCDR3区或其任意CDR变体”中的“其任意CDR变体”是指对HCDR1、HCDR2和HCDR3区中任意一个、或两个、或三个HCDR进行氨基酸突变获得的变体。
“抗体恒定区结构域”指来源于抗体的轻链和重链的恒定区的结构域，包括CL和来源于不同类抗体的CH1、CH2、CH3和CH4结构域。
“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。
当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold SpringHarbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用能与带有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白结合的纯化抗原(所述抗原在固态表面或细胞表面)。在待测抗原结合蛋白存在下，测量结合于固态表面或细胞的标记的量，来测量竞争性抑制。通常，待测抗原结合蛋白是过量存在的。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本公开实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
术语“亲和力”是指在单一表位处，抗体与抗原之间相互作用的强度。在各抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在多个氨基酸位点处相互作用；相互作用愈大，亲和力愈强。如本文所用，抗体或其抗原结合片段(例如Fab片段)的术语“高亲和力”通常是指具有1E-9M或更小的KD(例如1E-10M或更小的KD、1E-11M或更小的KD、1E-12M或更小的KD、1E-13M或更小的KD、1E-14M或更小的KD等)的抗体或抗原结合片段。
术语″KD″或“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，抗体以小于大约1E-8M，例如小于大约1E-9M、1E-10M或1E-11M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。KD值越小，亲和力越大。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA或mRNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语″载体″意指能够递送一个或多个目标基因或序列并且优选地在宿主细胞中表达其的构建体。载体的示例包括，但不限于，病毒载体、裸露DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核生物细胞诸如生产细胞。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用抗原或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。本公开所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从网站http：// www.imgt.org/得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、HEK293细胞(非限制性实施例如HEK293E细胞)和NS0细胞。
工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种可选的现有技术，哺乳动物类表达***会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的蛋白A或蛋白G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“施用”、“给药”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂、组合物或者人为操作(比如实施例中的“安乐死”)提供给动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，例如包含本公开实施例的任一种化合物的组合物，所述受试者具有(或疑似患有、或易感于)一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床有测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)可能无法在缓解每个目标疾病症状方面都有效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。
“氨基酸保守修饰”或“氨基酸保守取代”指蛋白质或多肽中的氨基酸被具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸取代，从而使得在不改变蛋白质或多肽的生物活性或其他所需特性(例如抗原亲和力和/或特异性)的情况下，可以经常进行改变。本领域技术人员认识到，通常，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson等人，(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第4版))。此外，结构上或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。示例性氨基酸保守取代于下表：
原始残基 保守取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys；His
Asn(N) Gln；His；Asp
Asp(D) Glu；Asn
Cys(C) Ser；Ala；Val
Gln(Q) Asn；Glu
Glu(E) Asp；Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；His
Met(M) Leu；Ile；Tyr
Phe(F) Tyr；Met；Leu
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr；Phe
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
“有效量”、“有效剂量”是指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓受试者的本公开靶抗原相关病症的进展。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”、“同一性”在本文中可以互换，是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。通常，当比对两个序列时进行比较以给出最大百分比同源性。例如，可以通过BLAST算法执行比较，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。
以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLASTALGORITHMS)：Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656。其他如NCBI BLAST提供的常规BLAST算法也为本领域技术人员所熟知。
“分离的”指脱离其原始状态，在这种状态下意味着在指定的分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”并不意图指完全不存在这些材料或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以显著干扰如本文所述的化合物的实验或治疗用途的量存在。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
“药物组合物”表示含有一种或多种本公开所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“药学上可接受的载体”指适合用于制剂中用于递送抗体或抗原结合片段的任何无活性物质。载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、充填剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、增甜剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲液、缓冲的盐水和等渗剂例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。
此外，本公开另一方面涉及用于免疫检测或测定目标抗原的方法、用于免疫检测或测定目标抗原的试剂、用于免疫检测或测定表达目标抗原的细胞的方法和用于诊断与目标抗原阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其包含本公开的特异性识别并结合目标抗原的单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。
在本公开中，用于检测或测定目标抗原的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。
免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的示例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
上述与目标抗原阳性细胞相关的疾病可以通过用本公开的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达目标抗原的细胞来诊断。
为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS***(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。
在本公开中，对用于检测或测定目标抗原的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达目标抗原的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。
根据所需的诊断方法，含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。
术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长/增殖为特征的生理症状。可用本公开的双特异性结合分子治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。US2008/0014196中建议用VEGF拮抗剂治疗的这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子***、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌(hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌、黑素瘤、皮肤癌、及各种类型的头颈癌。血管生成的调控异常可导致许多可由本公开组合物及方法治疗的病症。这些病症包括非赘生性症状及赘生性症状两者。赘生性病症包括但不限于上述病症。
非赘生性病症包括但不限于如US2008/0014196中所述用VEGF拮抗剂治疗的不欲或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、类肉瘤病(sarcoidosis)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性及其他增殖性视网膜病(包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生(retrolental fibroplasia)、新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成(cornealneovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜红变(rubeosis))、眼新血管病(ocular neovasculardisease)、血管再狭窄(vascular restenosis)、动静脉畸形(arteriovenousmalformations，AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纤维瘤(angiofibroma)、甲状腺增生(包括格雷夫氏病(Grave’s disease))、角膜及其他组织移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压(primary pulmonary hypertension)、恶性肺积液(malignant pulmonaryeffusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部损伤(closed head injury)/外伤相关)、滑液炎症、类风湿性关节炎中的血管翳形成(pannus formationin，RA)、骨化性肌炎(myositis ossificans)、肥大性骨形成(hypertropic bone formation)、骨关节炎(OA)、难治愈的腹水症、多囊性卵巢疾病(polycystic ovarian disease)、子宫内膜异位症(endometriosis)、第3间隔体液疾病(3rdspacing of fluid disease)(胰腺炎、间隔综合征(compartment syndrome)、灼伤、肠病)、子宫纤维瘤、早产、例如IBD(克罗恩氏病(Crohn’sdisease)及溃疡性结肠炎)的慢性炎症、肾同种异体移植排斥、炎性肠病、肾病综合征、不欲或异常的组织大量生长(非癌)、血友病性关节(hemophilic joint)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scar)、头发生长抑制、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Webersyndrome)、化脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生(pyogenic granuloma retrolental fibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascular adhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子痫前症(preeclampsia)、腹水症、心包积液(pericardial effusion)(例如与心包炎(pericarditis)相关的心包积液)、及胸膜积液(pleural effusion)。以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1.ANG2和ANG2受体Tie2的表达
编码带人IgG1-Fc标签的人ANG2和人ANG2受体Tie2胞外区序列***phr载体中，构建成表达质粒，然后转染HEK293。具体转染步骤为：前一天将HEK293E细胞以1×106/ml接种于freestyle表达培养基(含有1％FBS，Gibco，12338-026)，放置于37度恒温摇床(120rpm)继续培养24小时。24小时后，将转染质粒和转染试剂PEI用0.22μm的滤器除菌，然后将转染质粒调整为100μg/100ml细胞，PEI(1mg/ml)和质粒的质量比为2∶1，取10ml的Opti-MEM和200μg质粒混匀，静置5min；另取10ml的Opti-MEM和400μg PEI混匀，静置5min。将质粒和PEI进行混匀，静置15min。将质粒和PEI混合物缓慢加入200ml HEK293E的细胞中，放入8％CO2、120rpm、37℃的摇床中培养。转染第3天，补充10％体积的补料培养基(20mM葡萄糖+2mM L-谷氨酸)。待转染第6天，取样4500rpm离心10min收集细胞上清，将重组的ANG2和Tie2受体蛋白上清如实施例2所述进行纯化。纯化的蛋白可用于下述各实施例或测试例实验中。
其中人ANG2氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，Tie2胞外区Fc融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
相关序列如下所示：
(1)带人Fc标签的人ANG2氨基酸序列
Figure GPA0000304212110000241
注释：横线部分为ANG2蛋白全长序列，点线为接头，斜体部分为人IgG1Fc标签。
(2)带人Fc标签的Tie2氨基酸序列
Figure GPA0000304212110000242
Figure GPA0000304212110000251
注释：下划线部分为Tie2的胞外区，斜体部分为人IgG1Fc标签。
实施例2.Protein A亲和层析纯化带Fc标签的重组蛋白或抗体
将细胞表达的抗体或ANG2、Tie2上清样品高速离心去除杂质，通过Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用100mM乙酸pH3.5洗脱目的蛋白，用1MTris-HCl，pH8.0中和。洗脱样品适当浓缩后利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，将得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。
实施例3.表达重组ANG2受体Tie2的细胞系的构建和鉴定
为筛选有功能的抗体，本公开构建了表达Tie2的CHO-K1/Tie2细胞株。
将人Tie2全长基因克隆到哺乳动物细胞表达载体pBABE上，用pVSV-G，pGag-pol和pBABE-Tie2三种质粒共同转染HEK293T细胞(ATCC，CRL-3216)来包装病毒，转染48小时后，收集病毒感染CHOK1细胞(ATCC，CRL-9618)。感染72小时后用10μg/ml嘌呤霉素加压筛选，待克隆团扩增生长后，消化细胞用FACS检测表达量，阳性率约40％，然后分选单克隆细胞，得到表达Tie2的单克隆1B11。
实施例4.抗人ANG2单域抗体的制备和筛选
本公开通过免疫羊驼(llama)获得免疫库，对免疫库进行富集，筛选出了针对人ANG2的llama源单克隆抗体，得到的抗体可以与ANG2特异性结合，并与食蟹猴、小鼠Ang2有交叉反应，可以阻断ANG2与其受体结合，且可以抑制ANG2介导的Tie2的磷酸化。
具体为：用人Ang2-Fc蛋白与弗氏佐剂混合免疫羊驼，每次免疫使用250μg蛋白，每三周一次，共免疫4次后，取200ml血分离PBMC，提取PBMC中的总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，扩增抗体基因序列。通过酶切连接将抗体基因连接到噬菌粒载体中，电转化TG1感受态细胞。用5nM和2nM生物素-hAng2-His(sinobiological，10691-H07H)经过两轮富集，对富集库进行筛选，包括与人ANG2的ELISA结合(见测试例1)，阻断ANG2与Tie2的结合(见测试例2、测试例3)，以及与鼠ANG2交叉结合(见测试例1)，共筛选出多个活性优异的单域抗体，例如nano14和nano15，具体序列分别为SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4。
羊驼源单域抗体nano14
Figure GPA0000304212110000252
Figure GPA0000304212110000261
羊驼源单域抗体nano15
Figure GPA0000304212110000262
本公开中羊驼源单域抗体的CDR序列由Kabrat编号***确定并注释，具体序列如表1所述。
表1.羊驼来源抗体CDR区序列
Figure GPA0000304212110000263
实施例5.抗人ANG2单域抗体的CDR突变及人源化设计
1.CDR突变设计
对单域抗体nano14的CDR2进行突变，获得包含新的CDR2序列的单域抗体nano14.1和nano14.2如下所示：
表2.突变后获得的单域抗体的CDR序列(由Kabrat编号***确定)
Figure GPA0000304212110000264
突变后获得的nano14.1和nano14.2的全长序列如下所示：
羊驼nano14.1：
Figure GPA0000304212110000265
羊驼nano14.2
Figure GPA0000304212110000266
Figure GPA0000304212110000271
由上可知，本公开中的抗ANG2的单域抗体的CDR序列高度的相似，其通式序列如下所示：
表3.羊驼单域抗体CDR通式
Figure GPA0000304212110000272
获得的羊驼抗ANG2单域抗体的通式为：
Figure GPA0000304212110000273
其中，X1选自D或S；X2选自F或Y；X3选自G或A；X4选自S或T；X5选自T或N；X6选自W或S；X7选自N，G或S；X8选自R或S；X9选自Y或G；X10选自D或N，X11选自V或L。
2.羊驼源抗人ANG2单域抗体的人源化
为降低羊驼源抗体的免疫原性，本公开将已筛选出的体内外活性优异的抗体进行了人源化。
羊驼源抗人ANG2单域抗体人源化如本领域许多文献公示的方法进行。简言之，因骆驼源单域抗体仅只有一条重链的可变区，故将其CDR移植到同源性最高的人源重链模板上，同时对FR区进行回复突变。Grafted代表将羊驼源抗体的CDR区嫁接到模板序列的FR上，回复突变的位置按照Kabat编号确定。
2.1 nano14的人源FR区的选择和关键氨基酸的回复突变
nano14的VH选取了IGHV3-23*04作为模板，J区(FR4)选取了IGHJ6*01作为模板。将nano14的CDR移植到人源模板上，并通过MOE软件找出包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基并回复突变，设计出不同的重链可变区人源化抗体，如表4所示。
表4.nano14的回复突变设计
Figure GPA0000304212110000274
Figure GPA0000304212110000281
注：如A93N表示依照Kabat编号***，将93位A突变回N。Grafted代表羊驼抗体CDR植入人种系FR区序列。
羊驼抗ANG2nano14抗体人源后获得抗体序列如下所示，其中CDR区氨基酸残基的确定由Kabat编号***确定并注释。
＞hu14.A(SEQ ID NO：17)
Figure GPA0000304212110000282
＞hu14.1A(SEQ ID NO：18)
Figure GPA0000304212110000283
＞hu14.2A(SEQ ID NO：19)
Figure GPA0000304212110000284
＞hu14.1B(SEQ ID NO：20)
Figure GPA0000304212110000285
＞hu14.2B(SEQ ID NO：21)
Figure GPA0000304212110000286
将上述VHH融合至如SEQ ID NO：31所示的雷珠单抗的重链可变区+IgG1重链恒定区C末端，形成双特异性抗体的重链。
2.2.nano15的人源FR区的选择和回复突变
nano15的VH选取了IGHV3-23*04作为模板，J区(FR4)选取了IGHJ6*01作为模板。将nano15的CDR移植到人源模板上，并通过MOE软件找出包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基并回复突变，设计出具有不同的重链可变区人源化抗体，如表5所示。
表5.nano15的模板选择和回复突变设计
Figure GPA0000304212110000287
Figure GPA0000304212110000291
注：如A93N表示依照Kabat编号***，将93位A突变回N。Grafted代表羊驼抗体CDR植入人种系FR区序列。
nano15人源化抗体可变区具体序列如下：
＞hu15.A(SEQ ID NO：22)
Figure GPA0000304212110000292
＞hu15.B(SEQ ID NO：23)
Figure GPA0000304212110000293
＞hu15.C(SEQ ID NO：24)
Figure GPA0000304212110000294
＞hu15.D(SEQ ID NO：25)
Figure GPA0000304212110000295
＞hu15.E(SEQ ID NO：26)
Figure GPA0000304212110000296
人源化后获得的单域抗体的全长通式序列如下：
Figure GPA0000304212110000297
其中，X1选自D或S；X2选自F或Y；X3选自G或A；X4选自S或T；X5选自T或N；X6选自W或S；X7选自N，G或S；X8选自R或S；X9选自Y或G，X12选自V或Q，X13选自S或N，X14选自R或K，X15选自A或P，X16选自A或N，X17选自K或A。
实施例6.抗VEGF/ANG2双特异性抗体的制备及鉴定
本公开双特异性抗体中的抗VEGF抗体可以是目前已有的针对VEGF的任何抗体，比如阿瓦斯汀(Avastin)、RAZUMAB(Axxiom Inc)、GNR-011(Affitech A/S)、R-TPR-024(Reliance Life Sciences Grou)、雷莫芦单抗(ramucirumab)(ImClone Systems)等，示例性的抗体为基因泰克已上市Fab抗体雷珠单抗(Lucentis)，其轻链可变区序列如SEQ IDNO：28所示(参见WO1998045332或CAS Registry Number：347396-82-1)。抗VEGF抗体的重链是将雷珠单抗的重链可变区(序列如SEQ ID NO：30所示，参见WO1998045332)与人IgG1恒定区组合成完整IgG1重链，并将末端K突变成G，其具体序列如SEQ ID NO：31所示。相关序列如下：
(1)雷珠单抗的轻链可变区
Figure GPA0000304212110000301
(2)雷珠单抗的轻链
Figure GPA0000304212110000302
(3)雷珠单抗的重链可变区
Figure GPA0000304212110000303
(4)雷珠单抗的重链可变区+IgG1恒定区(重链)
Figure GPA0000304212110000304
Figure GPA0000304212110000311
(5)雷珠单抗的重链可变区+IgG1恒定区变体(重链)
Figure GPA0000304212110000312
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列，点线为恒定区序列。
表6.雷珠单抗CDR区序列
Figure GPA0000304212110000313
利用同源重组技术将本公开的抗ANG2单域抗体的N末端氨基酸直接地(通过肽键)或通过接头(如GG)间接地连接至抗VEGF抗体重链C末端氨，通过293表达***进行常规表达，得到双特异性抗体，其结构模式见图1。
表7.ANG2/VEGF双特异性抗体结构模式
Figure GPA0000304212110000314
Figure GPA0000304212110000321
*注：Ab为可以为任何一种抗VEGF抗体。
抗ANG2单域抗体可以连接至抗VEGF抗体中重链的氨基端、羧基端或连接至抗VEGR抗体轻链的氨基端。经验证，抗ANG2单域抗体连接至抗VEGF抗体重链羧基端获得的双特异性抗体的稳定性更佳。
示例性的，将不同抗ANG2单域抗体的氨基端与雷珠单抗的重链羧基端通过接头，如(G)n(n＞＝1)接头，相连接，形成以下双特异性抗体：
表8.双特异性抗体序列
Figure GPA0000304212110000322
Figure GPA0000304212110000331
Figure GPA0000304212110000341
Figure GPA0000304212110000351
Figure GPA0000304212110000361
Figure GPA0000304212110000371
Figure GPA0000304212110000381
注：第一条链的顺序为雷珠单抗FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-CH-接头-单域抗体FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中正体部分为雷珠单抗可变区FR序列，下划波浪线为雷珠单抗CDR序列，点线为IgG1重链恒定区序列，双划线为接头，斜体部分为单域抗体序列，下划线为CDR序列。
按照实施例2中的纯化方式，使用proteinA亲和层析纯化即可得到纯度＞98％的双特异性抗体分子。
同时，将Roche VEGF/ANG2的双特异性抗体crossmab(Vanucizumab)作为阳性对照，其序列如SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51所示(参考WHODrug Information，Vol.29，No.1，2015)。另外，还将阿瓦斯汀作为阳性对照，其重链序列如SEQ ID NO：52所示，轻链序列如SEQ ID NO：53所示(参考CAS Registry Number：216974-75-3)。
＞crossmab抗ANG2重链
Figure GPA0000304212110000382
＞crossmab抗ANG2轻链
Figure GPA0000304212110000383
＞crossmab抗VEGF重链
Figure GPA0000304212110000384
Figure GPA0000304212110000391
＞crossmab抗VEGF轻链
Figure GPA0000304212110000392
注：下划线为可变区序列，其余为恒定区序列。
＞阿瓦斯汀重链
Figure GPA0000304212110000393
＞阿瓦斯汀轻链
Figure GPA0000304212110000394
＞RG7716(参考CN105143262A中VEGFang2-0016制备)：
抗-VEGF-重链(Knob)
Figure GPA0000304212110000395
Figure GPA0000304212110000401
抗-Ang2重链(Hole)
Figure GPA0000304212110000402
抗-VEGF轻链
Figure GPA0000304212110000403
抗-Ang2轻链
Figure GPA0000304212110000404
另外，本公开中使用的阴性对照(NC)是指针对HIV的一个IgG形式单克隆抗体。
体外活性生物学评价
测试例1.ELISA测定ANG2抗体与ANG2以及同家族蛋白ANG1的亲和力
(1)人ANG2-His结合ELISA
用链霉亲和素(abcam，ab123480)，浓度1ng/μl，每孔100μl，4℃过夜包被平板后，除去上清液，加250μl 5％脱脂奶粉37℃封闭1h，洗板机洗板3遍。加0.5ng/μl生物素-hAng2-His(sinobiologican，10691-H07H)，37℃孵育1h。洗板机洗板3遍，加100μl 1∶1稀释的噬菌体上清液，37℃孵育1h。洗板机洗板3遍，每孔加100μl 1∶10000稀释的抗M13-HRP(GE，27-9421-01)，37℃孵育1h。洗板机洗板3遍，每孔加100μl TMB显色。5-10min后每孔加100μl 1M H2SO4终止显色，酶标仪测OD450值。结果见图2A。
(2)ANG1结合ELISA
用人ANG1(RD，923-AN)，浓度1ng/μl，每孔100μl，4℃过夜包被平板。除去上清液，加250μl 5％脱脂奶粉37℃封闭1h。洗板机洗板3遍，加100μl 1∶1稀释的噬菌体上清液，37℃孵育1h。洗板机洗板3遍，每孔加100μl 1∶10000稀释的M13-HRP，37℃孵育1h。洗板机洗板3遍，每孔加100μl TMB显色。5～10min后每孔加100μl 1M H2SO4终止显色，酶标仪测OD450值。结果见图2B。
结果显示，nano14和nano15显示出很强的结合人ANG2的能力但却不结合人ANG1，有良好的选择性。
测试例2.Biacore测定VEGF/ANG2双特异性抗体与不同种属VEGF/ANG2的亲和力
用Biacore T200(GE)仪器测定待测人源化VEGF/ANG2双特异性抗体和人、猴和小鼠VEGF和ANG2的亲和力。
用Protein A生物传感芯片亲和捕获抗体，然后于芯片表面流经抗原人VEGF(R&D，293-VE)，猴VEGF(sinobiological，11066)，小鼠VEGF(sinobiological，51059)，人ANG2(sinobiological，10691-H08H)，猴ANG2(sinobiological，90026-C07H)，小鼠ANG2(sinobiological，50298-M07H)，用Biacore T200仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用10mM甘氨酸-盐酸再生溶液(pH 1.5)将生物传感芯片洗净再生。用BIA评估版本4.1，GE软件以(1∶1)Langmuir模型拟合数据，得出亲和力数值，如表9所示。
表9.双特异性抗体与不同种属ANG2的亲和力
Figure GPA0000304212110000411
结果显示，hu15.E-V和hu14.2B-V与所测各种属VEGF(小鼠VEGF除外)和ANG2均有较高的亲和力。
测试例3.基于ELISA的抗体阻断ANG2结合Tie2受体实验
ANG2与血管内皮细胞表面的ANG2受体Tie2结合，引发Tie2细胞内酪氨酸激酶发生磷酸化继而传导信号使外周细胞从血管内皮细胞脱落，使血管处于不稳定易于增殖的状态。因此，通过抗体阻断ANG2与Tie2的结合可以使血管更稳定，抑制新生血管的生成。本实验鉴定结果表明双特异性抗体可以阻断ANG2结合到重组表达的Tie2蛋白胞外区。
具体方法：用Tie2-Fc(SEQ ID NO：2，3μg/ml溶于PBS，100μl/孔，)包被ELISA板，4℃包被过夜，去除包被液后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(含0.05％tween-20的PBS，pH7.4)洗板5次后，加入50μl用1％BSA稀释生物素标记试剂盒(东仁化学，LK03)标记的huANG2-Fc(SEQ ID NO：1，bio-huANG2-Fc，终浓度为0.15μg/ml)和50μl待测抗体(始浓度为10μg/ml，3倍比稀释)，混匀后37℃孵育15min，加至ELISA板，37℃孵育1h。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板5次后，加入100μl/孔1∶4000稀释的链霉亲和素-过氧化物酶聚合物(Sigma，S2438-250UG)于37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入100μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，于室温孵育3-10min，加入100μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算抗体阻断ANG2与Tie2结合的IC50值，结果显示，单域抗体ANG2和双特异性抗体均可较强地抑制ANG2与Tie2的结合(见表10和表11)。
表10.单域抗体抑制ANG2与Tie2的结合结果
抗体 nano14 nano15 Crossmab
IC50(nM) 0.03927 0.02810 2.583
表11.双特异性抗体抑制ANG2与Tie2的结合结果
抗体 hu15.E-V hu14.2B-V Crossmab NC
IC50(nM) 0.192 0.2702 24.82 ～
测试例4.基于FACS的双特异性抗体阻断ANG2结合Tie2的实验
为了鉴定筛选到的双特异性抗体可以阻断细胞表面的Tie2受体，构建了高表达Tie2的CHOK1重组细胞系。本实验鉴定了双特异性抗体可以阻断ANG2结合到CHOK1细胞系表面的重组Tie2。
具体方法如下：
细胞实验过程中用含2％FBS的PBS作为实验缓冲液。将过表达Tie2的稳转株CHO-Tie2#1B11消化重悬后，用2％FBS/PBS洗涤一次，重悬，调整密度为2.0×106cell/ml，50μl/well铺入96孔圆底培养板，即1.0×105cell/孔。用2％FBS/PBS分别稀释bio-huANG2-Fc、抗体及阴性对照，等体积混匀，37℃孵育15min后，取50μl抗原抗体混合物加入细胞悬液，混合体系中bio-huANG2-Fc终浓度为0.20μg/ml，受试抗体起始浓度为10nM，3倍梯度稀释。4℃孵育1h。200μl/孔PBS洗涤二次，加入1∶1000稀释的PE-链霉亲和素(BD Pharmingen，Cat#554061)，100μl/well，4℃孵育40min。200μl/well PBS洗涤二次，加入100μl/well 2％FBS/PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测，每孔分析10000个细胞数据。根据荧光信号值计算双特异性抗体阻断ANG2与Tie2结合的IC50值。结果如图3所示。
结果显示，抗体hu15.E-V和hu14.2B-V分别显示出比阳性抗体更强的阻断ANG2结合到细胞表面的Tie2的能力。
测试例5.双特异性抗体抑制ANG2诱导的Tie2磷酸化
ANG2与血管内皮细胞表面的ANG2受体Tie2结合，引发Tie2细胞内酪氨酸激酶发生磷酸化继而传导信号使外周细胞从血管内皮细胞脱落，使血管处于不稳定易于增殖的状态。本实验是为鉴定双特异性抗体可以阻断ANG2诱导的Tie2磷酸化。
具体实验方法如下：
将过表达huTie2的稳转株CHO-Tie2#1B11-1消化重悬后，用完全培养基调整密度为2.5×105cell/ml，100μl/孔铺入96孔细胞培养板，即2.5×104cell/well。4～5h后换液(DME/F-12，HyClone，Cat#SH30023.01+0.1％BSA+20μg/ml嘌呤霉素，Gibco，Cat#A1113803)，饥饿过夜。4.0μg/ml，100μl/well抗huTie2capture(R&D Systems，Cat#DYC2720E)包板，常温过夜。去除包被液，250μl/well 1％BSA+0.05％NaN3封闭液，常温封闭2h。将25μl huAng2-Fc(终浓度2.5μg/ml)和25μl待测抗体3倍比稀释的抗体(最高浓度50.0nM)，等体积混匀，37℃孵育15min后，再加入Na3VO4(1.0mM，Sigma，Cat#S6508)，混匀。过夜培养的细胞，弃去50μl培养上清后，加入50μl准备好的抗原抗体混合液，37℃孵育10min。200μl/well洗液(PBS+2.0mM Na3VO4)洗两次，加入90μl裂解液((1×lysis buffer+10μg/ml Leupeptin hemisulfate(Tocris，Cat#1167)+10.0μg/ml APROTININ，Sigma，Cat#SRE0050))冰上裂解10～15min，4000g离心5min，收集细胞裂解液，加入已封闭好的ELISA板中，常温孵育2h。PBST洗板5次，加入1∶1000稀释的二抗抗PY-HRP(R&D Systems，Cat#DYC2720E)，常温孵育1～2h。PBST洗板5次，TMB显色15～30min，1M H2SO4终止显色。用VersaMax酶标仪读取OD450，计算IC50，结果(见图4)显示，抗体hu15.E-V和hu14.2B-V显示出很强的抑制ANG2介导的Tie2磷酸化的能力。
测试例6.双特异性抗体抑制VEGF诱导的VEGFR的磷酸化
VEGF与血管内皮细胞上的VEGFR结合，使VEGFR细胞内激酶发生磷酸化促进内皮细胞增殖形成新的血管来促进肿瘤细胞的生长和转移。本实验用来鉴定双特异性抗体可以阻止VEGF诱导的VEGFR的磷酸化。
具体为：将HUVEC细胞(PromoCell/妙通生物，C-12205)消化后用完全培养基将细胞密度调整为每500μl中含1.5×105个细胞，加到24孔板中，每孔500μl。在37℃培养箱中培养过夜后，弃去培养基，用500μl冰DPBS(Gibco，14190-250)洗一遍，每孔加200μl含0.1％BSA的基本培养基饥饿培养30分钟。将待测抗体用基本培养基稀释至10nM、1nM和0.1nM(crossmab为20nM、2nM和0.2nM)。将VEGF(R&D system，Cat#293-VE)用基本培养基稀释至400ng/ml。取等体积稀释好的VEGF和抗体混匀后取200μl加到培养板对应的孔中，37℃孵育5分钟。将4×裂解缓冲液#1(cisbio，63ADK041PEG)用dd H2O稀释成1×。将封闭液用1×裂解缓冲液稀释100倍配制成裂解液。取出细胞培养板，弃去细胞培养板中的培养基，加入冰PBS 500μl，轻微晃动后，弃去PBS。立即加入50μl配制好的裂解液，放在振荡器上，室温孵育30分钟。2400g离心10分钟，收集上清。使用Phospho-VEGFR2(Tyr1175)试剂盒(cisbio，63ADK041PEG)检测上清中p-VEGFR。检测方法为取10μl磷酸-VEGFR2(Tyr1175)d2抗体，加入200μl检测缓冲液，配制成工作液。取10μl磷酸-VEGFR2(Tyr1175)Cryptate抗体，加入200μl检测缓冲液，配制成工作液。将d2抗体工作液与Cryptate抗体工作液等体积混合，在HTRF96孔微孔板中，加入16μl细胞裂解液，加入4μl d2抗体与Cryptate抗体混合液，用封板膜封好，微孔板离心机离心1分钟，室温避光孵育4-24小时，用PHERAstar多功能酶标仪读取340nm波长激发，665nm和620nm波长发射的荧光值。数据处理：比＝信号665nm/信号620nm×10000，用Graphpad Prism 5绘制柱状图。结果如图5所示。
结果表明，hu15.E-V和hu14.2B-V可以显著抑制VEGF引起的HUVEC胞内磷酸化VEGFR水平升高。
测试例7.双特异性抗体抑制VEGF诱导的HUVEC的增殖
VEGF与HUVEC上的VEGFR结合，使VEGFR细胞内激酶发生磷酸化促进HUVEC增殖，本实验用来鉴定双特异性抗体可以阻止VEGF诱导的HUVEC的增殖。
具体方法如下：
HUVEC按照5×104个/ml密度接种至T75细胞瓶，大约2-3天细胞生长至对数期。将对数生长期的HUVEC细胞用0.08％胰酶消化，室温大约1-2min，加10％FBS终止。收集上述消化后的HUVEC，800rpm/min，离心5min，用PBS洗三遍除去培养基中刺激HUVEC增殖的细胞因子(800rpm/min，离心5min)。将HUVEC细胞重悬于6％FBS培养基中，细胞计数后，按照4000个细胞/50μl/孔接种在白色96孔细胞培养板中，培养箱中培养2h。将VEGF起始浓度调整为300ng/ml，120μl/孔加入无菌96孔板中，将待测抗体梯度稀释：抗体起始浓度为600nM，4倍比进行梯度稀释，将稀释好的抗体等体积加入上述96孔板中，室温孵育30min。将孵育好的抗体、抗原混合物100μl/孔加入贴壁后的HUVEC细胞中，培养箱中培养5天，培养结束后加入
Figure GPA0000304212110000452
(G7573，PROMEGA)，50μl/孔，室温避光孵育10min，用Cytation5细胞成像仪Luminescence程序检测。结果如图6所示。结果显示，hu15.E-V和hu14.2B-V可以显著抑制VEGF引起的HUVEC的增殖。
体内活性生物学评价
测试例8.双特异性抗体对COLO205移植瘤裸鼠的体内药效
本实验评价ANG2/VEGF双特异抗体以及对照抗体阿瓦斯汀腹腔注射给药后对人结肠癌细胞COLO205移植瘤裸小鼠的疗效。
Balb/c裸鼠，SPF，16-18g，
Figure GPA0000304212110000453
购自北京维通利华实验动物有限责任公司，将Colo205细胞(
Figure GPA0000304212110000454
CCL-222TM)3×106cells/mouse/100μl接种于100只Balb/c Nude小鼠右肋部皮下，当荷瘤小鼠肿瘤体积达到120mm3左右时将小鼠随机分为4组：即，载剂(PBS)组、阿瓦斯汀3mpk组、hu15.E-V 3.5mpk组和hu14.2B-V 3.5mpk组，每组8只。将分组当天定义为该实验第0天，分组当天开始腹腔注射各抗体，每周2次，共给药8次，每周2次监测肿瘤体积、动物重量并记录数据。当肿瘤体积超过1500mm3或多数肿瘤出现破溃或体重下降20％时，将荷瘤动物进行安乐死作为实验终点。所有数据使用Excel和GraphPad Prism 5软件进行作图及统计分析。肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。
相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时治疗组和PBS对照组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。
结果如表12和图7所示。
表12.各组抗体抑瘤率TGI％
Figure GPA0000304212110000451
结果表明，本公开候选双特异性抗体hu15.E-V和hu14.2B-V实验结果显示：与载剂组相比，本次实验的所有抗体药物，VEGF单抗阿瓦斯汀和各受试抗体均能抑制Balb/c Nude小鼠皮下Colo205移植瘤的生长，在第27天停止给药时均与载剂组存在极显著差异(表12和图7)。从抑瘤率来看，hu15.E-V在整个给药过程中抑瘤率都高于VEGF单抗阿瓦斯汀-hIgG1，且在给药6次后与阿瓦斯汀组瘤体积出现统计差异并保持到给药结束(给药结束时p＝0.0081)。
测试例9.双特异性抗体在高转移非小细胞肺癌H460-Luc细胞株BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型上的药效
本实验评价ANG2/VEGF双特异抗体以及对照抗体阿瓦斯汀，雷珠单-hIgG1，crossmab腹腔注射给药后抑制人非小细胞肺癌H460移植瘤生长和转移的效果。
BALB/c裸鼠雌性，4-5周，18-20克，购自上海灵畅生物科技有限公司。人非小细胞肺癌H460-Luc(稳定转染荧光素酶基因)在添加10％FBS的RPMI 1640培养基中在含5％CO2的37℃培养箱中培养。细胞连续培养5代，接种于小鼠皮下。接种前用3-4％异氟烷将小鼠麻醉。将约1×106个H460细胞重悬于无血清培养基和基质胶(Matrigel)混悬液中(培养基：Matrigel＝50％：50％)，通过皮下注射接种于100只小鼠，接种体积为200μL。当肿瘤生长到平均约100-150mm3左右时，72只肿瘤大小合适的小鼠将根据肿瘤大小和体重被随机分成8组，每组8只。分组给药当天定义为第0天。分组情况和给药方案如表13所示。
表13.分组、给药方案及抑瘤率
Figure GPA0000304212110000461
分组后每周测量肿瘤体积两次，连续3周。肿瘤体积(V)的计算方法如下：
V＝(长×宽2)/2。
每只小鼠相对肿瘤体积(RTV)的计算方法是：
RTV＝Vt/V0，其中Vt为每天的测量体积，V0为治疗开始时的体积。
实验结束时，所有荷瘤动物拍照，将所有肿瘤取出，称重并拍照。
统计分析
结果将以平均值±S.E.M的方式呈现。两组间比较将用Dunnett多重比较检验进行检验。如果p＜0.05则认为有统计学显著性差异。
肝肺转移的检测方法：
因H460细胞株含有luciferase标记，小鼠安乐死后，解剖各组小鼠肝脏，荧光成像采集肝脏转移灶病变，根据荧光信号强度，计算转移程度。
测试结果如表13和图8A、图8B所示。
图8A显示，本公开候选分子hu15.E-V可显著抑制H460肿瘤的生长，而且hu15.E-V呈剂量依赖效应，3.5mpk的hu15.E-V比同摩尔数的3mpk的阿瓦斯汀和雷珠单抗-hIgG1有更强的抑制肿瘤生长的效果，且抑瘤率存在统计学差异。图8B显示，同摩尔剂量的阿瓦斯汀和雷珠单抗-hIgG1均出现较为严重的肝肺转移，而双特异性抗体hu15.E-V则可以显著抑制肿瘤的肝肺转移，该组所有小鼠均未检测到任何转移灶。
测试例10：双特异性抗体在人皮肤癌和***癌细胞小鼠皮下移植瘤模型上的药效
将A431细胞2×106细胞/小鼠/100μl或PC-3细胞5×106接种于Balb/c裸鼠右肋部皮下，当荷瘤小鼠肿瘤体积达到100mm3左右时将小鼠分别随机分为3组：载剂(PBS)、hu15.E-V 3.5mpk和hu14.2B-V 3.5mpk，每组8只。将分组当天定义第0天，分组当日开始腹腔注射各抗体，每周2次，共给药6次，每周2次监测肿瘤体积、动物重量并记录数据。当肿瘤体积超过1000mm3或多数肿瘤出现破溃或体重下降20％时，将荷瘤动物进行安乐死作为实验终点。所有数据使用Excel和GraphPad Prism 5软件进行作图及统计分析。肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。
相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。
分组情况和给药方案如表14所示，肿瘤生长曲线如图9A和图9B所示。
表14.分组、给药方案及抑瘤率
Figure GPA0000304212110000471
结果见表14和图9A-9B，显示本公开中的双特异性抗体hu15.E-V和hu14.2B-V均可显著抑制A431肿瘤和PC-3肿瘤的生长。
测试例11.双特异性抗体对激光致恒河猴脉络膜新生血管抑制功能的测试
本测试例通过眼玻璃体注射给药对恒河猴激光致脉络膜新生血管渗漏和生长的影响，来验证本申请中的双特异性抗体可玻璃体注射用于老年性黄斑变性(Age-relatedmacular degeneration，AMD)等疾病的治疗。具体方法如下：
通过激光围绕恒河猴眼底黄斑中心凹光凝，诱导眼底脉络膜血管新生，建立与人类脉络膜新生血管类似的动物模型。光凝前及光凝后20天进行荧光素眼底血管造影判定造模情况，选择造模成功的16只恒河猴(四川格林豪斯生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK(川)2014-013，实验动物质量合格证编号：No：0022202)，将恒河猴随机分为溶媒对照组、雷珠单抗(96μg，4μM)组、RG7716(292μg，2μM)组、hu15.E-V1(170μg，1μM)组，共4组，每组4只猴。
光凝后21天，雷珠单抗组、RG7716292组、hu15.E-V1组，分别按96μg、292μg、170μg/眼，双眼玻璃体注射给予50μL浓度为1.92mg/mL的雷珠单抗，5.84mg/mL的RG7716，3.4mg/mL的hu15.E-V1，溶媒对照组给与等体积的溶剂。各组动物于给药后7、14、28天进行眼压检查、眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影检查、光学相干断层扫描(OCT)，观察抗体对脉络膜新生血管的抑制情况。于给药后28天取房水100～200μL，分装100μL进行房水VEGF测定。于给药后29天实施安乐死后每组取3只眼球进行HE染色组织学检查。结果如下：
AMD造模
激光造模后20天，所纳入试验的16只猴双眼眼底彩色照相均可见黄斑周围各9个激光斑，眼底黄斑周围均可见有激光斑呈高荧光，明显的荧光素渗漏且渗漏超过光斑边缘，激光造模后20天(给药前)，溶媒对照组、雷珠单抗组、RG7716组、hu15.E-V1组4级荧光斑数分别为46、42、40、40个。上述改变类似临床脉络膜新生血管(Choroidal Neovascularization，CNV)改变，提示造模成功。
荧光造影检查
雷珠单抗组、RG7716组、hu15.E-V1组在给药后7、14、28天荧光斑面积均有一定程度的缩小，各组荧光渗漏面积改善率、荧光素渗漏面积减少量均优于溶媒对照组，各组4级荧光斑数与溶媒对照组相比明显降低。给药量为1μM hu15.E-V1组与给药量4μM的雷珠单抗组和给药量为2μM的RG7716组，在各时间点荧光渗漏面积改善率相当。结果见图10A和图10B。
房水VEGF
雷珠单抗组、RG7716292组、hu15.E-V1170组在给药后28天房水VEGF表达量均明显低于溶媒对照组。RG7716组、hu15.E-V1组房水VEGF表达量均明显低于雷珠单抗组。结果见图11。
综上所述，在本试验条件下，激光CNV模型的恒河猴经双眼玻璃体单次注射给予170μg/眼剂量的hu15.E-V1，经视网膜血管荧光造影、光学相干断层成像、房水VEGF及眼组织病理学检查，hu15.E-V1在170μg/眼剂量下对猴CNV均具有明显的抑制作用。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司
上海恒瑞医药有限公司
<120> 特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体
<130> 702011CPCT
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 带人Fc标签的人ANG2氨基酸序列
<400> 1
Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys Gln Tyr
1 5 10 15
Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro Glu Met
20 25 30
Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala Val Gln
35 40 45
Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu Gln Val
50 55 60
Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys Leu Glu
65 70 75 80
Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile Gln Gln
85 90 95
Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly Thr Asn
100 105 110
Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val Glu
115 120 125
Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu Leu Glu
130 135 140
His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp Gln Thr
145 150 155 160
Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu Lys Lys
165 170 175
Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser Ile Lys
180 185 190
Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn Ser Ile
195 200 205
Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn Asn Ser
210 215 220
Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn Asn Leu
225 230 235 240
Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr Val Ala
245 250 255
Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe Lys Ser
260 265 270
Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn Ser Thr
275 280 285
Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly Gly Trp
290 295 300
Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln Arg Thr
305 310 315 320
Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp
325 330 335
Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg Tyr Val
340 345 350
Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr Ser Leu
355 360 365
Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg Ile His
370 375 380
Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile Ser Gln
385 390 395 400
Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys Cys Ile
405 410 415
Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys
420 425 430
Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln Asn Thr
435 440 445
Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser Gly Tyr
450 455 460
Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe Asp Ile
465 470 475 480
Glu Gly Arg Met Asp Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
485 490 495
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
500 505 510
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
515 520 525
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
530 535 540
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
545 550 555 560
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
565 570 575
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
580 585 590
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
595 600 605
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
610 615 620
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
625 630 635 640
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
645 650 655
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
660 665 670
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
675 680 685
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
690 695 700
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys His His His
705 710 715 720
His His His
<210> 2
<211> 953
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 带人Fc标签Tie2的氨基酸序列
<400> 2
Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu Pro Leu Val Ser Asp Ala
1 5 10 15
Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly Trp Arg Pro His Glu Pro
20 25 30
Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu Met Asn Gln His Gln Asp
35 40 45
Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg Glu Trp Ala Lys Lys Val
50 55 60
Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile Asn Gly Ala Tyr Phe Cys
65 70 75 80
Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg Ile Arg Thr Met Lys Met
85 90 95
Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met Thr Val Asp
100 105 110
Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys Lys Val Leu Ile Lys Glu
115 120 125
Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser Phe Ile His Ser Val Pro
130 135 140
Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val His Leu Pro His Ala Gln
145 150 155 160
Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Gly Asn Leu
165 170 175
Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val Arg Arg Cys Glu Ala Gln
180 185 190
Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn His Leu Cys Thr Ala Cys Met Asn Asn
195 200 205
Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys Ile Cys Pro Pro Gly Phe
210 215 220
Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu Leu His Thr Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu Gly Cys Lys Ser Tyr Val
245 250 255
Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser Cys Ala Thr Gly Trp Lys
260 265 270
Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His Pro Gly Phe Tyr Gly Pro Asp
275 280 285
Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Asn Asn Gly Glu Met Cys Asp Arg Phe
290 295 300
Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gln Gly Leu Gln Cys Glu Arg
305 310 315 320
Glu Gly Ile Pro Arg Met Thr Pro Lys Ile Val Asp Leu Pro Asp His
325 330 335
Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro Ile Cys Lys Ala Ser Gly
340 345 350
Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr Leu Val Lys Pro Asp Gly
355 360 365
Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His Thr Asp His Phe Ser Val
370 375 380
Ala Ile Phe Thr Ile His Arg Ile Leu Pro Pro Asp Ser Gly Val Trp
385 390 395 400
Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met Val Glu Lys Pro Phe Asn
405 410 415
Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu Asn Ala Pro Asn Val Ile
420 425 430
Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Val Ile Asn Ile Ser Ser Glu Pro Tyr
435 440 445
Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys Leu Leu Tyr Lys Pro Val
450 455 460
Asn His Tyr Glu Ala Trp Gln His Ile Gln Val Thr Asn Glu Ile Val
465 470 475 480
Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Pro Arg Thr Glu Tyr Glu Leu Cys Val Gln
485 490 495
Leu Val Arg Arg Gly Glu Gly Gly Glu Gly His Pro Gly Pro Val Arg
500 505 510
Arg Phe Thr Thr Ala Ser Ile Gly Leu Pro Pro Pro Arg Gly Leu Asn
515 520 525
Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Thr Leu Asn Leu Thr Trp Gln Pro Ile
530 535 540
Phe Pro Ser Ser Glu Asp Asp Phe Tyr Val Glu Val Glu Arg Arg Ser
545 550 555 560
Val Gln Lys Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys Val Pro Gly Asn Leu Thr
565 570 575
Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg Glu Gln Tyr Val Val Arg
580 585 590
Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu Trp Ser Glu Asp Leu Thr
595 600 605
Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro Gln Pro Glu Asn Ile Lys
610 615 620
Ile Ser Asn Ile Thr His Ser Ser Ala Val Ile Ser Trp Thr Ile Leu
625 630 635 640
Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile Arg Tyr Lys Val Gln Gly
645 650 655
Lys Asn Glu Asp Gln His Val Asp Val Lys Ile Lys Asn Ala Thr Ile
660 665 670
Thr Gln Tyr Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro Glu Thr Ala Tyr Gln Val
675 680 685
Asp Ile Phe Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser Ser Asn Pro Ala Phe Ser
690 695 700
His Glu Leu Val Thr Leu Pro Glu Ser Gln Ala Pro Ala Asp Leu Gly
705 710 715 720
Gly Gly Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
725 730 735
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
740 745 750
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
755 760 765
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
770 775 780
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
785 790 795 800
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
805 810 815
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
820 825 830
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
835 840 845
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
850 855 860
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
865 870 875 880
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
885 890 895
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
900 905 910
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
915 920 925
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
930 935 940
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
945 950
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 羊驼源单域抗体nano14
<400> 3
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 羊驼源单域抗体nano15
<400> 4
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> nano14 CDR1
<400> 5
Asp Phe Gly Met Ser
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> nano14 CDR2
<400> 6
Ser Ile Thr Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> nano14 CDR3
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Asp His Pro Gln Gly Tyr
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> nano15 CDR1
<400> 8
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> nano15 CDR2
<400> 9
Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> nano14.1 CDR2
<400> 10
Ser Ile Thr Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> nano14.2 CDR2
<400> 11
Ser Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 羊驼nano14.1
<400> 12
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 羊驼nano14.2
<400> 13
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CDR1通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自Asp或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa选自Phe或Tyr.
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa选自Gly或Ala.
<400> 14
Xaa Xaa Xaa Met Ser
1 5
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> CDR2通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自Ser或Thr.
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa选自Thr或Asn.
<220>
<221> UNSURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa选自Trp或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自Asn,Gly或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa选自Arg或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa选自Tyr或Gly.
<400> 15
Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 16
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 羊驼抗ANG2单域抗体的通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa选自Asp或Asn.
<220>
<221> UNSURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa选自Asp或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa选自Phe或Tyr.
<220>
<221> UNSURE
<222> (33)..(33)
<223> Xaa选自Gly或Ala.
<220>
<221> UNSURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa选自Ser或Thr.
<220>
<221> UNSURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa选自Thr或Asn.
<220>
<221> UNSURE
<222> (53)..(53)
<223> Xaa选自Trp或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (54)..(54)
<223> Xaa选自Asn,Gly或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (57)..(57)
<223> Xaa选自Arg或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (59)..(59)
<223> Xaa选自Tyr或Gly.
<220>
<221> UNSURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa选自Val或Leu.
<400> 16
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Xaa Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.A
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.1A
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.2A
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.1B
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.2B
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu15.A
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu15.B
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu15.C
<400> 24
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu15.D
<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu15.E
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 人源化单域抗体通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自Val或Gln.
<220>
<221> UNSURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa选自Ser或Asn.
<220>
<221> UNSURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa选自Asp或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa选自Phe或Tyr.
<220>
<221> UNSURE
<222> (33)..(33)
<223> Xaa选自Gly或Ala.
<220>
<221> UNSURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa选自Ser或Thr.
<220>
<221> UNSURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa选自Thr或Asn.
<220>
<221> UNSURE
<222> (53)..(53)
<223> Xaa选自Trp或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (54)..(54)
<223> Xaa选自Asn,Gly或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (57)..(57)
<223> Xaa选自Arg或Ser.
<220>
<221> UNSURE
<222> (59)..(59)
<223> Xaa选自Tyr或Gly.
<220>
<221> UNSURE
<222> (87)..(87)
<223> Xaa选自Arg或Lys.
<220>
<221> UNSURE
<222> (88)..(88)
<223> Xaa选自Ala或Pro.
<220>
<221> UNSURE
<222> (97)..(97)
<223> Xaa选自Ala或Asn.
<220>
<221> UNSURE
<222> (98)..(98)
<223> Xaa选自Lys或Ala.
<400> 27
Glu Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Xaa Xaa Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 雷珠单抗的轻链可变区
<400> 28
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> 雷珠单抗的轻链
<400> 29
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 雷珠单抗的重链可变区
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> 雷珠单抗的重链可变区+IgG1恒定区（重链）
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro
450
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> lucentis HCDR1
<400> 32
His Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> lucentis HCDR2
<400> 33
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> lucentis HCDR3
<400> 34
Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> lucentis LCDR1
<400> 35
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> lucentis LCDR2
<400> 36
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> lucentis LCDR3
<400> 37
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe
1 5 10
<210> 38
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.A-V 第一条链
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Asp Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Thr Trp Asn Gly Gly Ser Thr
500 505 510
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
530 535 540
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
<210> 39
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.1A-V第一条链
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Asp Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Thr Trp Gly Gly Gly Ser Thr
500 505 510
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
530 535 540
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
<210> 40
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.2A-V第一条链
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Asp Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr
500 505 510
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
530 535 540
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
<210> 41
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.1B-V第一条链
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Asp Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Thr Trp Gly Gly Gly Ser Thr
500 505 510
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
530 535 540
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
<210> 42
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu14.2B-V
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Asp Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr
500 505 510
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
530 535 540
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
<210> 43
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu15.A-V第一条链
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr
500 505 510
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
530 535 540
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
<210> 44
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu15.B-V第一条链
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> DOMAIN
<223> hu15.C-V第一条链
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1 5 10 15
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<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr
500 505 510
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
530 535 540
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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
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<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu15.E-V第一条链
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
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305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr
500 505 510
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
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530 535 540
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<221> CHAIN
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
355 360 365
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 49
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
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Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> crossmab anti-VEGF 重链
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
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Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 51
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> crossmab anti-VEGF轻链
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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195 200 205
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<210> 52
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> 阿瓦斯汀 重链
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> 阿瓦斯汀轻链
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 54
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> 雷珠单抗的重链可变区+ IgG1恒定区变体
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro
450
<210> 55
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> hu15.E-V1
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Arg Thr
500 505 510
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
530 535 540
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
<210> 56
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> hu14.2B-V1
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Ser Asp Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr
500 505 510
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
515 520 525
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
530 535 540
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp His Pro Gln Gly Tyr Trp Gly
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565
<210> 57
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> RG7716 抗-VEGF-重链（Knob)
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 58
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> RG7716 抗-Ang2 重链（Hole）
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 59
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> RG7716 抗-Ang2轻链
<400> 59
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys
210

Claims (21)

1.一种特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其包含特异性结合VEGF的抗VEGF抗体或其抗原结合片段和特异性结合ANG2的抗ANG2单域抗体，其中所述的抗ANG2单域抗体直接地通过肽键或间接地通过接头连接至抗VEGF抗体或其抗原结合片段的重链羧基端，其中所述的抗ANG2单域抗体包含如下任一项所示的CDR1、CDR2和CDR3：
i)如SEQ ID NO:5所示的CDR1、如SEQ ID NO:6所示的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的CDR3；或
ii)如SEQ ID NO:8所示的CDR1、如SEQ ID NO:9所示的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的CDR3；或
iv)如SEQ ID NO:5所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其中所述接头为(G)n，其中n>＝1。
3.根据权利要求1或2所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其中所述的抗ANG2单域抗体为羊驼抗体或人源化抗体。
4.根据权利要求3所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其中所述的人源化抗体包含来源自人抗体的重链框架区或其框架区变体，所述框架区变体在人抗体的重链框架区上具有至多10个氨基酸的回复突变。
5.根据权利要求3所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其中所述的抗ANG2单域抗体包含如下任一项所示的序列：
v)如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:13所示的序列，或
vi)如SEQ ID NO:21或26所示的序列。
6.根据权利要求1或2所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其中所述的抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含：
分别如SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和分别如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
7.根据权利要求6所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其中所述的抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:28所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:30所示的重链可变区。
8.根据权利要求7所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其中所述的抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:29所示的轻链和如SEQ ID NO:31或54所示的重链。
9.根据权利要求1或2所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，其包含选自SEQID NO：42、47、55或56中任一所示的第一多肽链，和/或如SEQ ID NO:29所示的第二多肽链。
10.一种抗ANG2单域抗体，其中所述的抗ANG2单域抗体包含如下所示的CDR1、CDR2和CDR3：
i)如SEQ ID NO:5所示的CDR1，如SEQ ID NO:6所示的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的CDR3；或
ii)如SEQ ID NO:8所示的CDR1，如SEQ ID NO:9所示的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的CDR3；或
iv)如SEQ ID NO:5所示的CDR1，如SEQ ID NO:11所示的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的CDR3。
11.根据权利要求10所述的抗ANG2单域抗体，其为羊驼抗体或人源化抗体。
12.根据权利要求11所述的抗ANG2单域抗体，其中所述的人源化抗体包含来源自人抗体的重链框架区或其框架区变体，所述框架区变体在人抗体的重链框架区上具有至多10个氨基酸的回复突变。
13.根据权利要求11所述的抗ANG2单域抗体，其中所述的抗ANG2单域抗体包含如下所示的序列：
v)包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:13所示的序列，或
vi)包含如SEQ ID NO:21或26所示的序列。
14.一种单克隆抗体，其包含如权利要求10至13中任一项所述的抗ANG2单域抗体。
15.一种双特异性抗体，其包含10至13中任一项所述的抗ANG2单域抗体。
16.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
17.一种核酸分子，其编码权利要求1至9中任一项所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体。
18.一种宿主细胞，其转化有权利要求17所述的核酸分子，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。
19.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体。
20.根据权利要求1至9中任一项所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体或根据权利要求16所述的药物组合物在制备用于治疗癌症或血管生成性眼病的药物中的用途，包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的特异性结合VEGF和ANG2的双特异性抗体或根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述的癌症选自乳腺癌、肾上腺肿瘤、输卵管癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胆管癌、膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌和肝癌；其中所述的血管生成性眼病选自新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿和眼部新生血管性疾病。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述的血管生成性眼病选自角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、视网膜/脉络膜新血管生成和房角的新血管生成。
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