CN112946287B - 用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病及其标志细胞的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病及其标志细胞的试剂盒，其包含能够指示细胞内或其表面是否存在选自PECAM1、PTPRC、子宫内膜标志物的指示剂和DAPI。本发明的试剂盒能够大大提高循环子宫内膜细胞的鉴定准确性，进而能够更有效地进行与外周血中循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的诊断。

Description

用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病及其 标志细胞的试剂盒

技术领域

本发明涉及细胞鉴定领域，具体地涉及用于诊断与外周血中循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病，特别是诊断子宫内膜异位症的试剂盒以及用于鉴定与子宫内膜异位症相关的特异细胞的试剂盒。

背景技术

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)在生育年龄妇女中的发病率超过10％，常引起盆腔疼痛或***，且具有易复发、可恶变的特点，不仅会造成生理上的痛苦，也给患者的心理和社交带来障碍。目前，EM发病机制尚未明确，比较公认的是Sampson的经血逆流种植学说，但其并不能解释为什么约90％女性有经血逆流现象，而只有一部分患有EM。近年来，国内学者提出的“在位内膜决定论”，认为在位内膜的异常决定了随经血逆流的内膜碎片的命运-存活或者死亡。EM患者异常的内膜碎片随经血逆流入盆腔，完成粘附、侵袭、血管生成，最终形成EM。

血行种植理论提出了另一种子宫内膜异位症碎片转移至异位的途径：EM可能是由于子宫内膜组织碎片由循环转移至异位种植形成，但具体的转移过程仍然未明。2014年有研究首次报道，EM患者中存在循环内膜细胞(CEC)，是有活性的异位病灶存在的明确而特异的证据，有助于阐释血行转移的过程，作为该学说有力的证据，有着重要的基础和临床研究价值。

由于CEC与EM的临床相关性目前尚无报道，且文献报道在EM中的CEC检出率较低，仅为23.5％，这大大限制了基于CEC细胞检测EM的后续应用。

申请人先前的研究表明，CEC对EM具有良好的敏感性与特异性，可更好的区别早期EM，而且不受***的影响，因此可以作为诊断子宫内膜异位症的生物标志物，并且在子宫内膜异位症中CEC细胞的检出率也进一步提高到89％左右，但与此同时在健康对照及其他非子宫内膜异位症患者中也存在较高，甚至高达20％的检出率。

背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对现有技术中存的问题，发明人在进一步研究后发现先前研究的基于CEC诊断子宫内膜异位症的检测率中存在假阳性现象，而致使产生假阳性的原因主要在于在分离检测CEC细胞时存在一定数量的内皮细胞。基于此发现发明人优化制备得到一种试剂盒，其可用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病或及标志细胞。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的试剂盒，其包含能够指示细胞内或其表面是否存在选自PECAM1、PTPRC、子宫内膜标志物的指示剂和DAPI。

在某些实施方案中，根据本发明的用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的试剂盒，其进一步包括能够显示细胞染色体是否异常的试剂。

在某些实施方案中，根据本发明的用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的试剂盒，其中，所述显示细胞染色体是否异常的试剂包括CEP8。

在某些实施方案中，根据本发明的用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的试剂盒，其中，所述指示剂包括抗体和与抗体偶联的可检测发光基团。

在某些实施方案中，根据本发明的用于诊断与外周血中循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的试剂盒，其中，所述指示剂包含抗PECAM1抗体、抗PTPRC抗体、抗子宫内膜标志物抗体，且各抗体分别偶联不同的荧光基团。

在某些实施方案中，根据本发明的用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的试剂盒，其进一步包括含柠檬酸钠的缓冲液。

在某些实施方案中，根据本发明的用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的试剂盒，其中，所述诊断包括判断受试者患子宫内膜异位症的风险，或者包括判断或预测子宫内膜异位症受试者是否恶变或恶变风险。

在某些实施方案中，根据本发明的用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的试剂盒，其中，所述诊断包括以下步骤：

(1)从受试者采集外周血，弃掉前2-3ml后，取6-8ml进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相；

(2)向所述富集液相加入含柠檬酸钠的缓冲液，然后加入染色混合液进行结合反应，离心后去上清得到细胞液，所述染色混合液包含抗PECAM1抗体、DAPI、抗PTPRC抗体、抗子宫内膜标志物抗体，且各抗体分别偶联不同的荧光基团；

(3)在荧光显微镜下通过颜色选择PECAM1^-、DAPI⁺、PTPRC^-，同时子宫内膜标志物为阳性，将选择的细胞作为标志物细胞。

在某些实施方案中，根据本发明的用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病的试剂盒，优选地，在步骤(2)和(3)之间进一步包括向所述细胞液加入固定液混匀后，涂布于载玻片，干燥后加入包含CEP8探针的显色试剂进行杂交，得到检测标本，并选择染色体异常的细胞作为标记物细胞。

本发明的第二方面，提供一种用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的试剂盒，其包含能够指示细胞内或其表面是否存在选自PECAM1、PTPRC、子宫内膜标志物的指示剂和DAPI；优选地，进一步包括能够显示细胞染色体是否异常的试剂；进一步优选地，指示剂包括抗体和与抗体偶联的可检测发光基团；更进一步优选地，还包括含柠檬酸钠的缓冲液。

本发明的试剂盒能够大大提高循环子宫内膜细胞的鉴定准确性，从而能够有效地用于子宫内膜异位症的诊断。

附图说明

图1为本发明的试剂盒得到的示例性细胞检测结果的典型图像。

图2为CEC、CVEC在EM和非EM对照中的存在情况，其中每组中左边的柱表示EM，右边的柱表示非EM。

图3为CEC、CVEC在EM和非EM对照中的数量比较。

图4为分层后CEC、CVEC的检出率比较，其中每组中左边的柱表示活跃型EM，中间的柱表示休眠型EM，右边的柱表示非EM对照。

图5为分层后CEC、CVEC的细胞数比较。

图6为CEC、CVEC和***的关系。

图7为CEC、CVEC和EM分期的关系。

图8为小细胞和非小细胞CEC的比例。

图9为二倍体和非二倍体CEC的比例。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于数量的百分数。

本发明中，表示细胞数量或个数的数值一般为自然数，例如1、2、3、4、5等。在数量统计的情况下，例如多次计数或测量并统计平均值时，细胞数量可以用小数表示，例如1.5个，1.8个等。

本发明提供的试剂盒一般可用于在从来自受试者的外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中选择PECAM1^-、DAPI⁺、PTPRC^-，同时子宫内膜标志物(例如，ER、PR、CD10等)为阳性的细胞作为候选细胞。

发明人发现，前期研究中在鉴定出循环内膜细胞中存在较多的内皮细胞，这些内皮细胞的存在致使子宫异位症的诊断结果中存在较多的假阳性，准确性大大降低。发明人发现通过选择PECAM1、PTPRC、子宫内膜标志物抗原作为指标可以有效鉴定出循环子宫内膜细胞，排除内皮细胞的干扰。另外，发明人还发现，循环子宫内膜细胞的大小并非均一，而是存在差异。因此在从外周血中基于细胞大小分离细胞的方法中会不可避免地排除部分所期望的细胞。这对于细胞数量本身极少的循环内膜细胞的检测而言是极为不利的。为了避免数量极少的循环内膜细胞的损失，本发明的试剂盒利用通过差相富集得到小细胞。与传统基于细胞大小，例如微流控技术进行的细胞筛选方案相比，本发明的试剂盒能够避免小的循环内膜细胞，例如直径5μm以下的细胞损失。

本发明中，通过从来自受试者的外周血中去除红细胞和白细胞而得到富集液相。由于外周血中红细胞的数量较多，可通过例如离心，优选密度梯度离心的方式进行去除。白细胞在外周血中的数量较少，可通过例如结合有白细胞抗体的磁珠去除样品中的白细胞。上述方法并不会排除外周血中的期望细胞，因而是优选的。

本发明的试剂盒进一步能够检测CEC细胞中非正常细胞或变异细胞。具体地，可对基于蛋白或免疫筛选的候选细胞进一步进行核酸检测。通过进一步选择异常细胞，例如基于非二倍的细胞可进一步预测EM患者的恶变风险。核酸检测一般为检测染色体的检测，例如可以使用针对染色体的探针进行检测的技术。在优选的实施方案中，本发明通过检测某一条染色体例如8号染色体在细胞内的数量进行是否异常的检测。

本发明中，在得到的富集液相中包含期望的细胞及杂质细胞和液体成分。在接下来的鉴定或筛选过程中，可以直接向富集液相中加入检测试剂进行反应，而不需要对液相进行离心等其他操作。检测试剂一般包括能够指示选自PECAM1、PTPRC、子宫内膜标志物组成的组的蛋白的指示剂和DAPI，和可选的能够显示细胞染色体是否异常的试剂。为了提高检测的灵敏性，优选地，在加入检测试剂之前加入含柠檬酸钠的缓冲液。

本发明中，能够指示选自PECAM1、PTPRC、子宫内膜标志物组成的组的蛋白的指示剂可以是一种，也可以是多种。例如，一种指示剂可用于指示PECAM1、DAPI、PTPRC、ER、PR和CD10等中的一种，或者两种以上的指示剂组合可用于指示PECAM1、DAPI、PTPRC、ER、PR和CD10等中的一种。优选地，指示剂是相应抗原或蛋白的抗体或抗原结合片段。更优选地，抗体进一步包括与之偶联的可检测基团，例如荧光基团。

在检测试剂为多种的情况下，可以向富集液相中一次性加入各检测试剂的预混物，也可以依次分别加入各检测试剂。对此不做特别限定。各检测试剂的用量也不特别限定，可根据需要而作适应性调整。优选地，各检测试剂的用量基本上相等。更优选地，用于检测PTPRC的试剂的量大于其他试剂。例如，用于检测PTPRC的试剂的量为4体积份，而其他试剂的量分别为1体积份。在某些实施方案中，用于检测PTPRC的试剂的量:用于检测PECAM1的试剂的量:用于检测DAPI的试剂的量:用于检测ER的试剂的量:用于检测PR的试剂的量为(2-6):(0.8-1.5):(0.8-1.5):(0.8-1.5)，优选4:1:1:1。

除了上述成分外，本发明的试剂盒还可包括其他成分。其他成分的实例包括但不限于缓冲液、组织固定液、样本稀释液、免疫显色试剂和清洗液等。这些成分可以使用本领域已知的那些。本发明的试剂盒可以包含上述成分中的一种或多种。

本发明中，受试者一般为任何雌性动物或女性人类。在子宫异位症诊断时的受试者不包括已被诊断为恶性肿瘤或有肿瘤病史的患者，也不包括诊断有血液性疾病或白细胞异常的患者，并且优选排除检测时正在妊娠或哺乳、或已绝经的受试者。另外，优选地，受试者在检测前3个月未使用过甾体类激素药物。

本发明中，用于判断的阀值不特别限定，并且根据情况不同，阀值也可变化。由于本发明提高了检测的准确性，因此检测结果更可靠和准确。为了方便说明，本发明中使用特定体积(例如6ml)的血液中所含的细胞数量表示阀值，本领域技术人员应理解，本发明中表示阀值的数值与其单位密切相关，实际上当单位变化时，本发明的数值也会相应的变化。本发明的阀值范围包括说明书中明确记载的数值，也包括通过单位换算得到的对应数值。

本发明中，一般而言，只要能够在8ml以下的体积中能够检测到大于一个的循环子宫内膜细胞时(优选为1个/6ml血样以上，更优选为2个/6ml血样以上，还进一步优选3个/6ml血样以上时)，则即可将受试者诊断为患子宫内膜异位症高风险。当在8ml以下，优选4-8ml，更优选6-8ml外周血中存在1个以下循环子宫内膜细胞时(在平均值的情况下，优选0.7个/6ml血样以下，更优选0.5个/6ml血样以下，进一步优选0.3个/6ml血样以下，还进一步优选0.2个/6ml血样以下时)，将受试者诊断为患子宫内膜异位症低风险。

在某些实施方案中，本发明的受试者具有内异症相关症状，使用本发明的试剂盒用于确诊。其中，此处的内异症相关症状包括在6个月内存在痛经等内异症相关症状的进行性加重或肿物增幅大于2cm。在此情况下，判断阀值一般为2个/6ml以上的循环子宫内膜细胞，优选3个/6ml以上的循环子宫内膜细胞，更优选4个/6ml以上的循环子宫内膜细胞，进一步优选5个/6ml以上的循环子宫内膜细胞。

在某些实施方案中，本发明的受试者处于***的分泌期，此时用于判断的阀值相对而言一般较低，例如为1个细胞/6ml以上，优选2个细胞/6ml以上。当受试者处于***的增殖期时，用于判断的阀值相对而言一般较高，例如为3个细胞/6ml以上，优选为4个细胞/6ml以上，更优选5个细胞/6ml以上，进一步优选6个细胞/6ml以上。在针对同一受试者不同时间采集的血样进行检测时，本发明的判断阀值可基于分泌期的阀值和增殖期的阀值进行结合或优化处理。

利用本发明的试剂盒可以更有效地检测出外周血循环子宫内膜细胞。并且基于所检测出的外周血循环子宫内膜细胞可进一步用于诊断子宫内膜异位症。在诊断子宫内膜异位症的时，可进一步包括对检出的外周血循环子宫内膜细胞进一步分析的步骤。这些进一步分析的步骤包括对外周血循环子宫内膜细胞的大小进行分析的步骤，或对外周血循环子宫内膜细胞的染色体进行分析的步骤。例如，根据细胞大小，将直径5μm以下的细胞归为小细胞，并将其他细胞归为大细胞。再例如，根据细胞中染色体的位数，将外周血循环子宫内膜细胞进一步分为二倍体细胞、三倍体细胞、四倍体细胞或五倍体以上细胞等。

本发明中，用于诊断子宫内膜异位症包括判断或确认受试者是否患有子宫内膜异位症或患有子宫内膜异位症的风险，还包括判断或预测子宫内膜异位症受试者是否恶变或恶变风险。

实施例

一、主要实验材料和试剂

1.血液标本来源于招募因超声检查发现盆腔肿物而接受手术治疗的患者。

纳入标准：

1)育龄期妇女高度怀疑患有内异症

2)准备接受手术治疗

排除标准：

1)检测时正在妊娠或哺乳，或已绝经的女性

2)诊断有其他恶性肿瘤或有肿瘤病史

3)诊断有血液性疾病或白细胞异常

4)检测前3个月使用过甾体类激素药物(包括口服避孕药，皮下植入避孕药，孕激素宫内释放装置等)

5)未签署知情同意书。

此外无症状的月经规律且超声检查无异常的女性招募为健康对照组。

2.实验试剂和材料

DMEM/F12细胞培养基(美国Gibco公司)

胎牛血清(美国Gibco公司)

胰蛋白酶(美国Gibco公司)

ACD抗凝采血管(美国BD公司)

清洗液10×CRC(美国Cytelligen公司)

样本密度分离液(美国Cytelligen公司)

缓冲液Magnetic Beads Buffer(美国Cytelligen)

组织固定液Cytelligen Fixative(美国Cytelligen)

组织固定液FR1、样本稀释液FR2、缓冲液10×FR3

免疫显色试剂FISH

血细胞分析用稀释液

血细胞分析用染色液A01(anti-PTPRC，AF594)

血细胞分析用染色液

血细胞分析用染色液

血细胞分析用染色液

清洗液Ab Washing

血细胞分析用染色液DAPI5

二、实验方法

1.采集病人外周血：为避免上皮细胞污染，弃掉前2ml血液后，使用ACD抗凝采血管采集6.0ml血液，并立即头尾颠倒混匀采血管8次。室温避光保存，24小时内处理最佳，不超过48小时。

2.将采血管配平，头尾颠倒混匀后，室温离心15分钟(400x g)。弃上清至棕红色沉淀上方5毫米处，加入清洗液1×CRC至采血管标签黄线满管处，盖上黄色管帽，头尾颠倒混匀10次。

3.于50ml离心管A中加入3ml样本密度分离液，将采血管轻柔头尾颠倒混匀，使用电动移液器将采血管中的血细胞沿离心管A管壁液面处缓慢加到分离液顶层。配平后，室温离心6分钟(350x g)。

4.A管离心后可见三层液体，上层为黄色液体(Layer 1)，中间层为透明或淡红色液体(Layer 2)，底层为深棕红色沉积红细胞(Layer 3)。将1、2层所有液体转移至50ml离心管B中，震荡混匀液体。

5.将缓冲液Magnetic Beads Buffer充分混匀，按每管300μl的比例将缓冲液Magnetic Beads Buffer缓慢加入离心管B中，边加边摇动离心管以混匀缓冲液MagneticBeads Buffer。将离心管以35°-40°角倾斜固定于摇床上，室温摇动20分钟，125rpm(液面摇晃的最高处于刻度30-35ml之间)。

6.将管B置于磁力架上，1分钟时使用5ml枪头伸入管底中央轻柔吹打2下，2分钟后使用同样枪头沿管B正中央将液体小心转移至50ml离心管C中。

7.50ml离心管C中加入清洗液1×CRC至45ml，配平，颠倒混匀，室温离心5分钟(500x g)。弃上清至500μl，于旋涡混合仪轻柔震荡混匀细胞，加入清洗液1×CRC至45ml，配平，颠倒混匀，室温离心5分钟(400x g)。

8.弃上清至100μl。

9.于离心管C液面加入2μl抗原修复缓冲液，使用振荡混合仪轻柔振荡混匀沉淀细胞，室温静置10分钟。

配制染色液：从冰箱取出染色液保存管于1.5ml离心管台式离心机中高速离心5秒钟。2-8℃条件下吸取染色液，按每张玻片计算，200μl血细胞分析用稀释液+4μl血细胞分析用染色液PTPRC+1μl血细胞分析用染色液PECAM1+1μl血细胞分析用染色液ER+1μl血细胞分析用染色液PR；

使用加样器轻柔吹打10次以充分混匀抗体。将配制后的血细胞分析用染色液混合液室温避光放置。

10.(避光)于管C中加入全部200μl上述血细胞分析用染色液混合液，使用振荡混合仪轻柔振荡混匀沉淀细胞，室温避光孵育20分钟(10分钟时使用振荡混合仪轻柔振荡混匀沉淀细胞)。

11.于管C中加入5ml清洗液1×CRC，使用5ml移液枪轻柔吹打混匀后转移至新的15ml离心管中，加入清洗液1×CRC至14ml。配平，颠倒混匀，室温离心5分钟(500xg)，弃上清至100μl。

12.使用1ml注射器扎入组织固定液Cytelligen Fixative试剂瓶，抽取适量组织固定液Cytelligen Fixative(100μl固定液/玻片/人份)于1.5ml离心管中。将上述100μl细胞液轻柔振荡混匀后加入100μl组织固定液Cytelligen Fixative，并使用保留的加样器枪头轻柔吹打混匀。将每管标本液体分别涂于Cytelligen载玻片标本框内(1人份/玻片)。

13.标本干燥与保存：将标本放置30-33℃干燥箱过夜(全程不开鼓风，打开顶置通风口)，第二天关闭干燥箱温度后将标本继续静置于干燥箱中30分钟凉至室温，立即进行后续检测。干燥后进行FISH操作。

14.以下操作均须避光。

配制混合液：使用1.5ml离心管离心机室温高速离心组织固定液FR1管10秒。按每张玻片计算取液：20μl组织固定液FR1+180μl样本稀释液FR2(取用前从37℃水浴中取出，确保已预热至37℃)，于振荡器上充分振荡混匀。混合液配制好后立即加入标本上：沿Cytelligen CTC载玻片标本框内侧边角轻柔滴加200μl混合液覆盖标本框，室温避光静置10分钟，吸弃混合液。

15.沿标本框内侧边角轻柔滴加200μl缓冲液1×FR3后，立即吸弃溶液，共重复2次。沿标本框内侧边角轻柔滴加200μl缓冲液1×FR3，室温静置2分钟，吸弃溶液，共重复2次。

16.沿标本框内侧边角轻柔滴加200μl无水乙醇后，立即吸弃，共重复2次。

17.将玻片***缸Ⅱ(无水乙醇)中静置2分钟。取出玻片，竖立在滤纸上吸干玻片流下残留液，并使用微型吹风机将玻片轻柔吹至完全干燥后，立即按步骤10滴加探针。

18.自2-8℃取出分装好的免疫显色试剂FISH(CEP8探针)，于标本框中央滴加10μl探针后，立即使用镊子将盖玻片平放在探针液上，使液体向四周蔓延至整个标本框。如果需要，可轻按盖玻片以使探针液覆盖整个标本框。

19.封片：剪去1ml加样器尖头，使用封片胶(Rubber Cement)封住盖玻片四边边缘后，直接放入杂交仪(不需等待封片胶干燥)。

20.杂交：变性76℃，10分钟；杂交37℃，3小时。

21.杂交完毕，取出玻片。用手轻按盖玻片一角，使用镊子撕去Rubber Cement，将玻片置于预热至37℃的缸Ⅰ(缓冲液1×FR3)中，静置1分钟后轻柔晃动缸Ⅰ，直至盖玻片脱落。盖玻片脱落后，将玻片继续在缸Ⅰ中静置5分钟后再轻轻晃动缸Ⅰ5秒，取出，使用滤纸吸干玻片流下的残留液，并擦干标本框***液体。

22.沿标本框内侧边角轻柔滴加200μl清洗液Ab Washing后，立即吸弃溶液，共重复2次。沿标本框内侧边角轻柔滴加200μl清洗液Ab Washing，室温静置2分钟，吸弃溶液。使用吹风机将玻片标本框吹干。

23.将血细胞分析用染色液DAPI分装管瞬时高速离心，取10μl血细胞分析用染色液DAPI滴加于标本框中央，置放盖玻片后，一手固定盖玻片防止其滑动，另一手用真空泵吸头或滤纸挤压并吸干溢出的多余液体，封干标本，不可出现气泡。封干后使用封片胶将盖玻片的四个边角封住，以防玻片滑落。

24.立即在荧光显微镜下观察或于2-8℃避光保存。为避免FISH信号及抗体染色荧光减弱，标本应在一周内完成检测。

三、实验结果

将PECAM1-、DAPI+、PTPRC-，同时ER和PR至少之一为阳性的细胞作为血液循环子宫内膜细胞(CEC)，将PECAM1+、DAPI+、PTPRC-，同时ER和PR至少之一为阳性的细胞作为循环血管内皮细胞(CVEC)。

图2为CEC、CVEC在EM和非EM对照中的存在情况。如图2所示，本发明的方法得到的CEC和CVEC两者的总和在内异症(EM)患者中的检出率为85.3％，与前期微流控芯片方法(89.5％)相近。本发明的新染色方法由于PECAM1的增加，捕捉更为准确。其中，CEC在EM患者中检出率58.8％，在对照组中检出率16.7％，而CVEC在EM患者中检出率为73.5，在对照组中为66.7％。

从细胞数量上进一步分析，结果如图3所示，CEC在EM患者中平均1.94个/6ml，在对照组中平均为0.17个/6ml(P＜0.05)，而CVEC在EM患者中平均6.29个/6ml血，在对照组中平均为1.83个/6ml(P＜0.05)。二者总和在EM患者中平均8.24个/6ml血，在对照组中平均为2个/6ml(P＜0.05)。

进一步分析发现85％的CEC阳性的患者在临床病程特点上具有相似性，即均在6个月内存在痛经等内异症相关症状的进行性加重或肿物增大大于2cm。

因此接下来把所有EM患者中具有如上特点的患者划分为活跃型内异症，其它划分为休眠型内异症，首先再次比较了检出率。结果如图4所示。

接下来，再次比较了不同类型EM患者的细胞数量的差异。结果如图5所示，CEC在活跃型EM患者中平均3.5个/6ml，显著多于休眠型EM(3.5vs0.21个/6ml，P＜0.05)，显著多于对照组(3.5vs0.2个/6ml，P＜0.05)，后两者间无统计学差异(P＞0.05)。CVEC在活跃型EM患者中平均9.22个/6ml，显著多于休眠型EM(9.22vs3个/6ml，P＜0.05)，显著多于对照组(9.22vs1.83个/6ml，P＜0.05)，后两者间无统计学差异(P＞0.05)。二者之和在活跃型EM患者中平均12.72个/6ml，显著多于休眠型EM(12.72vs3.19个/6ml，P＜0.05)，显著多于对照组(12.72vs2个/6ml，P＜0.05)，后两者间无统计学差异(P＞0.05)。

图6为CEC、CVEC和***的关系。如图6所示，CEC在增殖期平均为4.82个/6ml，在分泌期平均为1.43个/6ml，差异具有统计学意义(P＜0.05)。CVEC在增殖期平均为13.91个/6ml，在分泌期平均为1.86个/6ml，差异具有统计学意义(P＜0.05)。二者之和在增殖期平均为18.73个/6ml，在分泌期平均为3.29个/6ml，差异具有统计学意义(P＜0.05)。认为增殖期外周血中具有较分泌期更多的CEC及CVEC，之后可于增殖期检测。

图7为CEC、CVEC和EM分期的关系。如图7所示，CEC在I-II期EM中平均为1.86个/6ml，在III-IV期EM中平均为4.9个/6ml，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。CVEC在I-II期EM中平均为10.57个/6ml，在III-IV期EM中平均为9.1个/6ml，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。二者总和在I-II期EM中平均为12.43个/6ml，在III-IV期EM中平均为14个/6ml，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。因此认为EM患者外周血中CEC、CVEC在I-II期和III-IV期内异症中没有明显差异。

图8为CEC细胞中大小细胞的统计结果。如图8所示，小细胞(直径＜5μm)占比为63.5％，其它细胞占比为36.5％。

图9为对CEC的8号染色体倍体数的统计结果。如图9所示，在CEC中二倍体细胞占比为55.6％，其它细胞占比为44.4％。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (7)

1.试剂在制备用于外周血诊断活跃型异位症的试剂盒中的用途，其特征在于：

所述试剂为抗PECAM1抗体、抗PTPRC抗体、抗子宫内膜标志物抗体、CEP8以及DAPI，其中所述子宫内膜标志物选自ER、PR和CD10中的至少一种；

所述试剂用于检测DAPI⁺、PTPRC^-、PECAM1^-，同时子宫内膜标志物为阳性的细胞作为活跃型异位症的标志细胞。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗体偶联可检测发光基团。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，各抗体分别偶联不同的荧光基团。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，进一步包括含柠檬酸钠的缓冲液。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断包括鉴定外周血循环子宫内膜细胞。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述鉴定包括以下步骤：

(1) 从受试者采集外周血，弃掉前2-3ml后，取6-8ml进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相；

(2) 向所述富集液相加入含柠檬酸钠的缓冲液，然后加入染色混合液进行结合反应，离心后去上清得到细胞液，所述染色混合液包含抗PECAM1抗体、DAPI、抗PTPRC抗体、抗子宫内膜标志物抗体，且各抗体分别偶联不同的荧光基团；

(3) 在荧光显微镜下通过颜色选择DAPI⁺、PTPRC^-、PECAM1^-，同时子宫内膜标志物为阳性的细胞，将选择的细胞作为外周血循环子宫内膜细胞。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，在步骤(2)和(3)之间进一步包括向所述细胞液加入固定液混匀后，涂布于载玻片，干燥后加入包含CEP8探针的显色试剂进行杂交，得到检测标本，并选择染色体异常的细胞作为外周血循环子宫内膜细胞。

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