CN112898172A - 可被羧肽酶酶解的双亲和功能团化合物的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可被羧肽酶酶解的双亲和功能团化合物的合成方法。利用两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物与两种带有不同亲和功能团(A,B)的氨基酸衍生物的氨基进行反应,然后对反应产物使用液相色谱进行分离纯化,得到带有两种不同亲和功能团的化合物。该化合物由于其两端都具有羧基和酰胺键,因此可以被羧肽酶酶切。
Description
技术领域
本发明涉及可被羧肽酶酶解的双亲和功能团化合物的合成方法,具体地说是一种通过对两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物分别标记上带有不同亲和功能团的氨基酸衍生化合物,使合成的产物两端都可被羧肽酶酶切的方法。
背景技术
具有亲和功能团的分子,被广泛应用于样品分离、富集和纯化。这些分子通常被相应的抗体、蛋白质或者亲和小分子选择性捕获。为了提高亲和选择性,可以在分子上修饰上不同的亲和功能团,从而利用依次富集的方法提高富集选择性和效率。在具有亲和功能团的分子被捕获后,需要用合适的方法进行释放,例如加热、加入变性剂等使蛋白质或者抗体失去活性,破坏亲和作用。剧烈的条件会导致被富集分子结构或者功能的改变。另一种方法是加入高浓度竞争试剂,将被富集的分子替代出来,虽然条件相对温和,但是会引入大量的杂质,不利于被富集分子的纯化。
羧肽酶是一种选择性对蛋白质和多肽C末端氨基酸依次切除的蛋白酶。该酶通过识别蛋白质和多肽C末端羧基和酰胺键,进而对其C末端氨基酸依次切除。通过在分子两端引入带有不同亲和功能团的氨基酸衍生物,可进行顺序亲和富集。此外,分子两端的氨基酸可以使用羧肽酶进行切除,条件温和,而且可避免引入大量的干扰杂质。
发明内容
具有亲和功能团的化合物被广泛应用于分离、纯化和富集。带有双亲功能团的分子,可应用于目标分子的顺序富集,进一步提高其富集选择性。通常在释放捕获的目标分子时,需要使用剧烈的条件或者加入竞争试剂,会导致目标分子结构和功能的变化或者引入大量竞争试剂,不利于目标分子的纯化。本发明的目的是合成具有双亲功能团且可被羧肽酶酶切的化合物。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
利用两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物1与两种带有不同亲和功能团(A,B)的氨基酸衍生化合物2和3的氨基进行反应,反应产物混合物包括带有两个亲和功能团A的化合物,带有两个亲和功能团B的化合物和带有亲和功能团A和B的化合物。对产物混合物使用液相色谱进行分离纯化,得到带有两种不同亲和功能团A和B的化合物4。该化合物两端均含有羧基和酰胺键,可被羧肽酶酶切。
两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物1,其中间连接臂的长度在3-20之间,连接臂的原子种类包括C,N,O和S。其结构如下:
X-L-X
其中C是12C或者13C,O是18O或者16O。
L是一个含有若干个N、O、S原子的碳链;
(1)反应试剂的选择:选择两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物1,包括商品化试剂如辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)、戊二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)等或者利用琥珀酰亚胺对两端带有羧基的化合物进行活化得到带有活性的琥珀酰亚胺酯。选择带有不同亲和功能团的两种氨基酸衍生物2和3,氨基酸的种类包括丝氨酸,酪氨酸,苏氨酸,赖氨酸和精氨酸,亲和功能团包括乙酰基,苯甲酰基,丙酰基,丙二酰基,琥珀酰基,巴豆酰基,戊二酰基,2-羟基异丁基酰基,丁酰基,β-羟基丁酰基,甲基、磷酸基和生物素等可以倍亲和富集的功能团。
(2)带有亲和功能团分子的合成:在弱碱性条件下(pH7.0-9.0,缓冲液浓度0.01-0.5mol/L),使带有不同亲和功能团A和B的化合物2和3与化合物1反应,反应温度为35~85℃,反应时间为30~120分钟。生成的产物包括带有两个亲和功能团A的化合物(A-L-A),带有两个亲和功能团B的化合物(B-L-B)和带有亲和功能团A和B的化合物4(A-L-B)
(3)具有双亲和功能团分子的纯化:使用液相色谱对反应产物中的带有亲和功能团A和B的化合物4(A-L-B)进行纯化,包括利用反相色谱、正相色谱、离子交换色谱或者亲水色谱,收集目标化合物4进行冷冻干燥。
发明的方法可以合成具有双亲功能团且可被羧肽酶酶切的化合物。
本发明具有如下优点:
1.本发明通过引入不同的亲和功能团,可进行顺序富集,具有良好的富集选择性。
2.本发明通过在亲和分子中引入氨基酸衍生物,使其可被羧肽酶酶解,条件温和,且不引入大量杂质。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述,但不以任何形式限制本发明。
实施例1
1.选择反应试剂:
两端带有琥珀酰亚胺基团试剂的选择:选择辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)作为两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物1;带有亲和功能团氨基酸衍生物的选择:选择侧链氨基乙酰化的赖氨酸和侧链氨基生物素化的赖氨酸作为带有不同亲和功能团A和B的化合物2和3。前者可以被乙酰化赖氨酸抗体亲和富集,后者可以被亲和素亲和富集。
2.合成带有双亲功能团化合物
将带有不同亲和功能团的化合物2和3与化合物1反应,反应条件如下:磷酸缓冲液(pH值8.0,浓度0.05mol/L)中,反应温度为50℃,反应时间为60分钟。反应产物包括带有两个亲和功能团A的化合物(A-L-A),带有两个亲和功能团B的化合物(B-L-B)和带有亲和功能团A和B的化合物4(A-L-B)。
3.纯化双亲功能团化合物
使用反相液相色谱对反应产物进行分离纯化,填料为C18固定相,采取梯度洗脱方法,初始流动相和最终流动相分别为2%乙腈和98%乙腈,梯度时间为60分钟。收集目标产物对应的流出组分,进行冷冻干燥,得到纯化的化合物4。
实施例2
1.选择反应试剂
两端带有琥珀酰亚胺基团试剂的选择:选择丁二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)作为两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物1;带有亲和功能团氨基酸衍生物的选择:选择侧链氨基乙酰化的赖氨酸和磷酸化丝氨酸作为带有不同亲和功能团A和B的化合物2和3。前者可以被乙酰化赖氨酸抗体亲和富集,后者可以被二氧化钛亲和富集。
2.合成带有双亲功能团化合物
将带有不同亲和功能团的化合物2和3与化合物1反应,反应条件如下:碳酸氢钠缓冲液(pH值7.6,浓度0.05mol/L)中,反应温度为60℃,反应时间为40分钟。反应产物包括带有两个亲和功能团A的化合物(A-L-A),带有两个亲和功能团B的化合物(B-L-B)和带有亲和功能团A和B的化合物4(A-L-B)。
3.纯化双亲功能团化合物
使用反相液相色谱对反应产物进行分离纯化,填料为C18固定相,采取梯度洗脱方法,初始流动相和最终流动相分别为0%乙腈和98%乙腈,梯度时间为60分钟。收集目标产物对应的流出组分,进行冷冻干燥,得到纯化的化合物4。
实施例3
1.选择反应试剂
两端带有琥珀酰亚胺基团试剂的选择:选择戊二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)作为两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物1;带有亲和功能团氨基酸衍生物的选择:选择磷酸化苏氨酸和侧链氨基生物素化的赖氨酸作为带有不同亲和功能团A和B的化合物2和3。前者可以被二氧化钛亲和富集,后者可以被亲和素亲和富集。
2.合成带有双亲功能团化合物
将带有不同亲和功能团的化合物2和3与化合物1反应,反应条件如下:磷酸缓冲液(pH值7.2,浓度0.04mol/L)中,反应温度为40℃,反应时间为50分钟。反应产物包括带有两个亲和功能团A的化合物(A-L-A),带有两个亲和功能团B的化合物(B-L-B)和带有亲和功能团A和B的化合物4(A-L-B)。
3.纯化双亲功能团化合物
使用反相液相色谱对反应产物进行分离纯化,填料为C18固定相,采取梯度洗脱方法,初始流动相和最终流动相分别为2%乙腈和98%乙腈,梯度时间为40分钟。收集目标产物对应的流出组分,进行冷冻干燥,得到纯化的化合物4。
实施例4
1.选择反应试剂
两端带有琥珀酰亚胺基团试剂的选择:选择庚二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)作为两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物1;带有亲和功能团氨基酸衍生物的选择:选择侧链氨基丙酰化的赖氨酸和侧链氨基生物素化的赖氨酸作为带有不同亲和功能团A和B的化合物2和3。前者可以被丙酰化赖氨酸抗体亲和富集,后者可以被亲和素亲和富集。
2.合成带有双亲功能团化合物
将带有不同亲和功能团的化合物2和3与化合物1反应,反应条件如下:碳酸氢钠缓冲液(pH值7.6,浓度0.05mol/L)中,反应温度为37℃,反应时间为60分钟。反应产物包括带有两个亲和功能团A的化合物(A-L-A),带有两个亲和功能团B的化合物(B-L-B)和带有亲和功能团A和B的化合物4(A-L-B)。
3.纯化双亲功能团化合物
使用反相液相色谱对反应产物进行分离纯化,填料为C18固定相,采取梯度洗脱方法,初始流动相和最终流动相分别为2%乙腈和100%乙腈,梯度时间为80分钟。收集目标产物对应的流出组分,进行冷冻干燥,得到纯化的化合物4。
应用例
采用实施例1合成的化合物4进行海水中含有氨基化合物的富集。
在待富集样品中加入化合物4,浓度为10毫摩尔/升。使用磷酸缓冲液调节pH值至7.5,加入50mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和50mMN-羟基琥珀酰亚胺对化合物4中的羧基进行活化,活化后的羧基与海水中含有氨基的化合物反应。反应温度为40摄氏度,反应时间为30分钟。反应完成后,将样品pH值使用氢氧化钠调节至10,使没有参与反应的活化后羧基水解为羧基。分别使用乙酰化抗体和亲和素,利用抗体对乙酰基的亲和作用以及亲和素对生物素的亲和作用,对样品中与化合物4结合的含有氨基化合物进行顺序富集。然后使用羧肽酶对被富集的物质进行处理,使含有氨基化合物与化合物4结合物中的带有乙酰基和生物素的氨基酸被水解掉,含有氨基化合物不再与抗体和亲和素结合,从而被释放下来。
Claims (7)
1.可被羧肽酶酶解的双亲和功能团化合物的合成方法,其特征在于:利用两端带有琥珀酰亚胺基团的化合物与两种带有不同亲和功能团(A,B)的氨基酸衍生化合物2和3的氨基进行反应,分离纯化,得到两端带有两种不同亲和功能团A和B的化合物4;
亲和功能团A和B分别包括乙酰基,苯甲酰基,丙酰基,丙二酰基,琥珀酰基,巴豆酰基,戊二酰基,2-羟基异丁基酰基,丁酰基,β-羟基丁酰基,甲基、磷酸基或生物素。
3.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:氨基酸衍生化合物2和3中的氨基酸种类分别包括丝氨酸,酪氨酸,苏氨酸,赖氨酸或精氨酸中的一种或二种以上;亲和功能团A和B包括乙酰基,苯甲酰基,丙酰基,丙二酰基,琥珀酰基,巴豆酰基,戊二酰基,2-羟基异丁基酰基,丁酰基,β-羟基丁酰基,甲基、磷酸基和生物素;这些亲和功能团连接在氨基酸的侧链氨基,胍基或者羟基上,并且这些功能团可被抗体或者蛋白质亲和富集。
4.按照权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于:将带有不同亲和功能团A和B的化合物2和3与化合物1反应,反应条件如下:弱碱性缓冲溶液(pH值在7.0-9.0之间,缓冲盐总浓度为0.01-0.5mol/L)中,反应温度为35~85℃,反应时间为30~120分钟;得产物。
5.按照权利要求4所述的方法,其特征在于:对化合物1与化合物2和3的反应产物,使用液相色谱进行分离纯化,收集带有两种不同亲和功能团的化物4(A-L-B)。
6.按照权利要求1-3任一所述的方法,合成的双亲和功能团化合物4,其两端均含有自由羧基和酰胺键,因此可被羧肽酶酶切。
7.一种权利要求1-6任一所述方法合成的双亲和功能团化合物4。
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