CN112941005A - 一种凝结芽孢杆菌快速产孢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，属于生物技术领域。本发明方法为：将凝结芽孢杆菌在80‑100℃进行热处理后涂布平板进行培养，挑取形成芽孢的单菌落重复进行热处理和涂布平板培养，形成芽孢的单菌落为快速产孢的凝结芽孢杆菌，其可用于扩大培养。通过对菌株进行循环热处理，可以维持菌株的产孢活性。通过本发明能够使凝结芽孢杆菌15‑24h就可以形成芽孢，比一般的芽孢形成时间提前了12‑48h，且芽孢率可达到90%以上。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种凝结芽孢杆菌快速产孢的方法。
背景技术
凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一类能形成芽孢的产乳酸细菌，革兰氏阳性，属于厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，1989年美国食品与药物管理局（FDA）列入可用于饲料的安全菌株，及1992年再次批准42种包括的5种芽孢杆菌中，凝结芽孢杆菌排在第一位。凝结芽孢杆菌在人体肠道内能促进微生物菌群平衡，提高机体免疫力，还能产生大量抑制有害菌生长的凝固素和乳酸等抑菌物质，在食品和药品方面的应用越来越广泛。
因为芽孢具有抗干燥、耐高温、耐酸碱能力强等特点，市售的产品多以芽孢的形式保存。而现有的技术凝结芽孢杆菌产孢能力较差、周期长、芽孢率低，基于此研究一种产孢快、产孢周期短的方法非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，通过该方法能够时凝结芽孢杆菌的产孢周期短、芽孢生成比率高。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，包括如下步骤：将凝结芽孢杆菌在80-100℃进行热处理后涂布平板进行培养，挑取形成芽孢的单菌落重复进行热处理和涂布平板培养，形成芽孢的单菌落为快速产孢的凝结芽孢杆菌，其可用于扩大培养。通过此方法对菌株进行循环热处理，可以维持凝结芽孢杆菌的产孢活性。
优选的，所述的热处理为将凝结芽孢杆菌制成菌悬液进行热处理；热处理为在热水中进行；热处理的时间为15-30min。
优选的，所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，包括如下步骤：
（1）将凝结芽孢杆菌制成菌悬液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的菌悬液涂布平板，培养48-72h。
（2）挑取形成芽孢的单菌落制成菌悬液，在80-100℃热水中进行热处理15-30min。
（3）将热处理后的菌悬液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的菌悬液涂布平板，培养24-72h。
（4）挑取形成芽孢的单菌落制成菌悬液，在80-100℃热水中进行二次热处理15-30min。
（5）取热处理后的菌悬液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的菌悬液涂布平板，培养15-72h，形成芽孢的单菌落为快速产孢的凝结芽孢杆菌，其可用于扩大培养。
优选的，上述步骤中使用灭菌生理盐水制备菌悬液和梯度稀释。进一步地，使用1mL灭菌生理盐水将单菌落制成菌悬液；选择合适稀释梯度的菌悬液0.5mL涂布平板。
优选的，上述步骤中热处理的条件优选为在90℃热水中处理15min。
优选的，上述步骤中培养的温度优选为42℃。
本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：通过本发明筛选出来的凝结芽孢杆菌15-24h就可以形成芽孢，比一般的芽孢形成时间提前了12-48h，且芽孢率可达到90%以上。
附图说明
图1是培养72h菌体热处理前制成菌悬液的镜检图，看不到菌体形成芽孢。
图2是初次热处理的单菌落培养48h的镜检图，可以明显看到有芽孢形成。
图3是二次热处理的单菌落培养24h的镜检图，芽孢比率得到显著提升，产孢时间明显提前。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所用的凝结芽孢杆菌BC99，保藏编号为CGMCC No.19487，保藏时间为2020年3月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。凝结芽孢杆菌BC99已在申请号为202010469207.9、名称为一种凝结芽孢杆菌BC99及其筛选方法的专利中公开。
下述实施例所使用的平板培养基的配制为：葡萄糖0.1g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL，pH调节至7.0，500mL三角瓶分装，每瓶300mL，按每瓶装量称琼脂粉18g/L于三角瓶中，塞好棉塞，牛皮纸外包扎，121℃灭菌20min。灭菌好的培养基冷却至45-50℃时，倒制平板培养基。
实施例1：凝结芽孢杆菌BC99初次热处理
（1）将BC99菌液用灭菌生理盐水制成1:10（V/V）的菌悬液，再用灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释到合适梯度。
（2）取合适稀释梯度的菌悬液0.5mL用无菌玻耙均匀地涂布于平板培养基上，平行涂布3个平板，置于42℃培养箱培养48-72h。
（3）48-72h期间观察平板培养基上菌落生长状态，同时取单菌落进行镜检，发现芽孢出现时，将该单菌落挑至1mL无菌生理盐水中混合均匀。
（4）取步骤（3）得到的菌悬液于密封冷冻管中，浸没于90℃热水中处理15min。
（5）取热处理后的菌悬液进行10倍梯度稀释，选合适稀释梯度的菌悬液0.5mL进行平板涂布，置于42℃培养箱培养24-72h，期间观察单菌落形态、数量、芽孢出现情况。
结果见图1、图2和表1。
表1 培养72h菌落观察情况
| 处理项目 | 单菌落形态 | 数量 | 镜检芽孢情况 |
| 初始菌悬液涂布平板 | 米白色，光滑湿润 | 铺满平板 | 个别芽孢 |
| 初次热处理菌悬液涂布平板 | 米白色，光滑湿润 | 30个左右 | 50%芽孢 |
实施例2：凝结芽孢杆菌BC99二次热处理
（1）将实施例1初次热处理涂布平板后出现芽孢的单菌落挑至1mL无菌生理盐水中混合均匀。
（2）取步骤（1）得到的菌悬液1mL于密封冷冻管中，浸没于90℃热水中处理15min。
（3）取热处理后的菌悬液进行10倍梯度稀释，选合适稀释梯度的菌悬液0.5mL进行平板涂布，置于42℃培养箱培养15-72h，期间观察单菌落形态、数量、芽孢出现情况。
结果见图3和表2。
表2 培养48h菌落观察情况
| 处理项目 | 单菌落形态 | 数量 | 镜检芽孢情况 |
| 二次热处理菌悬液涂布平板 | 米白色，光滑湿润 | 20-30个 | 80-90%芽孢 |
实施例3：凝结芽孢杆菌BC99 3次热处理
（1）按实施例2的方法进行二次热处理涂布平板后出现芽孢的单菌落挑至1mL无菌生理盐水中混合均匀。
（2）取步骤（1）得到的菌悬液1mL于密封冷冻管中，浸没于90℃热水中处理15min。
（3）取热处理后的菌悬液进行10倍梯度稀释，选合适稀释梯度的菌悬液0.5mL进行平板涂布，置于42℃培养箱培养15-72h，期间观察单菌落形态、数量、芽孢出现情况。
结果见下表3。
表3 培养48h菌落观察情况
| 处理项目 | 单菌落形态 | 数量 | 镜检芽孢情况 |
| 三次热处理菌悬液涂布平板 | 米白色，光滑湿润 | 20-30个 | 80-90%芽孢 |
实施例4：对市场上的凝结芽孢杆菌产品进行热处理比较
购买青岛东海药业有限公司售卖的凝结芽孢杆菌活菌片（通用名称爽舒宝）进行稀释分离纯化，得到凝结芽孢杆菌单菌落，按所述的方法进行实验。
按照实施例1和实施例2的方法对该菌株进行两次热处理，将第二次热处理后在平板上培养出现芽孢的单菌落用无菌生理盐水制成菌悬液。
将菌悬液进行10倍梯度稀释，选合适稀释梯度的菌悬液0.5mL进行平板涂布，置于42℃培养箱培养15-72h，期间观察单菌落形态、数量、芽孢出现情况。同时取未经热处理的单菌落进行平行培养对比。
对比方式将培养不同时间段的菌苔制成悬液，取悬液进行80℃水浴10min，计算芽孢数和总菌数的比率。以下表4为有无热处理的芽孢比率结果：
表4
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：包括如下步骤：将凝结芽孢杆菌在80-100℃进行热处理后涂布平板进行培养，挑取形成芽孢的单菌落重复进行热处理和涂布平板培养，形成芽孢的单菌落为快速产孢的凝结芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：所述的热处理为将凝结芽孢杆菌制成菌悬液进行热处理。
3.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：所述的热处理为在热水中进行。
4.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：所述的热处理的时间为15-30min。
5.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将凝结芽孢杆菌制成菌悬液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的菌悬液涂布平板，培养48-72h；
（2）挑取形成芽孢的单菌落制成菌悬液，在80-100℃热水中进行热处理15-30min；
（3）将热处理后的菌悬液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的菌悬液涂布平板，培养24-72h；
（4）挑取形成芽孢的单菌落制成菌悬液，在80-100℃热水中进行二次热处理15-30min；
（5）取热处理后的菌悬液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的菌悬液涂布平板，培养15-72h，形成芽孢的单菌落为快速产孢的凝结芽孢杆菌。
6.根据权利要求5所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：使用灭菌生理盐水制备菌悬液和梯度稀释。
7.根据权利要求5所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（4）中使用1mL灭菌生理盐水将单菌落制成菌悬液。
8.根据权利要求5所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：步骤（3）和步骤（5）中选择合适稀释梯度的菌悬液0.5mL涂布平板。
9.根据权利要求5所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（4）中热处理的条件为在90℃热水中处理15min。
10.根据权利要求5所述的凝结芽孢杆菌快速产孢的方法，其特征在于：步骤（1）、步骤（3）和步骤（5）中培养的温度为42℃。
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