CN112940083A - 一种高纯度硫酸多粘菌素b1晶型及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高纯度多粘菌素B1的晶型的制备方法，具体采用DAC制备柱分离，然后大孔树脂脱盐处理，其次，经过纳滤浓缩后，结晶硫酸多粘菌素B1的晶型，本发明提供的晶型粒径分布均，流动性好，有利于制备制剂，并且，所述晶型的制备方法简单，得到晶体纯度高。

Description

一种高纯度硫酸多粘菌素B1晶型及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵产物纯化和结晶技术领域，具体地，本发明涉及一种高纯度硫酸多粘菌素B1晶型及其制备方法。

背景技术

硫酸多粘菌素B(Polymyxin B sulfate)，又称硫酸粘杆菌素B，是一种由多种氨基酸和脂肪酸组成的多肽抗生素，包括多粘菌素B1、B2、B3、B1-1，其中B1、B2是有效组分，B3、B1-1是主要杂质。几乎对所有革兰氏阴性菌均有较强的抑制或杀菌作用，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等,尤其对绿脓杆菌有显著作用。世界上许多国家已批准该药作为饲料添加剂使用。

硫酸多粘菌素B分子式为：C₅₆H₉₈N₁₆O₁₃·H₂SO₄，分子结构式如下式I所示：

多粘菌素	R	R′	X	分子式	Mr
						B1	CH<sub>3</sub>	CH<sub>3</sub>	L-Leu	C<sub>56</sub>H<sub>98</sub>N<sub>16</sub>O<sub>13</sub>	1204
B2	H	CH<sub>3</sub>	L-Leu	C<sub>56</sub>H<sub>96</sub>N<sub>16</sub>O<sub>13</sub>	1190
						B3	CH<sub>3</sub>	H	L-Leu	C<sub>56</sub>H<sub>96</sub>N<sub>16</sub>O<sub>13</sub>	1190
B1-I	CH<sub>3</sub>	CH<sub>3</sub>	L-Ile	C<sub>56</sub>H<sub>98</sub>N<sub>16</sub>O<sub>13</sub>	1204

硫酸多粘菌素B还作为药品使用，临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿***感染、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。但是，主要杂质B3、B1-I毒副作用较大，严重影响了多粘菌素的临床使用，目前主要用药方式是外用，局部用于敏感菌的眼、耳、皮肤、粘膜感染及烧伤绿脓菌感染，欧洲药典EP、美国药典USP规定硫酸多粘菌素B的质量标准基本一样，要求B1、B2、B3、B1-1总和≤80.0％，杂质B3≤6.0％、B1-I≤15.0％。杂质B3、B1-I在结构上与有效成分B1，B2极为接近(见下式I)，常规的超滤，有机溶剂萃取，纳滤，色谱柱纯化、沉淀法等方法难以有效去除，若要更广泛的推广使用，需要使用新技术手段除去毒副作用大的杂质，以获得有效单体。

发明专利CN107759670A公开了一种到硫酸多粘菌素B1的无水晶型I和晶型A，并指出晶型I不稳定，且晶型I和晶型A均极易吸湿，HPLC纯度98.43％。

发明内容

本发明提供一种高纯度的多粘菌素B1的新晶型，以及该晶型的制备方法。

具体的本发明第一方面提供了一种高纯度的多粘菌素B1的晶型，所述晶型使用Cu-Ka辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱显示在2.9°±0.2°、3.1°±0.2°处具有特征峰，并且所述晶型熔点为219.5～226.1℃；更优选的，所述结晶以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如附图1所示。

本发明第二方面，提供了一种一种高纯度的多粘菌素B1的晶型的制备方法，包括以下步骤：

(1)DAC制备分离：用纯化水将多组分的多粘菌素B样品溶解，采用DAC制备分离，分段收集多粘菌素B1组分；

(2)脱盐：将步骤(1)收集的多粘菌素B1组分浓缩后，通过大孔树脂吸附，用有机溶剂水溶液解析，收集解析液；

(3)浓缩：将步骤(2)收集的解析液稀释至有机溶剂比例为10-30％，然后将解析液浓缩；

(4)结晶：向步骤(3)得到的浓缩液中滴加有机溶剂，或向有机溶剂中滴加浓缩液，析出晶体。

上述方法中，进一步的包括步骤(5)过滤、干燥：步骤(4)析出晶体后，抽滤出固体，然后用结晶用有机溶剂淋洗，真空干燥，得到高纯度的多粘菌素B1的晶型。

优选的，上述方法中，步骤(1)采用DAC制备分离，固定相填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P；流动选择20-90％的乙腈盐溶液，盐浓度为3～10‰的硫酸钠，磷酸调节流动相pH为2.0-3.5；

步骤(2)所述大孔树脂选自HZ820、HZ818、XAD1600N、SP825、H20SS中的一种，所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、丙酮、乙醇中的一种，有机溶液的浓度为30-70％，(v/v)；

步骤(3)将解析收集液浓缩至50-150g/L；

步骤(4)滴加过程中将温度控制在20～50℃，滴加结束后将温度控制在-10～20℃结晶；所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃、甲醇、乙醇、丁醇，丙酮、丁酮、丙醇、异丙醇中的一种或几种混合液；

更优选的，上述方法中，步骤(1)用纯化水将多组分的多粘菌素B样品溶解成50-200g/L的水溶液，任选的采用超声助溶，溶解后经过0.45u的微孔滤膜过滤，再采用DAC制备分离；检测波长为215mn，分段收集后，合并液相纯度≥99％的多粘菌素B1的所有产品；

步骤(5)真空干燥温度控制在控制温度30-60℃。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述多粘菌素B1的晶型的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)DAC制备分离：用纯化水将多组分的多粘菌素B样品溶解成50-200g/L的水溶液，任选的采用超声助溶，溶解后经过0.45u的微孔滤膜过滤后备用；固定相填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P；流动选择20-90％的乙腈盐溶液，盐浓度为3～10‰的硫酸钠，磷酸调节流动相pH为2.0-3.5；检测波长为215mn，分段收集后，合并液相纯度≥99％的多粘菌素B1的所有产品；

(2)脱盐：将收集的多粘菌素B1组分纳滤浓缩后，加入纯化水将溶剂的比例稀释至5-10％范围内，以1-5BV/h上大孔树脂吸附，大孔树脂优选HZ820、HZ818、XAD1600N、SP825、H20SS其中的一种；以1-5BV/h用纯化水洗后，用pH4.0-5.0的有机溶剂水溶液解析3-5BV；有机溶剂优选甲醇、乙腈、丙酮、乙醇中的一种，有机溶液的浓度为30-70％，收集解析液；

(3)浓缩：将解析液稀释至有机溶剂比例为10-30％范围内，将解析收集液浓缩至50-150g/L；

(4)结晶：将浓缩液滴加入有机溶剂中，或是将有机溶剂滴加入浓缩液中，滴加过程中将温度控制在20～50℃，滴加结束后将温度控制在-10～20℃结晶5～15小时；所诉结晶溶剂选自乙腈、四氢呋喃、甲醇、乙醇、丁醇，丙酮、丁酮、丙醇、异丙醇中的一种或几种混合液；

(5)过滤、干燥：抽滤出固体，用结晶用溶剂淋洗产品，控制温度30-60℃真空干燥得到多粘菌素B1新晶型。

本发明首先提供了一种多粘菌素B1的新晶型，所述晶型粒径分布均匀，流动性好，利于制备成制剂；其次本发明提供的多粘菌素B1的晶型的制备方法操作简便，重现性好，制备的产品纯度高，杂质种类及总量更少，HPLC纯度达到99％以上。。

附图说明：

图1为多粘菌素B1晶型XRD衍射图，显示2θ角仅在2.9°±0.2°、3.1°±0.2°处具有特征峰。

图2为通过实施例1制备的多粘菌素B1的高效液相色谱图，显示HPLC纯度99.05％。

具体实施方式

为了更好的说明本发明的技术内容，下面结合具体实例对本发明做进一步说明，本发明的具体实例仅用于说明目的，而非对本发明的限制。

实施例1：

将100g多组分硫酸多粘菌素B(各组分组成：B1＝40％，B2＝7.5％，B3＝1％,B1-I＝7％)溶于1000ml纯化水中，上100DAC制备分离，填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P，流动相为23％乙腈水加入8‰硫酸钠，磷酸调pH至2.5，检测波长215mn，分段收集后，合并多粘菌素B1组分≥99％的组分；将收集液纳滤浓缩至原体积的1/5，加入浓缩液体积4倍的纯化水后，上SP825大孔吸附树脂吸附，用5倍树脂体积纯化水洗树脂，用pH 5.0±0.5的70％乙醇水解吸5倍体积。收集解吸液，加解吸液等体积的纯化水稀释后进行纳滤浓缩至500ml，分5次一共加入3000ml纯化水置换乙腈后，浓缩至500ml，20℃将浓缩液滴加入4500ml乙腈，0℃搅拌结晶8小时，抽滤后用少量乙腈淋洗产品得湿品65g，40℃真空干燥得多粘菌素B1产品51.3g，晶型如附图1所示为晶型B。

实施例2：

将100g多组分硫酸多粘菌素B(各组分组成：B1＝40％，B2＝7.5％，B3＝1％,B1-I＝7％)溶于1000ml纯化水中，上100DAC制备分离，填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P，流动相为25％乙腈水加入4‰硫酸钠，磷酸调pH 2.0，检测波长215mn，分段收集后，合并多粘菌素B1组分≥99％的组分，将收集液纳滤浓缩至原体积的1/5，加入浓缩液体积4倍的纯化水后，上XAD1600N大孔吸附树脂吸附，用5倍树脂体积纯化水洗树脂，用pH4.0±0.5的60％丙酮水解吸5倍体积。收集解吸液，加解吸液等体积的纯化水稀释后进行纳滤浓缩至500ml，分5次一共加入3000ml纯化水置换乙腈后，浓缩至500ml，20℃将浓缩液滴加入4500ml丙酮，5℃搅拌结晶10小时，抽滤后用少量丙酮淋洗产品得湿品66g，40℃真空干燥得多粘菌素B1产品53.6g，晶型如附图1所示为晶型B。

实施例3：

将100g多组分硫酸多粘菌素B(各组分组成：B1＝40％，B2＝7.5％，B3＝1％,B1-I＝7％)溶于1000ml纯化水中，上100DAC制备分离，填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P，流动相为90％乙腈水加入10‰硫酸钠，磷酸调pH3.5。检测波长215mn，分段收集后，合并多粘菌素B1组分≥99％的组分。将收集液纳滤浓缩至原体积的1/5，加入浓缩液体积4倍的纯化水后，上HZ20SS大孔吸附树脂吸附，用5倍树脂体积纯化水洗树脂，用pH 5.0±0.5的50％乙腈水解吸5倍体积。收集解吸液，加解吸液等体积的纯化水稀释后进行纳滤浓缩至500ml，分5次一共加入3000ml纯化水置换乙腈后，浓缩至500ml，40℃将4500ml甲醇滴加入浓缩液，-5℃搅拌结晶10小时，抽滤后用少量甲醇淋洗产品得湿品63g，40℃真空干燥得多粘菌素B1产品49.7g，晶型如附图1所示为晶型B。

实施例4：

将100g多组分硫酸多粘菌素B(各组分组成：B1＝40％，B2＝7.5％，B3＝1％,B1-I＝7％)溶于1000ml纯化水中，上100DAC制备分离，填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P，流动相为25％乙腈水加入6‰硫酸钠，磷酸调pH2.5，检测波长215mn，分段收集后，合并多粘菌素B1组分≥99％的组分。将收集液纳滤浓缩至原体积的1/5，加入浓缩液体积4倍的纯化水后，上XAD1600N大孔吸附树脂吸附，用5倍树脂体积纯化水洗树脂，用pH5.0±0.5的50％乙腈水解吸5倍体积。收集解吸液，加解吸液等体积的纯化水稀释后进行纳滤浓缩至500ml，分5次一共加入3000ml纯化水置换乙腈后，浓缩至500ml，30℃将浓缩液滴加入4500ml乙腈，10℃搅拌结晶8小时，抽滤后用少量乙腈淋洗产品得湿品67g，40℃真空干燥得多粘菌素B1产品52.1g，晶型如附图1所示为晶型B。

实施例5：

将100g多组分硫酸多粘菌素B(各组分组成：B1＝40％，B2＝7.5％，B3＝1％,B1-I＝7％)溶于1000ml纯化水中，上100DAC制备分离，填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P，流动相为25％乙腈水加入6‰硫酸钠，磷酸调pH2.5。检测波长215mn，分段收集后，合并多粘菌素B1组分≥99％的组分。将收集液纳滤浓缩至原体积的1/5，加入浓缩液体积4倍的纯化水后，上XAD1600N大孔吸附树脂吸附，用5倍树脂体积纯化水洗树脂，用pH5.0±0.5的35％乙腈水解吸5倍体积。收集解吸液，加解吸液等体积的纯化水稀释后进行纳滤浓缩至500ml，分5次一共加入3000ml纯化水置换乙腈后，浓缩至500ml，20℃将浓缩液滴加入4500ml乙腈，5℃搅拌结晶5小时，抽滤后用少量乙腈淋洗产品得湿品64.6g，40℃真空干燥得多粘菌素B1产品52.3g，晶型如附图1所示为晶型B。

实施例6：

将100g多组分硫酸多粘菌素B(各组分组成：B1＝40％，B2＝7.5％，B3＝1％,B1-I＝7％)溶于1000ml纯化水中，上100DAC制备分离，填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P，流动相为25％乙腈水加入5‰硫酸钠，磷酸调pH2.5。检测波长215mn，分段收集后，合并多粘菌素B1组分≥90％的组分。将收集液纳滤浓缩至原体积的1/5，加入浓缩液体积4倍的纯化水后，上HZ820大孔吸附树脂吸附，用5倍树脂体积纯化水洗树脂，用pH5.0±0.5的50％甲醇水解吸5倍体积。收集解吸液，加解吸液等体积的纯化水稀释后进行纳滤浓缩至500ml，分5次一共加入3000ml纯化水置换乙腈后，浓缩至500ml，20℃将浓缩液滴加入4500ml溶剂中(乙醇：丙酮＝1:1)，5℃搅拌结晶10小时，抽滤后用少量乙醇淋洗产品得湿品65g，40℃真空干燥得多粘菌素B1产品51.3g，晶型如附图1所示为晶型B晶型。

实施例7：

将100g多组分硫酸多粘菌素B(各组分组成：B1＝40％，B2＝7.5％，B3＝1％,B1-I＝7％)溶于1000ml纯化水中，上100DAC制备分离，填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P，流动相为23％乙腈水加入8‰硫酸钠，磷酸调pH至2.5，检测波长215mn，分段收集后，合并多粘菌素B1组分≥99％的组分；将收集液纳滤浓缩至原体积的1/5，加入浓缩液体积4倍的纯化水后，上SP825大孔吸附树脂吸附，用5倍树脂体积纯化水洗树脂，用pH 5.0±0.5的70％乙醇水解吸5倍体积。收集解吸液，加解吸液等体积的纯化水稀释后进行纳滤浓缩至500ml，分5次一共加入3000ml纯化水置换乙腈后，浓缩至500ml，20℃将浓缩液滴加入4500ml乙腈，0℃搅拌结晶8小时，抽滤后用少量乙腈淋洗产品得湿品65g，产品HPLC纯度为99.05％，分布在80-120目的产品达到80％，粒度均匀，流动性好。

Claims (10)

1.一种高纯度的多粘菌素B1的晶型，其特征在于，所述晶型使用Cu-Ka辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱显示在2.9°±0.2°、3.1°±0.2°处具有特征峰，并且所述晶型熔点为219.5～226.1℃。

2.根据权利要求1所述的晶型，其特征在于，所述结晶以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如附图1所示。

3.一种权利要求1中所述的晶型的制备方法，包括以下步骤：

(1)DAC制备分离：用纯化水将多组分的多粘菌素B样品溶解，采用DAC制备分离，分段收集多粘菌素B1组分；

(2)脱盐：将步骤(1)收集的多粘菌素B1组分浓缩后，通过大孔树脂吸附，用有机溶剂水溶液解析，收集解析液；

(3)浓缩：将步骤(2)收集的解析液稀释至有机溶剂比例为10-30％，然后将解析液浓缩；

(4)结晶：向步骤(3)得到的浓缩液中滴加有机溶剂，或向有机溶剂中滴加浓缩液，析出晶体。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述方法还包括，步骤(5)过滤、干燥：步骤(4)析出晶体后，抽滤出固体，然后用结晶用有机溶剂淋洗，真空干燥，得到高纯度的多粘菌素B1的晶型。

5.根据权利要求3～4任一项所述方法，其特征在于，步骤(1)采用DAC制备分离，固定相填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P；流动选择20-90％的乙腈盐溶液，盐浓度为3～10‰的硫酸钠，磷酸调节流动相pH为2.0-3.5。

6.根据权利要求3～4任一项所述方法，其特征在于，步骤(2)所述大孔树脂选自HZ820、HZ818、XAD1600N、SP825、H20SS中的一种，所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、丙酮、乙醇中的一种，有机溶液的浓度为30-70％，(v/v)。

7.根据权利要求3～4任一项所述方法，其特征在于，步骤(3)将解析收集液浓缩至50-150g/L。

8.根据权利要求3～4任一项所述方法，其特征在于，步骤(4)滴加过程中温度控制在20～50℃，滴加结束后将温度控制在-10～20℃结晶；所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃、甲醇、乙醇、丁醇，丙酮、丁酮、丙醇、异丙醇中的一种或几种混合液。

9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(1)用纯化水将多组分的多粘菌素B样品溶解成50-200g/L的水溶液，任选的采用超声助溶，溶解后经过0.45u的微孔滤膜过滤，再采用DAC制备分离；检测波长为215mn，分段收集后，合并液相纯度≥99％的多粘菌素B1的所有产品。

10.根据权利要求3～4任一项所述方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)DAC制备分离：用纯化水将多组分的多粘菌素B样品溶解成50-200g/L的水溶液，任选的采用超声助溶，溶解后经过0.45u的微孔滤膜过滤后备用；固定相填料为Daiso的SP-100-8-ODS-P；流动选择20-90％的乙腈盐溶液，盐浓度为3～10‰的硫酸钠，磷酸调节流动相pH为2.0-3.5；检测波长为215mn，分段收集后，合并液相纯度≥99％的多粘菌素B1的所有产品；

(2)脱盐：将收集的多粘菌素B1组分纳滤浓缩后，加浓缩液体积(3～5)倍的纯化水将溶剂的比例稀释至5-10％范围内，以1-5BV/h上大孔树脂吸附，大孔树脂优选HZ820、HZ818、XAD1600N、SP825、H20SS其中的一种；以1-5BV/h用纯化水洗后，用pH4.0-6.0的有机溶剂水溶液解析3-5BV；有机溶剂优选甲醇、乙腈、丙酮、乙醇中的一种，有机溶液的浓度为30-70％，收集解析液；

(3)浓缩：将解析液稀释至有机溶剂比例为10-30％范围内，将解析收集液浓缩至50-150g/L；

(4)结晶：将浓缩液滴加入有机溶剂中，或是将有机溶剂滴加入浓缩液中，滴加过程中将温度控制在20～50℃，滴加结束后将温度控制在-10～20℃结晶5～15小时；所诉结晶溶剂选自乙腈、四氢呋喃、甲醇、乙醇、丁醇，丙酮、丁酮、丙醇、异丙醇中的一种或几种混合液；

(5)过滤、干燥：抽滤出固体，用结晶用溶剂淋洗产品，控制温度30-60℃真空干燥得到多粘菌素B1新晶型。

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