CN112930392B - 用于上呼吸道感染、压力、焦虑、记忆和认知功能障碍和衰老的益生菌 - Google Patents

Abstract

本发明内容涉及以下内容，本发明的第一方面涉及一株Lactobacillus plantarum(植物乳杆菌)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC15535，全基因组序列上传于GenBank登录号为CP031318。该菌株对上呼吸道感染、压力、焦虑、记忆与认知功能障碍、阿尔茨海默病、高血脂、肠道稳态与衰老具有独特的有益功能。

Description

用于上呼吸道感染、压力、焦虑、记忆和认知功能障碍和衰老的益生菌

技术领域

此申请要求主张递交日期为于2018年9月3日递交的马来西亚专利PI2018703091的全部权利利益,在马来西亚所递交的专利书全部内容均在此文中包括，在文中涉及到的地方均称其为“我的优先申请”。

本发明涉及的领域为医药、微生物与营养，特别是与益生菌Lactobacillusplantarum DR7相关。该菌株具有一系列有益生物功能，有益于健康，特别是对预防和治疗上呼吸道感染、压力、焦虑、记忆和认知功能障碍、延缓衰老有效果。

背景技术

科学论文题目为“Lactobacillus plantarum DR7通过磷酸化AMPK降低胆固醇下调HMG-CoA还原酶mRNA的表达”(Lactobacillus plantarum DR7 reduces cholesterolvia phosphorylation of AMPK that down-regulated the mRNA expression of HMG-CoA reductase)已经于2018年4月30日刊发。论文中涉及的发明与本专利中的相同，但是发表时间是在马来西亚提交的专利之前一年宽限期内。论文中的内容合并到我的优先申请中(以便论文内容在优先申请前未发表)同时也出现此申请中。文章的作者就是本专利的发明人，全部签署了本专利以及我的优先申请中所涉及的各项权利；换句话说，论文可以看做“发明人的原始披露”(公开披露的主要素材必须是发明人本人或联合发明人，或得到发明人以及联合发明人的直接授予)。该论文第一次描述了Lactobacillus plantarum DR7在胆固醇代谢中的基础机制。根据以上论述，Lactobacillus plantarum DR7和它的医学方向的应用，作为可获得专利的主体在国家内应在一年的宽限期内。

论文“Lactobacillus plantarum DR7通过血清素和多巴胺途径，减轻压力和焦虑，改善有压力成年人的记忆和认知能力”(Lactobacillus plantarum DR7 alleviatedstress和anxiety while improving memory和cognition in stressed adults via theserotonin和dopamine pathways)发表于2019年3月18号，晚于我的优先申请的优先权日。

上述论文的内容合并入我的优先申请(以便内容不会在申请递交前被发表)，同时内容也包含于本申请中。因此Lactobacillus plantarum DR7菌株在提高记忆与认知能力，缓解压力与焦虑在我的优先申请提交之前是未经发表的。

论文“Lactobacillus plantarum DR7通过增强免疫和炎症参数改善上呼吸道感染:一项随机、双盲、安慰剂对照研究”(Lactobacillus plantarum DR7 improved upperrespiratory tract infections via enhancing immune和inflammatory parameters：Ar和omised，double-blind，placebo-controlled study)发表于2019年4月3日，晚于我的优先申请中所设定的优先权日。上述论文的内容合并入我的优先申请(以便内容不会在申请递交前被发表)，同时内容也包含于本申请中。因此Lactobacillus plantarum DR7菌株在改善上呼吸道感染炎症，增强免疫力方面在我的优先申请提交之前是未经发表的。

上述所提到的论文全部内容都包含于本文之中。

根据(FAO\WHO,2006)，益生菌定义为“活的微生物，摄取一定量对人体健康有益”。乳杆菌在改善肠道微生态，调节代谢紊乱，调节免疫应答等方向具有健康作用。

在干燥的季节，空气中悬浮的污染物通过气体激发炎症反应，导致黏膜渗透性增加，增加了对致病菌的易感性。雨季下，潮湿的空气增加了霉菌等真菌以及病毒的生长繁殖，导致易发咳嗽，过敏等气体传播的感染疾病。上呼吸道感染是上呼吸***多感染的总称，包括常见的感冒、喉炎、咽炎、鼻窦炎。是全球健康威胁的具有代表性的疾病。在美国，成人每年约发生2-3次上呼吸道感染，而儿童多达5次。此外，超过20％的成人有着每4周即发生上呼吸道感染的经历。

阿尔茨海默病(AD)是全球流行的痴呆症，有超过4700万的患者，2018年全球因该疾病所消耗高达6040亿美元。全球12％(接近8亿)的人群位于60岁及以上，AD已成为流行性疾病，同时没有有效的治疗药物。该病的特点为淀粉样蛋白斑的出现，有例如β类淀粉状蛋白(Aβ)的降解。这类多肽的富集，会加速并成倍的转化为不溶性纤维。

压力是当遭遇胁迫下人体非特异性反应，导致焦虑，不适，情绪紧张，很难调整。焦虑是面对压力的第一个生理反应，长时间的焦虑可导致精神疾病如抑郁。全球超过3亿人受到抑郁的影响，每年有将近80万人由于该疾病而***。肠道菌群与脑部健康由肠脑轴的联系而产生紧密互作，呈现双向的调节作用。

衰老是基于年龄相关的多因子进程，与生理退化相关的是增加了与年龄相关的死亡率。衰老不可避免，所以目前的研究者都定位于提高生活质量与生活预期。

从影响感知、运动、高级认知的细胞功能层级，衰老过程对脑部的影响是多路径的。一些认知的退化与神经退行性疾病相关，例如阿尔茨海默病与记忆退化。同时，衰老还与代谢***疾病相关，例如高脂血症，增加了心脑血管疾病的风险。世界健康组织预计，在全球死亡率中31％皆由于心脑血管疾病所带来的副反应。因此，天然的日常饮食策略可以在衰老与心脑心管疾病中有积极的践行意义。衰老影响人体物理指标，比如机体的耐力。衰老会从机体的分子与细胞层面产生影响，因此对于机体来说，所导致的影响是全身性的。例如，对于身体肌肉的生理功能则会因为衰老而恶化。这些现象也可因为一些复杂的运动来得到改善和缓解。此外，细胞呼吸作用产生的分子对细胞具有损害，这一过程又会刺激机体加速衰老的进程。这些分子可以转化为氧化蛋白或其他细胞分子。在脑部的退行性疾病如阿尔茨海默病，衰老是主要的诱因。

端粒的长度通常也可作为衡量衰老以及年龄的生物标志。端粒是真核生物染色体末端的核蛋白复合体，每次细胞***之后都会衰减。每次细胞***都会使得端粒长度减少，直至到达临界长度，开始启动细胞的衰老。

当老年人的身体机能与先前年轻时期相比出现了许多功能障碍，由此导致的对老年化歧视现象更进而加重了老年人身体上与精神上的功能恶化。例如腺体难以产生足够的具有特定活性的荷尔蒙，从而影响机体无法正常的执行生化反应进程。举一个更为形象的例子，女性在更年期中因子宫与卵巢的萎缩，无法产生足够的性激素，最终无法受孕。此外，衰老还会导致听觉与视力的下降、睡眠障碍、肌肉与钙流失。衰老导致的激素改变，还使得皮肤健康衰退，皱纹与斑点出现。

有机体的内部的生化反应与机体代谢受年龄因素影响较高。生化反应和机体代谢可由腺苷酸磷酸蛋白激酶(AMPK)调控。AMPK是细胞内部的能量传感器，参与合成与分解途径，在细胞能量代谢中扮演着重要的平衡调控角色。当AMPK监测到细胞内ATP水平降低时，激发相关通路迅速刺激能量代谢产生足够的ATP用以脂肪酸的氧化与自噬。另方面，AMPK也会通过酶的磷酸化作用下调消耗ATP的生物反应进程，例如糖原、磷脂、蛋白的合成，通过转录因子磷酸化，共表达共激活等方式调节转录过程。因此，AMPK调节ATP水平控制机体的功能，保证机体维持在最适宜的条件状态下，是控制代谢与衰老的生物学开关。最近，也有研究显示AMPK通过磷酸化在感染性疾病发生时激活巨噬细胞，显示其在免疫功能与抵抗病毒感染过程中也扮演着重要的角色。

高脂血症可总的由高胆固醇与甘油三酯升高来定义。伴随着高胆固醇与甘油三酯升高，高脂血症是心脑血管疾病的重要诱因。高脂血症可以影响器官的抗氧化状态以及磷脂蛋白的水平，进而使得代谢异常，增加了诸如心脑血管疾病与非酒精性肝损伤的发病率。益生菌在动物实验中发现，可以改善血液中磷脂水平健康化。

肠道菌群紊乱可导致疾病、食欲下降、加速老化等问题。衰老与高脂饮食被公认为影响菌群状态的重要因素。肠道菌群是肠道中所有微生物的总称，其形成复杂的代谢网络，对宿主的新陈代谢起到重要的协同作用。人们猜测，通过修饰肠道菌群的结构，能够改变菌群代谢，从而影响宿主的代谢。最近的研究越来越多的揭示了肠道菌群与代谢对宿主能量代谢以及代谢性疾病，骨健康等方面的重要联系。

综上所述，对于以上疾病的改善继续有效的治疗方案，尤其是有效的益生菌株。

发明公开

拟解决的技术问题

本发明需要解决的关键问题是基于上述提到的状况，提供新的组合物与解决办法，能够安全有效的缓解以上所述的健康问题。

解决方案

解决办法基于提供益生菌株Lactobacillus plantarum，保藏号为CGMCC15535，也称为Lactobacillus plantarum DR7。本发明人发现该菌株的相关的生物功能有助于改善不同的症状和疾病，尤其是下面将详细阐述的疾病。

发明的第一方面涉及Lactobacillus plantarum菌株或其代谢产物，其中菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC15535，全基因组序列上传于GenBank登录号为CP031318，其中代谢产物包括2-羟基异己酸与3-苯乳酸。

此发明中的一方面涉及到Lactobacillus plantarum DR7菌株或其代谢产物产物用于治疗或作为药物使用。此方面也可描述为益生菌治疗的方法，包括根据需要给予有效量的Lactobacillus plantarum DR7或其代谢产物。如本文所用的，术语“益生菌”，指活性微生物，当给予足够数量，对宿主健康有益。

发明的另一方面涉及到菌株Lactobacillus plantarum DR7或其代谢产物产物，通过发挥抗炎与免疫调节保护，来预防与治疗上呼吸道感染。

发明的另一方面涉及到菌株Lactobacillus plantarum DR7或其代谢产物，通过促进例如5-羟色胺、多巴胺通路，用于治疗与预防压力、焦虑、记忆和认知功能障碍。

另一方面涉及到菌株Lactobacillus plantarum DR7或其代谢产物用于预防与治疗神经退行性疾病。

另一方面，本发明涉及到菌株Lactobacillus plantarum DR7或其代谢产物通过阻碍端粒缩短和/或增强能量代谢，减缓衰老迹象。

本发明的另一方面涉及到菌株Lactobacillus plantarum DR7或其代谢产物通过抑制甘油三酯水平升高、炎症以及脂肪积累来预防与治疗高脂血症与肝脂积累。

本发明的另一方面涉及到菌株Lactobacillus plantarum DR7或其代谢产物，用于预防与治疗心血管疾病及降低胆固醇。

发明的另一方面涉及到菌株Lactobacillus plantarum DR7或其代谢产物，作为益生菌用于肠道细菌种群失衡和代谢产物浓度的肠道调节。

需要强调的是，虽然Lactobacillus plantarum DR7具有以上所述的诸多医疗功能用途，而在其他情况下，菌株需要按照每项医疗用途进行使用。

本发明的另一方面涉及到包含菌株Lactobacillus plantarum DR7的组合物，其中所述菌株经冻干，在组合物中的数量为10⁴与10¹²cfu/g；以及包含该菌株代谢产物的组合物，其中代谢产物包含2-羟基异己酸和3-苯乳酸。

以上所提到的关于Lactobacillus plantarum DR7以及代谢产物的医疗用途，可以可选地根据菌株或其代谢产物的用途来配方，用于制备食品补充剂、药剂、婴幼儿配方、可食用产品或食品产品，用于上述适应症的治疗和预防。此外，可以可选地配制用于治疗和预防上述适应症的方法，包含向有需要的对象施用有效量的本发明的菌株或其代谢产物。应用的对象主要为哺乳动物，主要是人体。

如本文所用，术语“有效量”是指组合物中菌株的菌落形成单位(cfu)的数量，即在合理的医疗判断范围内，这一比例足够高，以显著改善病情进而以积极的方式治疗，但也足够低以避免严重的副作用(以合理的利益/风险比)。

本发明权利要求和各方面所使用的术语在本描述中按照其广泛和共同的含义理解，在本描述中植物乳杆菌DR7菌株(Lactobacillus plantarum DR7 strain)简称为“DR7”。

图例说明

为了促进对本专利的理解，此处实施例用的图示伴随着对应的图片说明，用以对相联系的图片进行解释说明，帮助更好的对发明所体现的优势点进行理解与掌握。

图1.表示图片说明，在(a)青年组(年龄<30岁；n＝50)，(b)成年组(年龄30-59岁；n＝52)，和(c)所有受试者(n＝111)中，与第0周相比，经过12周施用益生菌Lactobacillusplantarum菌株DR7(灰色)或安慰剂(黑色)上呼吸道感染(URTI)的发生和天数变化，其中*p<0.05以及**p<0.10。

图2.显示了在(a)青年组(年龄<30岁；n＝50)，(b)成年组(年龄30-59岁；n＝52)，(c)所有受试者(n＝111)中，经12周施用益生菌Lactobacillus plantarum菌株DR7(灰色)或安慰剂(黑色)，血浆中细胞因子的水平(pg/mL；IL-1β、-4和-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ)变化。

图3.显示了血浆中铁离子还原电势(FRAP)和硫代巴比妥酸(TBA)水平变化图，血红细胞(RBC)膜和溶血产物(μM)的水平变化，经12周施用益生菌Lactobacillus plantarum菌株DR7(灰色)或安慰剂(黑色)，在(a)和(d)青年组(年龄<30岁；n＝59)，(b)和(e)成年组(年龄30-59岁；n＝52)，(c)和(f)所有受试者(n＝111)中。

图4.显示了血浆中T细胞(CD4、CD8、CD44、CD117)和NK细胞(CD34、CD56、CD94、NKp46、NKp30)相关基因表达的变化，经12周施用Lactobacillus plantarum DR7(灰色)或安慰剂(黑色)，在(a)和(d)青年组(年龄<30岁；n＝59)，(b)和(e)成年组(年龄30-59岁；n＝52)，(c)和(f)所有受试者(n＝111)中。

图5.12周中，所有受试者(总共n＝109；Lactobacillus plantarum DR7，n＝56；安慰剂组，n＝53)的(A)咽；和(B)(鼻)的症状与普通流感的症状；血浆IFN-γ(C)，IL-10(D)，IL-4(E)与血浆中硫代巴比妥酸；血浆中CD117，CD8与CD44基因表达的变化的斯皮尔曼相关图。

图6.大鼠经12周的治疗，行为学评估采用(A)莫里斯水迷宫，(B)旷场实验(C)T迷宫进行评测。青年组(正常饮食)，青年高脂饮食(HFD)组(青年大鼠加高脂饮食)，老年组(D-半乳糖介导的老龄化；600mg/kg/日)，老年高脂饮食(HFD)组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食)，老年高脂饮食DR7组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食加L.plantarum DR7log10CFU/日)，老年高脂饮食他汀(statin)组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食加洛伐他汀(lovastatin)2mg/kg/日)。结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。相同处理组在不同日期下的平均值差异显著(P<0.05)。

图7.Lactobacillus plantarum DR7(灰条)或安慰剂(白条)处理12周的效果，数值上的改变与0周进行比较(A)PSS-10，(B)压力，(C)焦虑，(D)抑郁，(E)总分DASS-42，在青年组(年龄<30岁)、中年(年龄>30岁)以及所有受试者中。DASS-42重复测量ANOVA；年龄<30岁的压力；W：P＝0.130；T:P＝0.016，TXW:P＝0.628；所有受试者的压力：W：P＝0.003；T:P＝0.036，TXW:P＝0.593；年龄<30岁的焦虑：W：P＝0.040；T:P＝0.016，TXW:P＝0.291；年龄>30岁的焦虑：W：P＝0.127；T:P＝0.045，TXW:P＝0.433；所有受试者的焦虑：W：P＝0.007；T:P＝0.002，TXW:P＝0.170；年龄<30岁的总分：W：P＝0.061；T:P＝0.044，TXW:P＝0.484；所有受试者的总分：W：P＝0.005；T:P＝0.028，TXW:P＝0.448。P值表明不同处理组在各时间点下是有显著差异的。重复测量ANOVA在W上展示了统计差异性：周数的作用；T：DR7和安慰剂的作用；TXW：周数和处理之间的互作。结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝111(DR7n＝56，安慰剂n＝55)。

图8A和8B.认知和记忆参数通过修饰过的CogState简易电池进行评价，经12周的Lactobacillus plantarum DR7与安慰剂处理，成年组(n＝111；DR7 n＝56，安慰剂n＝55)。

图9.检测海马相关基因表达(A)伽马氨基丁酸a亚基(GABA A2)，(B)酪氨酸羟化酶(TH)，(C)多巴胺β羟化酶(DBH)，(D)吲哚胺双加氧酶(IDO)和(E)色氨酸羟化酶1(TPH1)在12周治疗后。(F)海马体中色氨酸经由IDO的激活代谢成犬尿氨酸(kynurenine)，或色氨酸经由TPH的激活代谢成5-羟色胺(serotonin)。青年组(正常饮食)，青年高脂饮食(HFD)组(高脂饮食)，老年组(D-半乳糖介导的老龄化；600mg/kg/日)，老年高脂饮食组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食)，老年高脂饮食DR7组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食加L.plantarum DR7 log10CFU/日)，老年高脂饮食他汀组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)。结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图10.Lactobacillus plantarum DR7处理12周后血液中mRNA基因的相对表达量(标准化用安慰剂作为对照)的效果：多巴胺β羟化酶(DBH)，酪氨酸羟化酶(TH)，色氨酸羟化酶1(TPH1)，色氨酸羟化酶2(TPH2),5-羟色胺受体6(5-HT6)，吲哚胺双加氧酶(IDO)，色氨酸2,3-加双氧酶(TDO),谷氨酸脱羧酶(GAD65),伽马氨基丁酸A-受体a-5(GABRA5),脑源性神经营养因子(BDNF)和cAMP应答元件结合蛋白(CREB)。在(A)青年组(年龄<30岁)，(B)中年组(年龄>30岁)以及(C)所有受试者。P值表现出不同处理组在各自的时间点差异显著。结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝111(DR7 n＝56，安慰剂n＝55)。

图11A和11B显微照片呈现(A)野生型果蝇(Oregon-R)与玻璃体多聚体报告子(Glass Multiple Reporter)-GAL4(GMR-GAL4)杂交产生的GMR-OreR型眼睛，在250×倍数下，(B)正常成形的六边形小眼与直鬃毛，在350×倍数下。(C)粗糙眼型同时有孔，(D)畸形小眼失去六边形性状，破损的鬃毛，在250×倍数下，来自基因改造过的果蝇Aβ42(GMR-Aβ42)，由GMR-Aβ42由玻璃体多聚体报告子-GAL4(GMR-GAL4)与表达野生型人源基因Aβ42的UAS-Aβ42杂交产生，GMR-Gal4导致眼睛全视网膜的退化。显微照片(E)正常型眼形状在250×倍数下，(F)六边形小眼与轻微损伤的鬃毛，在350×倍数下，来自基因改造过的果蝇Aβ42(GMR-Aβ42)，由玻璃体多聚体报告子-GAL4(GMR-GAL4)与UAS-Aβ42杂交产生，其中GMR-Aβ42饲喂100μL 1×10¹¹CFU/mL Lactobacillus plantarum DR7。(G)果蝇眼形态学的量化统计通过软件Flynotyper，计算每只眼的形态学得分。高P值代表了无序状态的升高与小眼排列对称性的改变，即增加了眼的表型。

图12.大鼠经12周干预后海马体细胞因子水平(A)白细胞介素1-beta(IL-1b)，(B)干扰素γ(IFN-γ)，(C)肿瘤坏死因子a(TNF-α)。青年组(正常饮食)，青年高脂组(高脂饮食)老年组(D-半乳糖介导的老龄化；600mg/kg/日)，老年高脂组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食)，老年高脂DR7组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食加L.plantarum DR7log¹⁰CFU/日)，老年高脂他汀组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)。结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图13.海马体凋亡基因相对表达量(A)肿瘤蛋白(P53)，(B)肿瘤蛋白19(P19)，(C)特大型B细胞淋巴瘤(BCL-XL),(D)BCL2联合X(BAX)，(E)12周治疗处理后的半胱天冬酶9(CAS-9)。(G)BAX，BCL-XL，CAS-9互作中产生细胞凋亡激活剂。青年组(正常饮食)，青年高脂组(高脂饮食)老年组(D-半乳糖介导的老龄化；600mg/kg/日)，老年高脂组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食)，老年高脂DR7组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食加L.plantarumDR7 log10CFU/日)，老年高脂他汀组(D-半乳糖介导的老龄化加高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)。结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图14.血浆中皮质醇(cortisol)和细胞因子[干扰素γ(IFN-γ)；肿瘤坏死因子α(TNF-a)；白介素(IL)-1β；IL-10；IL-4]的水平经12周的益生菌Lactobacillus p lantarumDR7干预组(亮灰格)与安慰剂组(黑灰格)相比，(A)青年组(年龄<30岁)，(B)中年组(年龄>30岁)，(C)所有受试者。细胞因子的标准化由全血血细胞计数获得的白细胞数检测。P值用来区分处理组的差异性，在不同的时间点下。结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝111(DR7n＝56，安慰剂组n＝55)。

图15.(A)图片表述在5’磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化活力，在杜尔贝科改良基本培养基(DMEM)培养基，空白MRS肉汤培养基(de Mann,Rogosa,Sharpe(MRS)broth)的脂质部分，Lactobacillus plantarum菌株DR7无细胞上清中脂质部分，空白MRS肉汤培养基的蛋白部分，L.plantarum菌株DR7无细胞上清中的蛋白部分，空白MRS肉汤培养基的多糖部分，以及L.plantarum菌株DR7无细胞上清中的多糖部分。(B)图像说明AMPK磷酸化的相对量，在空白MRS肉汤培养基中、商业化的AMPK激活剂，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)，Lactobacillus plantarum菌株DR7无细胞上清，Lactobacillus plantarum菌株DR7无细胞上清添加商业化AMPK抑制剂，化合物C，只加化合物C以及只添加洛伐他汀。

图16.色谱图(a)空白MRS肉汤培养基(b)无Lactobacillus plantarum DR7菌体上清，高强度峰值为2-羟基异己酸与3-苯乳酸，分别用HICA与PLA表示。

图17.经12周的处理后，采集大鼠血液测端粒长度(T/S比例)。Y(青年对照)，O(D-半乳糖介导的老龄化)，O+S(D-半乳糖介导的老龄化加洛伐他汀2mg/kg/日),O+DR7(D-半乳糖介导的老龄化加L.plantarum DR7(10logCFU/日)。结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图18.跑步机疲劳测试用来测验12周实验期后的大鼠。青年(对照)，老龄化(D-半乳糖介导的老龄化加洛伐他汀2mg/kg/日)，Aged-DR7(D-半乳糖介导的老龄化加L.plantarum DR7(10logCFU/日)结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图19A；19B和19C.(A)不同乳酸菌株(1％，v/v接种量)对胆固醇的同化作用，MRS肉汤培养基(包含3％(w/v牛胆汁酸和60μg/mL的胆固醇))发酵24h，37℃。胆固醇的累积在(B)小肠细胞(HT-29)与(C)肝细胞(HepG2)共培养24h，37℃，添加不同乳酸菌株无细胞上清发酵液(50％，v/v)。无血清达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’smedium)(DMEM)培养基，加1mM胆固醇与0.03％牛胆汁酸。空白MRS：无菌MRS肉汤培养基以50％(v/v)加入无血清DMEM培养基中；30242.细胞内胆固醇聚集(D)与β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a(HMG-CoA)还原酶(HMGCR)mRNA基因表达(E)肝细胞(HepG2)加不同浓度无Lactobacillus plantarum DR7菌体上清，共培养24h，37℃，5％CO₂。非治疗组：HepG2在无血清达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养基。空白MRS：无菌MRS肉汤培养基以50％(v/v)加入无血清DMEM培养基中。(F)β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a还原酶(HMGCR)mRNA基因表达(E)肝细胞(HepG2)加不同浓度无Lactobacillus plantarum DR7菌体上清，共培养3h，37℃，5％CO₂。AICAR(AMPK活化剂)与化合物C(Compound C)(AMPK抑制剂)作为阳性与阴性对照。非治疗组：HepG2在无血清达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养基中；空白MRS：HepG2在无菌MRS肉汤培养基以30％(v/v)加入无血清DMEM培养基中；CFS-DR7，HepG2培养于CFS，来自L.plantarum DR7,以30％(v/v)加入无血清DMEM培养基中。(G)肝细胞(HepG2)AMPK基因相对表达含量在不同处理组，培养3h，37℃，5％CO₂。AICAR(AMPK活化剂)与化合物C(AMPK抑制剂)作为阳性与阴性对照。非治疗组：HepG2在无血清达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养基中；空白MRS：HepG2在无菌MRS肉汤培养基以30％(v/v)加入无血清DMEM培养基中；CFS-DR7，HepG2培养于CFS，来自L.plantarum DR7,以30％(v/v)加入无血清DMEM培养基中。(H)不同处理组肝细胞(HepG2)AMPK相对磷酸化，培养3h，37℃，5％CO₂。AICAR(AMPK活化剂)与化合物C(AMPK抑制剂)作为阳性与阴性对照。非治疗组：HepG2在无血清达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养基中；空白MRS：HepG2在无菌MRS肉汤培养基以30％(v/v)加入无血清DMEM培养基中；CFS-DR7，HepG2培养于CFS，来自Lactobacillus plantarum DR7,以30％(v/v)加入无血清DMEM培养基中。结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝3。采用单向ANOVA，Duncan’s post hoc比较法进行统计分析。平均值用不同字母标注，具有显著差异性(p<0.05)。(I)在d-半乳糖(600mg/kg/日)处理12周介导的衰老大鼠组中甘油三酯(TG)含量。ND(正常饮食)，HFD(高脂饮食)，HFD-statin(高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)，HFD-DR7组(高脂饮食加L.plantarum DR7 log¹⁰CFU/日)，结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图20.在D-半乳糖(600mg/kg/日)处理12周介导的衰老大鼠组中肝脏的以下基因相对表达量(A)SCD1，(B)IL-6,(C)ABCG5，(D)ABCG8。ND(正常饮食)，HFD(高脂饮食)，HFD-statin(高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)，HFD-DR7组(高脂饮食加L.plantarum DR7log¹⁰CFU/日)，结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图21.在D-半乳糖(600mg/kg/日)处理12周介导的衰老大鼠组中肝脏以下基因相对表达量(A)SR-B1，(B)LDL-R,(C)ABCA1，(D)ApoA1。ND(正常饮食)，HFD(高脂饮食)，HFD-statin(高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)，HFD-DR7组(高脂饮食加L.plantarum DR7log¹⁰CFU/日)，结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图22.在D-半乳糖(600mg/kg/日)处理12周介导的衰老大鼠组中肝脏以下基因相对表达量(A)AMPKα1，(B)AMPKα2。ND(正常饮食)，HFD(高脂饮食)，HFD-statin(高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)，HFD-DR7组(高脂饮食加L.plantarum DR7 log¹⁰CFU/日)，结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图23.在D-半乳糖(600mg/kg/日)处理12周介导的衰老大鼠组中肝脏抗炎细胞因子IL-4水平。ND(正常饮食)，HFD(高脂饮食)，HFD-statin(高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)，HFD-DR7组(高脂饮食加L.plantarum DR7 log¹⁰CFU/日)，结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图24.在D-半乳糖(600mg/kg/日)处理12周介导的衰老大鼠组中肝脏HE染色切片。ND(正常饮食)，HFD(高脂饮食)，HFD-statin(高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)，HFD-DR7组(高脂饮食加L.plantarum DR7 log¹⁰CFU/日)，结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图25.三个优势菌门的相对丰度。；A)放线菌门，B)拟杆菌门，C)硬壁菌门，D)12周试验期后大鼠粪便中硬壁菌门与拟杆菌门的比例。Young-ND：青年组正常饮食；Young-HFD：青年组高脂饮食；aged-ND：D-半乳糖介导的老龄化组正常饮食；aged-HFD：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食；aged-HFD-statin：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食，加洛伐他汀2mg/kg/日；aged-HFD-DR7：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食，加L.plantarum DR7log¹⁰CFU/日)，结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图26.粪便中乙酸的绝对含量分析。Young-ND：青年组正常饮食；Young-HFD：青年组高脂饮食；aged-ND：D-半乳糖介导的老龄化组正常饮食；aged-HFD：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食；aged-HFD-statin：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食，加洛伐他汀2mg/kg/日；aged-HFD-DR7：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食，加L.plantarum DR7log¹⁰CFU/日)，结果用平均值表达；误差线(SEM)；n＝6。

图27.12周试验期后大鼠粪便中前70个水溶性代谢物含量分析；热图标准化了相对值2至﹣2之间的代谢物。红色代表较高浓度，蓝色代表较低浓度。Young-ND：青年组正常饮食；Young-HFD：青年组高脂饮食；aged-ND：D-半乳糖介导的老龄化组正常饮食；aged-HFD：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食；aged-HFD-statin：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食，加洛伐他汀2mg/kg/日；aged-HFD-DR7：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食，加L.plantarum DR7 log¹⁰CFU/日)。

图28.12周试验期后大鼠粪便中水溶性代谢物偏最小二乘分析(sPLS-DA)。Young-ND：青年组正常饮食；Young-HFD：青年组高脂饮食；aged-ND：D-半乳糖介导的老龄化组正常饮食；aged-HFD：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食；aged-HFD-statin：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食，加洛伐他汀2mg/kg/日；aged-HFD-DR7：D-半乳糖介导的老龄化组加高脂饮食，加L.plantarum DR7 log¹⁰CFU/日)。D-半乳糖(600mg/kg/日)通过皮肤注射。正常饮食(ND)：标准日粮，高脂饮食(HFD)：标准日粮加25％脂肪。

实施本发明的最佳模式

Lactobacillus plantarum DR7分离自槟城新鲜牛乳中，获得于马来西亚的临床营养国际(马来西亚)私人有限公司。菌株鉴定为Lactobacillus plantarum，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号中国科学院微生物研究所。保藏菌的菌株保藏号CGMCC15535，保藏时间2018年4月2号(02.04.2018)。保藏申请人为临床营养国际(马来西亚)私人有限公司与普罗沃利奥有限公司。所保藏菌株具有活性的且具有与其保藏相关的所需条件。

种属鉴定经16S rRNA基因测序。16S rRNA基因信息以及序列号为SEQ ID NO:1:

重叠群25(11475)

重叠群长度：1475碱基

平均长度/序列：875碱基

总序列长度：1751碱基

总链(Total Str和)：1序列

底链(Bottom Str和)：1序列

总：2序列

全基因组序列保藏于GenBank登记号为CP031318(2018年9月26号)(修改历史登记号：CP031318.1GI:1480141094 2018.9.26 07:35AM)

在此声明，利用所保藏的菌株作为起始材料进行试验，技术人员可按照通用操作，包括常规的基因诱变以及再分离技术，获得该菌株的变异型或突变体，同时保有此专利中所描述的原菌株的特性或增强特性。因此，本专利同时将一些可能的突变型在此公开。本文中，针对此菌株的术语“变异型”或“突变体”是指由所保藏的菌株经一些自然发生的，或专性进化菌株所获得的菌株，主要指突变，仍旧保持有原菌株的功能。对功能的评价技术方法已经在“实施例”章节进行阐述。

例如，菌株的“变形体”16S rRNA基因或是全基因组序列预计与在此公开的原菌株的16S rRNA基因SEQ ID NO:1或CP031318比对，具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％比例的基因相同。

在一个特定实施例中，突变株可以通过DNA重组技术获得。另一个特别的实施例中，突变体可由随机基因重组获得。因此，本专利的另一方面涉及对于获得DR7突变株的方法，在那里将详细阐述以所保藏的原菌株为原材料，进行基因突变，并获得突变株以及在原菌株基础上生物功能的迭代变化。

在一个详细的实施例中，本菌株在人造培养基中发酵，并在发酵后经后处理，获得大量细菌细胞，结果使得这些细菌细胞是处于液体培养基中或固体状态。详细为，后处理可由以下几个方式中进行选择：干燥、冷冻、冷冻干燥、流态干燥、喷雾干燥与液态培养基冷冻。

菌株由人造培养基，在适合的条件下经培养或发酵得来。对于“人造培养基”的解读为，是微生物的培养基，含有天然基质，选择添加化学合成物例如可使血清功能再生的聚乙烯醇。常规适配的培养基是营养肉汤培养基，包含微生物生长所需的基础碳源(例如葡萄糖)，氮源(氨基酸与蛋白质)，水与盐。生长培养基一般以液体的形式，或添加琼脂及凝胶组分制备的固体培养基。菌株可单独培养制备纯培养物，或跟其它微生物混合培养，亦可分开培养后再以设定比例进行混合。培养后，根据最终的目的，菌株可以作为纯菌使用，或细菌培养物及细胞悬浮经合适的后处理后再进行使用。本文中，“生物量”解读为微生物经培养后(或发酵作为培养的同义方式)所获得的细菌菌体。

“后处理”已经在本发明中进行了阐述，其中所涉及的流程均以获得目标生物量即可储藏的细菌体为目标。后处理的目的包括降低菌体细胞的代谢活力，延迟细胞凋亡的比例。所以经后处理之后，细菌细胞可以是固态也可是液态形式。固态形式下，菌体细胞可以以粉状或颗粒状形态储存。无论哪种形态，固态液态形式下的菌体细胞均经过人造条件的后处理，并非以天然形态存在。后处理的特别之处在于还需要用到后处理试剂。专利中提及的“后处理试剂”指在后处理过程中用到的一系列复合物。该系列复合物包括但不局限于，脱水剂、抑菌剂、防冷冻剂(冷冻保护剂)、惰性填充料(冻干支持剂)、载体材料(核心材料)等，单独使用或是联合使用。

这里有两个基本的方法用以降低菌体细胞的代谢活性，因此也形成两套后处理方式。第一个是抑制化学反应率，通过降低温度如冷藏冷冻、机械冷冻、液氮冷冻。另外，也可通过抑制菌体生长的基质，如抑菌剂等对菌体细胞的生化反应进行抑制。

第二种后处理方法是去除生物量中的水分，利用冷冻干燥法升华水分。去除生物量水分的匹配方式是干燥，冷冻干燥、喷雾干燥、流化床干燥。后处理经干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、流化床干燥工艺后，最终将样品处理为固体形态。

后处理中的关键是冷冻干燥，降低压力使冷冻菌体细胞悬浮液中的水分升华。此加工包括三个过程：预冷冻形成冷冻结构，先除去大部分水分，第二步干燥再除去结合水。由于工业化培养与菌体收集中，目的及预期具有可变性，因此需添加惰性填充材料，即冻干保护剂。作用是保证产品中活性益生菌的标准量。以下列举了可用的商业化冻干保护剂材料：白砂糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、玉米淀粉、菊粉，等可用的非吸潮组分。此外，例如抗坏血酸，也经常用作冻干保护剂。无论用何种材料，需要最终能够磨成所要的粒径大小，包括制成粉剂。

Lactobacillus plantarum DR7的医疗应用

Lactobacillus plantarum DR7具有作为益生菌的优良特性。益生菌需要具备的特性有无毒，活的，可粘附以及对健康有积极作用。每一个菌株都是独特的，即便与其归属于同一菌种的菌株，也无法进行类比。

在本专利实施例部分所述实验中，列举了Lactobacillus plantarum DR7菌株与其它相比所具有的与提升健康相关的优良特性。

1.Lactobacillus plantarum DR7可通过增强机体的免疫***进而提升宿主的抗上呼吸道感染能力，该效果通过随机双盲实验得到验证(详见本文后续的实施例1部分)。该研究的目的探究Lactobacillus plantarum DR7抵御上呼吸道感染(URT1)探究免疫调节下的相关机制。DR7菌株(9log cfu/d)的添加量为期12周的随机双盲实验，参与的志愿者达到109人。与安慰剂组相比，摄入DR7可以降低URT1导致的鼻炎症状与发生频率分别在12周与4周之后所观察到。与安慰剂组相比，DR7摄入可促表达血浆中促炎因子(IFN-γ，TNF-α)在中年组中(30-60岁)，同时增强抗炎因子(IL-4,IL-10)表达量，在青年组中(<30岁)，同时降低血浆中促氧化应激与氧化应激水平。与安慰剂组相比，青年组接受DR7后表现出较高的CD44与CD117血浆中表达量，分别达到4.50与2.22倍。同时，中年组表现出血浆中CD4与CD8的表达量降低，分别为11.26与1.80倍，表明T细胞活化量的降低。对比来看，青年组与中年组受试人群在接受DR7摄入后与安慰剂组相比，均能够显著提升血浆中活化的成熟的NK细胞的数量。因此，DR7正是通过提高免疫因子数量以及增强免疫力缓解URT1症状。

因此，就像先前所提到的，关于本专利中所涉及的Lactobacillus plantarum DR7菌株或其代谢物组分，通过抗炎与免疫调节保护途径，可用于上呼吸道感染性疾病的预防与治疗。

2.Lactobacillus plantarum DR7在成年人组中缓解压力与焦虑的作用研究，也通过随机双盲，有安慰剂对照的实验中得以验证(详见后续实施例2部分)111名压力成年人被招募，通过调整过的PSS-10调查问卷筛查后所确定的。12周连续摄入DR7(1×10⁹cfu/日)，与安慰剂组相比在第8周就观察到降低了压力，焦虑症状，通过DASS-42评卷发现同时降低了精神病变评分。与安慰剂组相比，摄入DR7组血浆中皮质醇水平降低，促炎因子如干扰素γ，转化生长因子α均降低，血浆中抗炎因子如白细胞介素10增高。与安慰剂组与青年组受试者相比，DR7可以更好的提升成年组(>30岁)认知与记忆功能，例如基本注意力，情感认知以及相关学习能力。摄入DR7可以增强5-羟色胺代谢通路，降低血浆中多巴胺β羟化酶(DBH)，酪氨酸(TH)，吲哚2,3-双加氧酶及色氨酸2,3-双加氧酶含量，提高色氨酸羟化酶-2与5-羟色胺受体6，经12周的实验期，稳固表达TH与DBH，从而稳固了多巴胺的代谢通路。结果表明DR7可以满足FAO/WHO对益生菌作为天然策略在压力成人群众提升其生理功能，认知和记忆力方面的生理健康所提出的要求。

因此，像先前所提到的，作为围绕Lactobacillus plantarum DR7或其代谢产物专利内容的一方面，其可用于预防与治疗压力、焦虑、记忆与认知功能障碍等。

3.Lactobacillus plantarum DR7提升脑神经健康水平，增强神经递质5-羟色胺与多巴胺代谢通路，能够抵御阿尔茨海默病，海马体的炎症及细胞凋亡(详见后文的实施例3)。老龄HFD大鼠组，实验中行为学评价研究数据表明DR7能够降低焦虑，增强其认知。老龄鼠中3个促炎因子在海马体中的浓度逐渐升高，而在摄入他汀与DR7组中发现呈降低趋势。海马体神经递质和细胞凋亡基因的表达都呈现出降低IDO和P53的表达，同时提高TPH1在摄入DR7的老龄高脂组中的表达，这表明DR7在5-羟色胺与氧化应激衰老相关通路中具备的潜在益生作用。由此，为Lactobacillus plantarum DR7作为日常饮食调控策略能够有效提升老龄化过程中的认知功能，提供了有效的实施例。

4.Lactobacillus plantarum DR7菌株在黑腹果蝇阿尔茨海默模型中表现出能够有效缓解眼睛神经退行性病变的相关病理表型(详见本文后续实施例3)。DR7菌株在黑腹果蝇阿尔茨海默模型中同时表现出具有AD逆转的潜在益生特性。在Lactobacillusplantarum DR7干预下，对果蝇最突出的作用是能够拯救因AD导致的眼表粗糙的病变表型。

由此可见，就像先前所描述的，围绕Lactobacillus plantarum DR7及其代谢产物的本专利重要内容之一就是可以预防与治疗神经退行性病变。具体例子为阿尔茨海默疾病，Lactobacillus plantarum DR7增强神经递质5-羟色胺和多巴胺代谢通路，用以抵制阿尔茨海默疾病以及海马体炎症与细胞凋亡。

5.Lactobacillus plantarum DR7可抑制端粒缩短与增强能量代谢***进而对抗衰老(详见后文的实施例5)。雄性SD大鼠在饲喂高脂饮食(54％千卡脂肪)同时注射D-半乳糖日粮12周制造衰老动物模型。衡量DR7菌株在与衰老导致的机体损伤，如端粒长度，血浆中脂质过氧化，肝脏AMPK表达，肌肉性能等指标方面的影响作用。饲喂他汀(statin)与Lactobacillus plantarum DR7(LP-DR7)可以显著降低端粒的缩短量，增加AMPK-α2亚基的表达量。在LP-DR7干预下，与对照组相比，AMPK-α1亚基量提高，而他汀没有此作用。肌肉性能检测中发现，与对照组相比DR7可以提高跑步距离、持续时间、速度、工作与能力，而他汀没有此作用。

由此可见，就像先前所描述的，围绕Lactobacillus plantarum DR7及其代谢产物的本专利重要内容之一就是可以通过阻碍端粒缩短与增强能量代谢。用于减缓衰老所伴随出现的生理变化。衰老带来的表现，例如降低能量代谢导致运动与协调方面的损伤，血液中的氧化反应导致的免疫***损伤。

6.Lactobacillus plantarum DR7通过AMPK的磷酸化作用降低胆固醇，下调HMG-CoA还原酶mRNA的表达，因此可调节肝脏脂质与能量代谢，有效的抵抗甘油三酯的升高，炎症发生以及脂质的累积(详见后文的实施例6)。与其它乳杆菌相比，Lactobacillusplantarum DR7无细胞上清液(CFS)也具有代谢胆固醇的能力，降低HepG2与HT-29细胞胆固醇的累积，同时降低HepG2细胞HMG-CoA还原酶(HMGCR)mRNA的表达。HMGCR表达量降低同时削弱了AMPK抑制因子数量，猜测HepG2细胞中，L.plantarum DR7是通过AMPK通路执行其生理作用，特别是AMPK的磷酸化代替AMPK mRNA的表达。总结以上，L.plantarum DR7可通过AMPK通路执行其降低胆固醇的生理功能，特别是经过AMPK的磷酸化抑制HMGCR表达。

由此可见，就像先前所描述的，围绕Lactobacillus plantarum DR7及其代谢产物的本专利重要内容之一就是预防与治疗心脑血管疾病与降低胆固醇。

7.Lactobacillus plantarum DR7改变脂质代谢缓解NAFLD在衰老大鼠模型中(详见后文的实施例6)。在这个研究中，不同的乳杆菌株用以评价在衰老大鼠体内是否可以通过AMPK通路来缓解高脂血症与脂肪肝。雄性SD大鼠在饲喂高脂饮食(HFD)并注射D-半乳糖12周来造衰老模型。治疗措施包括i)正常饮食，ii)HFD,iii)HFD-他汀(洛伐他汀2mg/kg/日)，iv)HFD-Lactobacillus plantarum DR7(10log CFU/日)。与HFD对照组相比，DR7摄入减少了血清中甘油三酯水平经12周的实验期后。在DR7组中观察到的更为突出的现象是，肝脏形态学以及基因表达两方面都与对照组有明显的变化；下调肝脏中肝脏中脂质的合成与β-氧化基因SCD1,上调肝脏甾醇***基因ABCG5与ABCG8，进而降低肝脏中甾醇含量，此外还上调肝脏中能量代谢基因AMPKα1与AMPKα2。总结以上，该研究证明了DR7菌株可经由激活能量与脂质代谢，进而提高脂质在机体对脂质的配置，暗示菌株具备通过机体自身代谢来缓解心脑血管与肝脏疾病。

由此可见，就像先前所描述的，围绕Lactobacillus plantarum DR7及其代谢产物的本专利重要内容之一就是通过阻碍甘油三酯水平升高来预防与治疗高血脂与肝脏脂肪堆积，及脂质堆积导致的炎症。具体来说，该菌株可用于非酒精性肝损伤疾病(NAFLD)的预防与治疗。

8.Lactobacillus plantarum DR7具有调节肠道菌群平衡与菌群丰度及代谢物浓度的作用(详见后文的实施例7)。雄性SD大鼠在饲喂高脂饮食(HFD)并注射D-半乳糖12周来造衰老模型用以评价Lactobacillus plantarum DR7在调节肠道菌群结构，短链脂肪酸与水溶性组分含量方面的作用。结果发现DR7改变肠道菌群的多样性与结构，以及代谢物。分析粪便中水溶性代谢物揭示L.plantarum DR7干预可以使得粪便中氨基酸等代谢物提升，如色氨酸，亮氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸与赖氨酸。

由此可见，就像先前所描述的，围绕Lactobacillus plantarum DR7及其代谢产物的本专利重要内容之一就是作为益生菌，可以调节菌群平衡与菌群代谢，减轻肠道微生态失衡现象。

菌株实现其益生功能，其中涉及诸多通路与机制，包括产生2-羟基异己酸(HICA)与3-苯乳酸(PLA)。

这些代谢产物可以抑制端粒的缩短来减缓衰老信号。进一步分析，代谢物通过对AMPK的磷酸化来激活AMPK通路。因此，代谢产物可以直接调节机体衰老因子，对与之相关的脂质代谢形成直接调控关系。另一方面对上呼吸道感染的抗炎与免疫调节作用，也促使菌株对衰老起着减速缓解的作用。因此，菌株代谢物适用于被衰老所带来的的心脑血管疾病、高胆固醇等困扰的人群。值得一提的是，代谢物在脂质代谢方面的调控作用，适用于上述所有提到的与衰老相关的病症。

未经加工的代谢产物可以与至少一种组分进行复配进行深加工形成健康食物或饮料。加工过程需要柔和，考虑到最大程度保存代谢产物的营养组分。

本专利的另一权利要求项，包含HICA和PLA的代谢产物通过磷酸化作用，激活磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)通路，进而减缓衰老导致的生理变化。该代谢产物同时也是如3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶还原酶(HMGCR)上游的关键代谢酶。在激活的条件下，AMPK磷酸化一大批下游靶点，导致如三磷酸腺苷通路上调与ATP利用通路的下调。此外，AMPK抑制HMGCR基因表达，HMGCR基因则参与胆固醇与类异戊二烯的生成。以上均表明摄取菌株代谢产物可以降低胆固醇，因此同时降低宿主体内胆固醇与脂质物质水平。

另外，对于衰老表型的缓解作用途径还有，通过AMPK磷酸化作用激活巨噬细胞，降低了流感病毒的感染。巨噬细胞可被细胞因子激活，例如γ干扰素，内毒素如脂多糖，激活的巨噬细胞可消灭入侵的细菌与被感染的细胞。激活的巨噬细胞通过释放有毒的化合物或蛋白例如蛋白酶，中性粒细胞趋化因子，活性氧，细胞因子，烯酸类与生长因子。因此，摄取本专利中的代谢产物可抵抗上呼吸道感染，具有免疫调节保护作用。

基于上述描述，在此所披露的代谢产物可以用于增强脂质代谢。尤其是，该代谢产物通过下调硬脂酰辅酶A脱氢酶1(SCD1)，上调肝脏中ATP结合盒亚家族G成员5(ABCG5)与ATP结合盒亚家族G成员8(ABCG8)，进而降低血清中甘油三酯。下调的SCD1抑制单一不饱和脂肪酸的合成，也使得血浆中甘油三酯水平得到降低。由此可见，机体中甘油三酯的产生受限于SCD1的活度。另一方面，上调的ABCG5与ABCG8可通过选择性驱动胆汁中中性胆固醇分泌来维持固醇平衡。由此可见，菌株的代谢产物可降低与衰老因子相关的肥胖-健康风险状况的发生。

本专利中所涉及的另一具体内容的说明，复合HICA与PLA的代谢产物可通过组织端粒的缩短来减缓衰老表型发生。在一个具体的阐述研究中，在衰老动物模型中，复合代谢产物的高脂饮食组相比单独摄入高脂饮食组相比，结果发现复合代谢产物的高脂饮食组能够出现更高的端粒单拷贝基因比例。线粒体氧化产生的活性氧是缩短端粒的重要诱因之一。而复合HICA与PLA的代谢产物可能作用于线粒体氧化过程，并减少过程中活性氧的产生。此外，该代谢产物可以减少脑组织中β类淀粉多肽。β类淀粉多肽是导致痴呆、渐进神经功能紊乱、突触功能损伤及阿尔茨海默病等中的关键氨基酸。如此，该代谢产物可以阻碍脑中淀粉样蛋白斑的形成。

产品形式

本专利发明物中的组合物包含了10⁴-10¹²cfu/g冻干形态活菌。

本专利发明物中的组合物也同时包含了菌株代谢物2-羟基异己酸与3-苯乳酸。

应用中有效的活菌细胞数量应由专业人员根据使用的途径与目的进行调整与确定，同时要考虑例如治疗者的年龄与生理状态，病症程度，使用时的最终剂型等。当口服途径时，本发明菌株组合物建议日服用量为10⁷-10¹²cfu，且符合目前的法规要求，最佳口服量为10⁹-10¹¹cfu。“菌落形成单位”(“cfu”)定义是在琼脂培养板中所出现的微生物克隆数，用以计算细菌细胞的数量。当使用本专利发明物组合物时，菌株在其中所占比例为1:1。

对本专利菌株的应用通常是指使用该菌株的活细胞，即活菌体。此外也可扩展为使用该菌株的灭活菌体或菌体裂解物(由以下方式获得灭活菌或菌体裂解物，如改变pH值、超声处理、辐射、高温高压等)，以及包括本专利菌株所产生的有益因子的组合物，例如代谢产物中的2-羟基异己酸与3-苯乳酸。

本专利发明物的具体应用于食品补充剂、药剂、婴幼儿配方食品、可食用产品及食品中。

本专利发明物的应用形式可为将组合物制备片剂，胶囊，丸剂等用于口服。

本专利发明的组合物可制备成任何合适的形态，在不影响其菌体与代谢物的生物活性基础上。因此在针对特定的使用终端来设计制备该发明组合物的使用形态时，也许在药剂学、食品技术领域的专业人员进行设计与制备。

本发明组合物也可制备成只包含菌体的单一组分，也可混合另外一种或多种活性成分或药剂辅料，添加剂，食品组分。本专利发明物的具体应用中，可以添加另外一种或多种的活性组分。当另外的添加组分为其它种类的益生菌菌株，当然对本专利菌株及其代谢物不产生拮抗作用的前提下，使用效果更好。根据以上阐述说明，本专利菌体细胞可以纯菌形态使用，亦可以菌体培养混合形态使用，作为菌体培养的部分组分使用，或菌体培养经后处理再使用，以单一菌株或符合其它菌株一同使用，亦可添加合适的载体与辅料一同使用。其它益生菌也可一同符合使用。

本专利组合物可用于药物产品形式使用。此处的“药物产品”定义较为广泛，包括添加了本专利组合物中任意活性组分，菌体细胞与相匹配的药剂符合使用。“药物产品”也并非局限于医用药剂。“药物产品”在此喻指混合物，材料，组合物等形式，在健全的医疗判断内，对人体等的组织无毒性伤害，无刺激，无过敏反应等其它副作用与并发症。其中每一种载体或辅料等，都必须与终产品中添加的其它复合物相适应。相匹配的载体或辅料等均可在药剂学标准资料中寻找。

药物产品根据各国的不同要求会有多种形态与名称。例如，一个药剂就可以是一个特定的药物产品。医用食品也在本专利所提到的药物产品范围内。“医用食品”与“特医食品”在一些国家中指某些食品可以通过饮食干预对特定疾病有效，弥补日常饮食所欠缺的营养。该定义由一些法案所规定，如美国食品与药品管理局的1988颁布的罕用药行政管理法案修正案，欧洲委员会指令1999/21/EC。医用食品因其所声称的特定保健功能，与其它广义的食物类别有明显的区分。

通常把益生菌组合物，例如在本专利中公开的菌株，作为食品补充剂使用。食品补充剂作为膳食补充或营养补充，通常作为一种特殊的药用产品。该品类的制备是作为膳食的补充，能够提供日常饮食中所缺乏的或获取量不足的营养成分。通常，食品补充剂也是一种食品，但有时也将他们划分到药物，天然健康产品或保健品之中。就本专利而言，食品补充剂也包括保健品。食品补充剂常作为“非处方药”在无处方下销售。如果食品补充剂采用丸剂或胶囊的形式，则使用与药物相同的赋形剂。食品补充剂也采用食品的形式，增强了某些营养效用(如婴幼儿配方产品等)。因此对于本专利发明物的具体应用，可作为食品补充剂使用。

本专利组合物可混合合适的可食用液体或固体组合物，经冷冻干燥制备片剂、丸剂、胶囊、糖果、颗粒剂、粉剂、悬混剂、散剂、糖浆，并明确其单位剂量。此外，也可按照一定剂量冻干组合物提供，另外配备液体组合物，在使用前混匀后一并摄入。

本专利组合物可添加于大范围的食品与可食用产品中，例如婴幼儿乳品。“可食用产品”在此为广泛的通指，包括众多产品类型，形态包括以上所述，如可被动物所利用；以及感官气味可被接受的产品。“食品”可理解为可食用的产品，同时可为机体提供营养支持。尤其是目前较为感兴趣的食品是食品补充剂与婴幼儿配方食品。食品中较为适宜的复合物为包含例如燕麦、乳酸发酵食品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水、蛋白以及糖基化蛋白。作为食品中的具体应用，菌体可与其它佐料均质，例如谷物与奶粉，构成婴幼儿配方食品。

本专利的其中一项内容涉及到包含冷冻保护剂的固态组合物；本专利菌株的冷冻干燥生物质；复合药剂学的载体。药剂学载体可从乳液、凝胶、糊剂、颗粒、粉剂、胶体中选择。本专利亦可用于提供口腔健康防护产品，结合药剂组分，可食用产品，膳食补充剂以及美容产品，均可复合本专利中发明物一定的有效剂量进行应用。具体应用产品可为口腔护理产品如口香糖、牙膏、口腔喷雾、止咳糖、口腔分散片等。具体来说，药用产品组分，可食用产品或是膳食补充剂均可以止咳糖或口腔分散片的产品形式应用。

本专利发明的组合物具体实施例在下文实施例8中。贯穿本专利申请书中描述以及声称的“组合物”，其多样性并不包括其它技术指标，添加剂，成分，操作步骤。其他对象，本专利的优点与特点对于有技术背景的人员在相关说明书阅读基础上是显而易见的，当然也可通过实践本专利的描述进行掌握。此外，目前的发明包含了所有本文中所描述的特定的与优先的多种体现的组合方式。以下的例子与图示均用来作为目标用途的实施例说明，但本专利并不局限与此。

发明方式

实施例

材料与方法

细菌菌株与培养

Lactobacillus plantarum DR7分离自马来西亚槟城的新鲜牛乳中，以友好的方式从临床营养国际(马来西亚)私人有限(马来西亚吉隆坡)公司获得。贮藏的菌体培养物在20％甘油下封存(-20℃)，活化时使用无菌MRS液体培养基(Hi-Media，孟买，印度)经三轮传代，每代活化条件为，按照10％(v/v)接种量，在37℃下培养24h。培养物4℃下12000×g离心5min，沉淀物在PBS(pH 7.5)下重悬，形成最终浓度为1×10¹¹CFU/mL。

DR7代谢物中脂质成分的特性说明

将液体培养基底部细胞沉淀的去除之后所获得发酵培养基中DR7的代谢物。上层液体培养基分为脂质，蛋白与多糖成分。脂质成分经浓缩，水解，甲基酯化为脂肪酸甲酯(FAME)通过气相色谱质谱分析法(GC-MC)进行分析。约100μL的样品混合500μL的溶剂于2mL离心管中，溶剂由2％的H₂SO₄与甲醇组成，混合后于80℃下2h。接下来，500μL氯化钠溶液0.9％质量体积比，与500μL己烷加入上述样品管中16000×g离心3min。吸取己烷层注入安捷伦5977A气象色谱与5977MSD质谱***联用设备(安捷伦；GC/MS)，用以鉴定FAME。采用BPX-70分离柱。

体外实验

胆固醇同化作用

乳杆菌对胆固醇的同化作用检测方法在先前已有描述(Liong和Shah，2005)。上清中残留的胆固醇通过试剂盒检测(Invitrogen，美国)按照说明书步骤进行。

细胞培养

HepG2(人肝癌细胞株)，与HT-29(人结肠细胞株)采用修饰过的Dulbecco’smodified Eagle’s培养基(DMED)(Gibco,美国)，先前已有描述(Lew等,2013)。HepG2与HT29细胞种于12孔板(1×10⁵个细胞/孔)，无DMEM血清加1mM胆固醇与0.03％牛胆汁孵育，37℃，5％的CO₂,24h。后用磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)洗脱细胞两次。脂质提取，用2mL正己烷∶异丙醇(3∶2)30min。提取物收集至玻璃管在氮气下浓缩干燥。细胞中摄取与留存的胆固醇量通过试剂盒检测，按照说明书步骤进行。胞内蛋白提取为将细胞置于12孔板加2mL NaOH(0.1N)，4℃下连续震荡16h。蛋白质浓度用Bradford法进行测定。细胞内胆固醇累积用其在单位数量的胞内蛋白中所含数量进行表示。

基因表达

总RNA的提取采用TRISURE试剂(Bioline，UK)反转录为cDNA，用反转录试剂盒(Thermo Scientific，美国)，按照试剂盒说明书采用随机引物。简述，1μg总RNA反转与扩增在反应体系中2℃，5min，接下来4℃，60min。反应终止于7℃，5min。cDNA稀释10倍，用无核酸水，进而作为qPCR模板使用，储存于-8℃。HMG-CoA还原酶与AMPK的mRNA水平采用实时PCR分析，Agilent AriaMx Realtime PCR System(Agilent Technologies,美国)。20微升PCR反应体系用10μL的2×SensiFAST SYBR mix(Bioline，UK)，0.8μL的10μM正反引物，1μL cDNA。引物序列在表格1中展示，扩增条件采用制造商推荐。18S rRNA基因用来作为管家基因来分析数据。mRNA表达量用于对照的相对百分比来表示。

表1：实时PCR分析中的引物

基于细胞的ELISA用以检测AMPK活性

AMPK活性用细胞ELISA试剂盒检测(RayBio cell-based proteinphosphorylation ELISA kit,RayBiotech,美国)根据说明书操作。简述为，HepG2细胞(1×10⁴个细胞/孔)接种于96孔板，24h孵育于3℃，5％CO2，无DMEM血清。之后用200μL PBS冲洗两次，后每孔加100mL固定剂室温震荡20min。用200μL TBST冲洗3次，加100μL猝灭剂室温下20min，之后添加封闭液3℃下1h。用200μL TBST冲洗3次，50μL兔抗磷酸化AMPK-α1/2(SantaCruz生物技术；Thr172,1∶10000稀释倍数于封闭体系中)加入室温震荡孵育3h。洗脱后，50μL HRP-标记小鼠抗兔IgG(1∶10000稀释倍数于封闭体系中；Santa Cruz生物技术)加入室温孵育1.5h。洗脱3次，加50μL TMB底物(3,3,5,5-四甲基联苯胺)至每孔，暗室室温震荡孵育30min。最后，加终止液(H₂SO₄,2N)，测定450nm的光密度值。

动物实验

实验组

所有动物实验均获得USM动物保护及使用委员会和(USM/动物伦理批准/2016/(724))批准。雄性SD大鼠8周龄分为两组，基于两个实验动物模型；1)衰老模型加他汀作为阳性对照，或2)衰老与高脂饮食(HFD)模型加他汀作为阳性对照。

模型(1)中，大鼠分到以下各组(N＝6)实验期12周：(1)青年组(对照)，(2)衰老组(D-半乳糖介导衰老)，(3)衰老-他汀组(D-半乳糖介导衰老，洛伐他汀2mg/kg/日),(4)衰老-DR7组(D-半乳糖介导衰老，L.plantarum DR7(10log CFU/日冻干粉与冻干保护剂为20％(v/v)))。

模型(2)中，大鼠分到以下各组(N＝6)实验期12周：(1)青年组(正常饮食)，青年HFD(青年大鼠加高脂饮食)，老年组(D-半乳糖介导衰老；600mg/kg/日)，老年HFD(D-半乳糖介导衰老加高脂饮食)，老年HFD DR7组(D-半乳糖介导衰老加高脂饮食加log 10CFU/日)，老年HFD他汀组(D-半乳糖介导衰老加高脂饮食加洛伐他汀2mg/kg/日)。标准日粮(Altromin，德国)用于ND组，标准日粮加入25％(w/w)动物脂肪(精奶油，99％脂肪含量)用于高脂组。治疗处理物混合到1g食物饲料中每天饲喂。大鼠单笼饲养确保能够完全摄入对应的食物。12周结束实验期，在处死前12h开始空腹，并采用二氧化碳法处死。所有组织迅速分离并用生理盐水冲洗。组织用于实时PCR基因定量分析。

端粒长度检测

两个标曲(端粒与白蛋白)生成是通过参照DNA样品(标准DNA)与终DNA浓度，范围从0.073ng/μL至17.65ng/μL。实验DNA的T/S比是T(标准DNA样的ng比对实验样本计算端粒模板的基因拷贝数)除以S(标准DNA样的ng比对实验样本计算白蛋白模板的基因拷贝数)。T/S平均数用以预测每个细胞端粒长度的平均比值。

跑步机疲劳测试

跑步机疲劳测试参照Castro和和Kuang(2017)。大鼠先置于无运动室5min适应环境，0°斜坡，接着进行5min速度10m/min 0°斜坡跑步运动。2-3天的适应期，让大鼠在10°斜坡跑步10min。一个带有瞬间的微电流刺激(0.4mA)网格置于大鼠身后，刺激大鼠向前跑。在第4天(测试日)，皮带转速设定为10m/min，5min，以2m/min的速度增至46m/min。大鼠持续跑步直至精疲力竭(能够静止抵抗5s的电刺激)或直至到达最高时速。时间，速度与距离在大鼠精疲力竭时显示并记录。功与功率计算基于以下方程式：功(J)＝身体指数(kg)×重力(9.81m/s2)×垂直速度(m/s×角度)×时间(s)。功率(W)＝功(J)/时间(s)。

水迷宫实验(MWM)

MWM在无反射直径180cm与高51cm水池中进行。水池注满水(19-20℃)，划分4区域(东南西北四方位区域)，设置直径20cm圆平台在北区下沿进水1.5cm(D’Hooge和De Deyn，2001)。评测开始前每个区域都用不同的对象与大鼠标记。在正式测验前，大鼠连续4天每天进行4轮训练(每轮分别在东南西北四个区域进行)。每天的训练均一致。大鼠轻置于水池中，面向池壁，每次均在不同区域下水，60s内自由游泳寻找逃生平台。记录大鼠找到平台所用时间。

旷场试验(OFT)

OFT在先前研究方法上进行修饰，采用长方形暗盒(32cm H×38cm W×52cm L)有标记的的网格(Sprott和和Eleftheriou,1974)。每只动物轻柔由笼舍转移至盒中，让其自由探索5min，连续3天。记录大鼠进入中央与外部区域的次数。每只大鼠的表现与轨迹均由相机记录(GoPro，加利福利亚，美国)。

T迷宫实验

动物进行T迷宫实验，既包含3臂的迷宫，主臂开放式，另两个为封闭臂规模为40cm高，50cm长，15cm宽。每个臂均由离地70cm的牢固金属支架固定。动物轻柔置于主臂的边缘，作为实验的起始位点。实验分为两个阶段，第一阶段放置食物于封闭臂内，让动物有60s的时间自由漫步可进入任一封闭臂内。在进入后，用纸板阻碍动物30s，使之无法离开进入的臂中。接下来释放动物，重新将其置于起点位置进行第二阶段测试。同样给动物60s时间选择进入任一封闭臂中，实验每日重复10次，记录进入臂中的次数。

海马体组织ELISA与基因检测

处死大鼠，迅速取其海马体组织用生理盐水冲洗。组织样本的总RNA分离置于RNAlater(西格玛，密苏里，美国)，直至样品速冻并储藏与-80℃进行下一步ELISA与实时PCR分析。

生化分析

全血用来分析血清中脂质情况(总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，低密度脂蛋白(LDL)与高密度脂蛋白(HDL))，肝功能(总蛋白，白蛋白，球蛋白，白蛋白/球蛋白比值(AG比例)，天冬氨酸氨基转氨酶(AST)，丙氨酸氨基转氨酶(ALT)，碱性磷酸酶(ALP)及总胆红素)与肾功能(钠，尿素，氯化物，钾，肌酸酐，尿酸，钙及磷酸盐)情况。组织进一步用于ELISA与实时PCR基因表达分析。

肝脏组织学

样品用全自动组织处理仪器处理(赛默科技Shandon Excelsior，美国)。样品用石蜡包埋低温切片机切片，切片用苏木精伊红染色并在光学显微镜下观察。

粪便样本中代谢物分析

水溶性代谢物分析依据Tsugawa等2011,在样品衍变前利用气象质谱进行分析(GCMC)。粪便中短链脂肪酸的提取参照Nakajima等2017。仪器平台为GCMS-TQ8030三重四级杆质谱仪(日本岛津公司,日本京都)。

粪便菌群测序与分析

对提取的细菌DNA中16S rRNA基因的V1-V2区扩增。PCR产物按照先前的研究中准备(Kato T等2014)。16S rRNA基因测序采用454GS Junior平台，根据其操作手册。测序结果用QIIME pipeline进行分析。

人体临床研究

Lactobacillus plantarum DR7与安慰剂产品

DR7与安慰剂产品由GN药物私人有限公司(雪兰莪州,马来西亚)生产制备。产品不含任何与猪或牛相关的组分；生产严格按照GMP并具有JAKIM(马来西亚***发展管理部)的清真认证。益生菌产品包含1×10⁹CFU/袋DR7以及麦芽糊精(95％)，安慰剂只有麦芽糊精(100％)。每剂均为2g的浅黄色粉末，铝纸包材，所有产品口味相同。

招募标准为男性与女性年龄在18-60岁，愿意坚持整个实验周期。排除包括一型糖尿病，具有需长期服药的疾病，HIV/AIDS,葡糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症。涉及人体试验的所有程序均获得马来西亚理工大学临床研究管理小组伦理委员会通过。同时也获得所有参加实验主体的知情同意书。

关于脑部的研究，受试者经修改过的科恩感知压力试卷(PSS-10)(Cohen等,1983)评测其精神压力水平。受试者压力，焦虑，抑郁评测使用DASS-42问卷调查(lovibond和Lovibond,1995)，在基线期(0周)与每隔4周(4,8,12周)进行评测。实验结束(12周)，对受试者的认知功能用计算机CogState简易电池(Brief Battery)(CBB；Mielke等,2015)分析评测。

对于上呼吸道感染(URTI)研究，受试者进行两次问卷调研：(ⅰ)基本情况调查表(基线；0周)，(ⅱ)健康状况调查，每四周记录上呼吸道感染发生情况(上呼吸道病症持续时间，症状数量，发作次数)。所有调查问卷均具备三种语言；英文，马来西亚文，中文(Lau等,2018a,b)。

人体血液采集与基因及ELISA分析

血液样本收集时间点为基线期(0周)与实验结束期(12周)，采用ELISA法分析压力激素皮质醇，IL-1β，-4与-10，肿瘤坏死因子(TNF)-α与干扰素(IFN)-γ的浓度。与5羟色胺及多巴胺分泌有关的基因如多巴胺β-羟化酶(DBH)，酪氨酸羟化酶(TH)，吲哚2,3-双加氧酶和色氨酸2,3-双加氧色氨酸羟化酶-2(tryptophan 2,3-dioxygenasetryptophanhydroxylase-2)和5-羟色胺受体-6均由实时PCR进行分析。全血中的细胞凋亡与炎症基因的表达均用18S rRNA基因作为管家基因进行表达分析。

生化检测

血红细胞(RBC)样本质膜与溶血产物的比例分析用来评价脂质氧化以及抗氧化特性。脂质氧化以及抗氧化特性分析着眼于分析血红细胞(RBC)原生质，膜以及溶血产物。RBC溶血产物与膜的获得依据之前研究所述。简述为，全血3500×g离心20min，分离血浆与红细胞。红细胞用等渗Tris-HCL缓冲液冲洗去除淡黄色壳层，等渗Tris-HCL缓冲液重悬，4℃下8000×g离心20min，反复几次直至细胞膜褪色。最后收集褪色沉淀并用Tris-HCL缓冲液冲洗两次，最终为无血红素的RBC膜(影细胞)。溶血产物在操作过程中收集并浓缩。RBC样本制成20μL的标样，使用20μL未稀释的血浆进行制备。通过检测丙二醛(MDA)来检测脂质过氧化，抗氧化力用铁离子还原/抗氧化能力法检测。

果蝇Drosophila melanogaster的研究:阿尔茨海默病

本实验中所用到的果蝇均列在果蝇数据库(http：//fybase.bio.indiana.edu)由Bloomington Drosophila保藏中心提供(布卢明顿，美国)：Oregon-R野生型(#5)，玻璃体多聚体报告子(Glass Multiple Reporter)-GAL4(#1104)(Moses和Rubin，1991)与UAS-Aβ42(#33769)(Sign和Mahoney，2011)。所有定向表达实验均使用GMR-GAL4。对于野生型对照，Oregon-R与GMR-GAL4杂交产生GMR-OreR，UAS-Aβ42与GMR-GAL4杂交产生转基因Drosophila系GMR-Aβ42，表达Aβ42。储藏在25℃，杂交温度29℃。正常饮食准备，煮沸4％(w/v)玉米淀粉，5％(w/v)玉米粥，10％(w/v)红糖，0.7％(w/v)琼脂，5％(w/v)热杀菌酵母，3％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯与0.7％(v/v)丙酸混合，在用无菌塑料瓶传递之前冷却并凝固。所有进食都不含对羟基苯甲酸甲酯与丙酸。Lactobacillus plantarum DR7(100μL)以浓度为1×10¹¹CFU/mL的添加量加入冷却凝固的饲料中，使其在表明凝固。新鲜的DR7饲料在其凝固的2h内饲喂Drosophila。

杂交前准备工作，5-10只Drosophila雌虫(GAL4或UAS系)与3-5只Drosophila雄虫置于塑料瓶中交配，提供食物。野生型对照杂交由雌性Oregon-R系与UAS-Aβ42雄虫交配，所有GMR-Aβ42杂交都来源自UAS-Aβ42雌虫与GMR-GAL4雄虫杂交所得。对照与转基因GMR-Aβ42.nf Drosophila系正常饮食饲喂，不含DR7(表2)。DR7组采用转基因GMR-Aβ42Drosophila。亲本Drosophila在交配期4-5天后分开。F1代在10天交配期后获得，并进行下一步的分析实验使用。

表2：Drosophila系与实验处理组

果蝇线名	益生菌菌株	简称
			OreR-GMR	未进食	野生型对照
GMR-Aβ42	未进食	GMR-Aβ42.nf
			GMR-Aβ42	乳杆菌DR7	GMR-Aβ42.DR7

每组选取10个子代放置于McDowell-Trump固定剂(西格玛-奥德里奇)中4℃过夜固定，其中包含4％甲醛1％戊二醛0.1M磷酸缓冲液(西格玛)(pH 7.2)。标本用磷酸缓冲液冲洗三次，继而使用1％(w/v)四氧化锇(西格玛-奥德里奇)25℃固定1小时。标本蒸馏水冲洗，在联系梯度乙醇脱水处理；50％，75％，95％与100％乙醇各处理15min。脱水后的标本浸入六甲基二硅氮烷(HMDS)(西格玛)10min。标本在干燥器中过夜自然风干。风干后的标本装裱，镀金处理进而用扫描电镜(SEM)(SU8010；日立有限公司,东京,日本)观察。眼睛区域利用每张图片通过Flynotyper(http://Flynotyper.sourceforge.net)方法计算，通过图片J计算表型分数(P-值)基于修饰过的Drosophila眼中的六边形排列小眼(Yyer等,2018)。

结果与结论

实施例1：Lactobacillus plantarum DR7通过抗炎与免疫调节保护作用抵抗上呼吸道感染的效果

人体临床实验结果

人体临床实验为双盲，随机，安慰剂对照设计实验，同时随机实验也是建立在一定的招募与排除标准之上的。合格的受试者通过计算机按1∶1随机分配到两个组，被随机化的名单按照随机块为4进行，按照年龄分层(18-29,30-39,40-49,50-60岁)，以上最终被分配到益生菌组(DR7)与安慰剂组(麦芽糖糊精)分别具有特定的编号。随机分配由统计员来执行，统计员与参与的受试者无接触。研究小组的任何成员均不知晓所分配的序列编号所代表的的研究组别，直至实验完成。

实验样本量大小的计算是考虑两个平行组，一个治疗组一个安慰剂组，基于对实验设计的权威性考虑。总共需要124位受试者，其中两组(DR7与安慰剂组)各62名，额外招募的10％则退出实验。这样的计算方式是基于如下需求，每个独立的对照或实验组受试者的持续反馈是存在不确定性的，对照与受试者为1：1，概率(幂)为0.9，与此零假设检验相关的I型错误概率为0.05。先前的数据表明，用益生菌干预降低肺炎疾病的表型与持续时间，在组内观察标准差为1.7天，在治疗组与空白组间减少的时间为1天。

招募的124受试者，其中13名受试者在12周之中退出，未完成调查问卷，未采集血液样本，因此最终111名志愿者完成了12周的实验(56名于DR7组，55名于安慰剂组)。DR7组与安慰剂组在其下各年龄层次组如青年组(年龄<30岁)，成年组(年龄30-59岁)大部分表型与全血指标无显著差异性，见表3中，但血红蛋白浓度与嗜碱性粒细胞在DR7组中要高于安慰剂组，而安慰剂组的嗜酸性粒细胞则较高。

表3：基线期111名(n＝111)成年受试者随机分配到Lactobacillus plantarumDR7或安慰剂组进行为期12周的双盲实验。

*P<0.05

与安慰剂组相比，DR7干预稍降低(p<0.10)青年人群组鼻，咽处等流感导致的病理现象的持续时间(图1A)。与安慰剂组相比，DR7干预显著降低(p<0.05)成人组鼻腔症状的持续时间，稍降低普通流感症状持续时间与上呼吸道感染发生频率(p<0.10；图1B)。从所有受试者来看，与安慰剂相比，在12周实验期内，DR7可显著降低鼻腔症状的持续时间以及上呼吸道感染的发生频率(p<0.05)同时对咽喉症状以及一般的流感症状也具有缓解作用(图1C)。

成年组在DR7干预下，12周实验期中与安慰剂组相比血浆中促炎症因子如IL-1β，TNF-α，IFN-γ均显著降低(p<0.05)，DR7在青年组中降低了IFN-γ(p<0.05；图2A与B)。12周实验期中与安慰剂组相比，血浆中抗炎因子IL-4，IL-10在DR7干预下，其在青年组中显著增高(p<0.05；图2A与B)，而在成年组中为发现相同现象。在所有受试者中，与安慰剂组相比DR7干预降低了血浆中促炎因子TNF-α与IFN-γ，而提高了了血浆中抗炎因子IL-4与IL-10的水平(p<0.05；图2C)。

与安慰剂相比，尽管DR7并未影响青年组中血浆的抗氧化活性，RBC膜及溶血产物(图3A)，但DR7微提高了成年组的RBC膜的抗氧化活性(p<0.10；图3B)，但其在12周的实验中，与安慰剂相比，显著增加受试者如图中所展示的参数(p<0.05；图3C)。在12周实验期内，所有受试者与安慰剂组相比，DR7显著降低了青年组，成年组丙二醛(MDA)的浓度，丙二醛由TBA所判定(p<0.05；图3D,E与F)。在12周实验期内，所有受试者与安慰剂组相比，DR7干预使得在RBC膜中TBA有轻微的下降(p<0.10；图3D与F)。

在12周实验期内，与安慰剂组相比DR7干预上调了青年组血浆中CD44与CD117基因的表达(p<0.05；图4A)。同时在12周实验期内，与安慰剂组相比DR7干预下调了成年组血浆中CD4与CD8基因的表达(p<0.05；图4B)。而对于全体受试者水平上分析，以上差异则并未在DR7与安慰剂之间观察到明显的差异(图4C)。青年组血浆中CD44与CD117水平在DR7组中高表达，而成年组血浆中CD4与CD8基因水平在DR7组中低表达，可以看出活化的T细胞在DR7组中要少于安慰剂组。在12周实验期内，与安慰剂组相比DR7干预下调了，青年组血浆中NKp46与NKp30基因表达水平，成年组CD56,NKp46与NKp30，以及所有受试者的CD56,CD94,NKp46与NKp30(p<0.05；图4D,E与F)。由此可见，与安慰剂组相比DR7干预增加了非休眠成熟NK细胞的数量。这些T细胞与NK细胞基因表达表明DR7增强黏膜上皮细胞的完整性，降低抗原物质的渗透，而固有免疫中的NK细胞是抵御外源抗原物质的第一道防线，因此尚未需要激活大量的获得性免疫中的T细胞。

图5表示受试者临床症状与血液指标的相关性分析。

结论：

该研究的目的是探究Lactobacillus plantarum DR7抵御上呼吸道感染

(URTI)以及在其免疫性能方面的相关作用机制。DR7菌株(9log cfu/d)干预下，为期12周的随机双盲安慰剂对照人群实验，参加人数109名成年人。与安慰剂组相比，DR7干预4周与12周之后，均可降低鼻腔症状的持续时间以及URTI的发生频率。DR7干预促进中年人群(30-60岁)血浆中促炎因子(IFN-γ，TNF-α)数量提升，增加了青年组(年龄<30岁)抗炎因子(IL-4，IL-10)数量，同时也降低了血浆中过氧化与氧化应激压力水平相较安慰剂组来看。青年组在接受DR7干预后与安慰剂组相比发现其血浆中CD44与CD117分别提高4.50与2.22倍。同时，中年人群组在接受DR7干预后与安慰剂组相比血浆中CD4与CD8则下降了11.26与1.80倍，而青年人群组与中年人群组在接受DR7干预后与安慰剂组相比都增强了非休眠成熟NK细胞的数量。因此，DR7缓解URTI的症状是通过提高炎症因子的水平及增强机体免疫应答的效应。

实施例2：Lactobacillus plantarum DR7在预防与治疗压力，焦虑，记忆与认知功能障碍方面的作用。

动物实验结果

老年高脂饮食加DR7与他汀组表现出在实验前2天时，能够缩短寻找逃生平台延迟时间，而空白老年高脂组则在实验前4天才发现有缩短寻找逃生平台延迟时间(平均差-28.66；95％CI-45.89至-11.48；p<0.05)。青年组(平均差-8.75；95％CI-26.48至-8.93；p<0.05)与老年组(平均差-8.75；95％CI-25.97至-8.47；p<0.05)在正常饮食下寻找逃生平台延迟时间在实验前3天出现(p<0.05)图6A。表明，DR7组大鼠具有更好的记忆力，能够花费更少的时间找到逃生平台。

评价焦虑采用旷场实验，结果显示所有组在3天的测试期间，其进入外环区域的次数没有差异，但唯有老年高脂加DR7干预组，在实验前2天则减少了进入外环区域的次数图6B，表示该组的焦虑程度降低。

图6C的图例说明表示出经L.plantarum DR7菌株干预的动物，提高了进入T迷宫的正确率，表明菌株提高了动物的记忆力。

人体临床实验结果

人体临床实验研究中，与安慰剂组相比，DR7干预8周可降低压力与焦虑水平，通过DASS-42问卷调查评估见图7。因此，菌株对于降低如焦虑与压力的精神状态有效。

与安慰剂组相比，DR7干预12周，普通成年人组的记忆与认知得到加强见图8。

结论：

根据修饰过的PSS-10调查问卷，111例压力患者被招募。摄入DR7(1×10⁹cfu/日)为期12周，在8周时即发现压力，焦虑等精神指数与安慰剂组相比经DASS-42问卷评估，有明显降低。血浆中皮质醇水平在DR7组中也低于安慰剂组，促炎因子如IFN-γ与TGF-α降低，抗炎因子IL-10则升高。与安慰剂组及青年组相比，DR7更好的提升普通成年人组(年龄>30岁)的认知与记忆功能，如基础注意力，情感认知，联想学习等能力。在12周实验期后，与安慰剂组相比摄入DR7提升5-羟色胺通路，降低了血浆中多巴胺β-羟化酶(DBH)，酪氨酸羟化酶(TH)，吲哚胺-2,3-双加氧酶以及色氨酸2,3-双加氧酶的表达，增加了色氨酸羟化酶-2与5-羟色胺受体6的表达，增强多巴胺代谢通路，增强TH与DBH的表达。结果表明DR7满足了FAO/WHO对于益生菌的要求，可以作为天然途径提升压力人群的精神功能，认知与记忆的健康态。

实施例3：Lactobacillus plantarum DR7通过增强神经递质5-羟色胺与多巴胺代谢途径抵御阿尔茨海默病，海马体炎症与细胞凋亡的效果。

动物实验结果

DR7干预对神经递质通路GABA(图9A)，多巴胺(图9B)或去甲肾上腺素(图9C)没有明显改变。但是大鼠在DR7干预下，高脂衰老组IDO表达降低，TPH1表达升高，与衰老高脂空白组相比，他汀增加了高脂衰老组TPH1表达(平均差-1.56；95％CI-2.88至-0.24；p<0.05；图9E,F)。这表明DR7可作用于5-羟色胺通路来缓解高脂衰老组的焦虑症状。

人体临床实验结果

人体临床实验研究中，DR7干预后可降低压力与焦虑水平，即降低多巴胺β-羟化酶(DBH)与色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)，两者皆为与去甲肾上腺素的产生有重要联系，增加了色氨酸羟化酶-2(TPH2)与5-羟色胺受体6(5-HT6)表达，二者参与血清素代谢通路进而提升了认知功能，以上结果均为12周实验期后在青年组中较安慰剂组相比得来(图10A)。12周实验较安慰剂组相比，在普通成人组中观察到的相似趋势是DR7降低了DBH，酪氨酸羟化酶(TH)，色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)与TDO的表达，同时增加了色氨酸羟化酶-2(TPH2)的表达(图10B)。12周实验，在所有受试者中，DR7干预均降低DBH，TH，TDO与TDO的表达，增加了TPH2与5-HT6的表达(图10C)。

果蝇眼模型研究结果

果蝇眼是神经发育学家的理想研究组织，因其由简单的神经外胚层构成光感受器及附件。每一只眼均由800个六边形单元小眼组成，按照晶体排列形成近似于形成蜂窝的蜂巢。小眼在按列排布交叉入眼形成凹面与蛋型结构。具有机械触感鬃毛在每个小眼交替的顶点处伸出，按照特定角度指向，提供了二级感知区域。异源表达人Aβ42基因于复眼，采用全视网膜GMR-GAL4驱动，结果生成神经退行性表型即粗糙眼表型(REP)。与对照OreR-GMR(图11A,B)相比,GMR-Aβ42.nf成年体眼型严重扭曲，即眼单元发生融合形成空洞造成全眼呈现“釉面外观”(图11C,D)。小眼间的鬃毛数量减少且指向角度随机无规律。

饲喂DR7可以在不同程度上逆转GMR-Aβ42的眼型(图11EF)，使之与对照组区域一致。小眼呈现出其原始的六边形状，无融合现象与孔洞出现。此外，鬃毛的数量显著增多且角度也调整至相同。果蝇眼形态学上的瑕疵定量，通过Flynotyper软件计算每只眼的表型分数(P值)。较高的P值代表病变无序度增加或小眼排列对称度的改变，以及由此所增加的眼型。与SEM图片(图11A-F)结果一致的是，GMR-Aβ42.nf的P值显著(P＝0.0355)高于野生型对照，表示Aβ42对果蝇眼的消极影响(图11G)。饲喂DR7显著降低眼型的P值表示DR7可改善由GMR-Aβ42诱发的果蝇神经退行性病变。

动物实验结果

使用他汀与DR7干预高脂衰老大鼠模型可有效的降低海马体中3种促炎因子浓度见图12(平均差5.62；95％CI 1.78至6.11；p<0.05)。老年阿尔茨海默病患者血浆中具有高水平的TNF-α，在老年痴呆的病变过程中扮演了重要的角色，增高的IL-6与TNF-α可作为认知能力衰退的标志物，同时IFN-g水平在衰老过程中也有升高的现象。

人体临床实验研究结果

在人体临床实验中，DR7通过调节衰老与凋亡基因表达，可降低海马体中神经细胞的凋亡(图13)。BCL-XL,BAX与CAS9基因管理着细胞凋亡与DNA损伤的生理进程(图13G)。老年高脂组BCL-XL,BAX与CAS9基因表达高于老年对照组，表明需要对高脂饮食所诱导的细胞凋亡进行抵抗与控制。他汀与DR7干预组则低表达这些基因，表明DR7与他汀可以抑制机体对上调该类基因的需求，使机体处在较低的细胞凋亡与氧化应激压力之下。

在普通成年人群12周实验期后发现，DR7可提高人体抗炎细胞因子同时降低促炎细胞因子，见图14。压力经常触发人体炎症反应，DR7在降低青年组人体压力水平的同时进而降低与其相关的炎症指标，而普通成年组人群的压力水平与炎症指标也有较小的下降幅度。

结论：

以大鼠为动物模型，对高脂衰老组大鼠的行为学进行研究，证实摄入DR7可降低焦虑的同时增强记忆力。海马体中的3种促炎细胞因子在衰老过程中增加，但在他汀与DR7的干预下有所回落。高脂衰老组大鼠在接受DR7干预后，海马体中神经递质与细胞凋亡基因表达情况为IDO与P35表达下降，同时TPH1的表达升高，表明DR7对5-羟色胺与氧化衰老相关途径具有重要的调节作用。由此可见，这些研究均为Lactobacillus plantarum DR7作为未来重要的饮食干预策略来提升衰老过程中的认知功能应用提供了实施例。

对Drosophila melanogaster AD模型研究结果表明DR7具备的逆转AD的潜在生物学特性。添加益生菌可以挽救AD模型中形成的粗糙眼型(REP)，而Lactobacillusplantarum DR7的干预实验发现对该过程有着更为积极的效果。

实施例4：Lactobacillus plantarum DR7的代谢产物HICA与PLA及其健康功效。

AMPK作为重要的生物学开关掌管了许多生物学通路与代谢通路，因此也作为重要的靶向代谢物用以评价DR7的生物学功能。因此也研究了L.plantarum DR7代谢对5’磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化的作用。杜尔贝科改良基本培养基(DMEM)作为对照，用来比较分析L.plantarum代谢产生的脂质，蛋白质及多糖等物质的含量比例。在图15A中标注了从L.plantarum代谢物中分离的脂质含量分数可以看出具有较高AMPK磷酸化活性，推测高AMPK磷酸化活性与脂质含量密切相关。脂质部分进一步纯化，鉴定。在图15B中展示，天然DR7无细胞上清液中的磷酸化活力与商业化AMPK活化剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)进行对比的数据。另一方面，L.plantarum代谢物与商业AMPK抑制剂，复合物C以及加入无细胞上清的复合物C，对比其磷酸化活性。天然DR7无细胞上清液增加了AMPK磷酸化活力水平的能力近似于AICAR，在添加了复合物C之后减损了其活力。

L.plantarum DR7代谢物中的脂质部分检测采用GC-MS分析，不同的峰值与空白的未发酵MRS培养基进行对比(图16)。两个特异强峰在色谱图(b)中显示，分别为2-羟基异己酸(HICA)与3-苯乳酸(PLA)。对于DR7所表现的抗衰老作用，HICA与PLA则作为其执行抗衰老作用的重要代谢产物。

为了检验上述两个产物是由DR7代谢产生，对该物质的代谢通路进行了评估。亮氨酸是形成HICA的前体物质，基于KICA的转化，通过HaDH酶激活。转录HaDH的基因在DR7全基因序列中被发现(蛋白ID AYA79606.1)。苯基丙氨酸是形成PLA的前体物质，基于PPA的转化，通过HPT,LDH,AAT酶激活。转录HPT的基因(蛋白ID AYA81108.1),转录AAT的基因(蛋白ID AYA79202.1),转录LDH的基因(蛋白ID AYA79316.1)在DR7全基因序列中被发现。这些基因的发现以及由FAME分析检测的HICA与PLA，均确认了HICA与PLA是DR7的代谢产物。

实施例5：Lactobacillus plantarum DR7通过抑制端粒缩短与增强能量代谢发挥抗衰老的作用

经12周实验期后，采集大鼠血液检测其端粒长度，见图17。结果显示，D-半乳糖介导的衰老大鼠端粒长度显著低于青年大鼠(P<0.05)。同时，衰老大鼠端粒长度也显著低于经他汀与DR7干预的衰老大数组(P<0.05)。

跑步机疲劳测试数据统计分析用以评价12周实验期后大鼠的耐力情况。跑步时间，距离最高时速均在精疲力竭后进行统计估算出最大耐力值。如图18所示，衰老组耐力(距离，跑步持续时间，速度，功与功率)显著低于青年组(P<0.05)。结果显示，衰老-DR7组耐力评价中的功与功率显著高于衰老组(P<0.05)。衰老-DR7组跑步距离与速度的均显著高于其它组，跑步距离显著高于衰老组(P<0.05)。

结论：

雄性SD大鼠饲喂高脂饮食(54％kcal脂肪)同时每天注射D-半乳糖持续12周造衰老模型。DR7菌株对衰老导致的缺陷病变的作用，从如端粒长度，血浆中脂质过氧化，肝脏AMPK表达，以及肌肉性能等方面进行评价。用他汀与Lactobacillus plantarum DR7(LP-DR7)干预，显著降低端粒的缩短，提升了AMPK-α2亚基的表达。与对照组相比，AMPK-α1亚基表达也在LP-DR7干预下提升，而他汀组并未表现出此功能。类似的是，通过对跑步距离，持续时间，速度，功与功率指标与对照组进行对比发现，DR7干预下增加了肌肉性能，而他汀组并未表现出此功能。通过衰老大鼠模型的体内实验研究发现，DR7具有缓解与衰老相关的缺陷病变作用。

实施例6：Lactobacillus plantarum DR7调节肝脏脂质与能量代谢对降低甘油三酯水平，炎症及脂质堆积的作用

对乳杆菌菌株的筛选基于对胆固醇的同化作用力，与对照相比(图19A；p<0.05)。L.plantarum DR7就是其中一株展现出对总胆固醇高降解力的菌株，采用含有胆固醇胶质培养基，随后进行下一步分析。DR7的CFS显著降低胆固醇在HT-29细胞中的累积(p<0.05)与对照相比(图19B,C)同时降低(p<0.05)HepG2细胞中胆固醇累积(约19.7％)与对照相比。L.plantarum DR7的CFS(CFS-DR7)降低HT-29细胞与HepG2细胞中胆固醇累积，接下来进行下一步分析。肝脏是控制胆固醇稳态的重要器官，不同浓度的CFS-DR7用来评价HepG2细胞中胆固醇的累积与HMGCR mRNA(胆固醇合成限速酶)的表达。浓度设置为10％-50％(v/v)，高于50％的浓度也不会导致细胞的凋亡(数据未展示)。洛伐他汀(1μM)作为阳性对照。在所有浓度下，HepG2细胞中胆固醇的累积均显著降低，与洛伐他汀的结果相似(图19D；p<0.05)。但是，只有30％浓度的CFS-DR7促使HMGCR mRNA的表达下降(图19E；p<0.05)。因此，选取30％浓度的CFS-DR7进行下一步分析。探究在AMPK抑制剂(复合物C，10μM；作为阴性对照)，AMPK激活剂(AICAR,1mM；作为阳性对照)存在的情况下，CFS-DR7对HMGCR mRNA表达量的作用(图19F)。CFS-DR7，30％浓度，显著降低HMGCR mRNA的表达(p<0.05)与对照相比，实验条件为37℃，3h。该降低幅度与阳性对照(1mM AICAR；p<0.05)相比具有统计学上的优势，洛伐他汀(1μM)对HMGCR mRNA的表达没有显著作用(p>0.05)。复合物C(10μM)显著增加了HMGCR mRNA的表达(p<0.05)与对照相比。CFS-DR7处理HepG2细胞，在复合物C(10μM)存在的情况下，HMGCR mRNA的表达与对照相比仍旧显著升高(p<0.05)，表明学弱了CFS-DR7的作用。我们进而假设CFS-DR7调节HMGCR表达是通过增强AMPK的表达。但是CFS-DR7并未影响AMPK mRNA的表达(图19G)，表明该调节作用是在转录之后进行的。因此，我们进一步分析了CFS-DR7对AMPK的磷酸化作用。通常，AMPK磷酸化可引导酶的激活，去磷酸化使之失活。我们先前的数据显示，CFS-DR7显著增加(p<0.05)AMPK磷酸化，与AMPK激活剂(AICAR；图18H)作用相当，而在添加AMPK抑制剂(化合物C)则抵消了该作用。CFS-DR7显著增加(p<0.05)AMPK磷酸化水平高于洛伐他汀(1μM)。这里，我们提出了通过使用源自DR7的CFS，靶向AMPK磷酸化通路，可以改变胆固醇代谢。

如DR7在体外实验，动物实验中所表现出强大的调节脂质代谢的能力。大鼠在接受为期12周的实验后，血清中甘油三酯(TG)水平值如图19I。结果显示在摄入高脂饮食(HFD)下，大鼠血清中甘油三酯水平显著提高(p<0.05)。只有HFD-DR7组与HFD组相比甘油三酯水平显著降低(p<0.05)。TG是CVD与糖尿病及非酒精性脂肪肝(NAFLD)中的重要标志物。

硬脂酰辅酶A脱氢酶1(SCD1)是催化合成单一不饱和脂肪酸(MUFA)的酶，是调节肝脏脂质合成与β氧化的关键控制点。SCD1酶在HFD-DR7组中被显著(p<0.05)下调了(图20A)与HFD组相比。因此，L.plantarum DR7通过下调SCD1基因表达来发挥其降TG的作用。与ND组相比，HFD组IL-6基因表达显著降低(p<0.05)，L.plantarum DR7干预可显著提高IL-6基因表达(p<0.05；图20B)。ABCG5与ABCG8是ABC转运蛋白的一半大小，作为二聚体执行其调节肝脏***固醇类物质的功能(ABCG5/G8)。高脂饮食显著降低ABCG5与G8的mRNA表达(p<0.05；图20C,D)，而L.plantarum DR7干预可显著上调ABCG5与ABCG8 mRNA表达(p<0.05)。

HFD组SR-B1与LDL-R表达显著低于ND组(p<0.05；图21A,B)。HFD-DR7组则显著高表达SR-B1与LDL-R(p<0.05)。ABCA1 mRNA表达在ND与HFD组之间无显著差异。但是，HFD-他汀与HFD-DR7组则显著高表达ABCA1(p<0.05)与HFD组相比(图21C)。与HFD组相比，他汀与HFD-DR7组均增高Apo-A1水平(图21D)。

AMPKα1与AMPKα2的mRNA在HFD组中均显著降低，与ND组相比(图22)。与HFD组相比，HFD-DR7组则表现出显著高表达AMPKα1与AMPKα2。因此，L.plantarum DR7可能通过下调SCD1基因表达来激活AMPK。

图23表示与ND组相比，IL-4在HFD组中显著增高。与HFD组相比；HFD-他汀与HFD-DR7组的IL-4水平较低(p<0.05)。

与ND组相比，HFD组中具有较高程度的脂质堆积与较少的组织结构(图24A,B)。与HFD组相比，HFD-他汀与HFD-DR7组则表现出较少的脂质堆积(图24C,D)。HFD-DR7与其它实验组相比具有更好的组织结构。

结论：

Lactobacillus plantarum DR7的无细胞上悬液(CFS)表现出同化胆固醇的高能力，降低HepG2细胞与HT-29细胞中胆固醇的累积，降低HepG2细胞HMG-CoA还原酶(HMGCR)mRNA表达。HMGCR表达降低现象被AMPK抑制剂的出现所抵消，推测L.plantarum DR7是通过AMPK通路来执行其功能，尤其是通过增强HepG2细胞中AMPK磷酸化而非通过影响AMPK mRNA表达。总结以上，研究说明L.plantarum DR7通过AMPK通路发挥其降胆固醇的作用，尤其是通过AMPK磷酸化致使HMGCR表达降低。

DR7被用于针对缓解高血脂与脂肪肝病症的衰老大鼠模型，验证是否经由AMPK途径产生作用。雄性SD大鼠经过12周的高脂饮食(HFD)与每日注射D-半乳糖构造衰老动物模型。实验处理包括ⅰ)正常饮食，ⅱ)HFD，ⅲ)HFD-他汀(洛伐他汀2mg/kg/日)，ⅳ)HFD-Lactobacillus plantarum DR7(10log CFU/日)。经过12周实验期，与HFD对照组相比，L.plantarum DR7干预降低血清中甘油三酯水平。与对照相比，L.plantarum DR7干预更为积极的效果从肝脏组织中基因表达中发现；下调了肝脏脂质合成与β氧化基因SCD1，上调了肝脏固醇分泌基因ABCG5与ABCG8，更低的肝脏脂肪化，上调肝脏能量代谢基因AMPKα1与AMPKα2。总结以上，该研究证明了DR7菌株经由增强能量与脂质代谢活力，提高脂质代谢，表明DR7作为天然干预途径对缓解心血管及肝脏疾病具有良好的应用前景。

实施例7.Lactobacillus plantarum DR7对肠道菌群失衡和代谢物浓度的调节作用。

衰老过程中，放线菌的数量逐渐减少，无论是否存在HFD(p<0.05；图25a)。DR7干预可阻止饲喂HFD的衰老大鼠放线菌的数量减少(p<0.05)。放线菌，以及它的初级菌属Bifidobacterium被通常认为与健康的肠道菌群构型相关。因此，DR7提升了衰老大鼠肠道中的健康态。拟杆菌在衰老-ND组中较高(p<0.05)与青年-ND组相比，而硬壁菌门则在所有处理组中没有显著差异(图25b，c)。D-半乳糖诱导发生硬壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B比例)显著降低(p<0.05)，而L.plantarum DR7干预显著提高了HFD衰老大鼠的F/B比例，且近似于青年-ND组(图25d)。

高脂饮食大鼠的粪便中乙酸盐浓度显著降低。他汀与L.plantarum DR7组则展现出较高的乙酸盐浓度(图26)。乙酸盐常被报道具有降低血浆以及肝脏中脂肪酸，胆固醇的含量，提高胰岛素的敏感性。也有报道称乙酸盐可以降低腔内的pH值，抑制致病菌增殖，维持肠道的屏障功能。

肠道菌群的代谢产物对于宿主健康与疾病有直接作用。L.plantarum DR7干预可以提高粪便中必需氨基酸如色氨酸，亮氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸与赖氨酸的含量(图27)，而这些氨基酸对于宿主体内氨基酸平衡与健康起到至关重要的作用。如图28所示，L.plantarum DR7干预可以改变肠道菌群的分布。

结论：

雄性SD大鼠12周连续饲喂高脂饮食同时注射D-半乳糖构建衰老模型。研究Lactobacillus plantarum DR7对粪便菌群结构，短链脂肪酸与水溶性组分的作用。结果发现菌株干预可以改变肠道菌群的多样性以及组成结构，无论是在菌门水平上亦或是代谢水平上。对粪便中水溶性代谢物分析揭示了L.plantarum DR7干预可以提高诸如色氨酸，亮氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸与赖氨酸等氨基酸的代谢。

实施例8.含有Lactobacillus plantarum DR7的组合物

表4

备注：以上所提及的文章内容中的材料与方法在本章节中所使用到的，均以完全引用的形式合并到本文中。

序列表自由文本

序列表

Claims (16)

1.一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号为CGMCC15535，全基因组序列上传于GenBank，登录号为CP031318，其代谢产物包括2-羟基异己酸与3-苯乳酸。

2.根据权利要求1中的菌株，菌株或其代谢产物用于预防与治疗上呼吸道感染。

3.根据权利要求1中的菌株，菌株或其代谢产物用于预防与治疗记忆与认知功能障碍、压力与焦虑。

4.根据权利要求1中的菌株，菌株或其代谢产物用于预防与治疗神经退行性疾病。

5.根据权利要求4中的菌株，其中的神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

6.根据权利要求1中的菌株，菌株或其代谢产物用于减缓衰老迹象。

7.根据权利要求1中的菌株，菌株或其代谢产物用于预防与治疗高脂血症、肝脏脂肪累积与脂肪代谢。

8.根据权利要求7中的菌株，菌株或其代谢产物用于预防与治疗非酒精性脂肪肝病。

9.根据权利要求1中的菌株，菌株或其代谢产物用于预防与治疗心血管疾病与降低胆固醇。

10.根据权利要求1中的菌株，作为益生菌用于肠道菌群失衡与代谢产物浓度的肠道调节。

11. 一种包含权利要求1中所述菌株的组合物，其中所述菌株经冷冻干燥且在组合物中的数量在10⁴与10¹² cfu/g之间。

12.如权利要求11所述的组合物，包含菌株代谢产物，其中代谢产物包括2-羟基异己酸与3-苯乳酸。

13.根据权利要求11-12中所述的任一组合物，所述组合物的形式选自下组：食品补充剂、药剂和婴幼儿配方。

14.根据权利要求11-12中所述的任一组合物，所述组合物的形式为可食用产品。

15.根据权利要求11-12中所述的任一组合物，所述组合物的形式为食品产品。

16.根据权利要求13中所述的组合物，所述组合物的形式为片剂、胶囊或丸剂。

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