CN112924578B - 同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法，其步骤包括:分别测定纤维素酶溶液及半纤维素酶溶液的单糖或多糖特征峰；取纤维素标样加入纤维素酶溶液反应，取半纤维素标样加入半纤维素酶反应，HPLC检测，计算得出半纤维素对应的特征峰面积的标准曲线A的公式以及纤维素水解产生的葡萄糖特征峰面积的标准曲线D的公式；取桃果实的果肉，用淀粉酶处理，然后离心取沉淀物；沉淀物中同时加入纤维素酶溶液和半纤维素酶溶液，反应后HPLC检测，根据公式A计算得到半纤维素含量，根据公式D的计算得到纤维素含量。本发明可同时水解纤维素和半纤维素，并分别推算出纤维素和半纤维素的含量。步骤简单，检测结果可靠。

Description

同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法
技术领域
本发明涉及到一种同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法。
背景技术
纤维素与半纤维素共同存在于大多数植物细胞壁中。纤维素全部由葡萄糖单位聚合而成，而半纤维素是一种杂聚多糖，常含有木糖，甘露糖，半乳糖，鼠李糖，***糖等单糖单位。在酸性环境下半纤维素远较纤维素易于水解。半纤维素比纤维素的分子要小，大约含有500到3000个单糖单位，后者大约含有7000到15000个。半纤维素是分支的聚糖，而纤维素是不分支的。半纤维素具有亲水性能，可以造成细胞壁的润胀。
现行所有标准中关于纤维素和半纤维素检测和定量的方法是使用硫酸重铬酸钾氧化-硫酸亚铁滴定的氧化还原滴定法及由美国国家可再生能源实验室(NREL)开发的采用两步酸水解***分析纤维中3大组分质量分数的方法。重铬酸钾法先在低温下使用高浓度硫酸将纤维转化为低聚糖,然后在高温下使用稀酸将低聚糖进一步转化为单糖,通过分析单糖确定纤维素和半纤维素的量,并且通过对酸水解液采用UV检测确定酸溶木质素的质量分数。然而，重铬酸钾有剧毒，硫酸危险性较大，且桃果实中成分复杂，含有酚类等易被氧化物质，均可被硫酸重铬酸钾氧化而对纤维素的测定产生干扰，因此，此方法不适用于桃果实中纤维素的检测。美国国家可再生能源实验室(NREL)的方法需要先烘干样品水分，还需要依次用浓硫酸和稀酸两部水解，同时需要高温加热，热处理时间长。
中国专利文献CN101726565A-乳制品中微晶纤维素的检测方法及其应用公开了一种利用纤维素酶水解奶制品中的纤维素并测定含量的方法。但桃果实与乳制品不同，含有纤维素、半纤维素、淀粉等多糖。纤维素酶很难提纯，市面上销售的纤维素酶含有淀粉酶和半纤维素酶等，水解桃果肉样品时对淀粉和半纤维素的水解具有不可控性，无法准确根据水解产物计算纤维素含量，因此此方法不适合桃果实中纤维素、半纤维素的测定。
纤维素水解产物为葡萄糖，半纤维素水解产物为包含葡萄糖在内的多种糖，因此同时水解纤维素与半纤维素的产物中的葡萄糖不能直接用来推算纤维素含量。
目前，桃果实中分别检测纤维素和半纤维素的方法尚为空白，同时检测纤维素和半纤维素的方法更属首创。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法，从而弥补桃果实中纤维素、半纤维素检测方法的空白。
本发明采用的技术方案为：
一种同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法，其步骤包括:
(1)排除酶溶液本身对HPLC结果的干扰：用HPLC法分别测定纤维素酶溶液以及半纤维素酶溶液的单糖或多糖特征峰；
(2)制作标准曲线及同时水解计算纤维素、半纤维素含量公式的获得：取纤维素标样加入与步骤(1)中浓度相同的纤维素酶溶液反应，取半纤维素标样加入与步骤(1)中浓度相同的半纤维素酶反应，然后分别进行HPLC检测，检测结果去除步骤(1)中酶溶液本身对HPLC结果的干扰后，计算得出半纤维素对应的特征峰面积的标准曲线A的公式：Y1＝(X1-a1)*b1/100*10/M
上式中X1为出峰时间Ⅰ对应的峰面积，Y1为半纤维素含量(g/ml)，a1为标准曲线A的截距，b1为标准曲线A的系数，M为桃果肉样品质量，其中出峰时间Ⅰ的选择标准为：1、与半纤维素含量成线性关系，相关系数>0.95；2、与纤维素水解物不重合；
以及通过特征峰面积推算葡萄糖特征峰面积的公式B：
YP＝X1*ap
上式中YP为半纤维素水解产物中葡萄糖峰面积，ap为半纤维素水解产物中葡萄糖峰面积与出峰时间Ⅰ峰面积的比值；
再计算纤维素对应的葡萄糖特征峰面积的标准曲线C的公式：
Y2＝(X2-a2)*b2/100*10/M
上式中X2为单独水解纤维素时水解产物出峰时间Ⅱ对应的峰面积，a2为标准曲线C的截距，b2为标准曲线C的系数，Y2为单独水解纤维素时纤维素含量(g/ml)，M为桃果肉样品质量；
最后通过计算混合纤维素酶及半纤维素酶同时水解纤维素、半纤维素产物特征峰面积，获得纤维素水解产生的葡萄糖特征峰面积的标准曲线D的公式：
Y3＝(X3-YP-a2)*b2/100*10/M
得到纤维素含量，上式中X3为同时水解纤维素、半纤维素时出峰时间Ⅱ峰面积,Y3为同时水解纤维素、半纤维素时纤维素含量(g/ml)；
(3)前处理：取桃果实的果肉，用淀粉酶处理，然后离心取沉淀物；
(4)沉淀物中同时加入与步骤(1)中浓度相同的纤维素酶溶液和半纤维素酶溶液，反应后HPLC检测，根据步骤(2)得到的半纤维素标准曲线A的公式计算得到半纤维素含量，根据纤维素标准曲线D的公式计算得到纤维素含量。
优选的，步骤(2)和(4)中反应条件为pH4.8、50℃水浴，反应时间以及纤维素酶和半纤维素酶的添加量为至少将样本中的纤维素和半纤维素酶解完全，用柠檬酸来调整酶溶液的pH值。
优选的，所述步骤(2)和(4)中反应时间为2h，纤维素酶和半纤维素酶的添加量为每1g果肉至少添加纤维素酶250u、半纤维素酶250u。
优选的，步骤(3)中，将果肉用液氮冷冻后粉碎，再加入淀粉酶处理；液氮冷冻后粉碎，可以使细胞壁破裂，细胞内容物完全释放，细胞内含有的糖在后续的离心步骤中去除，防止对最终的结果造成影响；如果采用其他方法例如匀浆或超声处理细胞，会留存有完整细胞，导致细胞内液泡的物质(主要是糖)不能完全释放，到最后酶解纤维素、半纤维素后细胞壁解体，细胞内糖释放出来，会干扰到HPLC检测结果。
优选的，步骤(3)淀粉酶的添加量为至少将果肉的淀粉完全酶解，加水后超声振荡，然后45℃水浴反应至果肉中的淀粉完全酶解，10000r离心10min，弃上清，ddH2O清洗沉淀物。通常而言，每g果肉中加入1u淀粉酶的量反应1h是可以达到酶解完全的要求的。
本发明从纤维素、半纤维素的结构特征出发，针对桃果实营养成分组成结构和特点，化繁为简去除能够干扰纤维素和半纤维素检测的组分，同时通过预实验，分别获得桃半纤维素和纤维素水解产物特征图谱和半纤维素和纤维素计算公式，排除了同时水解纤维素和半纤维素时产物的相互干扰，可同时水解纤维素和半纤维素，并分别推算出纤维素和半纤维素的含量。为桃果实中纤维素、半纤维素的检测探索了一种可靠、灵敏、便捷、安全的新方法。同时本发明方法还具有人工成本较低、步骤简单、适合大批量样品检测、废弃物排放环保等有益效果。
附图说明
图1为前处理前后样品糖、多糖残留对照。
图2为半纤维素酶水解半纤维素标样产物图谱。
图3为纤维素酶水解纤维素标样与纤维素酶溶液对照。
图4为半纤维素酶溶液图谱。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1
(1)排除酶溶液本身对HPLC测定结果的干扰：
称取纤维素酶0.025g，半纤维素酶0.0125g(纤维素酶和半纤维素酶均购自上海源叶生物科技有限公司，货号：s10043、s10045)，分别定容至10ml，经0.22um孔径水系滤头过滤，HPLC测定，结果显示使用的半纤维素酶基本无干扰峰(图4)，纤维素酶溶液在5.067～9.375min依次存在5个峰，其中9.375min为葡萄糖特征峰(图3)。计算该葡萄糖特征峰面积，在纤维素水解产物特征峰面积中减去纤维素酶溶液中葡萄糖的特征峰面积；
(2)制作标准曲线：
称取纤维素、半纤维素标样各0.5、0.2、0.1、0.05、0.01g，分别用25u/ml纤维素酶溶液和半纤维素酶溶液(PH4.8)混匀定容至10ml。50℃水浴20h。吸取上清液经0.22um孔径水系滤头过滤，HPLC检测。
半纤维素水解产物特征峰如图2所示，可以看出，在出峰时间Ⅰ、4.755min、7.541min、9.398min、12.449min时有分离较好的特征峰，其中出峰时间Ⅰ特征峰与纤维素酶溶液、纤维素水解产物特征峰均无重合，可作为衡量计算半纤维素的特征峰。
经计算，得出半纤维素对应的特征峰面积的标准曲线公式A：
Y1＝(X1-1191.94)/49334.9281/100*10/M
相关系数：0.99213
公式中X1为出峰时间Ⅰ峰面积，Y1为半纤维素含量(g/ml)，M为桃果肉样品质量。
以及通过特征峰面积推算葡萄糖特征峰面积的公式B：
YP＝X1/8897.5*26079.4
公式中YP为半纤维素水解产物中葡萄糖峰面积，X1为出峰时间Ⅰ峰面积，ap为半纤维素水解产物中葡萄糖峰面积与出峰时间Ⅰ峰面积的比值。
纤维素水解产物特征峰如图3所示，可以看出，在出峰时间Ⅱ有纤维素水解产物葡萄糖特征峰，其余为纤维素酶水溶液特征峰。需要注意的是本实验使用的纤维素酶水溶液含有少量葡萄糖，会干扰结果，因此需要计算纤维素酶水溶液中葡萄糖含量，并在纤维素水解产物中扣除。
经计算，纤维素对应的葡萄糖特征峰面积的标准曲线公式C：Y2＝(X2-1609.87)/39896.9234/100*10/M
相关系数：0.99900
公式中X2为单独水解纤维素时水解产物出峰时间Ⅱ峰面积，Y2为单独水解纤维素时纤维素含量(g/ml)，M为桃果肉样品质量。
(3)桃果实液氮冷冻后粉碎，称取1g粉末样品，加入含有淀粉酶(1u)的超纯水(PH6.0)定容至10ml，超声波仪超声震荡10min，45℃水浴1h，10000r离心10min。弃上清，沉淀物用超纯水洗2～3遍。
桃果实中主要可溶性糖(糖醇)为蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇，占比超过99％。从图1(桃果实液氮冷冻后粉碎，称取1g粉末样品，加入超纯水(PH6.0)定容至10ml，超声波仪超声震荡10min，45℃水浴1h，10000r离心10min。取上清经0.22um孔径水系滤头过滤，HPLC检测获得图1)可以看出，通过前处理降低了样品中可溶性糖(糖醇)和淀粉99％以上，基本去除了样品中可溶性糖(糖醇)和淀粉的本底值，从而达到提高检测准确性和灵敏度的目的。
(4)在沉淀物中同时加入半纤维素酶和纤维素酶(纤维素酶和半纤维素酶均购自上海源叶生物科技有限公司，货号：s10043、s10045)溶液各5ml(纤维素酶浓度25u/ml，半纤维素酶浓度25u/ml)，50℃水浴20h。
吸取上清液经0.22um孔径水系滤头过滤，HPLC检测。
根据公式A：Y1＝(X1-1191.94)/49334.9281/100*10/M计算得出半纤维素含量。
根据公式D：Y3＝(X3-X1/8897.5*26079.4-1609.87)/39896.9234/100*10/M得到纤维素含量。公式中X3为同时水解纤维素、半纤维素时出峰时间Ⅱ峰面积,Y3为同时水解纤维素、半纤维素时纤维素含量(g/ml)。

Claims (6)

1.一种同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法，其步骤包括：
（1）排除酶溶液本身对HPLC结果的干扰：用HPLC法分别测定纤维素酶溶液以及半纤维素酶溶液的单糖或多糖特征峰；
（2）制作标准曲线及同时水解计算纤维素、半纤维素含量公式的获得：取纤维素标样加入与步骤（1）中浓度相同的纤维素酶溶液反应，取半纤维素标样加入与步骤（1）中浓度相同的半纤维素酶反应，然后分别进行HPLC检测，检测结果去除步骤（1）中酶溶液本身对HPLC结果的干扰后，计算得出半纤维素对应的特征峰面积的标准曲线A的公式： Y1=(X1-a1)*b1/100*10/M
上式中X1为出峰时间Ⅰ对应的峰面积，Y1为半纤维素含量，单位为g/ml，a1为标准曲线A的截距，b1为标准曲线A的系数，M为桃果肉样品质量，其中出峰时间Ⅰ的特征峰即为半纤维素的特征峰；
以及通过特征峰面积推算葡萄糖特征峰面积的公式B：
YP=X1*ap
上式中YP为半纤维素水解产物中葡萄糖峰面积，ap为半纤维素水解产物中葡萄糖峰面积与出峰时间Ⅰ峰面积的比值；
再计算纤维素对应的葡萄糖特征峰面积的标准曲线C的公式：
Y2=（X2-a2）*b2/100*10/M
上式中X2为单独水解纤维素时水解产物出峰时间Ⅱ对应的峰面积，a2为标准曲线C的截距，b2为标准曲线C的系数，Y2为单独水解纤维素时纤维素含量，单位为g/ml，M为桃果肉样品质量，其中出峰时间Ⅱ的特征峰即为葡萄糖的特征峰；
最后通过计算混合纤维素酶及半纤维素酶同时水解纤维素、半纤维素产物的特征峰面积，获得纤维素水解产生的葡萄糖特征峰面积的标准曲线D的公式：
Y3=（X3-YP-a2）*b2/100*10/M
得到纤维素含量，上式中X3为同时水解纤维素、半纤维素时出峰时间Ⅱ峰面积, Y3为同时水解纤维素、半纤维素时纤维素含量，单位为g/ml；
（3）前处理：取桃果实的果肉，用淀粉酶处理，然后离心取沉淀物；
（4）沉淀物中同时加入与步骤（1）中浓度相同的纤维素酶溶液和半纤维素酶溶液，反应后HPLC检测，根据步骤（2）得到的半纤维素标准曲线A的公式计算得到半纤维素含量，根据纤维素标准曲线D的公式计算得到纤维素含量。
2.根据权利要求1所述的同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法，其特征在于：步骤（2）和（4）中反应条件为pH4.8、50℃水浴，反应时间以及纤维素酶和半纤维素酶的添加量为至少将样本中的纤维素和半纤维素酶解完全。
3.根据权利要求2所述的同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）和（4）中反应时间为2h，纤维素酶和半纤维素酶的添加量为每1g果肉至少加入纤维素酶250u、半纤维素酶250u。
4.根据权利要求1所述的同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，将果肉用液氮冷冻后粉碎，再加入淀粉酶处理。
5.根据权利要求4所述的同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法，其特征在于：步骤（3）淀粉酶的添加量为至少将果肉的淀粉完全酶解，加水后超声振荡，然后45℃水浴反应至果肉中的淀粉完全酶解，10000r离心10min，弃上清，ddH2O清洗沉淀物。
6.根据权利要求5所述的同时测定桃果实中半纤维素和纤维素的检测方法，其特征在于：步骤（3）淀粉酶的添加量为每1g果肉中至少加入1u的淀粉酶，反应时间为1h。
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