CN112946277A - 基于PEDOT@PSS-Pd电化学免疫传感器的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于PEDOT@PSS‑Pd的电化学免疫传感器的制备方法。本发明以PEDOT@PSS片和Pd纳米颗粒组装形成的PEDOT@PSS‑Pd作为电化学信号放大平台，实现了对癌胚抗原CEA的定量检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低等优点，对癌胚抗原CEA的检测具有重要的科学意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备，应用于癌胚抗原CEA的检测。
背景技术
恶性肿瘤具有极高的致死率，在所有疾病中，肿瘤的患病率和致死率都处于前列，严重威胁着世界人民的生命健康，虽然现在科技发展迅速，但当前癌症仍很难治愈，因此快速准确的检测到早期癌症，对于癌症治愈有重要意义。
癌胚抗原CEA是一种应用最广泛的细胞表面肿瘤标志物，在恶性肿瘤的诊断和筛查中发挥着重要作用，因此，迫切需要一种快速、准确的CEA定量检测方法。
Pd是用于有效化学转化的活性最高的过渡金属之一，具有良好的生物相容性，容易与抗体结合，催化活性高，导电性好，从而实现灵敏、迅速的电化学检测，同时PEDOT@PSS片表面积大，相容性好，具有较高的电导率，电子转移效率高，以及对H2O2的还原性能优越，可以有效负载Pd纳米颗粒，表现出更优良的导电性和催化性能；Pd纳米颗粒和PEDOT@PSS片组装形成的PEDOT@PSS-Pd能够进一步地实现信号放大，提高癌胚抗原CEA检测的灵敏度。
本发明以具有Pd纳米颗粒和PEDOT@PSS片组装形成的PEDOT@PSS-Pd作为电化学信号放大平台，具有操作简单，特异性强，灵敏度高，检测限低等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，实现对癌胚抗原CEA的超灵敏检测。
发明内容
本发明提供了一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备，实现了对癌胚抗原CEA的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器用于癌胚抗原CEA的检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤：
1. 一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的PEDOT@PSS-Pd分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的癌胚抗原CEA抗体滴加到电极表面，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10.0 fg/mL ~ 100.0 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原CEA溶液，用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗，4.0 ℃冰箱中干燥，制得一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器。
2. 一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备，所述相关材料的制备，步骤如下：
（1）PEDOT@PSS片的制备
通过使用冰模板合成自支撑的二维片状PEDOT@PSS膜，为了配制冰模板的光滑表面，将培养皿中的水在-20 ℃下冷冻并将冰倒置，将1.0 ~ 3.0 mL的Na2S2O8（0.1 M）和1.0~ 3.0 mL的FeCl3（1.5 M）水溶液添加到1.0 ~ 3.0 mL的PSS溶液，然后加入3.0 ~ 5.0 mLHCl（25.0 mM）水溶液，将0.11 ~ 0.33 mL的EDOT溶解在10.0 ~ 30.0 mL的丙酮中，并将1.0~ 3.0 mL的溶液在冰冷条件下添加至上述水性混合物中，振摇10 s左右，直到形成透明的浅绿色溶液，通过使溶液通过PTFE注射器过滤器，立即将溶液滴铸在-20 ℃的冰面上，在3min内，浅蓝色的液滴逐渐出现在冰表面的顶部，冰的温度升至0 ℃，冰在冰-空气界面（液体层）融化，在其中发生聚合反应，形成2D片状PEDOT@PSS，从冰块的边缘小心地倒出蒸馏水以漂浮并洗涤聚合物膜，用蒸馏水冲洗薄膜几次，立即将其收集，同时冷却至所需基材上，在120 ℃下干燥10 min以除去任何痕量的水，并在真空下保存；
（2）PEDOT@PSS-Pd的制备
将2.0 mg PEDOT@PSS溶解在含有8.0 ~ 10.0 mL CTAB（0.05 mM）的水溶液中，超声处理20 min，然后将溶液离心（8000 rpm，15 min），随后分散在10.0 ~ 12.0 mL中，以最大限度地减少残留的表面活性剂，之后在超声波处理下，将0.25 ~ 0.75 g的L-半胱氨酸及20.0 ~ 30.0 mL H2PdCl4水溶液（1.0 mM）注入悬浮液中10 min，随后快速注射1.0 ~ 3.0mL的丙烯酸水溶液（1.0 mM/mL）作为还原剂，连续摇动悬浮液几分钟，然后静置至少6 h，最后，通过用乙醇和水连续洗涤循环几次两次获得沉淀，然后冷冻干燥。
3. 一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备，用于癌胚抗原CEA的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的 pH 5.29 ~ 8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化；
（3）记录不同浓度下的癌胚抗原CEA所对应的电流峰值；
（4）利用工作曲线法，得到待测样品中癌胚抗原CEA的浓度。
本发明的有益成果
（1）本发明制备的PEDOT@PSS片表面积大，相容性好，具有较高的电导率，电子转移效率高，以及对H2O2还原性能优越，可以有效负载Pd纳米颗粒，表现出更优良的导电性和催化性能；Pd纳米颗粒和PEDOT@PSS片组装形成的PEDOT@PSS-Pd作为电化学信号放大平台，具有操作简单，特异性强，灵敏度高，检测限低等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，实现对癌胚抗原CEA的超灵敏检测。
（2）一种基于PEDOT@PSS的电化学免疫传感器对癌胚抗原CEA的检测，其对癌胚抗原CEA的线性检测范围是20.0 fg/mL ~ 100.0 ng/mL，最低检测下限为6.67 fg/mL；表明所制备的一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器可以精确定量检测癌胚抗原CEA。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1 一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径为3.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、1.0 mg/mL的PEDOT@PSS-Pd分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、5.0 µg/mL的癌胚抗原CEA抗体滴加到电极表面，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10.0 fg/mL ~ 100.0 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原CEA溶液，用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗，4.0 ℃冰箱中干燥，制得一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器。
实施例2 一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、1.5 mg/mL的PEDOT@PSS-Pd分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、10.0 µg/mL的癌胚抗原CEA抗体滴加到电极表面，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.5 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10.0 fg/mL ~ 100.0 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原CEA溶液，用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗，4.0 ℃冰箱中干燥，制得一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器。
实施例3 一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径为5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、2.0 mg/mL的PEDOT@PSS-Pd分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、15.0 µg/mL的癌胚抗原CEA抗体滴加到电极表面，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、2.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10.0 fg/mL ~ 100.0 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原CEA溶液，用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗，4.0 ℃冰箱中干燥，制得一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器。
实施例4 所述PEDOT@PSS片的制备
通过使用冰模板合成自支撑的二维片状PEDOT@PSS膜，为了配制冰模板的光滑表面，将培养皿中的水在-20 ℃下冷冻并将冰倒置，将1.0 mL的Na2S2O8（0.1 M）和1.0 mL的FeCl3（1.5 M）水溶液添加到1.0 mL的PSS溶液，然后加入3.0 mL HCl（25.0 mM）水溶液，将0.11 mL的EDOT溶解在10.0 mL的丙酮中，并将1.0 mL的溶液在冰冷条件下添加至上述水性混合物中，振摇10 s左右，直到形成透明的浅绿色溶液，通过使溶液通过PTFE注射器过滤器，立即将溶液滴铸在-20 ℃的冰面上，在3 min内，浅蓝色的液滴逐渐出现在冰表面的顶部，冰的温度升至0 ℃，冰在冰-空气界面（液体层）融化，在其中发生聚合反应，形成2D片状PEDOT@PSS，从冰块的边缘小心地倒出蒸馏水以漂浮并洗涤聚合物膜，用蒸馏水冲洗薄膜几次，立即将其收集，同时冷却至所需基材上，在120 ℃下干燥10 min以除去任何痕量的水，并在真空下保存。
实施例5 所述PEDOT@PSS片的制备
通过使用冰模板合成自支撑的二维片状PEDOT@PSS膜，为了配制冰模板的光滑表面，将培养皿中的水在-20 ℃下冷冻并将冰倒置，将2.0 mL的Na2S2O8（0.1 M）和 2.0 mL的FeCl3（1.5 M）水溶液添加到2.0 mL的PSS溶液，然后加入4.0 mL HCl（25.0 mM）水溶液，将0.22 mL的EDOT溶解在20.0 mL的丙酮中，并将2.0 mL的溶液在冰冷条件下添加至上述水性混合物中，振摇10 s左右，直到形成透明的浅绿色溶液，通过使溶液通过PTFE注射器过滤器，立即将溶液滴铸在-20 ℃的冰面上，在3 min内，浅蓝色的液滴逐渐出现在冰表面的顶部，冰的温度升至0 ℃，冰在冰-空气界面（液体层）融化，在其中发生聚合反应，形成2D片状PEDOT@PSS，从冰块的边缘小心地倒出蒸馏水以漂浮并洗涤聚合物膜，用蒸馏水冲洗薄膜几次，立即将其收集，同时冷却至所需基材上，在120 ℃下干燥10 min以除去任何痕量的水，并在真空下保存。
实施例6 所述PEDOT@PSS片的制备
通过使用冰模板合成自支撑的二维片状PEDOT@PSS膜，为了配制冰模板的光滑表面，将培养皿中的水在-20 ℃下冷冻并将冰倒置，将3.0 mL的Na2S2O8（0.1 M）和1.0 mL的FeCl3（1.5 M）水溶液添加到1.0 mL的PSS溶液，然后加入5.0 mL HCl（25.0 mM）水溶液，将0.33 mL的EDOT溶解在30.0 mL的丙酮中，并将3.0 mL的溶液在冰冷条件下添加至上述水性混合物中，振摇10 s左右，直到形成透明的浅绿色溶液，通过使溶液通过PTFE注射器过滤器，立即将溶液滴铸在-20 ℃的冰面上，在3 min内，浅蓝色的液滴逐渐出现在冰表面的顶部，冰的温度升至0 ℃，冰在冰-空气界面（液体层）融化，在其中发生聚合反应，形成2D片状PEDOT@PSS，从冰块的边缘小心地倒出蒸馏水以漂浮并洗涤聚合物膜，用蒸馏水冲洗薄膜几次，立即将其收集，同时冷却至所需基材上，在120 ℃下干燥10 min以除去任何痕量的水，并在真空下保存。
实施例7 所述PEDOT@PSS-Pd的制备
将2.0 mg PEDOT@PSS溶解在含有8.0 mL CTAB（0.05 mM）的水溶液中，超声处理20min，然后将溶液离心（8000 rpm，15 min），随后分散在10.0 mL中，以最大限度地减少残留的表面活性剂，之后在超声波处理下，将0.25 g的L-半胱氨酸及20.0 mL H2PdCl4水溶液（1.0 mM）注入悬浮液中10 min，随后快速注射1.0 mL的丙烯酸水溶液（1.0 mM/mL）作为还原剂，连续摇动悬浮液几分钟，然后静置至少6 h，最后，通过用乙醇和水连续洗涤循环几次两次获得沉淀，然后冷冻干燥。
实施例8 所述PEDOT@PSS-Pd的制备
将2.0 mg PEDOT@PSS溶解在含有9.0 mL CTAB （0.05 mM）的水溶液中，超声处理20 min，然后将溶液离心（8000 rpm，15 min），随后分散在11.0 mL中，以最大限度地减少残留的表面活性剂，之后在超声波处理下，将0.5 g的L-半胱氨酸及25.0 mL H2PdCl4水溶液（1.0 mM）注入悬浮液中10 min，随后快速注射2.0 mL的丙烯酸水溶液（1.0 mM/mL）作为还原剂，连续摇动悬浮液几分钟，然后静置至少6 h，最后，通过用乙醇和水连续洗涤循环几次两次获得沉淀，然后冷冻干燥。
实施例9 所述PEDOT@PSS-Pd的制备
将2.0 mg PEDOT@PSS溶解在含有10.0 mL CTAB（0.05 mM）的水溶液中，超声处理20 min，然后将溶液离心（8000 rpm，15 min），随后分散在12.0 mL中，以最大限度地减少残留的表面活性剂，之后在超声波处理下，将0.75 g的L-半胱氨酸及30.0 mL H2PdCl4水溶液（1.0 mM）注入悬浮液中10 min，随后快速注射3.0 mL的丙烯酸水溶液（1.0 mM/mL）作为还原剂，连续摇动悬浮液几分钟，然后静置至少6 h，最后，通过用乙醇和水连续洗涤循环几次两次获得沉淀，然后冷冻干燥。
实施例10 所述的基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器对癌胚抗原CEA的检测
（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10.0 mL的pH 5.29 ~ 8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10.0 mL的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10.0 µL、5.0 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化；
（3）记录不同浓度下的癌胚抗原CEA所对应的电流峰值；
（4）利用工作曲线法，得到待测样品中癌胚抗原CEA的线性检测范围是20 fg/mL ~100.0 ng/mL，最低检测下限为6.67 fg/mL。
Claims (4)
1.一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤：
（1）PEDOT@PSS-Pd的制备：将单独制备PEDOT@PSS-Pd片与钯纳米颗粒结合结合；
（2）构建无标记型PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器，测定癌胚抗原CEA含量，绘制工作曲线。
2.根据权利要求1所述的一种检测癌胚抗原CEA的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的PEDOT@PSS-Pd的制备具体如下：
（1）PEDOT@PSS片的制备
通过使用冰模板合成自支撑的二维片状PEDOT@PSS膜，为了配制冰模板的光滑表面，将培养皿中的水在-20 ℃下冷冻并将冰倒置，将1.0 ~ 3.0 mL的Na2S2O8（0.1 M）和1.0 ~ 3.0mL的FeCl3（1.5 M）水溶液添加到1.0 ~ 3.0 mL的PSS溶液，然后加入3.0 ~ 5.0 mL HCl（25.0 mM）水溶液，将0.11 ~ 0.33 mL的EDOT溶解在10.0 ~ 30.0 mL的丙酮中，并将1.0 ~3.0 mL的溶液在冰冷条件下添加至上述水性混合物中，振摇10.0 s左右，直到形成透明的浅绿色溶液，通过使溶液通过PTFE注射器过滤器，立即将溶液滴铸在-20 ℃的冰面上，在3min内，浅蓝色的液滴逐渐出现在冰表面的顶部，冰的温度升至0 ℃，冰在冰-空气界面（液体层）融化，在其中发生聚合反应，形成2D片状PEDOT@PSS，从冰块的边缘小心地倒出蒸馏水以漂浮并洗涤聚合物膜，用蒸馏水冲洗薄膜几次，立即将其收集，同时冷却至所需基材上，在120 ℃下干燥10 min以除去任何痕量的水，并在真空下保存；
（2）PEDOT@PSS-Pd的制备
将2.0 mg PEDOT@PSS溶解在含有8.0 ~ 10.0 mL CTAB (0.05 mM)的水溶液中，超声处理20 min，然后将溶液离心（8000 rpm，15 min），随后分散在10.0 ~ 12.0 mL中，以最大限度地减少残留的表面活性剂，之后在超声波处理下，将0.25 ~ 0.75g的L-半胱氨酸及20.0~ 30.0 mL H2PdCl4水溶液（1.0 mM）注入悬浮液中10 min，随后快速注射1.0 ~ 3.0 mL的丙烯酸水溶液（1.0 mM/mL）作为还原剂，连续摇动悬浮液几分钟，然后静置至少6 h，最后，通过用乙醇和水连续洗涤循环几次两次获得沉淀，然后冷冻干燥。
3.根据权利要求1所述的一种检测癌胚抗原CEA的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的构建电化学免疫传感器，具体如下：
（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的PEDOT@PSS-Pd分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的癌胚抗原CEA抗体滴加到电极表面，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10.0 fg/mL ~ 100.0 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原CEA溶液，用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗，4.0 ℃冰箱中干燥，制得一种基于PEDOT@PSS-Pd的电化学免疫传感器。
4.根据权利要求1所述的一种检测癌胚抗原CEA的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的测定癌胚抗原CEA，绘制工作曲线，具体如下：
（1）采用10.0 mL的pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液配制不同浓度的癌胚抗原CEA溶液，将3.0 ~ 10.0 µL不同浓度的癌胚抗原CEA溶液分别滴涂至电极表面，反应0.5 ~ 2.0 h，晾干后连接至电化学工作站中，分别将电极浸于pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液中测定其氧化还原电流变化，当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10.0 mL的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10.0 µL、5.0 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化；
（2）根据所得电流差值与癌胚抗原CEA浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（3）利用工作曲线法，得到待测样品中癌胚抗原CEA的浓度。
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