CN112931217B - 一种丹麦木槿的组培再生方法 - Google Patents

一种丹麦木槿的组培再生方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种丹麦木槿的组培再生方法，涉及丹麦木槿技术领域，本发明包括以下步骤：以丹麦木槿优良株系的当年生幼嫩的带腋芽茎段为外植体，经表面消毒后进行不定芽的诱导和增殖培养；待不定芽伸长至2～3cm并伴有2～4片完整叶片时，进行瓶内或瓶外不定根诱导，最终获得完整的丹麦木槿再生植株。本发明的有益效果在于：本发明对丹麦木槿优良株系的规模化繁殖及品种改良研究具有重要意义。

Description

一种丹麦木槿的组培再生方法
技术领域
本发明涉及丹麦木槿技术领域，具体涉及一种丹麦木槿的组培再生方法。
背景技术
丹麦木槿为锦葵科木槿属多年生植物，作为木槿的改良新品种，不仅叶色浓绿，花色丰富，花期长(开花后只要保证充足的营养条件即可实现周年开花)；而且适应性较强，室内室外均可栽培，具有极高的观赏价值和经济价值。
近年来，随着人们生活水平的提高和市场对丹麦木槿的需求的增加，使得丹麦木槿的产业化栽培发展面临着前所未有的机遇。但缺乏高效的优质种苗繁育技术，成为制约其产业化开发的瓶颈。
公开号为CN 107006326A的专利公开一种丹麦木槿优良株系高效繁育的方法，对丹麦木槿优良株系进行高效繁育，但目前在生产上，丹麦木槿的繁殖主要是通过从国外引进种苗，存在成本较高，严重限制了丹麦木槿的规模化繁育、推广及后期的品种改良。由于植物组培快繁技术，可在短期内获得大量的、遗传背景一致的优良种苗，一方面在一定程度上能够满足规模化种植对丹麦木槿优质种苗的需求；另一方面在此技术基础上，后期可以实现对丹麦木槿优良品种的遗传改良工作。但目前有关利用植物组织培养技术对丹麦木槿进行繁育的研究尚属空白。
因此，针对上述丹麦木槿繁育所存在的诸多问题，急需开发一种丹麦木槿高效组培再生的方法，以满足对丹麦木槿优良株系的快速繁殖和品种改良的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于运用植物组织培养技术，提供一种丹麦木槿高效组培再生的方法。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
一种丹麦木槿的组培再生方法，包括以下步骤：
(1)以丹麦木槿的当年生幼嫩带腋芽茎段为外植体，对其表面进行消毒处理；
(2)将消毒后茎段切成适宜大小的切段，接种于不定芽诱导培养基中，进行不定芽的诱导；
(3)光照培养3～4周后，将诱导出不定芽丛的茎段转接于伸长培养基中进行不定芽的伸长培养；
(4)光照培养2～3周后，待芽长至2～3cm并伴有2-3个叶片时进行瓶内或瓶外生根诱导，获得具有健壮根系的丹麦木槿再生植株；所述瓶外生根诱导是将不定芽的形态学下端置于添加有10～25mM褪黑素和100～500mg/L IAA的生根促进液中处理20-60s，然后将形态学下端定植于育苗盘中，进行瓶外生根诱导。
有益效果：繁育过程采用茎段直接诱导不定芽，不定芽伸长后一方面采取瓶内生根，为后期的分子遗传改良奠定基础；另一方面也可以直接进行瓶外生根，在提高繁育系数的同时，避免了组培苗瓶内生根和后期的驯化移栽，大大降低繁育的复杂程度，缩短繁育周期。
再生效率高，丛生芽诱导率最高达98.4％，平均每个外植体最高可产生8.5个不定芽，且不定芽瓶外生根率最高达到98.6％；且能实现对获得的无菌苗茎段进行进一步的扩大繁殖，为优良丹麦木槿株系的快速繁殖和遗传改良提供了重要的技术支撑。
当褪黑素和IAA结合使用时，二者具有协同作用，能够大大提高不定根的诱导效果；且生根促进液的处理时间超过60s时，不定根的诱导效果逐渐减弱，表现为不定根的诱导率下降，不定根的个数逐渐减少及不定根的长度逐渐变短趋势。
茎段为取材于丹麦木槿株系当年生幼嫩枝条，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面取材方便、材料丰富；可以实现对丹麦木槿优良单株的快速繁育。
优选地，所述褪黑素的浓度为25mM，所述IAA的浓度为100～250mg/L。
有益效果：在此浓度下，丹麦木槿伸长芽瓶外生根率达到90％以上。
优选地，所述褪黑素的浓度为25mM，所述IAA的浓度为250mg/L，处理时间为60s。
有益效果：在此浓度下，丹麦木槿伸长芽瓶外生根率高达98.6％。
优选地，所述不定芽诱导培养基包括添加0.2～3.0mg/L TDZ、2.0～10.0mg/LAgNO3、2.0％～3.0％(w/v)蔗糖、0.6％～0.8％(w/v)琼脂的DKW培养基。
有益效果：当不定芽诱导培养基中TDZ的浓度为2.0mg/L，AgNO3浓度为10mg/L时，丹麦木槿茎段不定芽的诱导率高达98.4％，平均每个外植体产生4.3个不定芽。
优选地，所述伸长培养基包括添加0.5～1.0mg/L TDZ+0.25～1.0mg/L GA3+0.05-0.3mg/L KT+2.0％～3.0％(w/v)蔗糖+0.6％～0.8％(w/v)琼脂的DKW培养基。
有益效果：培养基中低浓度的TDZ和KT相结合利于不定芽的增殖，当二者与较低浓度的GA3结合使用时能够促进丹麦木槿不定芽的伸长。
优选地，所述步骤(1)茎段的表面消毒是指将丹麦木槿当年生幼嫩茎段去叶后剪切成7-10cm大小的切段，于流水下冲洗5～10min，期间添加1～3次0.5～2ml洗手液；之后用70％～75％无水乙醇擦拭茎段；然后将茎段置于无菌操作台中，用无菌水冲洗4～6遍后，再相继用70％～75％无水乙醇进行表面消毒30～45s，0.1％(w/v)的升汞溶液消毒2～5min，最后用无菌水冲洗6～8遍；吸干茎段表面水分，切成带有一个腋芽的适宜大小茎段备用。
优选地，所述步骤(4)中瓶内生根诱导是将伸长的不定芽接种于生根培养基中进行不定根诱导培养，所述生根培养基包括添加10～100μM褪黑素+0.05～1.0mg/L IAA+1.5％～2.0％(w/v)蔗糖+0.6％～0.8％(w/v)琼脂的1/2DKW培养基。
有益效果：单独添加适宜浓度的褪黑素和IAA与对照相比均能够提高伸长芽不定根的诱导率。但当两者结合使用时，能够进一步提高不定根的诱导效果。
优选地，所述步骤(4)中将形态学下端定植于装有营养土与蛭石混合基质(1:1)的育苗盘中，盖上塑料盖，于温室中进行瓶外生根诱导。
优选地，所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中的茎段不定芽诱导、增殖与伸长、瓶内、瓶外生根培养条件为：温度为25±2℃，光照强度为2500～3000lx，光照/黑暗周期为14/10h。
本发明的优点在于：繁育过程采用茎段直接诱导不定芽，不定芽伸长后一方面采取瓶内生根，为后期的分子遗传改良奠定基础；另一方面直接进行瓶外生根，在提高繁育系数的同时，避免了组培苗瓶内生根和后期的驯化移栽，大大降低繁育的复杂程度，缩短繁育周期。其三，再生效率高，丛生芽诱导率最高达98.4％，平均每个外植体最高可产生8.5个不定芽，且不定芽瓶外生根率最高达到98.6％；且能实现对获得的无菌苗茎段进行进一步的扩大繁殖，为优良丹麦木槿株系的快速繁殖和遗传改良提供了重要的技术支撑。
茎段为取材于丹麦木槿株系当年生幼嫩枝条，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面取材方便、材料丰富；可以实现对丹麦木槿优良单株的快速繁育。
附图说明
图1为本发明实施例2中种于不定芽诱导培养基上的丹麦木槿无菌茎段图；
图2为本发明实施例2中丹麦木槿茎段不定芽的诱导图；
图3为本发明实施例2中茎段不定芽的增殖与伸长图；
图4为本发明实施例2中丹麦木槿组培伸长芽的瓶内生根；
图5为本发明实施例4中丹麦木槿伸长芽的瓶外生根图；图中a为定植于混合基质盘中的丹麦木槿组培伸长芽；b为瓶外生根后获得的丹麦木槿完整再生植株。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
一种丹麦木槿的组培再生方法，具体操作如下：
(1)选取生长良好的丹麦木槿优良株系，剪取当年生未木质化的枝条为外植体；去叶后剪切成7-10cm大小的切段，分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗5min，期间添加1次2ml洗手液冲洗；之后用75％无水乙醇擦拭茎段；然后将茎段置于无菌操作台中，用无菌水冲洗4遍后，再相继用75％无水乙醇进行表面消毒30s，用0.1％(w/v)的升汞溶液消毒2min，最后用无菌水冲洗6遍；吸干茎段表面水分，切成带有一个腋芽的茎段备用。
(2)将步骤(1)中的茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2500lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的诱导。经过3周的光照培养，茎段切口处诱导出不定芽丛，不定芽的诱导率为61.3％，且平均每个外植体产生3.4个不定芽。其中不定芽诱导培养基为添加0.2mg/L TDZ、2.0mg/L AgNO3、2.0％(w/v)蔗糖、0.6％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。
(3)将步骤(2)中诱导出不定芽的茎段转接于伸长培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2500lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的增殖和伸长培养。光照培养4周后获得带有2～3片完整叶片、平均不定数为4.8个，平均不定芽长度为2.4cm。其中不定芽伸长培养基为：添加有0.5mg/L TDZ、0.25mg/L GA3、0.05mg/L KT、2.0％(w/v)蔗糖、0.6％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。
(4)将步骤(3)中伸长的不定芽接种于生根培养基中于温度为25±2℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为14h的恒温培养室进行不定根瓶内诱导培养。光照培养4周后，不定根的诱导率为73.9％，平均每个外植体产生2.1个不定根，平均不定根长3.2cm。其中生根培养基为添加有10μM褪黑素、0.05mg/L IAA、1.5％(w/v)蔗糖、0.6％琼脂的1/2DKW培养基，pH＝5.8。
实施例2
一种丹麦木槿的组培再生方法，具体操作如下：
(1)选取生长良好的丹麦木槿优良株系，剪取当年生半木质化的枝条为外植体；去叶后剪切成8cm大小的切段，分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10min，期间添加2次0.5～1ml洗手液冲洗；之后用75％无水乙醇擦拭茎段；然后将茎段置于无菌操作台中，用无菌水冲洗6遍后，再相继用75％无水乙醇进行表面消毒40s，用0.1％(w/v)的升汞溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗8遍；吸干茎段表面水分，切成带有一个腋芽的茎段备用。
(2)如图1所示，将步骤(1)中的茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的诱导。经过3周的光照培养，茎段切口处诱导出不定芽丛，不定芽的诱导率为98.4％，且平均每个外植体产生4.3个不定芽如图2所示。其中不定芽诱导培养基为添加有2.0mg/L TDZ、5.0mg/LAgNO3、3.0％(w/v)蔗糖、0.7％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。
(3)将步骤(2)中诱导出不定芽的茎段转接于增殖培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的增殖和伸长培养。光照培养4周后获得带有2～3片完整叶片、平均长度为2.8cm的不定芽，平均每个外植体产生8.5个不定芽，如图3所示。其中不定芽增殖培养基为添加有0.75mg/L TDZ、0.5mg/L GA3、0.2mg/LKT、3.0％(w/v)蔗糖、0.7％(w/v)琼脂的DKW，pH＝5.8。
(4)将步骤(3)中伸长的不定芽接种于生根培养基中于温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光照时间为14h的恒温培养室进行不定根瓶内诱导培养。光照培养4周后，不定根的诱导率为89.6％，平均每个外植体产生3.4个不定根，平均不定根长4.2cm，如图4所示。其中生根培养基为添加有50μM褪黑素、0.5mg/L IAA、2.0％(w/v)蔗糖、0.7％琼脂的1/2DKW培养基，pH＝5.8；
实施例3
一种丹麦木槿的组培再生方法，具体操作如下：
(1)选取生长良好的丹麦木槿优良株系，剪取当年生木质化的枝条为外植体；去叶后剪切成10cm大小的切段，分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10min，期间添加3次0.5ml洗手液冲洗；之后用75％无水乙醇擦拭茎段；然后将茎段置于无菌操作台中，用无菌水冲洗6遍后，再相继用75％无水乙醇进行表面消毒45s，用0.1％(w/v)的升汞溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗8遍；吸干茎段表面水分，切成带有一个腋芽的茎段备用。
(2)将步骤(1)中的茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2800lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的诱导。经过4周的光照培养，茎段切口处诱导出不定芽丛，不定芽的诱导率为42.4％，且平均每个外植体产生1.9个不定芽。其中不定芽诱导培养基为添加有2.0mg/L TDZ、10.0mg/L AgNO3、3.0％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。
(3)将步骤(2)中诱导出不定芽的茎段转接于增殖培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2800lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的增殖和伸长培养。光照培养4周后获得带有2～3片完整叶片、平均长度为1.8cm的不定芽，平均每个外植体产生5.9个不定芽。其中不定芽增殖培养基为添加有1.0mg/L TDZ、1.0mg/L GA3、0.3mg/L KT、3.0％(w/v)蔗糖、0.6％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。
(4)将步骤(3)中伸长的不定芽接种于生根培养基中于温度为25±2℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为14h的恒温培养室进行不定根瓶内诱导培养。光照培养4周后，不定根的诱导率为76.9％，平均每个外植体产生4.1个不定根，平均不定根长2.5cm。其中生根培养基为添加有100μM褪黑素、1.0mg/L IAA、2.0％(w/v)蔗糖、0.8％琼脂的1/2DKW，pH＝5.8；
实施例4
本实施例测试了不同浓度TDZ和AgNO3对丹麦木槿茎段不定芽诱导的影响，具体步骤如下：
(1)选取生长良好的丹麦木槿优良株系，剪取当年生半木质化的枝条为外植体；去叶后剪切成8cm大小的切段，分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10min，期间添加2次0.5～1ml洗手液冲洗；之后用75％无水乙醇擦拭茎段；然后将茎段置于无菌操作台中，用无菌水冲洗6遍后，再相继用75％无水乙醇进行表面消毒40s，用0.1％(w/v)的升汞溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗8遍；吸干茎段表面水分，切成带有一个腋芽的茎段备用。
(2)将步骤(1)中的茎段切段竖直接种于添加有不同TDZ浓度(0.2-2.0mg/L)和不同AgNO3浓度(2.0-10.0mg/L)组合的不定芽诱导培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2500lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的诱导培养。其中不定芽诱导培养基为添加有2.0mg/L TDZ、5.0mg/L AgNO3、3.0％(w/v)蔗糖、0.7％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。光照培养3周后统计茎段不定芽的诱导率和平均每个外植体产生的不定芽的个数。研究结果如表1所示。
表1 不同浓度TDZ和AgNO3对丹麦木槿茎段不定芽诱导的影响
TDZ(mg/L) AgNO<sub>3</sub>(mg/L) 不定芽诱导率(％) 平均不定芽数/外植体
0.0 0.0 0.0 0.0
0.2 2.0 62.1 3.5
0.2 10.0 73.5 3.1
0.5 2.0 77.4 3.8
0.5 5.0 82.3 4.1
1.0 5.0 84.7 3.2
1.0 10 67.2 2.6
2.0 5.0 98.4 4.3
2.0 10.0 42.4 1.9
注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。
表1研究表明：不同浓度TDZ和AgNO3在丹麦木槿茎段不定芽诱导过程中起着重要的作用。当不定芽诱导培养基中TDZ的浓度为2.0mg/L，AgNO3浓度为10mg/L时，丹麦木槿茎段不定芽的诱导率高达98.4％，平均每个外植体产生4.3个不定芽。
实施例5
本实施例测试了不同浓度和种类植物生长调节剂对丹麦木槿茎段不定芽增殖和伸长的影响，具体步骤如下：
(1)选取生长良好的丹麦木槿优良株系，剪取当年生半木质化的枝条为外植体；去叶后剪切成8cm大小的切段，分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10min，期间添加2次0.5～1ml洗手液冲洗；之后用75％无水乙醇擦拭茎段；然后将茎段置于无菌操作台中，用无菌水冲洗6遍后，再相继用75％无水乙醇进行表面消毒40s，用0.1％(w/v)的升汞溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗8遍；吸干茎段表面水分，切成带有一个腋芽的茎段备用。
(2)将步骤(1)中的茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2500lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的诱导。其中不定芽诱导培养基为添加有2.0mg/L TDZ、5.0mg/L AgNO3、3.0％(w/v)蔗糖、0.7％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。
(3)将步骤(2)中诱导出不定芽的茎段转接于添加有不同种类和浓度植物生长调节剂的增殖培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2500lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的增殖和伸长培养。光照培养4周后，统计平均每个外植体产生的不定芽的个数及平均不定芽的高度。研究结果如表2所示。
表2 不同浓度和种类植物生长调节剂对丹麦木槿茎段不定芽增殖和伸长的影响
TDZ(mg/L) GA<sub>3</sub>(mg/L) KT(mg/L) 不定芽数 平均不定芽长(cm)
0.0 0.0 0.0 4.3 1.4
0.5 0.25 0.05 4.8 2.4
0.5 0.5 0.1 5.3 2.6
0.5 1.0 0.2 5.6 1.9
0.75 0.25 0.3 7.2 2.2
0.75 0.5 0.2 8.5 2.8
1.0 0.25 0.1 5.7 2.3
1.0 0.5 0.05 5.4 2.5
1.0 1.0 0.3 5.9 1.8
注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。
表2研究表明：不同浓度TDZ、KT及GA3的使用能够促进丹麦木槿茎段不定芽的增殖和伸长。培养基中低浓度的TDZ和KT相结合利于不定芽的增殖，当二者与较低浓度的GA3结合使用时能够促进丹麦木槿不定芽的伸长。当培养基中TDZ的浓度为0.75mg/L，GA3浓度为0.5mg/L，KT浓度为0.2mg/L时，平均每个丹麦木槿茎段产生8.5个不定芽且不定芽的平均长度为2.8cm。
实施例6
本实施例测试了外源褪黑素和IAA浓度对丹麦木槿伸长芽瓶内生根的影响，具体步骤如下：
(1)选取生长良好的丹麦木槿优良株系，剪取当年生半木质化的枝条为外植体；去叶后剪切成8cm大小的切段，分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10min，期间添加2次0.5～1ml洗手液冲洗；之后用75％无水乙醇擦拭茎段；然后将茎段置于无菌操作台中，用无菌水冲洗6遍后，再相继用75％无水乙醇进行表面消毒40s，用0.1％(w/v)的升汞溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗8遍；吸干茎段表面水分，切成带有一个腋芽的茎段备用。
(2)如图1所示，将步骤(1)中的茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的诱导。其中不定芽诱导培养基为添加有2.0mg/L TDZ、5.0mg/L AgNO3、3.0％(w/v)蔗糖、0.7％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。
(3)将步骤(2)中诱导出不定芽的茎段转接于增殖培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的增殖和伸长培养。其中不定芽增殖培养基为添加有0.75mg/L TDZ、0.5mg/L GA3、0.2mg/L KT、3.0％(w/v)蔗糖、0.7％(w/v)琼脂的DKW，pH＝5.8。
(4)将步骤(3)中伸长的不定芽接种于添加有不同浓度褪黑素和IAA的生根培养基中于温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光照时间为14h的恒温培养室进行不定根瓶内诱导培养。光照培养4周后，统计不定根的诱导率，平均每个外植体产生的不定根数量及平均不定根长度。研究结果如表3所示。研究结果表明培养基中褪黑素和IAA浓度对丹麦木槿伸长芽瓶内生根具有重要促进作用。单独添加适宜浓度的褪黑素和IAA与对照相比均能够提高伸长芽不定根的诱导率。当两者结合使用时，能够提高不定根的诱导效果。其中当褪黑素的浓度为50μM，IAA浓度为0.5mg/L时，丹麦木槿瓶内不定根的诱导率高达89.6％，平均每个外植体产生3.4个不定根，平均根长4.2cm。
表3 褪黑素和IAA浓度对丹麦木槿伸长芽瓶内生根的影响
Figure BDA0003011559960000141
Figure BDA0003011559960000151
注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。
实施例7
本实施例测试了外源褪黑素和IAA浓度对丹麦木槿伸长芽瓶外生根的影响，具体步骤如下：
(1)选取生长良好的丹麦木槿优良株系，剪取当年生半木质化的枝条为外植体；去叶后剪切成8cm大小的切段，分装于1000ml烧杯中，于流水下冲洗10min，期间添加2次0.5～1ml洗手液冲洗；之后用75％无水乙醇擦拭茎段；然后将茎段置于无菌操作台中，用无菌水冲洗6遍后，再相继用75％无水乙醇进行表面消毒40s，用0.1％(w/v)的升汞溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗8遍；吸干茎段表面水分，切成带有一个腋芽的茎段备用。
(2)将步骤(1)中的茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2500lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的诱导。其中不定芽诱导培养基为添加有2.0mg/L TDZ、5.0mg/L AgNO3、3.0％(w/v)蔗糖、0.7％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。
(3)将步骤(2)中诱导出不定芽的茎段转接于增殖培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2500lx，光照时间为14h的恒温培养室中进行不定芽的增殖和伸长培养。其中不定芽增殖培养基为添加有0.75mg/L TDZ、0.5mg/L GA3、0.2mg/L KT、3.0％(w/v)蔗糖、0.7％(w/v)琼脂的DKW培养基，pH＝5.8。
(4)待步骤(3)中的不定芽伸长至2.5cm左右，将伸长的不定芽从组培瓶中分离出来，用流水冲洗后，吸干表面水分，将不定芽的形态学下端置于含有不同浓度褪黑素和IAA的生根促进液中处理30s。然后将处理后不定芽的形态学下端定植于装有混合基质(营养土：蛭石＝1:1)的育苗盘中，盖上塑料盖，于温室中进行瓶外不定根诱导，如图5所示。于温室中培养4周后，统计外源褪黑素和IAA浓度对丹麦木槿伸长芽瓶外生根的影响，研究结果如表4所示。
表4 外源褪黑素和IAA浓度对丹麦木槿伸长芽瓶外生根的影响
褪黑素(mM) IAA(mg/L) 生根率(％) 平均根数 平均根长(cm)
0 0 7.5 1.1 3.6
10 0.0 45.6 2.2 4.3
25 0.0 68.2 4.6 5.2
50 0.0 47.1 3.7 5.8
0.0 100 53.5 2.1 6.1
0.0 250 77.3 3.4 5.5
0.0 500 59.4 4.2 4.9
25 100 90.2 5.5 6.3
25 250 96.5 6.3 5.9
25 500 87.8 5.2 5.4
注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。
表4研究表明：外源褪黑素和IAA浓度对丹麦木槿伸长芽瓶外生根具有重要的影响。单独使用外源褪黑素和IAA与对照相比均能够促进植株不定根的形成，同时也能够促进不定根长度和不定根数量的增加。此外，进一步分析发现褪黑素对不定根的诱导效果稍微弱IAA对不定根的诱导效果。当两者结合使用时，能够大大提高不定根的诱导效果。其中当褪黑素的浓度为25mM，IAA浓度为250mg/L时，丹麦木槿不定根的诱导率高达96.5％，平均每个外植体产生6.3个不定根，平均根长5.9cm。
实施例8
本实施例测试了外源褪黑素和IAA混合液的处理时间对丹麦木槿伸长芽瓶外生根的影响。发明人仅改变外源褪黑素和IAA混合液的处理时间，将所获得的伸长的丹麦木槿组培不定芽的形态学下端置于25mM褪黑素和250mg/L IAA的溶液中处理不同时间(10s，20s，30s，60s和90s)。其余步骤同实施例4。温室中培养4周后，统计处理时间对丹麦木槿伸长芽瓶外生根的影响，研究结果如表5所示。研究结果表明外源褪黑素和IAA混合液的处理时间对丹麦木槿伸长芽瓶外生根具有重要的影响。在一定范围内，随着处理时间的延长，不定根的诱导率和不定根的个数及不定根平均长度逐渐增加，在处理60s时达到最佳。之后随着处理时间的延长，不定根的诱导效果逐渐减弱，表现为不定根的诱导率下降，不定根的个数逐渐减少及不定根的长度逐渐变短趋势。推测原因可能是随着处理时间的延长，茎段的基部伴有愈伤组织形成，在一定程度上抑制了不定根的形成。
表5 外源褪黑素和IAA混合液的处理时间对丹麦木槿伸长芽瓶外生根的影响
Figure BDA0003011559960000171
Figure BDA0003011559960000181
注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种丹麦木槿的组培再生方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）以丹麦木槿的当年生幼嫩带腋芽茎段为外植体，对其表面进行消毒处理；
（2）将消毒后茎段切成适宜大小的切段，接种于不定芽诱导培养基中，进行不定芽的诱导；所述不定芽诱导培养基包括添加0.2～3.0 mg/L TDZ、2.0～10.0 mg/L AgNO3、2.0%～3.0%蔗糖、 0.6%～0.8%琼脂的DKW培养基；
（3）光照培养3～4周后，将诱导出不定芽丛的茎段转接于伸长培养基中进行不定芽的伸长培养；所述伸长培养基包括添加0.5～1.0 mg/L TDZ + 0.25～1.0 mg/L GA3 + 0.05-0.3mg/L KT + 2.0%～3.0%蔗糖 + 0.6%～0.8%琼脂的DKW培养基；
（4）光照培养2～3周后，待芽长至2～3cm并伴有2-3个叶片时进行瓶内或瓶外生根诱导，获得具有健壮根系的丹麦木槿再生植株；所述瓶外生根诱导是将不定芽的形态学下端置于添加有25 mM褪黑素和100～250 mg/L IAA的生根促进液中处理20-60 s，然后将形态学下端定植于育苗盘中，进行瓶外生根诱导；
所述瓶内生根诱导是将伸长的不定芽接种于生根培养基中进行不定根诱导培养，所述生根培养基包括添加10～100 μM褪黑素 + 0.05～1.0 mg/L IAA + 1.5%～2.0%蔗糖 +0.6%～0.8%琼脂的1/2DKW培养基。
2.根据权利要求1所述的丹麦木槿的组培再生方法，其特征在于：所述褪黑素的浓度为25 mM，所述IAA的浓度为250 mg/L，处理时间为60s。
3.根据权利要求1所述的丹麦木槿的组培再生方法，其特征在于：所述不定芽诱导培养基包括添加2.0 mg/L TDZ、10.0 mg/L AgNO3、2.0%～3.0%蔗糖、 0.6%～0.8%琼脂的DKW培养基。
4.根据权利要求1所述的丹麦木槿的组培再生方法，其特征在于：所述步骤（1）茎段的表面消毒是指将丹麦木槿当年生幼嫩茎段去叶后剪切成7-10 cm大小的切段，于流水下冲洗5～10 min，期间添加1～3次0.5～2 ml 洗手液；之后用70%～75%无水乙醇擦拭茎段；然后将茎段置于无菌操作台中，用无菌水冲洗4～6遍后，再相继用70%～75%无水乙醇进行表面消毒30～45 s，0.1%（w/v）的升汞溶液消毒2～5 min，最后用无菌水冲洗6～8遍；吸干茎段表面水分，切成带有一个腋芽的适宜大小茎段备用。
5.根据权利要求1所述的丹麦木槿的组培再生方法，其特征在于：所述步骤（4）中将形态学下端定植于装有营养土与蛭石混合基质的育苗盘中，盖上塑料盖，于温室中进行瓶外生根诱导。
6.根据权利要求1所述的丹麦木槿的组培再生方法，其特征在于：所述步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）中的茎段不定芽诱导、增殖与伸长、瓶内、瓶外生根培养条件为：温度为25 ±2 ℃，光照强度为2500～3000 lx，光照/黑暗周期为14 /10 h。
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