CN112915108B - 凝结芽孢杆菌ja845在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

凝结芽孢杆菌JA845在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用，属于生物领域，凝结芽孢杆菌JA845已于2020年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.19576。将凝结芽孢杆菌JA845制成菌悬液，活菌数量≥1×10⁹CFU/ml。本发明中，凝结芽孢杆菌JA845通过提高学习记忆能力、减轻神经元细胞受损程度、降低Aβ沉积、调节肠道菌群等预防和治疗阿尔茨海默病。本发明为临床上预防和治疗阿尔茨海默病提供了新思路，具有广阔的应用前景和推广价值。

Description

凝结芽孢杆菌JA845在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物 中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种凝结芽孢杆菌JA845在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

背景技术

痴呆症是一种以记忆力、思维、行为和日常活动能力下降为特征的综合征。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，属于老年期痴呆常见类型。AD的主要病理特征包括β淀粉样蛋白(βamyloidprotein，Aβ)沉积形成神经炎性斑，Tau蛋白过度磷酸化导致神经原纤维缠结，神经元和突触缺失，小胶质细胞活化等。世界上大约有5000万AD患者，每年有1000万新病例。据预测，到2030年，AD症患者总数将达到8200万，到2050年将达到1.52亿。阿尔茨海默病对患者本身以及他们的护理者、家庭和整个社会都会产生极大影响。中国是世界上痴呆症患者最多的国家，给公共和医疗保健***带来了沉重的负担。目前的医学治疗只能延缓AD患者症状的发展，无法根治AD。鉴于此，研究者开始探索多药疗法，包括补充剂等，以寻找相对便宜和更有效的疗法。

益生菌是一类活性微生物，通过在人体内定居并改变宿主特定部位的菌群组成及多样性，调节肠道菌群从而对宿主健康产生积极影响。研究发现AD患者肠道菌群失调表现为益生菌数量降低，病原微生物含量增多。肠道微生物通过由神经内分泌***、神经免疫***、肠神经***以及自主神经***的交感神经和副交感神经组成的“微生物-肠-脑”轴来影响中枢神经***。通过“肠-脑”轴进行干预可能是治疗包括痴呆症在内的神经***疾病的一种选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种凝结芽孢杆菌JA845在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用，为预防和/或治疗阿尔茨海默病提供新思路。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的凝结芽孢杆菌JA845在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

作为优选的实施方式，所述凝结芽孢杆菌JA845已于2020年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19576。

作为优选的实施方式，将凝结芽孢杆菌JA845制成菌悬液，活菌数量≥1×10⁹CFU/ml。

作为优选的实施方式，将凝结芽孢杆菌JA845制成菌悬液的具体过程如下：

步骤一、菌株活化

挑取凝结芽孢杆菌JA845冻干菌粉，接种于LB液体培养基中，在50℃、180rpm条件下震荡培养箱中培养8～9h活化菌株；

步骤二、菌株传代培养

取菌株活化培养液，以3％的接种量接种于新的LB液体培养基中，在50℃、180rpm条件下震荡培养箱中培养8～9h，重复此步骤将菌株传代3次，重复此步骤进行扩大培养；

步骤三、活菌数量计算

通过涂布平板计数方法，将菌液分别稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹倍，取稀释后的菌液均匀涂在LB固体培养基表面，培养48h后计数；

步骤四、菌悬液制备

将菌液在5000rpm、15min条件下离心去除培养基，用生理盐水清洗后离心得到菌体沉淀，再用生理盐水溶解制备菌悬液，要求活菌数量不低于1×10⁹CFU/ml。

作为优选的实施方式，所述药物的功能包括：

(1)提高学习记忆能力；

(2)减轻神经元细胞受损程度；

(3)降低Aβ沉积；

(4)调节肠道菌群。

本发明的有益效果是：

本发明通过凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠行为学的影响实验证实，凝结芽孢杆菌JA845能减轻阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆相关损伤；通过凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元形态的影响实验证实，凝结芽孢杆菌JA845可以减轻阿尔茨海默病导致的神经元变性；通过凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠大脑皮层Aβ沉积的影响实验证实，凝结芽孢杆菌JA845可以减轻AD模型小鼠脑部Aβ斑块沉积，改善AD病理特征；通过凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠肠道菌群的影响实验证实，凝结芽孢杆菌JA845能够抑制肠道中阿尔茨海默病相关的有害菌的增长，促进肠道中益生菌的增长从而调节肠道菌群，改善阿尔茨海默病症状。

本发明的一种凝结芽孢杆菌JA845在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用，凝结芽孢杆菌JA845通过提高学习记忆能力、减轻神经元细胞受损程度、降低Aβ沉积、调节肠道菌群等预防和治疗阿尔茨海默病。本发明为临床上预防和治疗阿尔茨海默病提供了新思路，具有广阔的应用前景和推广价值。

附图说明

图1为实施例1中阿尔茨海默病模型小鼠海马组织HE染色切片结果。图中，a为空白对照组；b为AD模型组；c为JA845预防组。

图2为实施例1中阿尔茨海默病模型小鼠大脑皮层Aβ免疫组化结果。图中，a为空白对照组；b为AD模型组；c为JA845预防组。

具体实施方式

本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

优选的，所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845已于2020年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC No.19576。

另外，关于凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845的其他信息包括分离、鉴定、保藏等均参考公开号为CN 111518720A的中国专利(发明名称为一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845及其应用)即可。

优选的，将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845制成菌悬液，活菌数量≥1×10⁹CFU/ml。

优选的，将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845制成菌悬液的具体过程如下：

步骤一、菌株活化

挑取凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845冻干菌粉，接种于LB液体培养基中，在50℃、180rpm条件下震荡培养箱中培养8～9h活化菌株；

步骤二、菌株传代培养

取菌株活化培养液，以3％的接种量接种于新的LB液体培养基中，在50℃、180rpm条件下震荡培养箱中培养8～9h，重复此步骤将菌株传代3次，重复此步骤进行扩大培养；

步骤三、活菌数量计算

通过涂布平板计数方法，将菌液分别稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹倍，取稀释后的菌液均匀涂在LB固体培养基表面，培养48h后计数；

步骤四、菌悬液制备

将菌液在5000rpm、15min条件下离心去除培养基，用生理盐水清洗后离心得到菌体沉淀，再用生理盐水溶解制备菌悬液，要求活菌数量不低于1×10⁹CFU/ml。

本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845用于制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物，药物的功能主要包括：

(1)提高阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力；

(2)减轻阿尔茨海默病模型小鼠神经元细胞受损程度；

(3)降低阿尔茨海默病模型小鼠大脑皮层Aβ沉积；

(4)调节阿尔茨海默病模型小鼠肠道菌群。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

固体LB培养基：溶剂为水，胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L；如无特殊说明，pH＝7.0。液体LB培养基与固体LB培养基的区别仅在于液体LB培养基中不加入琼脂。

基础饲料：购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

ICR小鼠：购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物许可证号：SCXK(吉)-2011-0004。

D-半乳糖：购自美国sigma公司，纯度≥99％。

D-半乳糖溶液的制备方法：取D-半乳糖粉末，用生理盐水配制成浓度为12mg/ml的D-半乳糖溶液。

氯化铝：购自国药集团化学试剂有限公司。

氯化铝溶液的制备方法：取氯化铝粉末，用生理盐水配制成浓度为2mg/ml的氯化铝溶液。

实施例1凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845菌悬液的制备

1、菌株活化：挑取凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845冻干菌粉，接种于LB液体培养基中，在50℃、180rpm条件下震荡培养箱中培养8～9h活化菌株。

2、菌株传代培养：取菌株活化培养液，以3％的接种量接种于新的LB液体培养基中，在50℃、180rpm条件下震荡培养箱中培养8～9h，重复此步骤将菌株传代3次，重复此步骤进行扩大培养，以获得更多菌液。

3、活菌数量计算：通过涂布平板计数方法，将菌液分别稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹倍，取稀释后的菌液均匀涂在LB固体培养基表面，培养48h后计数。

4、菌悬液制备：将菌液在5000rpm、15min条件下离心去除培养基，然后用生理盐水清洗后离心得到菌体沉淀，再用生理盐水溶解制备菌悬液，要求活菌数量不低于1×10⁹CFU/ml。

实施例2凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845预防和治疗阿尔茨海默病的作用

一、材料与方法：

1、阿尔茨海默病小鼠模型的建立以及实验分组

SPF级ICR小鼠，30只，雌雄各半，体重20±5(g)，在恒温(20±2℃)恒湿(40～60％)，保持12h昼夜节律，自由饮食，正常饲养一周后，按照体重和性别随机分为3组：空白对照组(n＝10)、AD模型组(n＝10)、JA845预防组(n＝10)，AD模型组每天灌胃无菌生理盐水，90min后，腹腔注射D-半乳糖溶液(120mg/kg)，灌胃AlCl₃溶液(20mg/kg)；JA845预防组每天灌胃凝结芽孢杆菌JA845菌悬液，90min后，腹腔注射D-半乳糖溶液(120mg/kg)，灌胃AlCl₃溶液(20mg/kg)；空白组灌胃等量无菌生理盐水，每三天称一次体重确定灌胃剂量，持续10周。

凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠形态学及体重的影响结果如下：

试验期间，观察各组小鼠的形态特征。与空白对照组相比，AD模型组小鼠的毛发逐渐脱落，皮肤变得僵硬、松弛，皮肤弹性变差，有些小鼠表现出焦虑行为；JA845预防组与AD模型组相比，小鼠毛发茂盛且有光泽，皮肤富有弹性；在阿尔茨海默病诱导期，如表1所示，AD模型组与空白对照组相比，小鼠的体重呈逐渐下降趋势，同时，JA845预防组显示出总体重逐渐增加。上述试验表明凝结芽孢杆菌JA845能够逆转AD导致的皮肤状态改变以及体重下降的现象。

表1

2、阿尔茨海默病模型小鼠的行为学评价

观察小鼠的毛发、精神状态、活动情况、进食饮水。跳台实验是基于被动回避反应来评价小鼠学***台，24h后，正式进行实验，记录小鼠在平台上的时间(潜伏期)和从台上跳下的次数(错误次数)。

凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠行为学的影响结果如下：

跳台试验结果如表2所示，在训练时期，AD模型组小鼠与空白对照组小鼠相比，错误次数显著增加(P＜0.01)，而逃逸潜伏期显著缩短(P＜0.01)；与AD模型组相比，JA845预防组小鼠错误次数显著降低(P＜0.05)，逃逸潜伏期明显延长。在测试时期，AD模型组小鼠与空白对照组小鼠相比，错误次数显著增加(P＜0.001)，而逃逸潜伏期显著缩短(P＜0.01)；与AD模型组相比，JA845预防组小鼠错误次数显著降低(P＜0.001)，逃逸潜伏期显著延长(P＜0.01)。上述试验表明凝结芽孢杆菌JA845能减轻阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆相关损伤。

表2

注：与空白对照组比较标注^#，与AD模型组比较标注*。“*”、“^#”均表示P<0.05；“^##”、“**”均表示P<0.01；“^###”、“***”均表示P<0.001。

3、阿尔茨海默病模型小鼠的组织病理学观察

(1)HE染色：行为学评价实验结束后，将小鼠进行断头、取脑、分离海马组织、石蜡包埋、切片，将石蜡切片常规脱蜡至水中，切片入苏木素染液染3～5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。切片依次放入无水乙醇I(5min)-无水乙醇II(5min)-无水乙醇Ⅲ(5min)-二甲苯Ⅰ(5min)-二甲苯Ⅱ(5min)透明，中性树胶封片。用显微镜观察HE染色小鼠脑切片中海马组织结构形态。

凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元形态的影响结果如图1所示。HE染色结果表明，空白对照组中小鼠海马神经元细胞染色均匀，细胞形态正常，核膜清晰分明，结构完整，细胞排列整齐，无坏死或变性神经元细胞；与空白对照组相比，AD模型组细胞染色较深，细胞形态异常，大量神经元核固缩坏死，细胞间隙增大且排列紊乱，膜核分辨不清；JA845预防组与AD模型组相比，正常神经元细胞数量增多，坏死变性神经元数量明显减少。上述试验说明凝结芽孢杆菌JA845可以减轻阿尔茨海默病导致的神经元变性。

(2)免疫组化：将制备好的石蜡组织切片于60℃下进行烤片2h，然后浸泡于二甲苯中10min×2次；在无水乙醇中浸泡5min×2次；在95％、85％、75％乙醇中依次浸泡5min；去离子水浸泡5min；最后用PBS缓冲液进行漂洗5min。抗原修复：加入0.01M柠檬酸盐缓冲液，微波加热至水微沸后煮20min；滴加3％的过氧化氢在组织区域内，室温条件下温育20min，再用PBS缓冲液进行漂洗3min；用山羊血清在37℃条件下进行封闭30min；吸走血清，加入β-淀粉样蛋白一抗Anti-betaAmyloid(Anti-Aβ)(1:200)，于4℃条件下过夜；用PBS进行漂洗，滴加生物素化二抗工作液，于37℃条件下孵育60min，用PBS缓冲液漂洗，滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液，37℃温育60min；PBS缓冲液漂洗，DAB染色3min；吸走液体，加入苏木素溶液染色3min左右；去离子水中冲洗载玻片终止反应；梯度酒精依次脱水2min；二甲苯透明3min×2；用树胶封片，显微镜观察结构形态。

凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠大脑皮层Aβ沉积的影响结果如图2所示。免疫组化结果显示，空白对照组小鼠大脑皮层未见Aβ沉积，AD模型组小鼠大脑皮层Aβ沉积现象明显，凝结芽孢杆菌JA845干预后小鼠大脑皮层Aβ斑块数量明显减少。胞外Aβ沉积是AD典型病理特征之一，免疫组化结果表明，凝结芽孢杆菌JA845可以减轻AD模型小鼠脑部Aβ斑块沉积，改善AD病理特征。

4、肠道菌群检测

上述试验结束最后一天，采用无菌EP管收集各组小鼠新鲜粪便(≥200mg)，保存于-80℃冰箱中待测分析。

(1)小鼠粪便样本中微生物总DNA提取：依据DNeasy PowerSoil Kit(QIAGEN，Inc.，Netherlands)说明书提取粪便样本中微生物总DNA，并对抽提的总DNA进行检测。采用荧光分光光度计，在260nm和280nm处分别测定总DNA的吸光值，检测总DNA的浓度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的质量。调整总DNA溶液浓度，总DNA工作液保存于4℃，储存液保存于-20℃。

(2)基因组DNA的PCR扩增：首先对16s rRNA基因可变区V4-V5区进行扩增，V4-V5区特异性扩增引物为515Forward(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和907Reverse(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)。①针对样本DNA V3-V4区进行PCR预试验；②大批量PCR扩增(Pyrobest DNA Polymerase，TaKaRa，DR500A)；然后进行胶回收纯化：针对目标条带进行割胶回收，得到纯化的样本(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，Axygen，AP-GX-500)；然后进行各样本定量：利用BioTek酶标仪对各个样品定量分析；最后依据Illumina TruSeq DNASample Preparation Kit试剂盒构建所需的上机文库。

(3)验证文库：利用Pico green和荧光分光光度计方法定量文库；并使用安捷伦(Agilent)2100对PCR富集片段进行质量控制，验证DNA文库的片段大小及分布。

(4)均一化并混合文库：多样品DNA文库(multiplexed DNAlibraries)均一化至10nM后等体积混合。

(5)上机测序：将混合好的文库(10nM)逐步稀释定量至4～5pM后进行上机测序。

凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠肠道菌群的影响结果如下：

通过对各组小鼠Alpha多样性指数进行分析，结果如表4所示，AD模型组小鼠肠道菌群的OTU数目显著少于空白对照组(P＜0.001)；Shannon指数显著低于空白组(P＜0.01)；Simpson指数也低于空白组(P＜0.05)，表明AD模型组肠道微生物丰度较低，预防给药10周后，JA845预防组小鼠肠道菌群的OTU数目显著多于AD模型组(P＜0.01)，同样，Shannon指数和Simpson指数也显著高于AD模型组(P＜0.05)。

表4凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠肠道菌群多样性影响

组别	OTUs	Shannon	Simpson
				空白对照组	2483.42±263.50	8.45±0.70	0.98±0.01
AD模型组	1652.46±475.63<sup>###</sup>	6.05±0.74<sup>##</sup>	0.90±0.03<sup>#</sup>
				JA845预防组	2137.96±358.24**	8.29±0.62*	0.96±0.02*

注：与空白对照组比较标注^#，与AD模型组比较标注*。“*”、“^#”均表示P<0.05；“^##”、“**”均表示P<0.01；“^###”、“***”均表示P<0.001。

物种组成分析结果如表5所示，植物乳杆菌JA845干预后在小鼠肠道中有13种微生物菌属明显发生变化，在AD模型组中，链球菌属(Streptococcus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、分节丝状菌属(Candidatus_Arthromitus)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、乳球菌属(Lactococcus)、厌氧支原体属(Anaeroplasma)、Allobaculum、萨特菌属(Sutterella)和艾克曼菌属(Akkermansia)相对丰度较高，而在JA845预防组中平均丰度较低，其中，脱硫弧菌属增多可以肠道屏障受损，萨特菌属发现存在于伴有胃肠功能障碍的自闭症患者肠道中，艾克曼菌属有研究发现它与海马萎缩呈正相关。在JA845预防组中，葡萄球菌属(Staphylococcus)、Jeotgalicoccus、Planococcaceae_Staphylococcus和气球菌属(Aerococcus)相对丰度较高。上述试验表明凝结芽孢杆菌JA845能够抑制肠道中阿尔茨海默病相关的有害菌的增长，促进肠道中益生菌的增长从而调节肠道菌群，改善阿尔茨海默病症状。

表5凝结芽孢杆菌JA845对阿尔茨海默病模型小鼠肠道菌群(属)组成的影响

本发明公开了一种凝结芽孢杆菌JA845在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (4)

1.凝结芽孢杆菌JA845在制备预防阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌JA845已于2020年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19576。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将凝结芽孢杆菌JA845制成菌悬液，活菌数量≥1×10⁹CFU/ml。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将凝结芽孢杆菌JA845制成菌悬液的具体过程如下：

步骤一、菌株活化

挑取凝结芽孢杆菌JA845冻干菌粉，接种于LB液体培养基中，在50℃、180rpm条件下震荡培养箱中培养8～9h活化菌株；

步骤二、菌株传代培养

取菌株活化培养液，以3％的接种量接种于新的LB液体培养基中，在50℃、180rpm条件下震荡培养箱中培养8～9h，重复此步骤将菌株传代3次，重复此步骤进行扩大培养；

步骤三、活菌数量计算

通过涂布平板计数方法，将菌液分别稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹倍，取稀释后的菌液均匀涂在LB固体培养基表面，培养48h后计数；

步骤四、菌悬液制备

将菌液在5000rpm、15min条件下离心去除培养基，用生理盐水清洗后离心得到菌体沉淀，再用生理盐水溶解制备菌悬液，要求活菌数量不低于1×10⁹CFU/ml。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的功能包括：

(1)提高学习记忆能力；

(2)减轻神经元细胞受损程度；

(3)降低Aβ沉积；

(4)调节肠道菌群。

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