CN112921058B - 黑曲霉发酵产柠檬酸的方法 - Google Patents

黑曲霉发酵产柠檬酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112921058B
CN112921058B CN201911235659.4A CN201911235659A CN112921058B CN 112921058 B CN112921058 B CN 112921058B CN 201911235659 A CN201911235659 A CN 201911235659A CN 112921058 B CN112921058 B CN 112921058B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aspergillus niger
fermentation
medium
culture
primary
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911235659.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112921058A (zh
Inventor
熊结青
刘梦涵
杨儒文
佟毅
李义
朱光耀
卜庆阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cofco Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Cofco Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cofco Biotechnology Co Ltd filed Critical Cofco Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201911235659.4A priority Critical patent/CN112921058B/zh
Publication of CN112921058A publication Critical patent/CN112921058A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112921058B publication Critical patent/CN112921058B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，公开了一种黑曲霉发酵产柠檬酸的方法，其中，该方法包括：将黑曲霉接种于一级种子培养基中进行培养，制备含有黑曲霉菌球的一级种子液；将所述一级种子液中的黑曲霉菌球进行分散处理，使黑曲霉菌球形成平均长度为20‑40μm的菌丝；将经分散处理后的一级种子液接种于二级种子培养基中进行培养，制备含有黑曲霉菌球的二级种子液，二级种子液中的黑曲霉菌球的平均直径为30‑50μm；将含有黑曲霉菌球的二级种子液接种于发酵培养基进行柠檬酸发酵。本发明的方法降低了黑曲霉种子制作量，缩短了黑曲霉种子制作周期，提高了黑曲霉种子质量稳定性，使用本发明的黑曲霉种子发酵柠檬酸，产量和发酵转化率均较高。

Description

黑曲霉发酵产柠檬酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地涉及一种黑曲霉发酵产柠檬酸的方法。
背景技术
柠檬酸发酵采用黑曲霉二级发酵方式，即先培养成熟的种子，然后再将成熟的种子液转接发酵柠檬酸。黑曲霉种子培养过程首先需要培养成熟的黑曲霉孢子，然后再将孢子转接培养得到成熟的种子。在工业化生产中需要制备大量成熟的孢子，而目前生产上大多采用三角瓶固态培养，制备过程繁琐且周期长，一批成熟的孢子制备周期至少10天以上。由于黑曲霉孢子的制作量大，且培养周期长，导致每批孢子的质量不能保持稳定，合格率为50-100％，质量波动比较大。当使用合格率低的批次进行后续工艺时，则可能对柠檬酸的发酵产生极为不利的影响。
另外，种子制备过程的成本在整个柠檬酸生产过程占据比较大的比例。以每月1万吨柠檬酸的产量来说，以三角瓶固态培养的方式制备种子，则每月用水量为420m3，用汽量为810吨，三角瓶损耗约1500个/月。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的黑曲霉种子制作量大，制作周期长且质量不稳定的问题，提供一种黑曲霉扩培并用于柠檬酸发酵的方法及黑曲霉，实现降低黑曲霉种子制作量和制作周期，提高黑曲霉种子质量稳定性的目的。
为了实现上述目的，本发明提供一种黑曲霉发酵产柠檬酸的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(1)将黑曲霉接种于一级种子培养基中进行一级培养，制备含有黑曲霉菌球的一级种子液；
(2)将所述一级种子液中的黑曲霉菌球进行分散处理，以使黑曲霉菌球形成尺寸变小的菌丝，分散处理的条件使得所述菌丝的平均长度为20-40μm；
(3)将经分散处理后的一级种子液接种于二级种子培养基中进行二级培养，制备含有黑曲霉菌球的二级种子液，所述二级培养的条件使得二级种子液中的黑曲霉菌球的平均直径为30-50μm；
(4)将含有黑曲霉菌球的二级种子液接种于发酵培养基进行柠檬酸发酵。
使用本发明的技术方案，降低了黑曲霉种子制作量，缩短了黑曲霉种子的制作周期，同时提高了黑曲霉种子质量稳定性，使用本发明的黑曲霉种子发酵柠檬酸，柠檬酸产量可达187g/L，发酵转化率可达到104％。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，将菌球在水平面上投影面积最大的投影上距离最远两点间的连线距离作为菌球的直径。“cfu”是指菌落形成单位，可以通过平板菌落计数法测得。
在本发明中，种子液中黑曲霉菌球含量的测定方法为显微镜血球计数板计数。
在本发明中，黑曲霉菌球直径的测定方法为将种子液进行稀释，在血球计数板上滴一滴稀释后的种子液，用自带尺寸的显微镜下进行观察，使血球计数板上的菌球数为30-50个，并且各菌球之间不相互接触，分别对该范围内的菌球进行直径测量，然后计算菌球直径的平均值。
菌丝的平均长度的测定方法为将种子液进行稀释，在血球计数板上滴一滴稀释后的种子液，用自带尺寸的显微镜下进行观察，使血球计数板上的菌丝数为30-50根，并且各菌丝之间不相互接触，分别对该范围内的菌丝进行长度测量，然后计算菌丝长度的平均值。
本发明提供一种黑曲霉发酵产柠檬酸的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(1)将黑曲霉接种于一级种子培养基中进行一级培养，制备含有黑曲霉菌球的一级种子液；
(2)将所述一级种子液中的黑曲霉菌球进行分散处理，以使黑曲霉菌球分散成菌丝，分散处理的条件使得所述菌丝的平均长度为20-40μm；
(3)将经分散处理后的一级种子液接种于二级种子培养基中进行二级培养，制备含有黑曲霉菌球的二级种子液，所述二级培养的条件使得二级种子液中的黑曲霉菌球的平均直径为30-50μm；
(4)将含有黑曲霉菌球的二级种子液接种于发酵培养基进行柠檬酸发酵。
根据本发明，对所述一级种子培养基中黑曲霉的接种量没有特别的限制，但为了提高黑曲霉的成球率，优选地，步骤(1)中，相对于1mL所述一级种子培养基，黑曲霉的接种量为1×104-1×107cfu，更优选为5×106-8×106cfu。
根据本发明，可以使用黑曲霉菌丝体或孢子对一级种子培养基进行接种，为了利于培养过程中形成菌球并提高成球率，优选地，使用黑曲霉孢子对一级种子培养基进行接种。
根据本发明，所述一级培养的条件可以为能使黑曲霉在一级种子培养基中正常生长的培养条件，但为了有利于形成黑曲霉菌球并提高成球率，优选地，一级培养的条件包括：温度为30-35℃，起始pH值为5-6，转速为300-500rpm，培养时间为20-30h。本发明中，对一级培养过程中的种子液的pH值不作限制，随着一级培养的进行，一级种子液的pH值逐渐降低。
根据本发明，对所述含有黑曲霉菌球的一级种子液中黑曲霉菌球的含量和黑曲霉菌球的平均直径没有特别的限制，但为了提高含有黑曲霉菌球的一级种子液中黑曲霉的活菌数和黑曲霉菌球整体的活性，优选地，所述含有黑曲霉菌球的一级种子液中黑曲霉菌球的平均直径为150-200μm。
根据本发明，优选地，步骤(2)中，所述分散处理的条件使得所述菌丝平均长度为25-35μm。
根据本发明，对所述分散处理的方式没有特别的限制，优选地情况下，所述分散处理的方式包括使一级种子液和微珠混合进行共振荡。
根据本发明，优选地情况下，相对于100mL含有黑曲霉菌球的一级种子液，微珠的用量为50-300粒，更优选为80-150粒。
根据本发明，优选地情况下，所述微珠的直径为2-5mm。
根据本发明，优选地情况下，所述微珠可以为玻璃微珠或陶瓷微珠。
根据本发明，对所述共振荡的实施方式没有特别的限制，可以借助振荡器进行实施，优选地，所述振荡器可以为摇瓶机或摇床。
根据本发明，优选地情况下，所述共振荡的条件包括：温度为30-35℃，摇瓶机转速为350-400rpm，振荡时间为10-15min。
本发明的发明人发现，接种于二级种子培养基的菌丝过长，则导致形成的菌球过大，容易造成菌种中心供氧不足而降低菌体活性；而如果菌丝过短，则不易形成菌球；经分散处理使得所述菌丝的平均长度为20-40μm优选为25-35μm时，将含有该菌丝的一级种子液接种于二级种子培养基进行二级培养，所述菌丝在二级培养过程中更易二次成球。
根据本发明，对所述二级种子培养基的接种量没有特别的限制，但为了缩短培养时间并且得到含有平均直径为30-50μm的黑曲霉菌球的二级种子液，优选地，步骤(3)中，相对于1mL二级种子培养基，黑曲霉的接种量为1×106-1.5×106根黑曲霉菌丝。
根据本发明，对所述二级培养的条件没有特别的限制，但为了缩短培养时间并且得到含有平均直径为30-50μm的黑曲霉菌球的二级种子液，优选地，所述二级培养的条件包括：温度为35-38℃，以二级种子培养基的体积为基准，溶氧量为30％以上，起始pH值为5-6，培养时间为16-20h。本发明中，对二级培养过程中的种子液的pH值不作限制，随着二级培养的进行，二级种子液的pH值逐渐降低。
在本发明中，所述溶氧量可以使用本领域常规的技术手段进行测定，具体的，可以使用溶氧电极按照本领域常规操作进行培养基培养过程中溶氧量的监测。
在本发明中，所述溶氧量为一相对值，可以使用本领域常规的方法进行标定，例如，可以在罐体中培养基刚灭菌完成时标定培养基中的溶氧量为0，然后开启搅拌和通气，当罐中的压力、搅拌转数和通气量达到设定值时，将此时培养基中溶氧量标定为100％。
根据本发明，对所述一级种子培养基没有特别的限制，可以为本领域常规使用的种子培养基，只要使得黑曲霉能够正常生长即可，优选地，以一级种子培养基的体积为基准，所述一级种子培养基总糖含量为100-150g/L，总氮含量为4-6g/L。
根据本发明，对所述二级种子培养基没有特别的限制，可以为本领域常规使用的种子培养基，只要使得黑曲霉能够正常生长即可，优选地，以二级种子培养基的体积为基准，所述二级种子培养基的总糖含量为100-150g/L，总氮含量为2-4g/L。
根据本发明，对所述一级种子培养基的制备原料没有特别的限制，可以为本领域常用的制备原料，例如，所述一级种子培养基的制备原料包括淀粉糖液和玉米浆。
根据本发明，对所述二级种子培养基的制备原料没有特别的限制，可以为本领域常用的制备原料，例如，所述二级种子培养基的制备原料包括淀粉糖液和玉米浆。
根据本发明，对所述一级种子培养基的制备原料的用量没有特别的限制，只要所述一级种子培养基的制备原料的用量使得一级种子培养基中总糖含量为100-150g/L，总氮含量为4-6g/L即可。
根据本发明，对所述二级种子培养基的制备原料的用量没有特别的限制，只要所述二级种子培养基的制备原料的用量使得二级种子培养基中总糖含量为100-150g/L，总氮含量为2-4g/L即可。
根据本发明，所述一级种子培养基和所述二级种子培养基可以相同也可以不相同，本发明对此并没有特别的限制，优选地情况下，所述一级种子培养基和所述二级种子培养基不同，其中二级种子培养基中总氮含量高于一级种子培养剂中总氮含量。
根据本发明，对所述发酵培养基的接种量没有特别的限制，为了提高发酵转化率，优选地，步骤(4)中，将所述含有黑曲霉菌球的二级种子液接种于发酵培养基，使相对于1mL发酵培养基，黑曲霉的接种量为1×104-5×104个黑曲霉菌球，优选为2×104-4×104个黑曲霉菌球。
根据本发明，对所述柠檬酸发酵的条件没有特别的限制，为了提高发酵转化率，优选地，所述柠檬酸发酵的条件包括：温度为35-38℃，搅拌速度为70-100rpm，以发酵培养基的体积为基准，溶氧量为30％以上，起始pH值为4-5，发酵时间为60-65h。本发明中，对发酵培养过程中的发酵液的pH值不作限制，随着发酵的进行，发酵液的pH值逐渐降低。
根据本发明，对所述发酵培养基没有特别的限制，可以为本领域常规使用的发酵培养基，例如，所述发酵培养基的总糖含量为170-180g/L，总氮含量为1.5-2g/L。
根据本发明，对所述发酵培养基的制备原料没有特别的限制，可以为本领域常用的制备原料，优选地，所述发酵培养基的制备原料包括淀粉糖液和玉米浆。
根据本发明，对所述发酵培养基的制备原料的用量没有特别的限制，只要所述发酵培养基的制备原料的用量使得发酵培养基中的总糖含量为170-180g/L，总氮含量为1.5-2g/L即可。
本发明中，对黑曲霉的具体种类没有特别的限制，可以为本领域常见的用于发酵产柠檬酸的黑曲霉菌种，但优选地，黑曲霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC40347。
实施例
以下结合具体实施例对本文进行详细描述。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂和设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
黑曲霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC40347；
发酵产酸量的测定方法：发酵产酸量由柠檬酸发酵液中柠檬酸的浓度表示，单位为g/L，柠檬酸发酵液的浓度简称酸度，酸度参数参照《GB 1987-2007食品添加剂柠檬酸》的方法测得。
发酵转化率的计算方法：柠檬酸的转化率(％)＝(发酵产酸量×柠檬酸发酵液的体积/总糖的重量)×100％；
术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V·min)，例如通气比为1：0.1-1，简称通气量为0.01-1体积：(体积·分钟)。
二级种子培养基中溶氧量的标定方法为：在二级种子培养基刚灭菌完成时标定培养基中溶氧量为0，然后开启搅拌和通风，当种子罐中压力为90Kpa，搅拌转速为100rpm，通气量为0.6体积：(体积·分钟)时将培养基中溶氧量标定为100％。
发酵培养基中溶氧量的标定方法为：在发酵培养基刚灭菌完成时标定培养基中溶氧量为0，然后开启搅拌和通风，当发酵罐中压力为90Kpa，搅拌转速为100rpm，通气量为0.4体积：(体积·分钟)时将培养基中溶氧量标定为100％。
使用的培养基如下：
一级种子培养基：94重量％淀粉糖液(总糖含量为120g/L)，6重量％玉米浆(总氮含量为75g/L)，pH值为5.5。
二级种子培养基：96重量％淀粉糖液(总糖含量为120g/L)，4重量％玉米浆(总氮含量为75g/L)，pH值为5.5。
发酵培养基：97重量％淀粉糖液(总糖含量为180g/L)，3重量％玉米浆(总氮含量为60g/L)，pH值为4.5。
平均直径或平均长度取50个样品的平均值。
实施例1
1)将一级种子培养基在121℃条件下，灭菌20min，将黑曲霉孢子粉接种于一级种子培养基，相对于1mL该一级种子培养基，黑曲霉的接种量为5×106cfu，在33℃，400rpm条件下培养24h，得到含有黑曲霉菌球(平均直径为180μm)的一级种子液；
2)将直径4mm的玻璃微珠加入到含有黑曲霉菌球的一级种子液中，在温度为33℃、380rpm条件下使用摇瓶机进行共振荡12min，得到平均长度为30μm的菌丝；相对于100mL含有黑曲霉菌球的一级种子液，玻璃微珠的用量为100个；
3)将经振荡处理后的一级种子液接种于二级种子培养基中，相对于1mL二级种子培养基，菌丝的接种量按照1.3×106根菌丝进行接种，开启搅拌，在培养温度为36℃，溶氧量为50％的条件下，培养18h，得到含有黑曲霉菌球的二级种子液，其中黑曲霉菌球的平均直径为40μm。
4)将含有黑曲霉菌球的二级种子液接种于发酵培养基，相对于1mL发酵培养基，黑曲霉的接种量3×104个菌球，开启搅拌，在温度为36℃，溶氧量为55％的条件下，进行柠檬酸发酵，发酵时间为65h。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
实施例2
1)将一级种子培养基在121℃条件下，灭菌20min，将黑曲霉孢子粉接种于一级种子培养基，相对于1mL该一级种子培养基，黑曲霉的接种量为7×106cfu，在35℃，500rpm下培养20h，得到含有黑曲霉菌球(平均直径为150μm)的一级种子液；
2)将直径为2mm的玻璃微珠加入到含有黑曲霉菌球的一级种子液中，在温度为35℃、350rpm条件下使用摇瓶机进行共振荡10min，得到平均长度为35μm的菌丝；相对于100mL含有黑曲霉菌球的一级种子液，玻璃微珠的用量为150个。
3)将经振荡处理后的一级种子液接种于二级种子培养基中，相对于1mL二级种子培养基，菌丝的接种量按照1.5×106根菌丝/ml进行接种，开启搅拌，在培养温度为38℃，溶氧量为55％的条件下，培养20h，得到含有黑曲霉菌球的二级种子液，其中黑曲霉菌球的平均直径为50μm。
4)将含有黑曲霉菌球的二级种子液接种于发酵培养基，相对于1mL发酵培养基，黑曲霉的接种量为4×104个菌球/ml，开启搅拌，在温度为38℃，溶氧量为55％的条件下，进行柠檬酸发酵，发酵时间为65h。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
实施例3
1)将一级种子培养基在121℃条件下，灭菌20min，将黑曲霉孢子粉接种于一级种子培养基，相对于1mL该一级种子培养基，黑曲霉的接种量为8×106cfu，在30℃，300rpm下培养30h，得到含有黑曲霉菌球(平均直径为200μm)的一级种子液；
2)将直径为5mm的玻璃微珠加入到含有黑曲霉菌球的一级种子液中，在温度为30℃、400rpm条件下使用摇瓶机进行共振荡15min，得到平均直径为25μm的菌丝；相对于100mL含有黑曲霉菌球的一级种子液，玻璃微珠的用量为80个；
3)将经振荡处理后的一级种子液接种于二级种子培养基中，相对于1mL二级种子培养基，菌丝的接种量按照1×106根菌丝/ml进行接种，开启搅拌，在培养温度为35℃，溶氧量为60％的条件下，培养16h，得到含有黑曲霉菌球的二级种子液，其中黑曲霉菌球的平均直径为30μm。
4)将含有黑曲霉菌球的二级种子液接种于发酵培养基，相对于1mL发酵培养基，黑曲霉的接种量为2×104个菌球/ml，开启搅拌，在温度为35℃，溶氧量为60％的条件下，进行柠檬酸发酵，发酵时间为65h。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
实施例4
按照实施例1的方法进行实验，不同的是，步骤2)中将直径5mm的玻璃微珠加入到含有黑曲霉菌球的一级种子液中，在温度为35℃、400rpm条件下使用摇瓶机进行共振荡15min，得到平均长度为20μm的菌丝；相对于100mL含有黑曲霉菌球的一级种子液，玻璃微珠的用量为150个。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
实施例5
按照实施例1的方法进行实验，不同的是，步骤2)中将直径2mm的玻璃微珠加入到含有黑曲霉菌球的一级种子液中，在温度为35℃、400rpm条件下使用摇瓶机进行共振荡10min，得到平均长度为40μm的菌丝；相对于100mL含有黑曲霉菌球的一级种子液，玻璃微珠的用量为80个。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
实施例6
按照实施例1的方法进行实验，不同的是，步骤3)中相对于1mL二级种子培养基，黑曲霉的接种量为1×107根菌丝。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
实施例7
按照实施例1的方法进行实验，不同的是，步骤4)中相对于1mL发酵培养基，黑曲霉的接种量为1×105个菌球。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
对比例1
按照实施例1的方法进行实验，不同的是：
不进行步骤2)，将步骤1)得到的含有黑曲霉菌球的一级种子液直接接种到二级种子培养基，相对于1mL二级种子培养基，以黑曲霉干重计，接种量与实施例1步骤3)的接种量相同。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
对比例2
按照实施例1的方法进行实验，不同的是，步骤2)中将直径4mm的玻璃微珠加入到含有黑曲霉菌球的一级种子液中，在温度为35℃、400rpm条件下使用摇瓶机进行共振荡20min，得到平均长度为10μm的菌丝；相对于100mL含有黑曲霉菌球的一级种子液，玻璃微珠的用量为100个。
步骤3)中未发现有菌球生成。
步骤4)将二级种子液接种于发酵培养基，相对于1mL发酵培养基，以黑曲霉干重计，接种量与实施例1的接种量相同。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
对比例3
按照实施例1的方法进行实验，不同的是，步骤3)中将经振荡处理后的一级种子液接种于二级种子培养基中，相对于1mL二级种子培养基，黑曲霉的接种量为1.3×106根菌丝，开启搅拌，在培养温度为35℃，溶氧量为60％的条件下，培养24h，得到含有黑曲霉菌球的二级种子液，其中黑曲霉菌球的平均直径为60μm。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
对比例4
1)麸曲扩大培养
将黑曲霉菌种(斜面培养)接种到麸曲培养基中，以每克培养基为基准，所述黑曲霉菌种的接入量为2×105个孢子。麸曲培养的条件包括：温度为34℃，湿度为50％，通气量为0.15体积：(体积·分钟)，培养时间为10天，且每隔12小时进行翻麸一次。得到黑曲霉麸曲，每克得到的黑曲霉麸曲中含有的孢子数为1.5×109个孢子；
2)将麸曲中成熟孢子接种于二级种子培养基，相对于100mL二级种子培养基，成熟孢子的接种量为5×106-8×106cfu/g，开启搅拌，在培养温度为35℃，溶氧量为50％的条件下，培养30h，得到二级种子液。
3)将二级种子液接种于发酵培养基，相对于1mL发酵培养基，以干重计，黑曲霉的接种量与实施例1的接种量相同，开启搅拌，在温度为35℃，溶氧量为50％的条件下，进行柠檬酸发酵，发酵时间为75h。
发酵产酸量和发酵转化率见下表1。
表1
编号 发酵产酸量(g/L) 发酵转化率(％)
实施例1 187 104
实施例2 186 103.3
实施例3 184 102.2
实施例4 182 101.1
实施例5 180 100.0
实施例6 181 100.5
实施例7 182 101.1
对比例1 173 96.1
对比例2 175 97.2
对比例3 177 98.3
对比例4 179 99.4
根据表中的实验结果可知，本发明的方法能够有效的降低种子液的制备量和制备周期(仅需40-50h)，并且种子质量稳定，发酵转化率达到100％以上，发酵产酸量在180g/L以上，有效的提高了发酵转化率和产酸量。
通过比较实施例1-7可知，使用本发明优选的实施方式能够获得更好的效果。发酵转化率可达到104％，发酵产酸量可达到187g/L。
从实施例1与对比例1的实验结果可以看出，一级种子液中的黑曲霉菌球经打散处理后进行接种，对于柠檬酸发酵的产酸量和发酵转化率有明显的提高。
从本发明的实施例1与对比例2的实验结果可以看出，黑曲霉菌球经分散处理后形成的菌丝的尺寸在本发明范围内有利于二次成球，并且对于后续的柠檬酸发酵的产酸量和发酵转化率有明显的提高。
从实施例1与对比例3的实验结果可以看出，将二级种子液中黑曲霉菌球的直径控制在本发明的范围内，更有利于提高柠檬酸发酵的产酸量和发酵转化率。
从实施例1与对比例4的实验结果可以看出，相比于传统的黑曲霉种子培养方法，本发明的方法对于提高柠檬酸发酵的产酸量和发酵转化率具有更明显的效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (17)

1.一种黑曲霉发酵产柠檬酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将黑曲霉接种于一级种子培养基中进行一级培养，制备含有黑曲霉菌球的一级种子液；
(2)将所述一级种子液中的黑曲霉菌球进行分散处理，以使黑曲霉菌球分散成菌丝，分散处理的条件使得所述菌丝的平均长度为20-40μm，所述分散处理的方式包括使一级种子液和微珠混合进行共振荡，相对于100mL含有黑曲霉菌球的一级种子液，微珠的用量为50-300粒，所述共振荡的条件包括：温度为30-35℃，转速350-400rpm，振荡时间为10-15min；
(3)将经分散处理后的一级种子液接种于二级种子培养基中进行二级培养，制备含有黑曲霉菌球的二级种子液，所述二级培养的条件使得二级种子液中的黑曲霉菌球的平均直径为30-50μm；
(4)将含有黑曲霉菌球的二级种子液接种于发酵培养基进行柠檬酸发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，相对于1mL所述一级种子培养基，黑曲霉的接种量为1×104-1×107cfu。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(1)中，相对于1mL所述一级种子培养基，黑曲霉的接种量为5×106-8×106cfu。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，一级培养的条件包括：温度为30-35℃，起始pH值为5-6，转速为300-500rpm，培养时间为20-30h。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述含有黑曲霉菌球的一级种子液中黑曲霉菌球的平均直径为150-200μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，分散处理的条件使得所述菌丝的平均长度为25-35μm。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，相对于100mL含有黑曲霉菌球的一级种子液，微珠的用量为80-150粒。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所述微珠的直径为2-5mm。
9.根据权利要求1、7或8所述的方法，其中，步骤(2)中，所述微珠为玻璃微珠或陶瓷微珠。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所述共振荡借助振荡器进行实施，所述振荡器为摇瓶机、摇床。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，相对于1mL二级种子培养基，黑曲霉的接种量为1×106-1.5×106根黑曲霉菌丝。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，所述二级培养的条件包括：温度为35-38℃，溶氧量为30％以上，起始pH值为5-6，培养时间为16-20h。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一级种子培养基总糖含量为100-150g/L，总氮含量为4-6g/L。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述二级种子培养基的总糖含量为100-150g/L，总氮含量为2-4g/L。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，将所述含有黑曲霉菌球的二级种子液接种于发酵培养基，使相对于1mL发酵培养基，黑曲霉的接种量为1×104-5×104个黑曲霉菌球。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述柠檬酸发酵的条件包括：温度为35-38℃，溶氧量为30％以上，起始pH值为4-5，发酵时间为60-65h。
17.根据权利要求1或15所述的方法，其中，所述发酵培养基的总糖含量为170-180g/L，总氮含量为1.5-2g/L。
CN201911235659.4A 2019-12-05 2019-12-05 黑曲霉发酵产柠檬酸的方法 Active CN112921058B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911235659.4A CN112921058B (zh) 2019-12-05 2019-12-05 黑曲霉发酵产柠檬酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911235659.4A CN112921058B (zh) 2019-12-05 2019-12-05 黑曲霉发酵产柠檬酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112921058A CN112921058A (zh) 2021-06-08
CN112921058B true CN112921058B (zh) 2023-01-13

Family

ID=76161933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911235659.4A Active CN112921058B (zh) 2019-12-05 2019-12-05 黑曲霉发酵产柠檬酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112921058B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1398591A (en) * 1972-02-10 1975-06-25 Ici Ltd Process for growing a fungus
CN104099253A (zh) * 2014-07-11 2014-10-15 江南大学 基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法
CN105586366A (zh) * 2016-03-10 2016-05-18 江南大学 一种基于控制菌丝体结构改善柠檬酸发酵性能的方法
CN107815421A (zh) * 2017-12-08 2018-03-20 江苏国信协联能源有限公司 一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1398591A (en) * 1972-02-10 1975-06-25 Ici Ltd Process for growing a fungus
CN104099253A (zh) * 2014-07-11 2014-10-15 江南大学 基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法
CN105586366A (zh) * 2016-03-10 2016-05-18 江南大学 一种基于控制菌丝体结构改善柠檬酸发酵性能的方法
CN107815421A (zh) * 2017-12-08 2018-03-20 江苏国信协联能源有限公司 一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Morphological development of Aspergillus niger in submerged citric acid fermentation as a function of the spore inoculum level. Application of neural network and cluster analysis for characterization of mycelial morphology;Maria Papagianni;《Microbial Cell Factories》;20060125;第5卷(第3期);1-10 *
黑曲霉菌丝球的形成及应用研究综述;黄勋娟等;《食品与发酵工业》;20141231;第40卷(第11期);171-176 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112921058A (zh) 2021-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6937366B2 (ja) 黒麹種菌の連続培養及びそれを用いたクエン酸製造方法
CN107488640B (zh) 一种耐氧化低温葡萄糖氧化酶及其生产方法与应用
CN109082385B (zh) 羊肚菌液体菌种的制备方法
CN107815421B (zh) 一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法
CN107488600B (zh) 一株高产耐氧化低温葡萄糖氧化酶的黑曲霉
CN100368519C (zh) 黑曲霉脂肪酶及其用途
CN105925495B (zh) 一种高活性粉状毕赤酵母菌粉及其制备方法
CN111394280A (zh) 一种适合地衣芽孢杆菌生长的培养基及其应用
CN103103135B (zh) 一种米曲霉菌株及其液态发酵生产真菌α-淀粉酶的方法
CN102864082B (zh) 柠檬酸发酵种子培养的方法及发酵制备柠檬酸的方法
CN112921058B (zh) 黑曲霉发酵产柠檬酸的方法
CN104342372B (zh) 一种利用益生菌发酵生产酵母水解物的方法
CN107267398B (zh) 一种灵芝液体菌种培养基及灵芝液体菌种培养方法
CN105385525A (zh) 一种馥郁浓香型酒曲的制作方法
CN105647815B (zh) 一种提高米曲霉曲酸产量的方法
CN104131042B (zh) 一种控制米根霉生长形态产l‑乳酸的方法
CN105420130A (zh) 一种饲用酿酒酵母液固两相发酵方法
CN107523512B (zh) 一种高芽孢率的地衣芽孢杆菌发酵方法
CN106957882B (zh) 一种发酵制备柠檬酸的方法
CN107974413A (zh) 赤霉酸种子液的制备方法
CN113930409A (zh) 米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法
CN105586366A (zh) 一种基于控制菌丝体结构改善柠檬酸发酵性能的方法
CN109536533A (zh) 一种制备番茄红素的方法
CN103215312A (zh) 真菌固体发酵培养基
CN113234646B (zh) 一种枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: No. 99, Kaiyuan Avenue, Bengbu, Anhui 233316

Applicant after: COFCO Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: No. 1, central grain Avenue, Bengbu, Anhui Province, Anhui

Applicant before: COFCO Biotechnology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant