CN112888305A - 保护动物防御病原细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益作用的基于rna的治疗方法 - Google Patents

保护动物防御病原细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益作用的基于rna的治疗方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抑制细菌中基因表达的方法，其在本文中称为抗菌基因沉默(Antibacterial Gene Silencing，AGS)。在特定实施方案中，该方法用于通过小非编码RNA以序列特异性的方式靶向致病性因子和/或必需基因来保护植物和动物防御致病性细菌。该方法还可用于增强共栖或共生细菌的有益作用和/或生长。本发明涉及将小RNA实体以RNA提取物的形式、或包埋在植物细胞外小泡(EV)的形式外源递送到细菌上，用于减少细菌生长、存活和/或致病性。本发明还描述一种以快速、可靠和具有成本效益的方式鉴定具有抗菌活性、并且具有进一步开发成抗感染剂潜力的小RNA的方法。此外，后一种方法有助于快速表征来自任何细菌物种的任何基因。

Description

保护动物防御病原细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益作 用的基于RNA的治疗方法
技术领域
发明概述
本发明涉及抑制细菌中基因表达的方法，其在本文中称为抗菌基因沉默(Antibacterial Gene Silencing，AGS)。在特定实施方案中，该方法用于通过小非编码RNA以序列特异性的方式靶向致病性因子和/或必需基因来保护植物和动物防御病原细菌。该方法还可用于增强共生或共栖细菌的有益作用和/或生长。本发明涉及将小RNA实体以RNA提取物的形式、或包埋在植物细胞外小泡(EV)的形式外源递送到细菌上，用于减少细菌生长、存活和/或致病性。本发明还描述一种以快速、可靠和具有成本效益的方式鉴定具有抗菌活性并且具有进步一开发为抗感染剂潜力的小RNA的方法。此外，后一种方法有助于快速表征来自任何细菌物种的任何基因。
背景技术
现有技术描述
植物免疫***概述
植物免疫***的第一层涉及与病原体或微生物相关的分子模式(Pathogen-或Microbe-Associated Molecular Pattern，PAMP或MAMP)的识别，这些分子模式是由表面定位的模式识别受体(PRR)感测到的保守微生物特征(1)。配体结合后，这些受体会在PRR复合物上引发复杂的磷酸化级联反应，从而导致PAMP触发的免疫(PTI)(1)。为使疾病发生，病原体分泌抑制PTI的效应子(2)。例如，革兰氏阴性细菌丁香假单胞菌致病变种番茄(Pseudomonas syringae pv.tomato)菌株DC3000(Pto DC3000)向植物细胞中注入36种III型分泌的效应子，以抑制PTI(3)。这种细菌还会产生冠菌素(Coronatine)(COR)，这是一种对致病性至关重要的植物毒素(4)。植物已经进化出疾病抗性(R)蛋白，它们可以感知病原体效应子的存在，从而触发宿主的抗逆防御(counter-counter defense)(5)。大多数R蛋白都属于核苷酸结合结构域(NBD)，即富含亮氨酸的重复(NLR)超家族，它们也存在于动物体内(2，5)。他们直接或间接识别病原体效应子，并产生效应子触发的免疫(ETI)，这是一种有效的免疫反应，其与PTI明显重叠但幅度更大(6、7)。
转录后基因沉默(PTGS)控制宿主-病原体的相互作用
PTGS是一种保守的转录后基因调控机制，其已被广泛表征为通过靶向和降解病毒转录本而在植物中的天然抗病毒防御反应(8)。植物中RNA沉默或RNA干扰(RNAi)的核心机制涉及RNase III酶DICER-LIKE(DCL)蛋白对双链RNA(dsRNA)的识别和加工，从而导致产生20-25nt长的短干扰RNA(siRNA)双链体。这些siRNA双链体与Argonaute(AGO)蛋白结合，后者是RNA诱导的沉默复合物(RISC)的主要组分。随后，在AGO蛋白上的链分离形成一个成熟的RISC，其由AGO和单链RNA(引导链)组成，而乘客链(passenger strand)则被降解。引导小RNA将AGO-RISC指导到序列互补的mRNA靶标上，导致它们的内切核酸裂解和/或翻译抑制。在过去十年中，还发现几种内源性短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)来协调针对非病毒病原体的PTI和ETI反应(9)，这暗示PTGS在调节植物免疫***中的关键作用。
在植物中，可移动的小RNA可以触发邻近细胞以及远端组织中的非细胞自主沉默(10)。它们对于在感染之前启动抗病毒防御尤为重要(10)。非细胞自主沉默对于在植物细胞及与其相互作用的非病毒病原体、寄生性或共生性生物之间的沉默信号的转位也很关键，细菌除外，该方法尚未证明对细菌是靶向性的(11)。这种天然的跨界(cross-kingdom)调控机制最近在植物与真菌的相互作用中已经显著表征(12-17)。例如，发现特定植物miRNA被输出到真菌病原体黄萎病菌(Verticillium dahliae)的菌丝中以触发毒力因子的沉默(14、17)。另一方面，内源性灰霉病菌(B.cinerea)小RNA可以输出到植物细胞中，使植物防御基因沉默(16)，突出了植物和真菌病原体之间的双向跨界(bi-directional cross-kingdom)的RNAi。虽然对宿主细胞和真菌细胞之间小RNA/dsRNA转运的机制知之甚少，但在吸器外间质(extrahaustorial matrix)中大量小泡的存在表明它们可能在两种生物之间传递沉默信号(18)。与此假说相一致的是，两项最新研究提供证据，证明植物细胞外小泡(EV)对于将抗真菌小RNA递送到灰霉病菌细胞中以及将抗卵菌(anti-oomycete)小RNA递送到辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)细胞中是必不可少的(17，19)。
可以利用跨界RNAi提供对具有典型RNA沉默机制的真核病原体的防御
最初是通过表达与给定寄生物或害虫的重要或致病性因子具有同源性的dsRNA来证明跨界RNAi的生物学相关性，前提是所述寄生物或害虫具有典型的RNAi机制(例如，功能性DCL和AGO蛋白)。迄今为止，这种宿主诱导基因沉默(HIGS)技术已成功用于保护植物抵御昆虫、线虫、卵菌、真菌和寄生植物的侵袭和捕食(WO 2012/155112、WO 2012/155109、CA2799 453、EP 2405013、US 2013/177539、15、20、21))。例如，HIGS赋予针对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和灰霉病菌的全面保护，通过在真菌感染之前将相关的外源dsRNA或siRNA喷洒到野生型植物内，这种现象得到充分的体现(15、20、21)。后一种现象称为喷洒诱导基因沉默(Spray-Induced Gene Silencing，SIGS)，让人联想到“环境RNAi”，其是涉及从环境摄取RNA的过程，最初描述见于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegan)和某些昆虫中(21、22)。因此，HIGS/SIGS被认为是旨在将R基因或PAMP受体引入农业相关作物的常规育种或基因工程的有力补充、或甚至有时是替代(5、23、24)。此外，该技术提供更持久、更环境友好的植物保护解决方案，这可能有助于减少农药的使用，在某些情况下，农药的使用可能对人类健康和环境产生重大影响。
HIGS/SIGS技术的当前限制
HIGS/SIGS技术受到以下事实的限制，即，表明它们仅仅针对具有典型RNA沉默机制的植物病原体和寄生物具有功能。例如，针对禾谷镰刀菌的SIGS至少部分依赖于dsRNA的摄取、以及真菌DICER-LIKE 1蛋白的进一步加工(21)。到目前为止，还没有针对不具有典型的RNAi机制的植物病原体的HIGS/SIGS实例，例如发明人在此处使用的细菌病原体，在其基因组中不包含典型的真核样RNA沉默因子，如S.Ghag在2017年的综述(22)中所述。这就是为什么至今尚未使用基于RNA的沉默技术保护植物抵御细菌病原体侵害的原因。这是一个相当大的限制，因为细菌病原体会对农业食品的质量和生产产生重大影响，从而导致全球范围内的重大经济损失。例如，细菌病原体，例如假单胞菌(Pseudomonas)、雷尔氏菌(Ralstonia)、木杆菌(Xylella)、黄单胞菌(Xanthomonas)会引起多种栽培植物的感染(25)。除致植物病细菌外，动物病原细菌也对人类和动物健康构成重大威胁。2009年，欧洲药品管理局(European Medicines Agency)和欧洲疾病预防控制中心(European Centrefor Disease Prevention and Control)的联合报告强调该担忧。例如，他们估计，在欧盟感染耐多药(MDR)细菌的400,000名患者中，每年约有25,000名患者死于耐抗生素菌株，由于这种MDR细菌增多，该数字预期会上升。这将导致额外的医疗保健费用，每年造成15亿欧元的经济损失(65-66)。此外，越来越多的证据表明，未经处理的栽培植物(例如生蔬菜)是传播人类食源性感染的载体(26-29)。例如，在亚的斯亚贝巴(埃塞俄比亚)的不同代销点种植的生菜和青椒中回收了具有药物抗性的沙门氏菌(Salomonella)和志贺氏菌(Shigella)，因此为消费者提供接种的来源(26)。
一些作者推测，通过使细菌细胞与长dsRNA接触，有可能影响细菌的生长。例如，WO2006/046148提出控制可摄取长dsRNA片段(＞80个碱基对)的害虫(据推测其中包括细菌)的增殖。然而，WO 2006/046148的发明人没有提供任何细菌对如此长的RNA片段敏感的实验证据(他们的实施例仅公开dsRNA对线虫的作用)。相反，本文的发明人证明细菌对长的dsRNA不敏感，这表明WO 2006/046148的发明人提出的假设在靶向原核细胞时无效。
发明内容
发明目的
在本发明中，作者在此首次表明植物小RNA可以通过序列特异性方式有效抑制细菌性植物病原体的基因表达，这种现象在本文中称为“抗菌基因沉默”(AGS)。该调节机制特别显示在两种不同的革兰氏阴性致植物病细菌种中起作用，表明尽管存在包含复杂的双层膜结构(细菌内膜和外膜)的细胞壁，细菌细胞仍可以摄取植物的小RNA。这是出人意料的结果，因为过去从未显示过植物小RNA可以穿透细菌磷脂双层或在病原细菌细胞内被动或主动转运。此外，该现象不限于植物病原细菌，因为发明人还证明植物小RNA可以在典型的革兰氏阴性人病原细菌中触发AGS，点明本发明的广泛潜力。
然而，尽管存在所有这些偏见，发明人的发现表明，通过使细菌细胞与携带与一个或多个细菌靶基因具有序列同源性的小RNA接触，实际上有可能直接沉默任何细菌基因，例如，毒力因子、必需基因或人工报告子基因。这些小RNA可以由所述植物细胞稳定表达，以保护它们抵御一种或多种细菌病原体的侵害。或者，可以在将它们外源施用至将要遇到靶向的病原细菌的植物或动物组织表面或内部，从而减弱所述病原细菌的致病性和生长。因此，与迄今为止所认为的相反，小RNA的定向沉默可用于有效地敲除植物和动物细菌病原体的基因表达，所述植物和动物细菌病原体不具有真核样RNA沉默机制并且甚至具有双层膜。
细菌细胞对这种外源递送的小RNA的出人意料的敏感性，可以有目的地用于抗菌应用，并且可以设想采用多种治疗来减少植物和动物细菌病原体的存活、致病性和/或生长。
最后，发明人采用一种基于体外的测定方法，以快速、可靠、和具有成本效益的方式鉴定具有抗菌活性的小RNA。因此，预期本发明将被广泛用于(i)保护植物和动物防御细菌病原体，(ii)增强共生或共栖细菌的有益作用和/或生长，和(iii)表征在任何细菌物种中任何基因的功能。
发明的详细描述
概述
在下面的结果中，发明人表明AGS是一种有效的技术，可通过单独或同时靶向细菌致病性所需的关键基因来增强对细菌感染的防御。它们在拟南芥稳定的转基因植物中显著地组成性表达小RNA，这些小RNA与革兰氏阴性细菌Pto DC3000的两个主要毒力因子(称为Cfa6和HrpL)具有同源性，并且发现与表达这些小RNA的植物细胞接触时，这种细菌病原体的毒力和生长显著降低。在表达针对毒力因子HrpG、HrpX和RsmA的小RNA的拟南芥(Arabidopsis)转基因植物中也观察到增强的针对芸苔黄单胞菌芸苔致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)(Xcc)的保护，该菌是黑腐病的致病菌，而黑腐病是十字花科作物最具有破坏力的疾病之一。这些数据表明，AGS可用于保护植物抵御不相关的农业相关植物病原体的侵害。
其还表明，在表达抗Cfa6和抗HrpL siRNA的拟南芥转基因植物中观察到的毒力降低与Pto DC3000中两个靶向毒力因子表达的特异性降低有关。发现这种体内抗菌基因沉默现象不仅对这些内源性胁迫反应性毒力基因有效，而且对在Pto DC3000基因组中组成性表达的异源报告基因也有效。因此，这些发现突出表明，细菌细胞尽管缺乏典型的真核生物样RNA沉默机制，但其实际上对植物编码的小RNA的作用敏感。其还提供证据，证明植物中产生的人工小RNA可以诱导细胞外细菌病原体中的基因沉默，表明这些小RNA必需通过牵涉细胞外植物小RNA的不同种群的机制从宿主细胞输出至细菌细胞(见下文)。
令人惊讶的是，不仅在遗传修饰的植物上观察到这种沉默效果，以便稳定表达与Cfa6和HrpL基因具有同源性的小RNA，而且在用含有抗Cfa6和抗HrpL siRNA的总RNA预处理、然后接种Pto DC3000的WT植物上也观察到这种沉默效果。有趣的是，发明人还发现，针对Pto DC3000或革兰氏阴性人病原细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的基因的体外合成的双链小RNA也胜任AGS。这些发现进一步支持这样的事实，即尽管存在双层膜，小RNA仍可到达细菌的细胞质，并且尽管缺乏典型的真核样RNAi机制，小RNA仍可以在各种原核细胞中触发基因沉默。
另外，通过产生表达小RNA的HrpL抗性版本的重组细菌，其在小RNA靶向的区域中包含尽可能多的沉默突变(这些突变旨在改变小RNA与HrpL mRNA的结合，但产生相同的蛋白质序列)，发明人表明沉默HrpL不再有效。此外，他们观察到，在外源应用含有有效抗HrpL小RNA的总RNA时，这种重组细菌的毒力不变。因此，这些发现提供令人信服的实验证据，表明针对HrpL基因的小RNA对AGS和细菌致病性的抑制均具有因果关系。
发明人继续进一步研究在响应外源性携带抗菌RNA的总RNA时，哪些RNA实体负责观察到的AGS现象。有趣的是，通过从表达靶向Cfa6和HrpL基因的嵌合发夹的转基因植物中提取的总RNA中分离出小RNA和长RNA物种，他们表明向植物外源递送小RNA级分触发抗菌作用，而用长的RNA级分处理是无效的。此外，发明人表明，来自IR-CFA6/HRPL参考品系的总RNA提取物对触发AGS或降低发病不够有效，该参考品系在DCL2、DCL3和DCL4基因中发生突变，因此抗Cfa6和抗HrpL siRNA的生物合成受到损害。总的来说，这些发现提供令人信服的证据，即小RNA而不是其长dsRNA前体(除非它们在植物原位被加工成小RNA)，是造成AGS的RNA实体。这与之前在秀丽隐杆线虫和植物食草动物中报告的专门依赖于长dsRNA(30-36)、或与在真核丝状病原体灰霉病菌和禾谷镰刀菌中报告的由dsRNA或siRNA触发(15、21)的环境RNAi有很大区别。
重要的是，发明人还证明，外源应用含有针对Cfa6和HrpL基因的有效小RNA的总RNA，可以在农业相关的植物番茄(Solanum lycopersicum)中有效降低Pto DC3000的生长和致病性，番茄是该细菌的天然宿主。因此，可以预见的是，可利用这种基于RNA的生物防治方法(以基于序列的高选择性)，用于防御广泛的细菌病原体。还可以预见，将与毒力因子和/或必需基因具有序列同源性的小RNA施用于植物或动物各种组织的表面上(或内)，将显著减少细菌感染。此外，可以通过同时靶向来自各种植物或动物细菌病原体的必需基因、和/或毒力因子，容易地设计该方法来控制多种细菌病原体。因此，AGS代表一种新的环境友好的基于RNAi的技术，可以保护植物和动物两者防御细菌疾病。
在以下结果中，发明人还研究在植物小RNA向细菌细胞的运输中EV的可能作用。他们发现至少有两个具有抗菌活性的EV群体，其中一个是大尺寸，在抑制细菌发病机理中具有充分的活性，另一个是较小的EV，具有中等较少的活性。此外，他们表明，将这些抗菌小RNA包埋在这些EV中保护抗菌小RNA免于微球菌核酸酶(Mnase)的消化，从而突出植物EV在田间条件下和基于RNA的治疗学中未来疾病管理策略中的潜力。有趣的是，发明人还发现，不与蛋白质结合的非原质体EV游离的抗菌小RNA，在抑制发病机理中也具有充分的活性。这些新颖的小RNA种类在这里被称为细胞外游离小RNA或“efsRNA”，并且对Mnase消化敏感。因此，发明人得出结论，IR-CFA6/HRPL转基因植物的非原质体由至少三个功能性抗菌小RNA群体组成，其是包埋在大EV中、包埋在较小EV中或以游离形式存在。
发明人还使用已经建立的农杆菌介导的烟草叶子的瞬时转化来瞬时表达小RNA，接着将相应的候选抗菌siRNA与细菌细胞一起体外孵育。这种方法尤其可用于确定针对HrpL基因的siRNA，与同时靶向Cfa6和HrpL基因的siRNA相比，可同样有效地预防PtoDC3000诱导的气孔重新打开。此外，发明人已经证明，小RNA的体外合成是筛选触发抗菌作用(例如，细菌基因沉默和抑制细菌诱导的气孔重新打开)的候选小RNA的简便、快速和可靠的方法。他们还将体外小RNA合成方法与基于液滴的微流体***相结合，显示针对来自PtoDC3000的保守基因GyrB或FusA的siRNA可以在体外极大地改变细菌的生长，从而鉴定出新型杀菌剂。因此，可以预见的是，这种基于瞬时烟草或体外合成的候选小RNA，接着将相应的小RNA与细菌细胞进行孵育，这在未来将被学术实验室和工业界广泛采用，以鉴定对细菌基因表达和/或特定表型(例如，细菌生长、存活、代谢活动)具有强烈影响的小RNA。还可以预期，本文所述的AGS技术将通过基于新颖RNA的反向遗传方法广泛用于表征细菌基因的功能。例如，此方法可用于首次证明HrpL在Pto DC3000诱导的气孔重新打开中的作用，以及GyrB和FusA在Pto DC3000的存活或适应性中的作用。最后，由于工业界已经以经济有效的方式使用烟草植物以生产高产量的重组蛋白或小泡样颗粒(参见Medicago Inc.的EP2610345)，因此它们将可能被用于生产候选小RNA，特别是在可以良好保护它们免受核酸酶降解的EV中生产候选小RNA，以用于未来在作物中基于RNA的生物防治应用。
上述发现，以及已知哺乳动物细胞表达的长dsRNA触发有力的抗病毒干扰素反应的事实(37)(这与在植物细胞中的情况不同)，促使本发明人评估是否可以采用植物作为生物反应器来生产针对动物病原细菌的小RNA。为此，他们已经使用农杆菌介导的瞬时转化在烟草叶子中瞬时表达特定的反向重复序列构建体，并进一步将相应的RNA提取物(包含抗菌小RNA)与人病原细菌铜绿假单胞菌的细胞进一步孵育。通过这样做，他们发现这些植物的小RNA确实能够触发铜绿假单胞菌中的人工报告子基因以及一些内源管家基因的AGS。他们特别表明，含有针对多个必需基因的siRNA的植物RNA提取物在体外条件下触发铜绿假单胞菌菌株的生长减少。此外，发明人已经进行概念验证实验，证明体外合成的抗菌小RNA与基于液滴的微流体***相结合，也是快速鉴定具有杀菌活性的候选小RNA的合适方法。抗SecEsiRNA尤其如此，其触发铜绿假单胞菌体外生长的显著减少。因此，可以预见的是，这种基于烟草或体外的瞬时合成候选小RNA，接着将相应的小RNA与靶细菌细胞进行孵育，将被学术实验室和工业界广泛采用，以鉴定可干扰来自动物病原细菌或有益细菌的细菌基因表达和/或特定表型的小RNA。例如，该方法将有助于鉴定可有效沉默抗生素抗性基因的小RNA，并在与给定抗生素同时施用时将进一步用于恢复抗生素敏感性。还可以预期，可采用本文所述的AGS技术来表征来自动物病原细菌和有益细菌的细菌基因的功能。例如，这种方法有助于为SecE、DnaN和GyrB基因作为铜绿假单胞菌的适应性决定因素发挥作用提供证据，从而验证了先前的报道(38-40)。最后，由于工业界已经使用烟草植物来高产量地生产重组蛋白或小泡样颗粒用于药物应用(参见Medicago Inc.的EP2610345)，因此它们很可能会被用于生产抗感染小RNA以用于未来基于RNA的治疗，特别是在可以保护它们免受核酸酶降解的EV中。将植物EV用于小RNA递送和治疗应用的用途特别吸引人，因为这些天然小泡通常不会在哺乳动物细胞中诱导细胞毒性作用，合成的纳米颗粒就是这种情况(41)。
基于所有这些发现，本发明人提出一种抑制细菌中至少一个基因表达的方法，所述方法包括：
i)向至少一个植物细胞引入至少一个特异性靶向至少一个细菌基因的功能性干扰RNA分子(iRNA)，所述iRNA能够在携带一个或多个所述基因的细菌中诱导一个或多个所述基因的序列特异性沉默，或者
ii)在细菌感染之前和/或之后在植物或动物组织上递送小RNA，例如，含有其的细胞外小泡或非原质体流体、或细胞外游离RNA，或
iii)直接向细菌细胞上递送小RNA，例如，含有其的细胞外小泡或非原质体流体、或细胞外游离RNA。
在一个实施方案中，该方法允许通过在植物细胞中表达iRNA分子(siRNA和miRNA的前体)、ii)回收所述植物细胞的非原质体流体(APF)、iii)在动物组织上、动物(例如，器官、体液)内或细菌细胞上递送在所述APF中存在的小RNA，来靶向一个或多个细菌基因。这种方法将在公共卫生、特别是在细菌感染管理中具有主要作用。
更准确地说，该技术将提供一种控制植物和动物中的细菌感染的方法，由于该方法基于序列的高选择性，因此其减少抗生素处理，而不会对有益细菌或环境产生负面影响。
此外，该策略将提供更加持久的抗病性，而一些常规处理并非如此。
最后，可以预期的是，本文描述的技术也将可用于控制来自有益细菌的基因的表达，以增强它们的增殖和/或对宿主动物的有益作用。
除这些优点之外，所提出的方法还具有成本效益并且相对易于工业化。实际上，设计和生产针对细菌基因的有效人工iRNA(例如，siRNA)的方法，当从本氏烟草叶子中瞬时表达时仅需要几周，而在体外合成时甚至只需一天。此外，在出现抗siRNA的细菌时，从头重新设计和生产人工iRNA相对容易。最后，有可能产生针对特定细菌种类、或针对广泛的病原细菌菌株的iRNA，从而根据所需的基于RNA的治疗，提供靶向的或广谱的处理方法。
本方法/用途可以在体内或体外进行。“体外”在本文中是指要求保护的方法或用途的步骤是使用生物组分(例如，细菌细胞)来进行，所述生物组分已经从其通常的宿主生物(皮肤、粘膜、粪便等)中分离、或直接生长在体外介质中(在没有宿主生物的情况下)。当本发明的小RNA直接与细菌细胞接触时就是这种情况。
“体内”或“植物原位(in planta)”在本文中是指所要求保护的方法或用途的步骤是使用完整的生物(例如，完整的个体)进行。当本发明的小RNA直接与含有在其周围的组织的细菌细胞接触，特别是触发细菌细胞内的毒力因子的沉默时，认为本发明的方法/用途在“半体内”测定中进行。
本发明小RNA的有用前体
本发明涉及至少一种功能性干扰RNA(iRNA)用于抑制细菌细胞中至少一个基因表达的用途。
如本文所用，术语“功能性干扰RNA”(功能性iRNA)是指，能够诱导特别是细菌细胞中至少一个细菌基因序列特异性沉默过程的RNA分子。特别地，所述功能性干扰RNA分子可以是：i)小干扰RNA，其在本领域中公知为小或短干扰RNA(siRNA)分子(单链体或双链体)、或其前体，或ii)微RNA(miRNA)分子(单链体或双链体)、或其前体。
本文中的术语“siRNA的前体”或“siRNA前体”是指可以在植物(或植物提取物)中直接或间接加工成siRNA双链体的RNA分子。可以直接加工的siRNA前体的实例包括长双链RNA(长dsRNA)，而可以间接加工的siRNA前体的实例包括长单链RNA(长ssRNA)，可以将其用作生产可加工的长dsRNA的模板。
本文中的术语“miRNA的前体”或“miRNA前体”是指可在植物(或植物提取物)中加工成miRNA双链体的RNA分子。miRNA前体的实例包括主要的miRNA前体(pri-miRNA)和pre-miRNA，包含发夹环。
值得注意的是，编码所述前体分子的质粒、或载体、和其他DNA构建体或病毒载体也包括在“功能性干扰iRNA”的定义中。
为靶向细菌中的多个基因，本发明的方法可以使用i)同时靶向多个目的细菌基因的几种不同iRNA的混合物，或者ii)靶向几种不同目的细菌基因的嵌合iRNA，或者iii)这些嵌合iRNA中的任意的混合物。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法/用途包括将一个或几个功能性iRNA作为前体引入真核细胞(例如，植物细胞)中，以在植物原位产生小RNA(例如，siRNA或miRNA)，所述小RNA可以被进一步配制并用于防止细菌感染。
在一个更特定的实施方案中，本发明的功能性iRNA是长单链RNA分子(此后称为“长ssRNA”)。这样的长ssRNA可以通过植物转基因产生，通过植物的RNA依赖性RNA聚合酶转化为长dsRNA分子，并通过植物DCL蛋白进一步加工为siRNA。或者，长ssRNA可由植物RNA病毒产生，并在病毒复制期间(作为复制中间体)和/或通过植物RNA依赖性RNA聚合酶的作用进一步转化为长dsRNA分子。产生的病毒dsRNA随后通过植物DCL蛋白加工成siRNA，其随后通过称为病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法触发序列特异性沉默(11)。
如本文所用，术语“长ssRNA”表示包含至少50个碱基，更优选80至7000个碱基的单链的单链结构。当由植物转基因产生时，长ssRNA可包含80至7000个碱基，但是当由植物重组RNA病毒产生时，优选包含80至2000个碱基。
在一个更特定的实施方案中，本发明的功能性iRNA是长双链RNA分子(以下称为“长dsRNA”)，其作为siRNA前体，并且可在植物原位由DCL蛋白和植物基因组编码的其他小RNA生物发生因子加工成siRNA。
如本文所用，术语“长dsRNA”表示包含至少50个碱基对、更优选80-7000个碱基对的第一(正义链)和第二(反义)链的双链结构。
在植物或植物细胞中，长dsRNA可以加工成小的RNA双链体。这样的长dsRNA有利地是嵌合dsRNA，即它们具有与多个细菌基因具有同源性的序列(参见下文)。
在一个实施方案中，本发明的功能性iRNA是长dsRNA，其可被植物细胞中的DCL蛋白切割以产生siRNA。
本发明的长dsRNA可以由发夹结构通过以下产生：通过正义反义转录构建体、通过进一步由植物RNA依赖性RNA聚合酶用作底物的人工正义转录本构建体、或通过VIGS产生。更精确地，它们可以包含凸起、环或摆动碱基对以调节dsRNA分子的活性，从而介导细菌细胞中有效的RNA干扰。本发明的长dsRNA分子的互补正义和反义区可以借助于基于核酸或基于非核酸的接头连接。本发明的长dsRNA还可包含一个双链体结构和一个环结构以形成对称或不对称的发夹二级结构。
因此，在一个实施方案中，本发明的功能性iRNA是包含发夹(例如，miRNA前体)的、长的(至少50个碱基对、更优选80至400个碱基对、100至200个碱基对、125至175个碱基对、特别是约150个碱基对)dsRNA。
如本申请的实施例所示，将dsRNA引入植物真核细胞，通过小RNA而不是长dsRNA的作用，在细菌细胞中诱导细菌基因的序列特异性沉默(实施例6和图7)。这意味着细菌细胞仅在其与小RNA实体直接接触时才对AGS敏感。使细菌直接与小RNA的前体(长dsRNA)接触将不会有沉默作用，因为这些原核细胞不具有将其正确加工成功能性抗菌iRNA的典型的真核样RNAi机制。
本发明的小RNA
事实上，通过使其与尺寸小于50个碱基对的小RNA种类接触，有可能在细菌细胞中直接抑制细菌基因的表达(图8和图10)。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明的功能性iRNA是小RNA，例如，siRNA或miRNA。这些小RNA具有短的尺寸，其小于50个碱基对，优选地在15至30个碱基对之间，更优选地在19至27个碱基对之间，甚至更优选地在20至25个碱基对之间。
这些小RNA可以配制成药物或美容组合物，例如，配制成局部组合物(topiccomposition)或可喷洒的液体组合物(见下文)。在这种情况下，可以将含有所述小RNA的所述组合物直接施用于组织或细菌。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的功能性iRNA是“siRNA”，其指“siRNA双链体”或“siRNA单链体”。
更具体地，术语“siRNA双链体”指包含至少15个碱基对、优选至少19个碱基对的第一(正义链)和第二(反义)链的双链结构或双链体分子；优选地，所述反义链包含与靶基因的转录本互补的至少15个连续核苷酸的区域。这些siRNA双链体可以由长dsRNA前体通过植物DCL蛋白加工产生。如以下所公开的，他们也可以从头化学合成。它们具有小于50个碱基对的短尺寸，优选地在15至30个碱基对之间，更优选地在19至27个碱基对之间，甚至更优选地在20至25个碱基对之间。
以下实验部分(实施例9和图10)显示，当本发明的小RNA在双链结构中时，它们是有效的。用体外从头合成的siRNA双链体已经证明这一点，据认为，用植物提取物观察到的生物学作用至少部分是由于植物分泌的这些siRNA双链体。
如本文所用，术语“siRNA单链体”或“成熟siRNA”指这样的单链体分子(也称为“单链”分子)：源自siRNA双链体、但已在植物细胞的RISC机制中成熟、并被装载进AGO蛋白中和/或与其他RNA结合蛋白结合。如以下所公开的，他们也可以从头化学合成。它们具有小于50个碱基的短的尺寸，优选地在15至30个碱基之间、更优选地在19至27个碱基之间、甚至更优选地在20至25个碱基之间。
在另一个实施方案中，本发明的功能性iRNA是“miRNA”，其表示“miRNA双链体”或“miRNA单链体”。
更具体地，术语“miRNA双链体”指包含至少15个碱基对、优选至少19个碱基对的第一(正义链)和第二(反义)链的双链结构或双链体分子；优选地，所述反义链包含与靶基因的转录本互补的至少15个连续核苷酸的区域。这些miRNA双链体也可能含有凸起。这些miRNA双链体可以由miRNA前体通过植物DCL蛋白加工产生。如以下所公开的，他们也可以从头化学合成。至于双链体siRNA，其具有小于50个碱基对的短的尺寸，优选地在15至30个碱基对之间、更优选地在19至27个碱基对之间、甚至更优选地在20至25个碱基对之间。
如本文所用，术语“miRNA单链体”或“成熟miRNA”指这样的单链体分子(也称为“单链”分子)：源自miRNA双链体、但已在植物细胞的RISC机制中成熟、并被装载进AGO蛋白中和/或与其他RNA结合蛋白结合。如以下所公开的，他们也可以从头化学合成。如单链体siRNA，其具有小于50个碱基的短的尺寸，优选地在15和30个碱基之间、更优选地在19和27个碱基之间、甚至更优选地在20和25个碱基之间。
设计iRNA(例如，长dsRNA/siRNA/miRNA)的方法在本领域中是可获得的，并且可用于获得具有这些性质的长dsRNA、siRNA和miRNA的序列。
本发明人在本文中显示(实施例9，图10)，可能使用人工体外合成的双链siRNA，以(i)抑制细菌基因表达，(ii)抑制细菌致病性，和(iii)在体外触发杀菌作用(参见图10)。
本发明包括合成、半合成或重组iRNA的用途，所述iRNA仅含有核糖核苷酸或既含有脱氧核糖核苷酸又含有核糖核苷酸。本发明还包括包含一个或多个修饰的修饰的iRNA分子的用途，所述修饰增加体内对核酸酶降解的抗性和/或改善细胞稳定性(例如，小RNA 3'末端甲基化、锁核酸(LNA))、被细菌细胞摄取(例如，肽载体)或细菌细胞内的沉默效率。本发明的iRNA可以包括在糖、磷酸和/或碱基部分修饰的核苷酸，和/或5'或3'末端、或核苷酸间键的修饰。
本发明中定义的化学合成的dsRNA分子可以由分别合成的两个不同的寡核苷酸组装而成。或者，可以使用可裂解的接头(例如，基于琥珀酰基的接头)串联合成RNA双链体或RNA前体分子的两条链。可选择的，可以从***到本领域技术人员已知的和商业上可获得的DNA或RNA载体中的转录单元(体外或在植物原位)表达本发明的RNA前体分子。值得注意的是，后一种方法可以包括转录表达长双链折回结构的转基因、通过位于转基因的每个部分且方向相反的启动子的正义反义转录本、miRNA前体、初级miRNA转录本、或正义转录本，其可在某些情况下(例如，被内源性或外源性22nt长miRNA靶向)被植物RNA依赖性RNA聚合酶用作底物以生成dsRNA。
本发明的iRNA分子，特别是本发明的小RNA，在携带一个或多个所述基因的细菌中优选使一个或多个靶细菌基因的表达水平降低至少30％、优选降低至少60％、更优选降低至少80％。可以通过本领域熟知的方法在RNA或蛋白质水平上评估一个或多个细菌基因的沉默，例如，通过实时定量RT-PCR(RT-qPCR)、Northern印迹、FACS、免疫组织学分析或Western印迹分析。
在本发明的上下文中，通过人工iRNA分子对一个或多个细菌基因的沉默(可能是部分的或全部的)，应足以对细菌产生所想要的作用，例如，在生物中降低所述细菌的细菌致病性或传染性。
在优选的实施方案中，本发明的小RNA具有15至30个碱基对的尺寸，并特异性抑制至少一个选自以下的细菌基因：PscC、PscJ、PscN、VirB1、VirD4、TssM、TssJ、TssB/TssC、TssE、VgrG、Hcp、DotC、DotD、DotF、DotG和DotH、LuxS、Luxl/LuxR、AroA、LysC、CysH、GalU、PbpA、PbpB、PbpC、Pigma70、Sigma 54、Arc、Ptr、Nor、Mep、Cme、TEM、SHV、GES、VIM、NDM、AmpC、VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、CasE、OXA-28、OXA-14、OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116、GES-9、FtsZ、FtsA、FtsN、FtsK、FtsI、FtsW、ZipA、ZapA、TolA、TolB、TolQ、TolR、Pal、MinCD、MreB和Mld。
靶细菌
本发明的用途/方法可用于使任何类型的细菌(致病或非致病；革兰氏阳性或革兰氏阴性)中的基因沉默，包括已知与动物生物体相关的有益细菌。
在优选的实施方案中，所述靶细菌是人病原细菌。
可以使用本发明的用途/方法靶向的病原细菌的非限制性实例包括：
以色列放线菌(Actinomyces israelii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、包柔氏菌属(Borrelia sp.)(伯氏(burgdorferi)、伽氏(garinii)、埃氏(afzelii)、回归热(recurrentis)、麝鼩(crocidurae)、达氏(duttonii)、赫氏(hermsii)等)、布鲁氏菌属(Brucella sp.)(牛(abortus)、犬(canis)、马耳他(melitensis)、猪(suis))、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、衣原体属(Chlamydiasp.)(肺炎(pneumoniae)、沙眼(trachomatis))、鹦鹉热衣原体(Chlamydophilapsittaci)、肉毒杆菌属(Clostridium sp.)(肉毒杆菌(botulinum)、艰难(difficile)、产气荚膜(perfringens)、破伤风杆菌(tetani))、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、埃立克体菌属(Ehrlichia sp.)(犬、查菲(chaffeensis))、肠球菌(Enterococcus)(粪(faecalis)、屎(faecium))、大肠杆菌(Escherichia coli)O157：H7、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、克雷伯军团菌(Legionella pneumophila)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、单细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)(麻风(leprae)、结核(tuberculosis))、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、奈瑟氏菌(Neisseria)(淋病(gonorrhoeae)、脑膜炎(meningitidis))、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、星状诺卡菌(Nocardia asteroides)、立克次氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)(伤寒(typhi)、鼠伤寒(typhimurium))、志贺氏菌属(Shigella sp.)(猪痢疾(sonnei)、痢疾(dysenteriae))、葡萄球菌(Staphylococcus)(金黄色葡萄球菌(aureus)、表皮(epidermidis)、腐生(saprophyticus))、链球菌属(Streptococcus sp.)(龙舌兰(agalactiae)、变形(mutans)、肺炎(pneumoniae)、化脓(pyogenes)、绿色(viridans))、福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythia)、***(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法使用靶向有益细菌(例如，共生或共栖细菌)的一个或多个基因的功能性iRNA。该特定实施方案的目的是促进所述细菌的有益作用。在该特定实施方案中，靶细菌基因是这样的因子：其在沉默时促进靶细菌细胞的复制或促进对宿主有益以及正性调节有益化合物(例如，anhormone)、次级代谢产物的产生的途径，所述次级代谢产物(i)改变周围病原体或竞争者的存活/致病性，(ii)激活宿主防御反应(例如，抗微生物肽产生)，(iii)促进从环境中摄取养分(4)增强宿主生物对非生物胁迫条件等的耐受性等。因此，此类细菌靶基因的沉默将导致宿主生物的生长速率增加和/或宿主生物的若干其他可能的有益效果。
在这样的实施方案中，本发明的iRNA应当具有与有益细菌基因的序列同源性，但是与致病细菌基因组、宿主基因组、或宿主定植者和/或与以宿主生物为食的哺乳动物的其他基因组没有序列同源性。
可以用本发明的方法靶向的有益(共生或共栖)细菌的非限制性实例包括：
奈氏放线菌(Actinomyces naeslundii)、殊异韦荣菌(Veillonella dispar)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、肠杆菌(Enterobacteriaceae)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)(长(longum)、双歧(bifidum)、青春(adolescentis)、齿(dentium)、短(breve)、嗜热(themophilum))、迟缓埃格瑟拉菌(Eggerthella lenta)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)(解木聚糖(xylanisolvens)、多型(thetaiotaomicron)、脆弱(fragilis)、普通(vulgatus)、盐藻(salanitronis)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、瘤胃球菌(Ruminococcussp.)(布鲁米(Bromie)、champanellensis、SR1/5)、链球菌属(Streptococcus)(副血(parasanguinis)、嗜酸(salivarius)、嗜热(thermophilus)、猪、化脓(pyogenes)、咽峡炎(anginosus))、乳球菌(Lactococcus)(乳酸(lactis)、格氏(garvieae))、肠球菌(粪、屎、卡塞尔(casseliflavus)、durans、海氏(hirae))、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)、嗜盐四球菌(Tetragenococcus halophilus)、乳杆菌(Lactobacillus sp.)(干酪(casei)、鲁米尼(ruminis)、德尔布吕克(delbrueckii)、布氏(buchneri)、罗伊特氏(reuteri)、发酵(fermentum)、戊糖(pentosus)、淀粉(amylovorus)、唾液(salivarius))、片球菌(Pediococcus)(戊糖(pentosaceus)、克劳森氏(claussenii))、明串珠菌(Leuconostoc)(肠膜(mesenteroides)、乳酸(lactis)、肉质(carnosum)、明胶(gelidum)、柠檬(citreum))、魏斯氏菌(Weissella)(泰国(thailandensis)、朝鲜(koreensis))、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)((土地(terrae)、多粘(polymyxa)、胶质(mucilaginosus)、Y412MC10)、堆肥嗜热芽孢杆菌(Thermobacilluscomposti)、短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、芽孢杆菌(Bacillus)(解淀粉(amyloliquefaciens)、枯草(subtilis)，地衣(licheniformis)、萎缩(atrophaeus)、韦氏(weihenstephanensis)、蜡样(cereus)、苏云金(thuringiensis)、凝结(coagulans)、巨大(megaterium)、硒化(selenitireducens))、热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、盐芽孢杆菌(Halobacillus halophilus)、李斯特菌属(Listeria sp.)、链霉菌属(Streptomycessp.)、真细菌(Eubacterium)(直肠(rectale)、挑剔(eligens)、惰性(siraeum))、化糖梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharolyticum)、和产丁酸的细菌(SS3/4和SSC/2)。
靶细菌基因
本发明的iRNA应与至少一个细菌基因具有足够的序列同源性，以诱导所述至少一个基因的序列特异性沉默。另外，为防止不希望的脱靶效应，本发明的dsRNA、miRNA或小RNA种类与真核宿主基因组或有益细菌，宿主定植者和\或以宿主生物为食的哺乳动物的其他基因组的序列同源性应该几乎不存在(如果不是不存在)。
本发明的iRNA能够抑制至少一个细菌基因的表达。
根据本发明，术语“细菌基因”是指细菌中的任何基因，包括(天然)蛋白质编码基因或非编码基因(其天然存在于细菌中)，和通过重组DNA技术引入细菌中的人工基因。所述靶细菌基因或者对于给定的细菌种类是特异性的，或者在多种细菌种类之间是保守的。优选地，它与真核宿主基因组、宿主定植者和/或以宿主生物为食的哺乳动物的任何基因不具有同源性。这避免对植物宿主、与宿主相关的有益细菌、宿主定植者和/或以宿主生物为食的哺乳动物的附带影响。
在一个优选的实施方案中，所述至少一个细菌基因是细菌毒力因子或细菌的必需基因或抗生素抗性基因。
如本文所用，术语“细菌的必需基因”是指对于细菌细胞生存力必不可少的任何细菌基因。当前提是所有营养素均可获得时，这些基因是维持细菌存活绝对必需的。据认为，细菌必需基因的绝对需要的数量为约250-500。现在，通过使用转座子测序方法，从无关细菌中鉴定出这些必需基因变得相对容易。这些必需基因编码蛋白质以维持中央代谢、复制DNA、确保适当的细胞***，将基因翻译成蛋白质维持基本的细胞结构、并介导进出细胞的转运过程(42)。GyrB、DnaN或SecE基因就是这种情况，发现它们的沉默损害体外铜绿假单胞菌的生长(图12)。
如本文所用，术语“毒力基因”是指已显示出对以下至少一种活性起关键作用的任何细菌基因：致病性、疾病发展、特定宿主组织或宿主细胞环境的定植等。尽管这些活性对于细菌在体外的存活不是必需的，所有这些活性有助于细菌在宿主中生长和/或促进宿主的疾病症状。
在本发明的内容中，本发明的iRNA靶向，例如，分泌***的结构基因，包括III型分泌***的结构基因(例如，PscC、PscJ、PscN)，IV型分泌***的结构基因(例如，VirB1、VirD4)、VI型分泌***的结构基因(例如，TssM、TssJ、TssB/TssC、TssE、VgrG、Hcp)、dot/icm***的基因(DotC、DotD、DotF、DotG和DotH)、群体感应基因(例如，LuxS、Luxl/LuxR)、参与氨基酸合成的必需基因(AroA、LysC、CysH、GalU)、转肽酶(PbpA、PbpB、PbpC)、细菌转录机制的组分(例如，σ70、σ54)、细菌细胞壁的结构组分(肽聚糖生物合成基因)、对细胞***至关重要的基因(例如，FtsZ、FtsA、FtsN、FtsK、FtsI、FtsW)、肌动蛋白的结构同源物(例如，MreB、Mbl)、其他重要的基因，例如，ZipA、ZapA、TolA、TolB、TolQ、TolR、Pal、MinCD、肌动蛋白相关基因(MreB和Mld)、通常的抗生素靶标(参见，全面的抗生素抗性数据库(TheComprehensive Antibiotic Resistance Database)或CARD”，2017，一个生物数据库，其收集并组织在抗微生物抗性基因、蛋白和表型中的参考信息，并覆盖药物类型和抗性机制和结构的所有类型)(67)等，用于预防或治疗由细菌病原体在人或非人动物中导致的疾病。
本发明的iRNA还可抑制抗生素抗性基因的表达，以使得细菌对所述抗生素处理敏感。
这些抗生素抗性基因是，例如：细菌外排泵基因(Arc、Ptr、Nor、Mep、Cme型)、β内酰胺酶的四个分子类别的基因：A类(例如，TEM、SHV、GES型)、B类(例如，金属β内酰胺酶VIM、NDM)、C类(例如，AmpC型)、D类(OXA型)。抗生素抗性基因的非限制性实例包括：VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、CasE、OXA-28、OXA-14、OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116和GES-9，以及其他至关重要的基因，当这些基因在微生物中缺失或失活时导致细菌的死亡，这些列举在全面的抗生素抗性数据库2017(或CARD2017)(67)。这些靶基因还可编码细菌病原体的主要毒力决定因素，例如用于细菌分泌***组装所需要的组分、细菌效应子/毒素的转录激活子、群体感应受体和来自其他所靶向的细菌病原体的特征明确的致病性因子。
在一个优选的实施方案中，所述毒力因子基因或细菌生存力基因或抗生素抗性基因因此选自：PscC、PscJ、PscN、VirB1、VirD4、TssM、TssJ、TssB/TssC、TssE、VgrG、Hcp、DotC、DotD、DotF、DotG和DotH、LuxS、Luxl/LuxR、AroA、LysC、CysH、GalU、PbpA、PbpB、PbpC、Pigma70、Sigma 54、Arc、Ptr、Nor、Mep、Cme、TEM、SHV、GES、VIM、NDM、AmpC、VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、Case、OXA-28、OXA-14、OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116、GES-9、FtsZ、FtsA、FtsN、FtsK、FtsI、FtsW、ZipA、ZapA、TolA、TolB、TolQ、TolR、Pal、MinCD、MreB、和Mld。
在这些实施方案中，iRNA与细菌病原体种类的生存力或毒力基因的必需基因具有有利地序列同源性、但与共生细菌基因组没有序列同源性。该方法的这种有利的实施方案避免了对宿主中存在的共生细菌的附带作用。
本发明的iRNA是，例如双链体小RNA，具有序列SEQ ID NO:108-109(同时靶向铜绿假单胞菌的DnaA、DnaN和GyrB基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:110-111(同时靶向铜绿假单胞菌的RpoC、SecE和SodB基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:112-113(同时靶向铜绿假单胞菌的XcpQ、PscF和PscC基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:114-115(同时靶向铜绿假单胞菌的XcpQ,ExsA和HphA基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:116-117(同时靶向福氏志贺菌(Shigella flexneri)的FtsA、Can、Tsf基因第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:118-119(同时靶向福氏志贺菌的AccD、Der、Psd基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:120-121(同时靶向福氏志贺菌的VirF、VirB、IcsA基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:122-123(靶向福氏志贺菌FusA基因的第一链和第二链的序列)、SEQID NO:124-125(靶向福氏志贺菌Can基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:126-127(靶向福氏志贺菌的Tsf基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:128-129(靶向福氏志贺菌AccD基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:130-131(靶向福氏志贺菌Der基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:132-133(靶向福氏志贺菌Psd基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:134-135(靶向福氏志贺菌VirB基因的第一链和第二链的序列)、SEQID NO:136-137(靶向福氏志贺菌VirF基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:138-139(靶向福氏志贺菌IcsA基因的第一链和第二链的序)、SEQ ID NO:140-141(靶向福氏志贺菌Spa47基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:142-143(靶向福氏志贺菌MukB基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:144-145(靶向福氏志贺菌YbiT基因的第一链和第二链的序列)。
在另一优选的实施方案中，本发明的iRNA靶向以下基因：负调节有益(共生/共栖)细菌生存的基因，或预防其侵入宿主以及与宿主相关的基因、或负控制其碳水化合物代谢和吸收的基因(敲除此类基因可导致增加的细菌滴度)。
本发明的iRNA有利地与来自靶细菌病原体种类的任何这些必需基因或毒力基因或抗生素抗性基因具有序列同源性。
如本文所用，术语“序列同源性”是指具有序列相似性，即核酸序列之间具有足够程度的同一性或对应性的序列。在本发明的上下文中，当至少约80％、或者至少约81％、或者至少约82％、或者至少约83％、或者至少约84％、或者至少约85％、或者至少约86％、或者至少约87％、或者至少约88％、或者至少约89％、或者至少约90％、或者至少约91％、或者至少约92％、或者至少约93％、或者至少约94％、或者至少约95％、或者至少约96％、或者至少约97％、或者至少约98％、或者至少约99％的核苷酸是相似时，两个核苷酸序列具有“序列同源性”。
相反，具有“无序列同源性”的核苷酸序列是具有小于约10％、或者小于约5％、或者小于2％的同一性程度的核苷酸序列。
优选地，通过使用Needleman和Wunsch的算法鉴定相似或同源的核苷酸序列。除非另有说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用以下参数使用GAP版本10获得的值：使用50的GAP权重和3的长度权重以及nwsgapdna.cmp评分矩阵得出的核苷酸序列的％同一性和％相似性；使用8的GAP权重和2的长度权重以及BLOSUM62评分矩阵得出的氨基酸序列的％同一性和％相似性；或其任何等效程序。“等效程序”意指任何序列比较程序，当与由GAP 10版本产生的相应比对进行比较时，该序列比较程序针对所讨论的任何两个序列产生具有相同核苷酸残基匹配和相同序列百分比同一性的比对。
值得注意的是，本发明的iRNA不抑制在真核细胞、或真菌、昆虫、害虫或其他感染植物的病原体中表达的基因。具体而言，本发明的iRNA不抑制具有细菌起源并***其他基因组的致癌基因的表达。更精确地，本发明的iRNA不抑制根瘤农杆菌细菌的致癌基因iiaM和ipt的表达。
嵌合沉默元件
为保护植物抵御由几种细菌病原体引起的疾病的侵害，本发明的方法有利地使用与多于一个细菌基因具有序列同源性的功能性iRNA(以下称为“嵌合iRNA”)。这些嵌合iRNA优选与至少两个、三个、四个或更多个细菌必需基因和/或毒力因子(例如，上述那些)具有同源性。
在一个优选的实施方案中，本发明的iRNA是嵌合iRNA，其抑制至少一个编码如上所定义的细菌细胞的毒力因子或必需基因的基因，以及至少一个编码已知对HIGS敏感的其他病原体或寄生物的毒力因子或必需基因的其他基因。它也可以是来自非细菌性病原体或植物寄生物的毒性次级代谢产物的生物合成所需的基因。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法使用：(i)一个或多个靶向在大量细菌病原体中保守的必需基因或毒力基因的广泛序列区域的iRNA，或(ii)一个或多个靶向来自无关细菌病原体的必需的基因或毒力因子的iRNA。该方法的这种特定实施方案赋予针对多种细菌病原体的广谱保护。本发明的iRNA有利地是如上所述的长dsRNA、miRNA和/或siRNA。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法还包括向植物引入一个或多个dsRNA；其靶向非细菌的寄生物(诸如病毒、真菌、卵菌、昆虫或线虫)的一个或多个基因。在该实施方案中，iRNA针对寄生物的必需基因或毒力基因。靶向寄生物的基因的一个或多个iRNA有利地与靶向细菌基因的iRNA同时递送或共表达。在另一特定实施方案中，本发明的方法包括使细菌和靶向与细菌不同的寄生物(例如，病毒、真菌、卵菌、昆虫或线虫)的一个或多个基因的小RNA接触。在该实施方案中，小RNA针对寄生物的必需基因或毒力基因。有利地，将一个或多个靶向寄生物基因的小RNA与靶向细菌基因的小RNA同时递送或共表达。
这种方法对于同时预防或治疗由细菌病原体和其他寄生物导致的疾病有用。可以使用如上所述的与细菌以及其他病原体/寄生物基因具有序列同源性的嵌合iRNA、或iRNA分子的混合物(其中一些与细菌基因具有同源性、而另一些与来自其他病原体/寄生物的基因具有同源性)进行该方法。
用于产生本发明的小RNA的载体
在一个优选的实施方案中，本发明的长RNA和小RNA是作为细胞外游离RNA分子分离的，其分别直接用于生产植物细胞和靶细菌细胞上。
也可以使用无毒且可降解的层状双氢氧化物(LDH)粘土纳米片携带抗菌dsRNA。它们已经被成功地用于递送抗病毒dsRNA，并且发现可以提供至少20天的病毒防御(43)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的长RNA由重组DNA构建体编码，所述重组DNA构建体促进导入植物细胞和/或促进长RNA在所述植物细胞中的表达。所述重组构建体可以是可商业上可获得的质粒或载体。优选地，其是如下所述的植物表达载体。
因此，在另一方面本发明还涉及植物重组DNA载体(或“DNA构建体”)或植物病毒载体，其包含编码至少一个抑制至少一个细菌基因表达的功能性干扰RNA(iRNA)的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可在真核细胞中表达。
所述功能性iRNA如上文所定义，为短或长的dsRNA、长的ssRNA、siRNA或miRNA，优选地，所述功能性iRNA为长的dsRNA、长的ssRNA、siRNA或miRNA。
所述至少一个细菌基因优选是如上定义的必需或毒力细菌基因、或抗生素抗性基因。
在一个实施方案中，载体是DNA载体。所述DNA载体有利地包含转录单元，所述转录单元包含：转录起始区、转录终止区、和编码本发明的iRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列以允许iRNA分子在真核细胞中表达的方式可操作地连接至所述起始和终止区。
在一个优选的实施方案中，所述真核细胞是能够表达大量iRNA的植物细胞，例如，非常适合农杆菌介导的瞬时转化的本氏烟草叶子。
本发明的DNA载体可以编码本发明的iRNA分子的一条或两条链，或编码自身杂交成dsRNA双链体的单个自身互补链。转录起始区域可能来自针对真核RNA聚合酶II或III(pol II或III)的启动子，包括在植物细胞中有活性的病毒启动子，例如，CaMV 35S启动子，因为这些启动子的转录本在植物生物的所有细胞中都高水平表达。适用于在植物细胞中表达异源基因的多种启动子是本领域可获得的。它们可以例如从植物病毒获得。它们包括组成型启动子，即，大多数环境条件下在大多数组织和细胞中均具有活性的启动子，以及仅在或主要在某些组织或某些细胞类型中具有活性的组织特异性或细胞特异性启动子，以及响应化学刺激而活化的可诱导启动子。另外，可在本发明中使用用于从细菌病原体保护植物的器官或组织特异性启动子包括，特别是，在与细菌病原体的进入和增殖有关的组织/细胞类型(例如，在hydathodes、防御细胞、木质部薄壁组织细胞、和毛状体基部周围的细胞)中有活性的启动子。
所述转录终止区优选被真核RNA聚合酶识别，更优选被Pol II或Pol III识别。例如，所述转录终止子可以是TTTTT序列。
适于dsRNA分子表达的大量DNA载体是本领域技术人员已知的并且是商业上可获得的。合适载体的选择和在其中***DNA构建体的方法是众所周知的。能够稳定表达dsRNA分子的重组载体可以转化进入植物原位，并在靶细胞中持续存在。载体的选择取决于预期的宿主和所述宿主的预期转化方法。
在一个实施方案中，载体是病毒载体，优选植物病毒载体。所述病毒载体优选选自各种植物RNA病毒(例如，烟草花叶病毒、烟草拨浪鼓病毒、土豆X病毒、大麦条纹花叶病毒、番茄丛矮病毒)，其可用于植物细胞通过VIGS产生大量小RNA(11)。在此，病毒载体的选择还取决于预期的宿主和所述宿主的预期感染方法。
本发明还包含含有一个或多个标记基因的重组DNA载体或病毒载体，其允许选择转化的宿主细胞。
在一个优选的实施方案中，本发明的DNA或病毒载体包含编码如上所定义的两个、三个、或四个功能性干扰RNA(iRNA)基因的多核苷酸序列，因此能够抑制两个、三个、或四个不同的细菌基因。技术人员可以通过常规方法鉴定iRNA的最佳组合。超过四个靶基因的组合也包括在本发明内。
在一个实施方案中，本发明的DNA载体包含序列SEQ ID NO：108-145和248-249中的至少一个，优选序列SEQ ID NO：108-145中的至少一个，更优选序列***：SEQ ID NO:108-109(同时靶向铜绿假单胞菌的DnaA、DnaN和GyrB基因的第一和第二链的序列)、SEQ IDNO:110-111(同时靶向铜绿假单胞菌的RpoC、SecE和SodB基因的第一和第二链的序列)、SEQID NO:112-113(同时靶向铜绿假单胞菌的XcpQ、PscF和PscC基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:114-115(同时靶向铜绿假单胞菌的XcpQ、ExsA和HphA基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:116-117(同时靶向福氏志贺菌的FtsA、Can、和Tsf基因第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:118-119(同时靶向福氏志贺菌AccD、Der、和Psd基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:120-121(同时靶向福氏志贺菌的VirF、VirB和IcsA基因的第一和第二链的序列)、SEQ ID NO:122-123(靶向福氏志贺菌FusA基因的第一链和第二链的序列)、SEQ IDNO:124-125(靶向福氏志贺菌Can基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:126-127(靶向福氏志贺菌的Tsf基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:128-129(靶向福氏志贺菌AccD基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:130-131(靶向福氏志贺菌Der基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:132-133(靶向福氏志贺菌Psd基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:134-135(靶向福氏志贺菌VirB基因的第一链和第二链的序列)、SEQ IDNO:136-137(靶向福氏志贺菌VirF基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:138-139(靶向福氏志贺菌IcsA基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:140-141(靶向福氏志贺菌spa47基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:142-143(靶向福氏志贺菌MukB基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:144-145(靶向福氏志贺菌YbiT基因的第一链和第二链的序列)、SEQ ID NO:248-249(靶向Pto DC3000和铜绿假单胞菌的LuxA和LuxB基因的第一和第二链的序列)。
本发明的DNA载体可以通过本领域已知的常规方法制备。例如，它可以通过PCR或RT-PCR扩增核酸序列，通过与同源探针杂交筛选基因组DNA文库，或通过全部或部分化学合成来产生。可以通过本领域已知的常规技术将重组载体引入宿主细胞。
本发明的体外抗菌方法和用途
在另一方面，本发明涉及抑制靶细菌细胞中至少一个基因表达的体外方法，所述方法包括使所述靶细菌细胞与本发明的一个或多个小RNA或者包含其的组合物接触的步骤。对于在宿主细胞接触中被转录活化的毒力因子，将使用特定的培养基(例如，基本培养基)。
换句话说，本发明涉及小RNA或包含小RNA的组合物在体外用于抑制靶细菌细胞中至少一个基因表达的用途，其中所述靶细菌细胞与所述小RNA或所述组合物直接接触。
优选地，所述小RNA是单链或双链siRNA、或单链或双链miRNA双链体。更优选地，如果所述细菌细胞是致病性的，则所述小或长RNA抑制至少一个编码毒力因子的基因或必需基因或抗生素抗性基因的表达，如果所述细菌细胞是有益的，或抑制至少一个编码生长抑制因子的基因或对于宿主有用的途径的负调节子的基因的表达。
优选地，所述组合物包含从生产者植物细胞获得的植物提取物，所述生产者植物细胞与对所述细菌细胞的至少一个基因具有特异性的至少一个长dsRNA接触。更优选地，所述组合物包含从所述植物提取物回收的细胞外小泡、或所述植物提取物分泌的细胞外游离RNA、来自所述植物提取物的非原质体流体、或与所述小RNA复合的纳米颗粒。所述生产者植物细胞例如选自：烟草(例如，本氏烟草、红花烟草(Nicotiana tobaccum))；芋头(槟榔芋(Colocasia esculenta))；姜(Zingiber officinale)，拟南芥(例如，Arabidopsisthaliana)；番茄(例如，栽培番茄(Lycopersicon esculentum)或Solanum lycopersicum)；土豆(Solanum tuberosum)；水稻(Oryza sativa)；玉米(Zea mays)；大麦(Hordeumvulgare)；小麦(例如，普通小麦(Triticum aestivum)、硬质小麦(Triticum durum))、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橙树、苹果树、柑橘树、橄榄树等。
“抑制至少一个基因的表达”，在本文中是指所述基因的表达降低，即，靶序列的mRNA或蛋白质水平在统计学上低于在暴露于靶向无关基因(例如真菌基因)的对照小RNA的合适对照细菌中相同靶序列的mRNA或蛋白质水平。特别地，降低根据本发明的细菌中靶基因的mRNA多核苷酸水平和/或多肽水平，导致实现相较于合适的对照细菌中相同靶序列的mRNA多核苷酸水平或由其编码的多肽水平，小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％的mRNA多核苷酸水平或由其编码的多肽水平。测定RNA转录本的表达水平、由靶基因编码的多肽的表达水平、或所述多核苷酸或多肽的活性的方法是本领域众所周知的。
在这方面，可以靶向任何类型的细菌。如上所述，可以靶向感染动物(包括人类)宿主的病原细菌、或为动物(包括人类)宿主提供有益作用的有益(例如，共栖的或共生的)细菌。
在一个实施方案中，该方法对于抑制或限制样本中的致病细菌的致病性和生长特别有意义。它也可用于杀死样本中的病原细菌细胞。
在另一个实施方案中，如上所述，该方法还可用于通过抑制直接或间接地负调节细菌生长的基因，来促进有益细菌的复制。
在另一个实施方案中，还可以通过靶向参与对所述抗生素化合物的细菌抗性的基因，来使用该方法来恢复细菌细胞对抗生素化合物的敏感性。
本发明的植物治疗方法和用途
根据本发明，通过使用上述用于表达核酸的标准方法将本发明的一个或多个iRNA引入植物细胞。在本领域中可获得的用于真核细胞遗传转化的多种方法可用于许多植物物种。作为非限制性实例，可以进行弹丸轰击、病毒介导的转化、农杆菌介导的转化等。不包括电穿孔。
在将核酸***细胞中的上下文中的术语“引入”，指“转染”、或“转化”、或“转导”以及包括提及将核酸掺入到真核细胞中，其中所述核酸可以稳定的掺入到细胞基因组(例如，染色体、质粒)中、或瞬时表达(例如，通过根瘤农杆菌瞬时递送基因构建体)。
本发明的iRNA在宿主植物细胞中的表达可以是瞬时的或稳定的。稳定表达特别指使用常规技术制备转基因植物。
通过使用植物Dicer-样酶和其他小RNA加工因子将所述iRNA加工成siRNA或miRNA双链体。然后，将所述小RNA双链体和/或成熟的小RNA向导(即，载入AGO中)转位至细胞外培养基中或植物细胞表面，在此它们可能会遇到细菌细胞。
如以下实施例(实施例4、和5和图4-6)所示，当在本发明的成熟iRNA分泌的条件下，当放置细菌细胞与本发明的植物细胞接触时，细菌细胞的生长和毒力降低。
在一个方面，本发明涉及一种用于处理靶植物抵抗细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：向所述靶植物的至少一个细胞中引入特异性靶向毒力细菌基因、或必需细菌基因、或抗菌抗性基因的长dsRNA分子。
该方法对于人和动物避免食用植物的污染特别有用。通过用本发明的处理来阻断存在于植物上的细菌的生长或存活，这将避免由于摄入污染的、受感染的植物而污染动物和人。
该方法对于预防植物被诸如志贺氏菌、沙门氏菌、李斯特菌、布鲁氏菌、大肠杆菌等病原性动物细菌感染特别有用，因此对于预防其消费者随后被感染也特别有用。
在另一方面，因此，本发明涉及用于处理植物抵抗细菌感染的基于RNA的生物防治方法，所述方法包括，在被人或动物病原细菌的细菌感染之前和/或之后，将小RNA、或包含此类小RNA的植物提取物、或包含这些小RNA(例如，稳定或瞬时表达这些小RNA实体的植物细胞或组织中提取的总RNA，含有其的细胞外小泡、或与所述RNA偶联的纳米颗粒)的组合物递送到植物组织上的步骤，所述人或动物病原细菌，例如，以色列放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、百日咳博德特氏菌、包柔氏菌属(伯氏、伽氏、埃氏、回归热、麝鼩、达氏、赫氏等)、布鲁氏菌属(牛、犬、马耳他、猪)、空肠弯曲杆菌、衣原体属(肺炎、沙眼)、鹦鹉热衣原体、肉毒杆菌属(肉毒杆菌、艰难、产气荚膜、破伤风杆菌)、白喉杆菌、埃立克体菌属(犬、查菲)、肠球菌(粪、屎)、大肠杆菌O157：H7、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、克雷伯军团菌、钩端螺旋体属、单细胞李斯特菌、分枝杆菌属(麻风、结核)、肺炎支原体、奈瑟氏菌(淋病、脑膜炎)、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、星状诺卡菌、立克次氏立克次体、沙门氏菌属(伤寒、鼠伤寒)、志贺氏菌属(猪痢疾、痢疾)、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮、腐生)、链球菌属(龙舌兰、变形、肺炎、化脓、绿色)、福赛斯坦纳菌、***、霍乱弧菌、或鼠疫耶尔森氏菌。
优选地，所述组合物包含从植物细胞获得的植物提取物，所述植物细胞表达对所述病原细菌的所述至少一个毒力或必需或抗生素抗性细菌基因具有特异性的至少一个长dsRNA、或已经与至少一个该长dsRNA接触。更优选地，所述组合物包含从所述植物提取物中回收的细胞外小泡，或由所述植物细胞分泌的细胞外游离小RNA，或与小RNA偶联的纳米颗粒。甚至更优选地，所述组合物是液体可喷洒组合物。
在这方面，细菌细胞最终直接与小RNA(即，siRNA或miRNA)接触，在革兰氏阴性细菌的情况下，小RNA能够穿过细菌的双层膜并到达细菌细胞的胞浆中，在这里将以序列特异性的方式沉默靶基因，从而导致细菌致病性的减弱(参见实施例5-7和图4-图6以及图9-图10)。
如本文所用，术语“小RNA”指具有本发明的iRNA的抑制活性的小RNA。具体而言，它们是与至少一个细菌基因，优选地与至少一个细菌毒力或必需基因，更优选地与至少一个以上引用的基因具有至少80％的序列同源性的siRNA或miRNA(双链体或单链体)。这些小RNA通常包含不超过40个碱基对。优选地，它们包含18至30个碱基对，更优选地18至25个碱基对。更优选地，所述小RNA特异性抑制以上定义的细菌必需或毒力基因中的至少一个。
优选地，如上所述，这些小RNA是双链siRNA。
本发明的另一方面涉及如上定义的至少一个iRNA或包含该iRNA的载体作为植物治疗剂的用途。优选地，所述iRNA或载体用于治疗由植物中致病细菌引起的疾病、或用于预防植物中的细菌感染。
在一个实施方案中，该植物治疗性iRNA是短或长的dsRNA、siRNA双链体、或miRNA双链体、siRNA单链体或miRNA单链体，如上文所定义。在又一个实施方案中，iRNA靶向细菌基因和如上所定义的其他非细菌病原体或寄生物的基因，用于同时预防或治疗植物中细菌病原体和其他病原体/寄生物引起的疾病。本文涵盖针对iRNA、载体和转化方法提出的所有实施方案，并且不需要重复。
在由动物病原细菌引起的植物检疫技术问题的情况下，可以通过各种方式(例如通过喷洒)将所述小RNA递送至植物组织。它们可以包埋在微球、纳米颗粒、脂质体、或天然外泌体中。优选的制剂在下面公开。
产生本发明的小RNA的转基因植物
在下文中，将用本发明的iRNA转化并能够产生本发明的小RNA的植物细胞称为“本发明的植物细胞”或“本发明的宿主细胞”。它们含有至少一个iRNA(优选长RNA)或如上所定义的DNA构建体或载体，所述iRNA含有至少一个特异性靶向细菌基因(例如，毒力、或必需细菌基因)的序列。
用编码长RNA的转基因稳定转化的植物可以作为种子、生殖材料、增殖材料、或细胞培养材料提供，其不主动表达长RNA但具有这样做的能力。
如果它们仅用于产生本发明的小RNA，则可以将它们称为“生产者植物细胞”。如果它们将从产生的小RNA赋予的抗菌作用中受益，它们也可以称为“靶植物”。两种类型的植物(生产者和靶植物)都是表达和产生本发明小RNA的重组细胞。生产者植物可以是靶植物，如分泌本发明的小RNA的植物可用于装饰/食物目的。
本文中的术语“植物”涵盖植物细胞、植物组织、植物部分、整株植物、其祖先及其后代。植物部分可以是植物的任何部分或器官，并且包括例如种子、果实、茎、叶子、枝、花、花药、根、块茎和叶柄。术语“植物”还涵盖悬浮培养物、胚胎、分生组织、区域、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子。其指所有植物，包括蕨类和树木。
在另一方面，本发明涉及稳定或瞬时表达至少一个本发明的功能性iRNA的分离的植物细胞或转基因植物。其还涉及含有本发明的DNA、或病毒载体的分离的植物细胞。所述植物细胞可以是通过用所述DNA载体转化而获得的遗传修饰的细胞。
转化方法的实例是农杆菌介导的转化或鸟枪介导的转化。
本文涵盖以上针对植物细胞、iRNA、载体和转化方法提出的所有实施方案，并且不需要重复。
在下面的实施例部分中公开产生这种转基因植物的方法。其包括以下步骤：
i)用表达本发明的至少一个功能性干扰RNA的DNA载体转化植物细胞，或
ii)用表达本发明的至少一个功能性干扰RNA的植物病毒，优选植物RNA病毒感染植物细胞，
持续足够的时间(对于烟草植物通常为3-4天)，使植物细胞稳定或瞬时表达大量的小RNA。
“显著量”在本文中是指在如上所述的测试中已显示具有抗菌作用的量。该显著量优选可以包含10到30ng/μl的表达有效小RNA的总RNA。
特别地，所述转基因植物能够宿主诱导细菌的基因沉默，并且包含能够下调或抑制细菌的至少一个基因表达的可表达的iRNA，其中，所述植物表达成熟的小RNA。如发明人所证明，所述小RNA能够跨越或跨过靶细菌的双层膜传播。
在另一方面，本发明涉及稳定或瞬时表达本发明的成熟小RNA的靶转基因植物。在一个实施方案中，所述靶转基因植物包含本发明的DNA载体。在一个优选的实施方案中，所述靶植物是水稻、玉米、大麦、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、土豆、番茄、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芋头、烟草、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橙树、苹果树、柑橘树和橄榄树。本文涵盖针对iRNA、载体和转化技术提出的所有实施方案，并且不需要重复。
另一方面，本发明涉及稳定或瞬时表达本发明的iRNA的转基因植物。在一个实施方案中，所述转基因生产者植物包含本发明的DNA载体。在一个优选的实施方案中，所述生产者植物是：烟草(例如本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、红花烟草(Nicotianatobaccum))；芋头(槟榔芋(Colocasia esculenta))；姜(Zingiber officinale)、拟南芥(例如，Arabidopsis thaliana)；番茄(例如，栽培番茄(Lycopersicon esculentum)或Solanum lycopersicum)；土豆(Solanum tuberosum)；水稻(Oryza sativa)；玉米(Zeamays)；大麦(Hordeum vulgare)；小麦(例如，普通小麦(Triticum aestivum)、硬质小麦(Triticum durum))、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橙树、苹果树、柑橘树、橄榄树等。优选的生产者植物是烟草、芋头和姜。
本发明的益生菌方法和用途
在另一个方面，如上所述，该方法还可用于通过抑制直接或间接地负调节细菌生长的基因，来促进有益(共生)细菌的复制。
因此，本发明涉及小RNA，其具有15至30碱基对的长度并且特异性抑制至少一个细菌基因的表达，以用于促进有益共生的或共栖的细菌在需要其的受试者中的有益效果，其中所述小RNA通过口服、局部或全身地施用至受试者。
优选地，所述有益共生的或共栖的细菌选自以下：奈氏放线菌、殊异韦荣菌、普氏栖粪杆菌、肠杆菌、多形拟杆菌、大肠杆菌K12、双歧杆菌(长、双歧、青春、齿、短、嗜热)、迟缓埃格瑟拉菌、拟杆菌属(解木聚糖、多型、脆弱、普通、盐藻)、狄氏副拟杆菌、普氏栖粪杆菌、瘤胃球菌(布鲁米、champanellensis、SR1/5)、链球菌属(副血、嗜酸、嗜热、猪、化脓、咽峡炎)、乳球菌属(乳酸、格氏)、肠球菌(粪、屎、卡塞尔、durans、海氏)、蜂房蜜蜂球菌、嗜盐四球菌、乳杆菌属(干酪、鲁米尼、德尔布吕克、布氏、罗伊特氏、发酵、戊糖、淀粉、唾液)、片球菌(戊糖、克劳森氏)、明串珠菌(肠膜、乳酸、肉质、明胶、柠檬)、魏斯氏菌(泰国、朝鲜)、酒类酒球菌、类芽孢杆菌属(土地、多粘、胶质、Y412MC10)、堆肥嗜热芽孢杆菌、短芽孢杆菌、芽孢杆菌(解淀粉、枯草，地衣、萎缩、韦氏、蜡样、苏云金、凝结、巨大、硒化)、热脱氮芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、盐芽孢杆菌、李斯特菌属、链霉菌属、真细菌(直肠、挑剔、惰性)、化糖梭状芽胞杆菌、和产丁酸的细菌(SS3/4和SSC/2)。
使用本发明的iRNA恢复抗生素敏感性
在另一方面，发明人建议使用该方法，通过靶向参与细菌对抗生素化合物抗性的基因，用于恢复细菌细胞对所述抗生素化合物的敏感性。
“抗生素化合物”，是指用于或建议用于杀死细菌的化合物。在治疗领域使用的经典抗生素化合物是，例如，铜基杀菌剂或衍生自大生物和微生物的次级代谢产物。这些包括但不限于氨基糖苷、碳青霉烯、头孢他啶(第3代)、头孢吡肟(第4代)、头孢吡普(第5代)、头孢洛扎/他唑巴坦、氟喹诺酮、哌拉西林/他唑巴坦、羟基噻吩青霉素/克拉维酸、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、乙基西梭霉素、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除草霉素、利福昔明、艾他培南、多利培南、亚胺培南、美洛培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢哌啶、先锋霉素、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢替坦、头孢羟唑、头孢美唑、头孢尼西、氯炭头孢、头孢罗齐、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮钠、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布希、头孢唑肟、羟羧氧酰胺菌素、头孢曲松钠、头孢菌素、头孢吡肟、头孢菌素、头孢洛林酯、头孢吡普、糖肽、替考拉宁、万古霉素、特拉万星、达巴万星、奥利万星、林可酰胺(Bs)、克林霉素、洁霉素、脂肽、达托霉素、大环内酯(Bs)、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素、非达霉素、单菌霉素、氨曲南、硝基呋喃、呋喃唑酮、呋喃咀啶(Bs)、恶唑烷酮(Bs)、利奈唑胺、波西唑来、雷得唑来、托雷唑来、青霉素、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯甲异噁唑青霉素、青霉素G、青霉素、哌拉西林、替莫西林、羟基噻吩青霉素、青霉素组合、阿莫西林/克拉维酸、氨苄青霉素/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、羟基噻吩青霉素/克拉维酸、多肽、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、喹诺酮类/氟喹诺酮类、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、那氟沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格雷沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺(Bs)、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、银磺胺嘧啶、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲异恶唑(旧称)、柳氮磺吡啶、磺胺异恶唑、复方新诺明(Sulfisoxazole、Trimethoprim-Sulfamethoxazole)(复方新诺名(Co-trimoxazole)(TMP-SMX)、磺胺基甲萘啶(旧称)、四环素(Bs)、地美环素、强力霉素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、氧四环素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇(Bs)、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素(Bs)、磷霉素、夫西地酸、甲硝哒唑、莫匹罗星、板霉素、奎奴普汀/达福普汀、甲砜霉素、替加环素(Bs)、磺甲硝咪唑、甲氧苄氨嘧啶(Bs)等。
优选地，然后靶细菌选自以下：
以色列放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、百日咳博德特氏菌、包柔氏菌属(伯氏、伽氏、埃氏、回归热、麝鼩、达氏、赫氏等)、布鲁氏菌属(牛、犬、马耳他、猪)、空肠弯曲杆菌、衣原体属(肺炎、沙眼)、鹦鹉热衣原体、肉毒杆菌属(肉毒杆菌、艰难、产气荚膜、破伤风杆菌)、白喉杆菌、埃立克体菌属(犬、查菲)、肠球菌(粪、屎)、大肠杆菌O157：H7、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、克雷伯军团菌、钩端螺旋体属、单细胞李斯特菌、分枝杆菌属(麻风、结核)、肺炎支原体、奈瑟氏菌(淋病、脑膜炎)、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、星状诺卡菌、立克次氏立克次体、沙门氏菌属(伤寒、鼠伤寒)、志贺氏菌属(猪痢疾、痢疾)、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮、腐生)、链球菌属(龙舌兰、变形、肺炎、化脓、绿色)、福赛斯坦纳菌、***、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌等。
待用的植物小RNA的量通常取决于所靶向细菌的数量和所靶向细菌的类型。该量可以为10至30ng/μl含有有效小RNA的总RNA。
本发明的治疗方法
在另一方面，本发明涉及用于治疗动物抵御细菌感染的基于RNA的治疗方法，所述方法包括在细菌感染之前和/或之后，在动物组织之上(或之内)递送小RNA(从头合成或从植物提取物纯化)、或植物提取物的步骤，所述植物提取物包含这种小RNA或含有这些小RNA的组合物(例如，从稳定或瞬时表达这些小RNA实体的植物细胞或组织提取的总RNA、来自所述植物细胞的细胞外小泡、来自所述植物细胞的非原质体流体、来自所述植物的细胞外游离小RNA、或与所述小RNA偶联的纳米颗粒)。
优选地，所述动物是以下属：智人(Homo sapiens)、家犬(Canis lupus)、家猫(Felis catus)、家马(Equus caballus)、普通牛(Bos Taurus)、绵羊(Ovis aries)、家山羊(Capra hircus)、野猪(Sus scrofa)、原鸡(Gallus gallus)、火鸡(Meleagrisgallopavo)、灰雁(Anser anser)、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、穴兔(Oryctolaguscuniculus)。其可以是有益细菌寄宿的健康动物，或已经感染病原细菌的患病动物。
更优选地，所述动物是人类。
其可以是有益细菌寄宿的健康人，或已经感染病原细菌的患病人。
在这方面，细菌细胞直接与小RNA(即，siRNA或miRNA)接触，在革兰氏-阴性细菌的情况下，小RNA能够穿过细菌的双层膜并到达细菌细胞的胞质中，在这里将以序列特异性的方式沉默靶基因，从而导致细菌致病性的减弱。
如本文所用，术语“小RNA”指携带本发明的iRNA的抑制活性的小RNA。具体而言，它们是与至少一个细菌基因，优选地与至少一个细菌毒力或必需基因，更优选地与至少一个以上引用的基因具有至少80％的序列同源性的siRNA或miRNA(双链体或单链体)。这些小RNA通常包含不超过40个碱基对。优选地，它们包含18至25个碱基对。更优选地，所述小RNA特异性抑制以上定义的细菌必需或毒力基因中的至少一个。
本发明的处理方法包括口服、局部和全身施用本发明的小RNA。也可考虑鼻内和静脉施用。
本发明的另一方面涉及如上定义的至少一个小RNA作为美容或治疗剂的用途。优选地，所述小RNA用于治疗由病原细菌引起的疾病、或用于预防细菌感染。
在一个实施方案中，该小RNA靶向细菌基因和如上所定义的其他非细菌病原体或寄生物的基因，用于同时预防或治疗细菌病原体和其他病原体/寄生物引起的疾病。本文上涵盖以上针对iRNA、载体和转化方法提出的所有实施方案，并且不需要重复。
本发明的另一方面涉及如上定义的至少一个小RNA、或含有其的治疗组合物(如上公开)，用于制备旨在治疗由病原细菌引起的疾病、或预防细菌感染的药物的用途。
在一个实施方案中，当小RNA靶向细菌基因和如上所定义的其他非细菌病原体或寄生物的基因时，所述药物可同时治疗或预防细菌病原体和其他病原体/寄生物引起的疾病。
本发明还包含治疗或美容方法，其包括使用如上定义的有效量的小RNA。
在这些治疗/美容方法中，本发明的小RNA可以配制成液体溶液、喷雾剂、丸剂、霜剂、或粉末。
本发明的小RNA还可以有利地偶联/结合/融合至已知在体内有效地传递小RNA的纳米颗粒。任何纳米颗粒介导的siRNA全身递送都可用于治疗动物(包括人)，只要其毒性是受控的或不存在毒性。如(44)中所述，已经提出了许多***，并已用于临床试验。
如(44)中所公开的，为了将本发明的小RNA全身递送到动物中，还可以将其与纳米颗粒***偶联。如(44)中的表3所示，这些可以是尺寸在50nm至500nm之间的基于硅或基于金属或基于碳的纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、环糊精、基于脂质的纳米颗粒、脂质体、水凝胶或半导体纳米晶体。如该综述所述，所有这些递送***已被证明可以在体内有效转移siRNA。
在本文中优选脂质纳米颗粒，因为脂质纳米颗粒最近已被FDA批准用于人类治疗。
本发明的治疗组合物
在公共卫生的情况下，本发明的小RNA或包含其的组合物可以通过各种方式(口服、局部、全身等)递送至动物组织。在一个特定的实施方案中，它们可以被包埋在微球、脂质体或天然EV中，以从有害试剂中对其进行保护。它们也可以与纳米颗粒偶联。它们也可以作为裸露的iRNA分子直接掺入组合物中。
因此，另一方面，本发明涉及包含本发明的小RNA作为活性组分的治疗组合物。特别地，本发明涉及包含显著量的siRNA或miRNA的治疗组合物，所述siRNA或miRNA抑制至少一个细菌基因的表达，优选抑制一个必需基因或一个毒力细菌基因或一个抗生素抗性细菌基因的表达。
如上述充分公开，本发明的治疗组合物中包含的小RNA可以是合成的、或者是可以从稳定或瞬时表达所述小RNA的植物、植物组织或植物细胞中获得的。
特别地，被本发明的DNA载体稳定或瞬时转化、或被本发明的病毒载体感染的植物、植物组织或植物细胞将产生小RNA。
因此，本发明的治疗组合物可以包含稳定或瞬时表达目的小RNA的植物、植物组织或植物细胞的总RNA、或包含总RNA的纯化的小RNA级分、或从头合成的小RNA。
“显著量”在本文中是指，如以下实施例中所述的，在测试中已显示具有抗菌效果的量。该量优选地为10至30ng/μl表达有效小RNA的总RNA。
本发明的沉默元件可以被添加在外部组合物(例如，喷雾剂、或霜剂或丸剂)中。
优选地，如下文所公开的，其包埋在微球、脂质体或天然外泌体中，以从有害试剂中对其进行保护或与纳米颗粒偶联。
本发明的治疗组合物还可包含含有活性抗菌小RNA的细胞(例如，粗植物细胞提取物)。还涵盖包含细胞提取物的混合物的组合物，一些细胞提取物来自表达至少一个本发明的iRNA的植物细胞的。在其他实施方案中，本发明的治疗组合物不包含任何细胞。
在一个实施方案中，将本发明的组合物外部施用于动物组织(即，通过将组合物喷雾在所述组织上或通过在所述组织上施加洗剂、凝胶剂、霜剂)，以保护个体防御细菌感染。
本发明的组合物可以施加在可以与细菌接触的任何组织上。该组织优选地选自：皮肤、毛发、粘膜、指甲、肠、伤口、眼睛等。
可以将本发明的治疗组合物配制在合适的和/或环境可接受的载体中。这样的载体可以是待处理个体可以耐受的任何材料。此外，载体必须是在控制细菌感染时仍然使组合物有效的材料。这样的载体的实例包括水、盐水、林格氏溶液、右旋葡萄糖或其他糖溶液、汉克氏溶液和其他水性生理平衡的盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液。
这些组合物还可包含表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、进料刺激剂、引诱剂、包囊剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线保护剂、缓冲剂、流动剂等。它也可包含其他活性成分，例如杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或杀螨剂。这些试剂可以与制剂领域中惯用的载体、表面活性剂或佐剂或其他组分组合，以促进产物的处理和应用。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如，天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、或粘合剂。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物是液体可喷雾的组合物。然后，可以很容易地将其施用到纸巾或衣服上、或者可以与病原细菌接触的任何材料上，作为预防措施或摆脱细菌感染的处理方法。它也可以很容易地被吸入，以预防鼻腔获得性感染。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物被配制成易于被动物和人类吞咽的丸剂。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物被配制成霜剂、洗剂或凝胶剂，可以方便地施加在皮肤或毛发组织上。
更一般地，可以在美容产品中添加本发明的小RNA(或包含其的EV)以防止细菌感染的发生。
在另一优选的实施方案中，将本发明的组合物配制成丸剂，例如，缓慢释放的丸剂，其可以方便地被吞咽以作用于肠粘膜或其他内部组织。
包含本发明小RNA的细胞外小泡
在一个优选的实施方案中，本发明的小RNA或其前体被包含在其将得到保护以抵御RNA酶作用的天然细胞外小泡(EV)中或人工小泡中。事实上，这些小泡对于处理的动物(特别是人)是非毒性的并且有效保护其中所含的小RNA。
现在已经发表许多研究，强调EV在将小RNA递送到植物真核病原体中重要的保护作用(17、19)。
本文的本发明人表明，从植物向细菌递送小RNA，也至少部分地通过转基因植物分泌的EV发生(图9B)。
因此，本发明的组合物优选包含已经由本发明的转基因植物分泌的EV，其包含本发明的成熟小RNA。
EV具有不同的尺寸直径(45、46)。它们包含源自亲本细胞的胞质和膜蛋白(45-48)。它们还包含功能性mRNA、长非编码RNA、miRNA前体以及成熟的miRNA和siRNA(17、19、49、50)。
EV的纯化可通过多种方法进行，最常见和最优选的方法是差速超速离心(45、46)。
更特别地，有可能通过如先前所述的过滤和差速离心步骤从植物细胞中获得EV(45，46)。简而言之，将用于收集非原质体洗涤流体的经典缓冲液(例如，pH 6MES缓冲液)对叶子进行真空浸润，然后进一步低速离心(46)。如最近所述(46)，进一步成功收集、过滤和离心非原质体洗涤流体。可以从非原质体流体中以40,000g的离心速度从拟南芥中回收大约50到300nm尺寸的植物EV群体(中位数在150nm)(46)。拟南芥中约10-20nm尺寸范围的较小EV也可以通过以下方法回收：通过以40,000g的离心速度从非原质体流体中进行差速超速离心，然后在上一步获得的上清液中以100,000g的速度进行另一次离心(46)。也可以使用专用柱(例如，Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel 30K)浓缩植物EV，并将其重新悬浮在专用缓冲液中，以便随后将其用于细菌细胞孵育(体外测定)或在细菌感染之前或之后进行外源施用于植物表面(植物原位测定)。
含有EV游离小RNA的非原质体流体
本发明的组合物还可包含由本发明的转基因植物分泌的、与蛋白质不结合的非原质体EV游离小RNA。这些小RNA种类在此处称为细胞外游离小RNA或“efsRNA”。
这些小RNA种类可通过从以下回收获得：从涉及以100,000g的离心速度进行的非原质体流体的差速超速离心所得的上清液，或从以40,000g、接着以100,000g离心速度进行的非原质体流体的差速超速离心的上清液。
所得上清液可在专用缓冲液中混合，或直接用于与细菌细胞孵育(体外测定)，或在细菌感染之前或之后外源施用于植物表面(在植物原位测定中)。
这些EV级分有利地以冷冻形式、或以冷冻干燥、或冻干粉末形式保存或提供，在这些形式中它们保持其高功能性。
本发明的组合产品
本发明的组合物可以与其他化合物同时或连续施用。
特别地，本发明的组合物可以与抗生素化合物一起施用，特别是当它们携带的iRNA靶向抗生素抗性基因时。
在这种情况下，本发明的组合物可以作为“组分试剂盒”提供，其在分开的容器中包含本发明的沉默元件(上文定义的小RNA)和相应的杀菌化合物。
因此，在另一方面，本发明涉及一种药物试剂盒，其包含：
a)小干扰RNA(siRNA)，其具有15至30个碱基对的长度、并且特异性抑制抗生素抗性基因，或含有其的治疗组合物，如上所公开的，以及
b)抗生素化合物。
本发明还涉及这种药物试剂盒在需要其的受试者中治疗和/或预防细菌感染的用途以及使用该药物试剂盒的治疗方法。
在另一方面，本发明涉及组合产品，其包含：
a)小干扰RNA(siRNA或miRNA)，其具有15至30个碱基对的长度、并且特异性抑制抗生素抗性基因，或含有其的治疗组合物，如上所公开的，以及
b)抗生素化合物，
同时、分开或交错用于在需要其的受试者中预防和/或治疗细菌感染的用途。
在一个优选的实施方案中，所述siRNA或miRNA在所述抗生素化合物之前施用，优选在一周之前，更优选在一天之前。
在这些试剂盒和产物中，所述抗生素抗性基因优选选自：VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、CasE、OXA-28、OXA-14、OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116和GES-9。
在这些试剂盒和产品中，所述抗生素化合物优选选自：氨基糖苷、碳青霉烯、头孢他啶(第3代)、头孢吡肟(第4代)、头孢吡普(第5代)、头孢洛扎/他唑巴坦、氟喹诺酮、哌拉西林/他唑巴坦、羟基噻吩青霉素/克拉维酸、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、乙基西梭霉素、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除草霉素、利福昔明、艾他培南、多利培南、亚胺培南、美洛培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢哌啶、先锋霉素、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢替坦、头孢羟唑、头孢美唑、头孢尼西、氯炭头孢、头孢罗齐、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮钠、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布希、头孢唑肟、羟羧氧酰胺菌素、头孢曲松钠、头孢菌素、头孢吡肟、头孢菌素、头孢洛林酯、头孢吡普、糖肽、替考拉宁、万古霉素、特拉万星、达巴万星、奥利万星、林可酰胺(Bs)、克林霉素、洁霉素、脂肽、达托霉素、大环内酯(Bs)、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素、非达霉素、单菌霉素、氨曲南、硝基呋喃、呋喃唑酮、呋喃咀啶(Bs)、恶唑烷酮(Bs)、利奈唑胺、波西唑来、雷得唑来、托雷唑来、青霉素、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯甲异噁唑青霉素、青霉素G、青霉素、哌拉西林、替莫西林、羟基噻吩青霉素、青霉素组合、阿莫西林/克拉维酸、氨苄青霉素/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、羟基噻吩青霉素/克拉维酸、多肽、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、喹诺酮类/氟喹诺酮类、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、那氟沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格雷沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺(Bs)、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、银磺胺嘧啶、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲异恶唑(旧称)、柳氮磺吡啶、磺胺异恶唑、复方新诺明(Sulfisoxazole,Trimethoprim-Sulfamethoxazole)(复方新诺名(Co-trimoxazole)(TMP-SMX)、磺胺基甲萘啶(旧称)、四环素(Bs)、地美环素、强力霉素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、氧四环素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇(Bs)、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素(Bs)、磷霉素、夫西地酸、甲硝哒唑、莫匹罗星、板霉素、奎奴普汀/达福普汀、甲砜霉素、替加环素(Bs)、磺甲硝咪唑、甲氧苄氨嘧啶(Bs)等。
优选地，所述受试者是以下属的动物：智人、家犬、家猫、家马、普通牛、绵羊、家山羊、野猪、原鸡、火鸡、灰雁、绿头鸭、穴兔。其可以是有益细菌宿主的健康动物，或已经感染病原细菌的患病动物。
更优选地，所述动物是人类。
其可以是有益细菌寄宿的健康人，或已经感染病原细菌的患病人。
本发明的筛选***
在一个特定的实施方案中，本发明的方法还可以用作实验研究的工具，特别是在功能基因组学领域。事实上，使用小分子RNA下调细菌基因可以用于以类似于线虫类蠕虫秀丽隐杆线虫(C.elegans)以及黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)领域中描述的类似方法来研究基因功能。这种方法对于不能在体外培养的细菌特别有用。
基于靶向特定细菌基因的下调或上调(导致可测量的表型)的测定，为鉴定抗菌剂提供了新的工具。
发明人确实已经进一步开发了在植物原位测定之前鉴定具有抗菌活性的候选小RNA的测定法(对于实验者而言，植物原位测定更为耗时)。如图8C/D所示，该***可依赖于使用成熟的农杆菌介导的烟草叶子瞬时转化的小RNA的瞬时表达。随后可以将相应的候选siRNA与细菌细胞一起孵育(在细菌细胞附近存在植物组织/提取物的情况下，或在体外培养基中，例如，模拟宿主环境的基本培养基，已知其触发毒力因子的表达)。
在另一方面，本发明涉及允许快速、可靠和成本有效地鉴定具有抗菌活性的功能性iRNA的体外筛选方法，所述方法包括以下步骤：
a)在植物细胞中表达至少一个长dsRNA，其同源siRNA抑制至少一个细菌基因，
b)使所述植物细胞与裂解缓冲液接触，
c)将所述植物细胞裂解物或其RNA提取物与细菌细胞一起孵育，以及
d)评估所述细菌细胞的生存力、生长、代谢活性。
通过评估所述细菌细胞的报告子(例如，细菌复制、一般胁迫反应、细胞***等的报告子)的表达/活性、代谢活性(例如，常用于监测细菌呼吸活性、氧化还原平衡指标和生存力的荧光标记刃天青的外源递送)、生长(例如，染色体整合的或由质粒编码的组成型启动子驱动的荧光报告子的表达)、小RNA靶向的基因的表达(例如，RT-qPCR分析、蛋白质印迹分析，与小RNA靶向的靶向基因或基因区域融合的报告基因的表达)进行步骤d)。
如上所述，可以使用抗菌小RNA的稳定或瞬时表达。对于瞬时表达，所述植物细胞优选是烟草叶子细胞，其可以通过农杆菌介导的瞬时转化用外源构建体容易且有效地转化。上文提出的用于产生iRNA、载体、宿主细胞、靶向基因、细菌的所有实施方案和转化技术均包含在本文中，并且不需要重复。
在步骤b)中，也可能使用含有分泌的分子和EV(与有效小RNA结合)的植物细胞的非原质体流体来接触细菌细胞。可以通过本领域技术人员通常使用的任何常规方式，例如真空渗透和离心来回收非原质体流体。根据制造商的说明，也可以使用专用色谱柱(例如，Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel 30K)进一步进行EV的浓缩。
本发明的方法可以包含最后步骤e)，将与所述非原质体流体或所述小RNA一起孵育的细菌细胞的生存力、生长、代谢或基因报告子活性，与不存在非原质体洗涤流体或所述小RNA的相同细菌细胞进行比较，或优选地，与存在来自表达对照小RNA的植物的非原质体洗涤流体、或靶向不相关基因(例如，本发明所用的禾谷镰刀菌的真菌基因CYP51)的对照小RNA的相同细菌细胞进行比较。
预期将来将使用该筛选***选择、并最终产生有效的抗菌小RNA，其可以掺入治疗组合物或试剂中。
本发明人还开发了***，其与植物产生小RNA无关而是使用靶向细菌基因的双链小RNA的快速体外合成(图10)。作为概念验证实验，发明人已经证明，体外合成的抗Cfa6和抗HrpL siRNA触发细菌基因沉默以及抑制Pto DC3000诱导的气孔重新打开，其程度与源自IR-CFA6/HRPL转基因植物的总RNA相同(图10B/C，图6A)。此外，他们已经表明，体外合成的针对Pto DC3000 FusA和GyrB基因的siRNA具有强的杀菌作用，从而在体外条件下阻止PtoDC3000的生长(图10D/E)。此外，使用相同方法，他们显示体外合成的针对铜绿假单孢菌SecE、GyrB和DnaN基因的siRNA也触发铜绿假单孢菌在体外条件下生长的降低(图12)。
因此，他们推荐一种鉴定影响人病原细菌细胞增殖的候选基因的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)生成抑制至少一个细菌基因表达的小RNA，
b)将所述小RNA与细菌细胞一起孵育，以及
c)如上所公开，评估所述细菌细胞的生存力、生长、代谢活性。
特别地，本发明涉及一种鉴定参与细菌抗生素抗性的候选基因的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)将细菌细胞与小RNA一起孵育的，所述小RNA具有15至30个碱基对的长度并且特异性抑制至少一个细菌基因，b)将所述小RNA处理的细菌细胞与抗生素化合物一起孵育，
c)评估在所述抗生素化合物存在时，所述小RNA处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性，并且将其与所述抗生素化合物不存在时所述小RNA处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性进行比较。
在优选的实施方案中，在抗生素化合物存在时，如果所述小RNA处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性低于在抗生素化合物不存在时所述小RNA处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性时，则认为所述候选基因参与细菌抗生素抗性。
除上述布置之外，本发明还包括其他布置，其将从以下参照本发明主题的示例性实施方案的描述中、并参考附图和序列表而出现，其中：
表1：在实施例中使用的工具的序列详情
Figure BDA0003024308560000341
Figure BDA0003024308560000351
Figure BDA0003024308560000361
Figure BDA0003024308560000371
Figure BDA0003024308560000381
Figure BDA0003024308560000391
Figure BDA0003024308560000401
Figure BDA0003024308560000411
Figure BDA0003024308560000421
附图说明
图1.在未经处理和细菌攻击条件下表达反向重复序列IR-CFA6/HRPL的拟南芥转基因植物的表型和分子表征
A.Pto DC3000基因Cfa6和HrpL的示意图。Cfa6(1-250nt)和HrpL(99-348nt)基因的250bp区域用于在组成型35S启动子的控制下产生嵌合发夹结构。
B.五周龄的Col-0植物和表达35Spro:IR-CYP51(对照载体：CV)或35Spro:IR-CFA6/HRPL构建体的独立纯合转基因植物的代表性图片。
C.通过B中描绘拟南芥植物的低分子量Northern印迹分析检测到的抗Cfa6和抗HrpL siRNA的积累水平。U6用作上样对照。
D.与Col-0和CV感染的植物相比，在IR-CFA6/HRPL感染的植物上，Pto DC3000HrpL mRNA的积累显著降低。用Pto DC3000 WT菌株浸入接种(dip-inoculate)图B中描述的拟南芥植物，并在感染后(dpi)3天，通过定量RT-PCR分析监测ProC、Cfa6和HrpL的细菌转录水平。相对于细菌GyrA转录本的水平，定量这些mRNA水平。误差棒表示在三个独立实验中获得的mRNA值的标准偏差。使用ANOVA检验评估统计学上的显著差异(ns：p值>0.05；*：p值<0.05，**：p值<0.01，***：p值<0.001)。
图2.在未经处理和细菌攻击条件下表达反向重复序列IR-LuxA/LuxB的拟南芥转基因植物的表型和分子表征
A.***Pto DC3000 WT基因组的luxCDABE操纵子的示意图。luxA(1-250nt)和luxB(1-250nt)基因的250bp区域用于在组成型35S启动子的控制下产生嵌合发夹结构。
B.通过拟南芥转基因植物的低分子量Northern印迹分析检测到的抗LuxA/LuxB的积累水平。U6用作上样对照。
C.与Col-0相比，感染后在表达IR-LuxA/LuxB的转基因品系中观察到对PtoDC3000荧光素酶(Pto Luc)发光的显著影响。IR-LuxA/LuxB#18和#20的两个独立的转基因品系、以及Col-0分别以106cfu/ml浓度的Pto Luc进行注射浸润，并在浸润后24小时测量发光。
D.与Col-0植物相比，IR-LuxA/LuxB转基因植物中Pto DC3000的植物原位生长未改变。将来自图C使用的植物的叶盘研磨并以系列稀释液铺板，以计数感染后24小时每种条件的Pto Luc。
图3.表达IR-CFA6/HRPL构建体的拟南芥转基因植物抑制Pto DC3000诱导的气孔重新打开
A.PtoΔcfa6和ΔhrpL菌株(而不是ΔhrcC菌株)的气孔重新打开能力受损，在添加外源COR后可以拯救这些表型。将Col-0植物的未去皮叶子切片与模拟溶液(水)、或PtoDC3000 WT、Δcfa6、ΔhrpL、或ΔhrcC菌株孵育3小时。通过使用ImageJ软件测量宽度和长度来评估气孔孔径。
B.Pto DC3000 WT不再诱导过表达IR-CFA6/HRPL发夹的拟南芥转基因品系中的气孔重新打开。如A中所述，在用Pto WT菌株感染的Col-0和35Spro:IR-CFA6/HRPL#4、#5、#10转基因品系中进行气孔孔径测量。
C.与Col-0植物相比，CV中Pto DC3000诱导的气孔重新打开反应没有改变。如A中所述，在感染Pto WT菌株的Col-0和CV植物中进行气孔孔径测量。
注意：对于所有这些实验，n＝每个条件下分析的气孔数量，并使用ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。
图4.表达IR-CFA6/HRPL构建体的拟南芥转基因植物在成年叶子中表现出降低的Pto DC3000的维管传播和生长
A.与Col-0和CV感染的植物相比，IR-CFA6/HRPL#4、#5和#10感染的植物表现出PtoWT的维管传播减少。将植物用Pto WT-GFP通过伤口接种在中脉中，并将Col-0用PtoΔcfa6-GFP进行伤口接种。在紫外线下观察GFP荧光信号，并在感染后3天(dpi)拍摄照片。为指示细菌从接种部位的传播，在紫外光下观察GFP荧光。当细菌从三个接种位点的任何一个传播出去时，它被指示(index)为传播，其中4个对应于最高的传播指数。考虑来自三个生物学重复的图片。
B.描绘在A中所用条件的被感染叶子的代表性图片。白色圆圈指示叶子中脉中的伤口接种位点。
C.与Col-0和CV感染的植物相比，IR-CFA6/HRPL#4、#5和#10转基因品系显示出显著降低的Pto WT滴度。将Col-0、CV和IR-CFA6/HRPL#4、#5和#10植物用Pto WT浸入接种，并将Col-0植物用PtoΔcfa6-GFP菌株浸入接种。在感染后2天(dpi)监测细菌滴度。考虑来自每种条件下的三个植物和来自三个独立实验(n)的四个叶子，用于比较分析。
D.与Col-0和CV植物相比，IR-CFA6/HRPL#4、#5和#10转基因植物的浸水症状减轻。浸入接种后24小时拍摄有代表性的浸水症状叶子照片。
注意：对于上述所有实验，使用双向ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；*：p值<0.05；**：p值<0.01；***：p值<0.001；****：p值<0.0001)。
图5.在未经处理和芸苔黄单孢菌芸苔致病变种攻击条件下表达反向重复序列IR-HRPG/HRPX/RSMA的拟南芥转基因植物的表型表征
A.与Col-0感染的植物相比，IR-HRPG/HRPX/RSMA#1-和#6感染的植物表现出降低的毒力XccΔXopAC(GUS/GFP)菌株的维管传播。将植物用XccΔXopAC(GUS/GFP)在中脉中伤口接种，OD＝0.01。在紫外线下观察到GFP荧光信号，并在感染后3天(dpi)拍摄照片。如4A中所述完成指示。
B.描绘在B中所用条件的被感染叶子的代表性图片。白色圆圈指示叶子中脉中的伤口接种位点。
图6.当将来自IR-CFA6/HRPL转基因植物的外源递送的总RNA施加至野生型拟南芥和番茄叶子的表面时，降低Pto DC3000的致病性。
A.体外AGS分析显示，CFA6/HRPL#4植物的总RNA提取物触发Cfa6和HrpL基因的沉默。将Pto WT细胞与来自CV或IR-CFA6/HRPL#4植物的20ng/μl总RNA体外孵育4和8小时。通过RT-qPCR在两个时间点观察到细菌转录本Cfa6和HrpL显著减少，而ProC和RpoB转录本的积累仍然不受影响。GyrA用作内部对照来量化细菌转录本的积累。误差棒指示来自三个独立实验的值的标准差。
B.与CV植物相比，外源施加IR-CFA6/HRPL植物的总RNA提取物后，Pto WT重新打开气孔的能力发生改变。将Col-0叶子用水处理1小时，或用从CV或IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的20ng/μl总RNA处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。如图3A所示，测量并分析气孔孔径。
C.用IR-CFA6/HRPL处理而不是CV处理，与用CV总RNA预处理相比，总RNA损害PtoDC3000在叶子的非原质体中增殖的能力。将Col-0叶子用来自CV或IR-CFA6/HRPL#4植物的20ng/μl的总RNA处理1小时，然后用Pto WT浸入接种。在2dpi监测细菌滴度。叶子数(n)对应于三个独立实验的集合值。
D.与用IR-CFA6/HRPL#4总RNA处理的叶子相比，用CV总RNA处理的叶子表现出更多的坏死症状。实验与在C中一样进行，但是使用5周龄的番茄(Solanum lycopersicumMoneymaker)植物。描绘在两个条件下被感染叶子的代表性图片。
E.与CV植物相比，用IR-CFA6/HRPL#4的总RNA提取物处理的番茄叶子中观察到的Pto DC3000-GFP基因座数量减少。在紫外线下在3dpi时观察感染的叶子，以估计GFP基因座的数量。在左边：点图代表使用ImageJ软件从每种条件的3-4张不同叶子中以及每片叶子至少有4张图片分析的GFP基因座数量。用于分析的值来自两个不同的独立实验。进行学生t检验以进行比较分析。在右边：在D中描述的番茄叶子的代表性图片。
F.与CV植物相比，用IR-CFA6/HRPL#4的总RNA提取物处理的番茄叶子中Pto WT-GFP DNA含量降低。使用番茄泛素作为对照，通过qPCR分析细菌DNA含量的水平。进行学生t检验以进行比较分析。
注意：对于A，B和C，使用ANOVA检验评估统计学上显著差异(ns：p值>0.05；**：p值<0.01，***：p值<0.001)。
图7.负责AGS和抑制气孔重新打开的RNA实体是DCL依赖性抗菌siRNA，而不是相应的未加工的dsRNA前体。
A.上图：通过RT-qPCR进行Col-0、dcl2-1 dcl3-1 dcl4-2(dcl234)、IR-CFA6/HRPL#4(#4)和dcl234突变体背景中(#4×dcl234)IR-CFA6/HRPL#4中的IR-CFA6/HRPL转录本的积累水平。泛素用作对照。该图代表三个独立实验的平均值和标准偏差。下图：抗Cfa6和抗HrpL siRNA的积累水平通过相同基因型的低分子量的Northern印迹分析进行。U6用作上样对照。
B.来自#4x dcl234植物的总RNA提取物不会改变Cfa6和HrpL的转录本积累水平。将Pto WT细胞与从A中描述的相同基因型提取的20ng/μl总RNA一起体外孵育8小时。使用GyrA作为对照，通过RT-qPCR分析评估Cfa6和HrpL转录本的积累水平。误差棒指示来自三个独立实验值的标准偏差。使用ANOVA检验评估统计学上的显著差异(ns：p值>0.05；*：p值<0.05，**：p值<0.01)。
C.来自#4x dcl234植物的总RNA提取物不能抑制Pto DC3000诱导的气孔重新打开反应。将Col-0叶子用水处理1小时或使用20ng/μl来与A.中使用的那些相同基因型的总RNA提取物处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。如图2A所示，测量并分析气孔孔径。补充图4B给出另外两个生物学复制。
D.上图：电泳图谱表示使用配备RNA Nano芯片的安捷伦Bioanalyzer 2100测定的来自IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA、长RNA和小RNA的RNA尺寸分布。每个样本均包括低分子量RNA级分。突出显示18S和25S核糖体峰。下图：溴化乙锭染色的在A中使用的总RNA、长RNA和小RNA的琼脂糖凝胶图片。
E.来自IR-CFA6/HRPL植物的小RNA种类、而不是相应的长RNA种类，抑制气孔重新打开的程度与总RNA提取物相同。如在D中所述进行实验，但使用总RNA级分、长(>200nt)RNA级分、或小(<200nt)RNA级分，其分离自IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA。
注意：对于所有气孔实验，使用ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。
图8.细菌表达的HrpL小RNA弹性(resilient)形式对由抗HrpL siRNA指导的基因沉默是难治的，并且通过外源施加抗HrpL siRNA时表现出正常的气孔重新打开表型
A.分别在组成性启动子NptII的控制下，用编码WT HrpL或突变HrpL的质粒转化后产生的PtoΔhrpL菌株以及互补菌株的示意图。
B.体外AGS分析显示，PtoΔhrpL WT HrpL菌株对抗菌RNA敏感，而PtoΔhrpL突变体HrpL对这些RNA实体是难治性的。将细菌PtoΔhrpL WT HrpL和PtoΔhrpL突变体HrpL菌株与来自CV或IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的总RNA孵育8小时。通过RT-qPCR分析WT HrpL和突变体HrpL转录本的积累水平(mRNA水平相对于GyrA转录本水平)。误差棒指示来自三个独立实验值的标准偏差。使用ANOVA检验评估统计学上的显著差异(ns：p值>0.05；*：p值<0.05，**：p值<0.01)。
C.通过使用瞬时表达35Spro：IR-HRPL、35Spro：IR-CFA6/HRPL的本氏烟草植物和未转化的本氏烟草叶子(Nb)的总RNA提取物通过低分子量Northern分析评估抗Cfa6和抗HrpLsiRNA的积累。U6用作上样对照。
D.PtoΔhrpL突变体HrpL菌株对抗HrpL siRNA作用是难治性的。用仅仅从本氏烟草中提取的总RNA、或从表达反向重复序列IR-HRPL的本氏烟草提取的总RNA处理Col-0叶子。如前所述评估气孔重新打开反应。
注意：对于所有气孔实验，使用ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。
图9.IR-CFA6/HRPL植物的非原质体流体由功能性抗菌siRNA组成，这些功能性抗菌siRNA可以包埋在EV中以抵御微球菌核酸酶的作用、或呈对微球菌核酸酶消化敏感的游离形式
A.与源自IR-CFA6/HRPL植物中的总RNA相比，外源施加非原质体流体(APF)提取物后，Pto WT重新打开气孔的能力也以相似的水平被改变。从CV植物中提取的总RNA和APF用作阴性对照。将Col-0叶子用水处理1小时(模拟)，或使用从CV或IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的20ng/μl总RNA或500μl的APF处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。如之前实验所述，测量并分析气孔孔径。
B.两种不同的小泡级分P40和P100，以及上清液(SN)中存在的游离RNA群体携带抗菌siRNA，因此参与AGS中。从CV和IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的非原质体流体在40,000g下进行超速离心以沉淀较大的EV(P40)群体，余下的上清液在100,000g下进一步超速离心以沉淀较小的EV(P100)。SN也已恢复。将Col-0叶子用水(模拟)、或从CV或IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的P40、P100和SN处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。#4的P40、P100和SN用20单位的Mnase处理，#4的SN也用20单位的蛋白酶K处理。如先前实验所述，对气孔孔径进行测量和分析。
注意：对于所有气孔实验，使用ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。
图10.外源递送体外合成的抗菌siRNA降低Pto DC3000的致病性和活力
A.描绘了体外合成的长dsRNA和RNase III消化的siRNA(对应于IR-CYP51和IR-CFA6/HRPL)的溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶。
B.外源施加体外合成的对应于IR-CFA6/HRPL的siRNA而不是长dsRNA改变Pto WT重新打开气孔的能力。来自IR-CYP51的长dsRNA和siRNA被用作阴性对照。将Col-0叶子用水(模拟)处理1小时，或用A中所述的RNA处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。如之前实验所述，测量并分析气孔孔径。
C.在体外AGS测定中，使用体外合成的来自IR-CFA6/HRPL的siRNA触发Cfa6和HrpL基因的沉默。将Pto WT细胞与来自IR-CYP51或IR-CFA6/HRPL#4植物的2ng/μl体外合成的siRNA体外孵育8小时。通过RT-qPCR观察到细菌转录本Cfa6和HrpL的显著减少，而ProC和RpoB转录本的积累未受影响。GyrA用作内部对照来量化细菌转录本的积累。误差棒指示来自三个独立实验值的标准偏差。
D.和E.体外合成的针对Pto DC3000的fusA或gyrB的siRNA对Pto DC3000-GFP菌株的生长具有显著影响。通过体外转录，然后RNaseIII消化合成针对Pto DC3000的secE、gyrB和fusA基因的siRNA。将Pto DC3000-GFP菌株与指定浓度的体外合成siRNA孵育。将96孔板放置在机器上，以通过基于液滴的微流体***(Millidrop)将样本分级成液滴。对于每个孔，形成各约500nl的10个液滴，并在仪器内部孵育。对于每个液滴，每约30分钟获取生物质和GFP荧光的测量值。
图11.外源递送的植物来源的小RNA对人病原细菌铜绿假单孢菌PAK菌株的影响
A.描绘了铜绿假单孢菌PAK荧光素酶(带有lux标签的PAK)菌株与植物来源的总RNA提取物一起孵育的发光的定量。108cfu ml-1浓度的带有lux标签的PAK菌株与水(模拟)或者20ng/μl的特异性总RNA在一段时间(分钟)，使用贝特光度计(Berthold Luminometer)测量发光，所述总RNA提取自本氏烟草未转化的叶子(NB)或表达IR-GF/FG的本氏烟草叶子(阴性对照)、或表达IR-LuxA/LuxB(IR-LuxAB)的本氏烟草叶子。绘制了4个技术重复/条件下，在4小时时间段内每30分钟测量的读数平均值。
B.使用酶标仪测量4小时时间点在A中样本的细菌计数(OD600)，并在点图中作图。
C.与A中相同，但区别在于将带有lux标签的PAK菌株与水(模拟)或者浓度为20ng/μl的特异性总RNA一起孵育，所述总RNA提取自本氏烟草未转化的叶子(NB)或瞬时表达IR-GF/FG的本氏烟草叶子(阴性对照)、瞬时表达IR-DnaA/DnaN/GyrB(IT13)的本氏烟草叶子、或瞬时表达IR-RpoC/SecE/SodB(IT14)的本氏烟草叶子。
D.与B相同，但样品为C中描绘的样品。
注意：使用ANOVA检验评估B和C的统计学显著性(ns：p值>0.05；**：p值<0.001)。
图12.体外合成的针对SecE的siRNA触发了铜绿假单孢菌PAO1菌株在体外条件下的生长降低
针对若干铜绿假单孢菌PAO1菌株的必需基因测试了体外合成的抗菌siRNA，并筛选了对细菌生长具有显著影响的抗菌siRNA。使用体外转录接着通过RNaseIII消化，合成针对铜绿假单孢菌的SecE、GyrB、DnaN、DnaA、RpoB或SodB基因的siRNA。使用5ng/μl浓度的靶向单个基因的siRNA处理108cfu ml-1的PAO1菌株。将96孔板放置在机器上，以通过Millidrop Analyzer将样本以液滴的形式进行级分。对于每个孔，各形成～500nl的10个液滴，并在仪器内部孵育。对于每个液滴，每～30分钟获取生物质测量值，持续14小时。绘制在每个时间点从30液滴/条件获得的散射信号的中位数的图。
具体实施方式
实施例
实施例1：材料和方法
携带反向重复序列构建体的转基因品系的产生
IR-HRPL/CFA6嵌合发夹经设计可产生靶向Cfa6的250bp区域(从1到250位核苷酸)和HrpL的250bp区域(从99到348位核苷酸)的人工siRNA(SEQ ID NO：1、2和3)。IR-CFA6-A和IR-CFA6-B是两个独立的反向重复序列，分别特异性靶向Cfa6基因的核苷酸1到250(SEQ IDNO：4、2和5)以及从核苷酸1到472(SEQ ID NO：6、2和7)。IR-HRPL-A和IR-HRPL-B是两个独立的反向重复序列，分别特异性靶向HrpL基因的从核苷酸99到348(SEQ ID NO：8、2和9)以及从核苷酸1到348(SEQ ID NO：10、2和11)。IR-HRCC发夹设计为特异性靶向HrcC基因(SEQ IDNO：12、2和13)和IR-AvrPto/AvrPtoB，以同时靶向III型效应子AvrPto和AvrPtoB基因(SEQID NO：14、2和15)。如之前进行地，IR-CYP51发夹设计用于产生针对真菌禾谷镰刀菌三个细胞色素P450羊毛甾醇C-14α-脱甲基酶基因(即，FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C)的siRNA(SEQ ID NO：16、2和17)(19)。该发夹用作本发明所有植物原位测定的阴性对照。设计并克隆其他反向重复序列作为本研究的一部分，以靶向来自假单胞菌、黄单胞菌和雷尔氏菌的不同菌株的毒力因子或必需基因。这些发夹描述如下：IR-HrpG/HrpB/HrcC发夹设计为同时靶向来自雷尔氏菌属的HrpG、HrpB和HrcC基因(SEQ ID NO：18、2和19)，IR-HrpB/HrcC/TssB/XpsR发夹设计为同时靶向来自雷尔氏菌属的HrpB、HrcC、TssB和XpsR基因(SEQ IDNO：20、2和21)，IR-HrpG/HrpX/RsmA发夹设计为同时靶向来自芸苔黄单胞菌芸苔致病变种的HrpG、HrpX和Rsma基因(SEQ ID NO:22、2和23)，IR-RpoB/RpoC/FusA发夹设计为同时靶向来自Pto DC3000和丁香假单胞菌株CC440的必需基因RpoB、RpoC和FusA(SEQ ID NO：24、2和25)，IR-SecE-RpoA-RplQ发夹设计为同时靶向来自Pto DC3000和丁香假单胞菌CC440的必需基因SecE、RpoA和RplQ(SEQ ID NO：26、2和27)，IR-NadHb/NadHd/NadHe发夹设计为同时靶向来自不同黄单孢菌属(包括芸苔黄单孢菌芸苔致病变种)的必需基因NadHb、NadHd和NadHe(SEQ ID NO：28、2和29)，IR-DnaA/DnaE1/DnaE2发夹设计为同时靶向来自不同黄单孢菌属(包括芸苔黄单孢菌芸苔致病变种)的必需基因NadHb、NadHd和NadHe(SEQ ID NO：30、2和31)。作为本研究的一部分，设计并克隆反向重复序列，以靶向来自不同铜绿假单胞菌和志贺菌菌株的毒力因子或必需基因。这些发夹描述如下：靶向DnaA、DnaN和GyrB基因的IT13发夹(SEQ ID NO:108-109)、靶向RpoC、SecE和SodB基因的IT14发夹(SEQ ID NO:110-111)、靶向XcpQ、PscF和PscC基因的IT16发夹(SEQ ID NO:112-113)、铜绿假单孢菌XcpQ、ExsA和HphA基因的IT18发夹(SEQ ID NO:114-115)、靶向FtsA、Can和Tsf基因的IT21发夹(SEQ IDNO:116-117)、靶向AccD、Der和Psd基因的IT26发夹(SEQ ID NO:118-119)、以及靶向福氏志贺菌的VirF、VirB和IcsA基因的IT27发夹(SEQ ID NO:120-121)。此外，作为本研究的一部分，设计并克隆嵌合的反向重复序列以靶向在Pto DC3000中在组成型卡那霉素启动子下以染色体表达的发光杆菌(Photorhabdus luminescens)luxCDABE操纵子：IR-LuxA/LuxB发夹，旨在同时靶向来自Pto DC3000荧光素酶菌株以及铜绿假单孢菌萤光素酶菌株的LuxA和LuxB基因(SEQ ID NO：248、2和249)。所有上述发夹含有来自矮牵牛查耳酮合酶基因CHSA的特定内含子序列(SEQ ID NO：2)，并将其克隆到携带花椰菜花叶病毒(CaMV)35S组成型启动子的载体中。更具体地说，以下发夹序列：IR-HRPL/CFA6、IR-CYP51、IR-CFA6-B、IR-HRPL-B、IR-HrpG/HrpB/HrcC、IR-HrpB/HrcC/TssB/XpsR、IR-AvrPto/AvrPtoB、IR-HRCC、IR-HrpG/HrpX/RsmA和IR-LuxA/LuxB克隆到带有其他EcoRI和SalI限制性酶切位点的修饰pDON221-P5-P2载体中，以利于将这些长的反向重复序列***该载体中。在pB7WG GATEWAY兼容最终载体(携带BAR选择标记物和门控重组位点的双元载体)中进行携带发夹序列的pDON221-P5-P2和携带组成型35S启动子序列的pDON221-P1-P5r(Life Technologies，12537-32)之间的双重组。其余发夹，即，IR-CFA6-A、IR-HRPL-A、IR-RpoB/RpoC/FusA、IR-SecE-RpoA-RplQ、IR-NadHb/NadHd/NadHe和IR-DnaA/DnaE1/DnaE2序列通过以下产生：使用细菌基因组DNA作为模板，通过PCR扩增靶基因的正义和反义区域，然后生成克隆到最终GreenGate最终载体pGGZ003中所需的模块。然后将所有质粒引入根瘤农杆菌菌株GV3101或C58C1，并进一步用于在本氏烟草中的瞬时表达或在拟南芥Columbia-0(Col-0)参考登记中的稳定表达。
植物材料和生长条件
通过使用农杆菌介导的花卉浸入法转化拟南芥WT(登记Col-0)植物而产生IR-CFA6/HRPL和CV的稳定转基因品系。选择表达相等量的抗Cfa6和抗HrpL siRNA的三个独立的转基因品系#4、#5和#10，并增殖直至T4代。类似地，选择的CV纯合系表达丰度水平的针对禾谷镰刀菌CYP51A/B/C基因的siRNA，对其进行增殖直到T4代，用于实验。类似地，基于siRNA的产生选择表达IR-LuxA/LuxB和IR-HrpG/HrpX/RsmA的转基因品系并进一步增殖。为进行遗传分析，将dcl2 dcl3dcl4(dcl234)三突变体植物与参考IR-CFA6/HRPL#4品系杂交，并对F3植物进行基因分型，以选择含有纯合IR-CFA6/HRPL转基因的纯合dcl234突变体。拟南芥Col-0的灭菌种子和选择的纯合转基因品系首先在含有1/2x MS培养基(Duchefa)、1％蔗糖和0.8％琼脂(有或没有抗生素选择)的平板上、在22℃下、在8小时的光照周期中、生长12-14天。然后，挑选幼苗种入土壤罐中，并在环境可控的条件下于22℃/19℃以8h光照周期在100μE/m2/s的光强度下生长。所有实验均使用4至5周龄的植物。将番茄(Solanumlycopersicum‘Moneymaker’)和本氏烟草的种子直接播种在土壤罐中，并在环境控制条件下于22℃/19℃(白天/夜晚)16h光照周期、在100μE/m2/s的光照强度下生长。所有实验均使用4至5周龄的植物。
细菌菌株
表达GFP的Pto DC3000-GFP和Pto DC3000Δcfa6-GFP(Pto DC3118)菌株是S.Y.He博士的礼物。而Pto DC3000ΔhrpL菌株是Cayo Ramos博士的礼物。Pto DC3000荧光素酶菌株是Chris Lamb博士的礼物。通过电穿孔使用与Pto DC3000-GFP中相同的质粒转化PtoDC3000ΔhrpL和Pto DC3000ΔhrcC菌株，来产生表达GFP报告基因的Pto DC3000ΔhrpL和Pto DC3000ΔhrcC菌株，然后在28℃接种于NYGB培养基(5g/L细菌蛋白胨、3g/L酵母提取物、20ml/L甘油)，其中含有庆大霉素(1μg/ml)用于选择。使用质粒NPTIIpro:WT-HrpL和NPTIIpro:mut-HrpL通过电穿孔分别转化Pto DC3000ΔhrpL菌株，以产生Pto DC3000-WT-HrpL和-mut-HrpL菌株，然后将其接种在含有庆大霉素的NYGB培养基中。铜绿假单孢菌的PAK和PAO1菌株是来自其他合作实验室。
RNA凝胶印迹分析
为进行低分子量RNA的Northern印迹分析，使用TriZOL试剂提取总RNA，并用50％甲酰胺稳定。如前所述(51)，使用特定条件下约30μg的总RNA进行Northern印迹分析。使用基因特异性引物从质粒中扩增出150bp至300bp的区域，并将扩增子进一步用于生成通过随机引物合成的特异性32P放射性标记的探针。U6探针用作小RNA同等上样的对照。
分离长RNA和小RNA级分
根据制造商的说明，使用Tri-Reagent(Sigma，St.Louis，MO)从IR-CFA6/HRPL#4的拟南芥叶子中提取总RNA。根据制造商的说明，使用mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion，Life Technologies)使用100μg的总RNA，分离长RNA和小RNA级分。使用琼脂糖凝胶电泳可视化从总RNA分离的长RNA和小RNA，并使用基于微流体的方法(Bioanalyzer 2100；AgilentTechnologies,http://www.agilent.com)进一步分析。总RNA、长RNA和小RNA进一步用于进行气孔重新打开测定。
植物中的细菌感染测定
(a)细菌生长测定：用于该实验的植物特别用于在生长区室中夜间周期开始三个小时后。在每种条件下，用5x107cfu/ml的细菌使用0.02％Silwet L-77(Lehle种子)将三个植物进行浸入接种。将经过细菌浸入的植物立即置于高湿度的区室内，以促进适当的感染。在感染后24小时观察到浸入接种后的浸水症状，对每种条件下来自三个植物的叶子进行拍照。接种后两天，按照(51)所述的方法对每种感染叶子的每种条件下的细菌滴度进行测量。为量化感染植物中的细菌转录本，在接种后三天收集合并的感染的叶子样本。
(b)伤口接种测定：为监测细菌在中脉中的增殖，用浸入5x 106cfu/ml浓度带GFP标签的细菌的牙签手动接种来自每种条件的三个植物的约15片叶子，然后将植物置于高湿度的区室中3天。然后，通过使用Olympus MV 10×宏观变焦在紫外光下监测GFP信号来分析细菌增殖，并使用带有GFP滤片的CCD相机AxioCam Mrc Zeiss拍摄照片。
(c)植物保护测定：在细菌感染之前，通过反复用模拟溶液或浓度为20ng/μl的特定总RNA的RNA溶液(二者均补充有Silwett L-77(0.02％))反复浸泡，单独处理每种条件下三种拟南芥植物的四片莲座叶。预处理一小时后，以与RNA相似的方式，将叶子浸润接种到5x107cfu/ml浓度的Pto DC3000 WT或Pto DC3000Δcfa6。如前所述，接种后两天监测细菌滴度。在番茄中，每种条件下三个植物的两片叶子用含有20ng/μl的特定总RNA的悬浮液(补充有Silwett L-77(0.02％))预处理，然后在1个小时后浸入到5x107cfu/ml的带有GFP标签的Pto DC3000中。然后，将植物置于24℃/19℃(白天/夜晚)具有16小时光照周期中无盖情况下持续3天的可控条件中。然后，通过使用Olympus MV 10x宏观变焦在紫外光下监测GFP信号来分析细菌感染，并拍摄照片。收集单个叶子样本以使用ImageJ软件定量每种条件下的细菌数量。
体外合成dsRNA和sRNA
按照
Figure BDA0003024308560000511
RNAi试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA)的指导进行RNA的体外合成。通过PCR扩增类似的模板，在序列的5'和3'端引入T7启动子。在两个不同的退火温度下分两步进行PCR扩增，以提高引物退火的特异性。扩增步骤后，借助
Figure BDA0003024308560000512
凝胶和PCR Clean-up试剂盒(Macherey-Nagel)，通过凝胶提取纯化PCR产物，以消除任何干扰(parasite)扩增。然后，将这些纯化的PCR产物用作体外转录的模板：2μg与2μL的T7聚合酶(T7酶Mix)、2μL的10X T7反应缓冲液和75mM ATP、CTP、GTP和UTP各2μL一起在37℃下孵育五小时。用无核酸酶的水将总体积调节至20μL。转录反应后，用2μL的DNaseI、2μL RNase、5μL 10X反应缓冲液处理dsRNA，以去除DNA模板和单链RNA。然后，用试剂盒提供的滤芯纯化dsRNA。在此步骤中获得的长dsRNA可用于以下实验。通过
Figure BDA0003024308560000513
RNase III(NEB,Ipswich,MA)获得siRNA。DsRNA用RNaseIII消化20分钟，然后借助mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA)进行纯化。纯化后，将siRNA用于以下实验。在该方法的每个步骤之后，进行凝胶电泳(TAE 1X，1％琼脂糖凝胶用于DNA扩增以及2％琼脂糖凝胶用于RNA)以检查RNA的质量。
细菌发光定量
在每种条件下，用1x 106cfu/ml的Pto DC3000荧光素酶(Pto Luc)菌株注射浸润三个植物。将植物放置在高湿度的区室内，以促进适当的感染。将叶盘放置在96孔板的各个孔中，以使用Berthold Centro LB 960微孔板光度计定量发光。考虑到每个植物四片叶子。如上所述，进行细菌滴度定量之后，合并来自单个叶子的叶盘。在LB培养基中对带有lux标签的PAK菌株进行发光定量测定，其中1x107 cfu/ml接种物与特定的RNA提取物一起孵育，以获得每种条件下在四个单独的孔中的20ng/μl的终浓度。将96孔板放在Berthold CentroLB 960微孔板发光检测仪上，在4小时时间段内每30分钟记录一次发光。
番茄感染定量
(a)GFP基因座定量：通过使用Olympus MV 10x宏观变焦在紫外光下对PtoDC3000-GFP菌株感染的番茄叶子进行GFP定量，并使用带有GFP滤片的CCD相机AxioCam MrcZeiss拍摄照片。使用ImageJ软件对每种条件下至少10张图片定量GFP基因座的数量。
(b)细菌基因组DNA定量
为量化在感染的番茄植物中的细菌感染(Ross等人，2006)，相对于植物gDNA，测量细菌基因组DNA(gDNA)的量。根据制造商的说明，使用DNeasy plant mini试剂盒(QIAGEN，德国)从感染Pto DC3000-GFP的番茄叶子样本中分离基因组DNA。使用1ng的gDNA，使用Takyon SYBR Green Supermix
Figure BDA0003024308560000521
和GFP基因特异性引物进行qPCR。使用泛素特异性引物将细菌gDNA的量相对于番茄进行标准化。
本氏烟草中农杆菌介导的反向重复序列的瞬时表达
为产生单个发夹(IR-CFA6和IR-HRPL)以及嵌合发夹(IR-CFA6/HRPL)，将携带质粒的根瘤农杆菌菌株在LB培养基中于28℃过夜生长。通过离心收集细胞，并以0.5OD600的最终密度将其重悬于含有10mM MES、pH 5.6、10mM MgCl2和200μM乙酰丁香酮的溶液中。将培养物在室温下于黑暗中孵育5-6小时，然后在四周龄的本氏烟草中进行农杆菌介导的浸润。浸润3天后，收获叶组织并进行Northern印迹分析以确认抗Cfa6和HrpL siRNA的产生。然后，将叶子样本用于总RNA提取。
体外抗菌基因沉默测定
为评估细菌转录本Cfa6和HrpL是否可以直接被发夹IR-CFA6/HRPL所生成的dsRNA和/或siRNA靶向，使用在六孔板中的CV或IR-CFA6/HRPL#4转基因植物提取的20ng/μl的特定总RNA分别处理107cfu/ml的Pto DC3000 WT、Pto DC3000-WT-HrpL和Pto DC3000-mut-HrpL的2ml培养物4小时和/或8小时。同样地，为定量细菌基因经体外合成的siRNA处理的沉默，在6孔板中，分别使用2ng/μl的体外合成的IR-CYP51 siRNA或IR-CFA6/HRPL siRNA处理2ml的107cfu/ml的Pto DC3000-GFP 6小时。针对每种情况收集细菌，然后进一步处理以进行分子分析。
非原质体流体(AF)和细胞外小泡(EV)提取
如先前所述(46)进行提取。用无针头的注射器用小泡分离缓冲液(VesicleIsolation Buffer)(VIB；20mM MES，2mM 324CaCl2、0.01M NaCl，pH 6.0)浸润5周龄CV或IR-CFA6/HRPL植物的60片叶子。然后将叶子置于20ml无针头的注射器中。然后将注射器置于50ml Falcon中，并以900g离心15分钟。收集非原质体流体(APF)，然后分别以2,000g和10,000g离心30分钟以除去任何细胞碎片，然后通过0.45μm的过滤器。将APF进一步以40,000g进行超速离心步骤以沉淀EV级分(P40)。将沉淀重悬于2ml的pH＝7.5的20μM Tris缓冲液中。然后，将上清液以100,000g进行超速离心步骤以沉淀EV级分(P100)。恢复来自该步骤的上清液(SN)。
气孔孔径测量
在进行任何处理之前，将植物在光照下(100μE/m2/s)保持至少3小时以确保气孔完全膨胀。切片来自三四周龄植物的完整叶子切片，并将其浸入浓度为108cfu/ml的水(模拟)或细菌悬浮液中。处理3小时后，在SP5激光扫描共聚焦显微镜下观察未剥皮的叶子远轴表面，并从不同区域拍摄照片。使用ImageJ软件测量在每种情况下的30-70个气孔的气孔孔径(宽度/长度)。在进行RNA预处理的情况下，将叶子切片与从特定基因型提取的总RNA一起孵育一小时，然后再与细菌孵育。在特定实验中需要时，向细菌悬浮液中补充1μM的外源性冠菌素(COR)(Sigma)(52)。
实时RT-PCR分析
为监测植物编码的转录本，使用RNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen)从植物样本中提取总RNA。使用qScript cDNA Supermix(Quanta Biosciences)反转录0.5μg的无DNA的RNA。然后，使用Takyon SYBR Green Supermix
Figure BDA0003024308560000531
和转录本特异性引物通过实时PCR反应扩增cDNA。将表达针对泛素进行标准化。为监测细菌转录本，如前所述，从细菌感染的植物样本或体外处理的细菌中提取总RNA。在DNAse处理之后，使用随机六聚体引物和qScript Flex cDNA试剂盒(Quanta Biosciences)反转录250ng的总RNA。然后，使用TakyonSYBR Green Supermix
Figure BDA0003024308560000532
和转录本特异性引物通过实时PCR反应扩增cDNA。将表达针对GyrA进行标准化。在384孔光学反应板中进行PCR，该板在95℃加热10分钟，然后在95℃变性15s，在60℃退火20s，并在72℃延伸40s，45循环。在扩增结束时以1℃的梯级(从95℃至50℃)进行熔解曲线。
基于液滴的微流体测定法，用于监测体外Pto DC3000-GFP或铜绿假单孢菌PAO的生长
使用Pto DC3000的基于液滴的微流体实验是在温度为28℃的NYGB培养基中进行的，而使用铜绿假单孢菌PAO的相同实验在温度为37℃的LB培养基中进行。通过直接在96孔板中移液200μl不同的最终溶液来制备RNAi测定液：100μl培养基、20μl的107cfu/ml的细菌、20μl体外合成的候选siRNA以获得所想要的最终浓度或作为对照样本的无菌水、以及60μl培养基。将96孔板放置在机器上，以通过Millidrop Analyzer(http://www.millidrop.com)将样本以液滴的形式分级。对于每个孔，形成各约500nl的10个液滴，并在仪器内部孵育24小时。对于每个液滴，每约30分钟获取生物质的测量值(和对于PtoDC3000-GFP的GFP荧光的测量值)。
实施例2.针对Pto DC3000的内源毒力因子或人工报告基因的拟南芥编码siRNA在细菌感染的情况下触发其沉默
为检验宿主编码的小RNA是否可以改变细菌基因表达，我们已经生成拟南芥稳定的转基因植物，该植物组成性地表达嵌合的反向重复序列，其与ECF家族σ因子HrpL基因和冠菌素(COR)生物合成Cfa6基因具有序列同源性，上述两种基因均编码Pto DC3000的关键毒力决定因素(图1A，(53、54))。作为阴性对照，我们还生成过表达反向重复序列的转基因品系，其与真菌禾谷镰刀菌的三个细胞色素P450羊毛甾醇C-14α-脱甲基酶(CYP51)基因具有序列同源性，之前已证明在拟南芥和大麦中可针对这种真菌性植物病原体提供全面保护(20,21)。这些稳定的转基因品系分别称为IR-CFA6/HRPL和IR-CYP51(或CV，对照载体植物)；虽然人工siRNA的积累很高(图1C)，但没有表现出任何发育缺陷(图1B)。为研究针对Cfa6和HrpL的人工siRNA是否能在细菌感染期间干扰这些毒力因子的表达，我们用PtoDC3000浸入接种上述转基因植物，并通过RT-qPCR分析进一步监测Cfa6和HrpL mRNA的水平。与Col-0植物相比，在三个独立的IR-CFA6/HRPL品系中的两个在Cfa6 mRNA水平有中等程度的变化，与Col-0植物相比，在这个时间点上所有三个IR-CFA6/HRPL品系中HrpL转录本水平均可再现地降低(图1D)。相比之下，相对于Col-0感染的植物，在IR-CYP51中未观察到Cfa6或HrpL mRNA的下调(图1D)，支持这些抗菌RNA在该调节方法中的特异性作用。同样，与Col-0感染的植物相比，在IR-CFA6/HRPL和IR-CYP51感染的品系中，非靶向ProC基因的mRNA水平均未改变(图1D)。总体而言，这些数据表明，在感染的情况下，拟南芥编码的IR-CFA6/HRPL反向重复序列至少可以触发细菌HrpL转录本的序列特异性沉默。
由于已知HrpL和Cfa6毒力因子的表达受多种环境因素的调节(54、55)，因此我们还测试AGS是否可以有效地针对在Pto DC3000中在组成型卡那霉素启动子下以染色体表达的发光杆菌(Photorhabdus luminescens)luxCDABE操纵子(56)。这种带lux标签的PtoDC3000菌株自发发射光，因为它共表达萤光素酶催化组分luxA和luxB基因以及底物生产所需的基因(即，luxC、luxD和luxE)(57)。选择两个独立的过表达抗-luxA和抗-luxB siRNA的拟南芥转基因品系，IR-LuxA/LuxB品系，并用带有lux-标签的Pto DC3000菌株进行注射浸润(图2A/B)。在接种后24小时(hpi)进一步监测luxA和luxB mRNA的水平以及发光活性。通过这样做，我们发现与Col-0感染的植物相比，luxA和luxB mRNA的丰度以及发光活性在IR-LuxA/LuxB-中均显著降低(图2C)。相比之下，在那些条件下，与Col-0植物相比，IR-LuxA/LuxB品系中细菌报告菌株的生长没有改变(图2D)，这表明上述作用并非由于这些转基因植物中细菌滴度的降低而引起的。总而言之，这些数据表明，AGS有效针对Pto DC3000感染过程中的内源性胁迫反应的细菌基因和外源性组成型细菌报告基因。
实施例3.针对Cfa6和HrpL的宿主编码的siRNA通过抑制冠菌素的生物合成来防止Pto DC3000诱导的气孔重新打开
因为已知Cfa6和HrpL相互调节(55)以及因为HrpL和Cfa6都是冠菌素(COR)生物合成所必需的(54，55)，所以我们接下来研究IR-CFA6/HRPL植物是否可以被保护以免受COR依赖的毒力反应。为此，我们在接种后3小时(3hpi)监测Pto DC3000触发的气孔重新打开，该表型完全依赖于COR生物合成，因此用Pto DC3000突变体(缺失Cfa6或HrpL基因)接种后消失(图3A，(52))。值得注意的是，此表型在感染的该时间点不依赖于III型效应子，因为在用Pto DC3000hrcC突变体(该突变体的III型分泌***组装受损)处理后观察到正常的气孔重新打开反应(图3A，(50))。重要的是，我们发现与Col-0感染的叶子相比，在毒性Pto DC3000菌株感染的三个独立的IR-CFA6/HRPL转基因品系中，Pto DC3000诱导的气孔重新打开完全消除(图3B)，从而模拟在用Pto DC3000 cfa6-或hrpl缺失菌株接种的Col-0叶子上观察到的表型(图3A)。相比之下，在IR-CYP51感染的植物中观察到正常的Pto DC3000诱导的气孔重新打开(图3C)，这表明观察到的作用是特异于针对Cfa6和HrpL基因的siRNA。此外，在外源应用COR后，在IR-CFA6/HRPL感染的转基因植物中检测到的受损气孔重新打开表型得以完全拯救(图3B)。因此，这些数据提供的药理学证据，表明感染的IR-CFA6/HRPL气孔表现出的Pto DC3000发病机理降低，可能是由相关和/或周围细菌细胞产生COR的能力发生改变引起的。
实施例4.表达针对来自Pto DC3000或芸苔黄单孢菌芸苔变种的关键毒力因子的小RNA的拟南芥稳定转基因植物受到保护免于细菌感染
为进一步监测抗Cfa6和抗HrpL siRNA对Pto DC3000致病性的可能影响，我们接下来监测该细菌在拟南芥IR-CFA6/HRPL转基因植物的叶子维管结构中传播的能力。为此，我们对发生在伤口接种性的带有毒力GFP标签的Pto DC3000(Pto DC3000-GFP)菌株的单个叶子中脉的三个部位的细菌传播数量进行评分。使用这种定量方法，我们观察到与Col-0植物相比，在三个独立的IR-CFA6/HRPL转基因品系中细菌增殖指数显著降低(图4A)。这表明针对Cfa6和HrpL的siRNA可以到达木质部维管，并进一步抑制拟南芥叶子维管结构中PtoDC3000的毒力活性。相比之下，与Col-0感染的叶子相比，在IR-CYP51转基因品系中观察到正常的Pto DC3000维管传播(图4A)，这表明在此方法中抗Cfa6和抗HrpL siRNA具有特异性作用。总体而言，这些结果表明，针对致病性决定子Cfa6和HrpL的siRNA可以特异性限制PtoDC3000在拟南芥叶子维管结构中的传播。在过表达针对毒力因子HrpX、HrpG和RsmA的siRNA的拟南芥转基因植物中也发现对革兰氏阴性细菌芸苔黄单孢菌芸苔致病变种(Xcc)的增强的维管疾病保护作用(图5，数据未显示，(58-62))。这表明，AGS还可用于保护植物抵御这种充分表征的拟南芥维管细菌病原体的侵害，其是世界范围内十字花科作物最致命的疾病之一，黑腐病的致病因子(25、63)。
接下来，我们研究针对Cfa6和HrpL的siRNA的稳定表达是否会在植物原位影响PtoDC3000的生长，该表型已知既依赖于COR也依赖于功能性III型分泌***(54)。为此，我们用Pto DC3000浸入接种IR-CFA6/HRPL、IR-CYP51和WT植物，并进一步在48hpi时监测细菌滴度。使用此测定法，我们发现与Col-0感染植物相比，三个独立的IR-CFA6/HRPL转基因品系中Pto DC3000滴度显著降低，并且该表型让人联想到在感染Cfa6缺失菌株的WT植物中观察到的表型(图4C)。有趣的是，我们还观察到在24hpi时，与WT感染植物相比，三个独立的IR-CFA6/HRPL植物中Pto DC3000诱导的水浸疾病症状减轻，类似于在用cfa6突变菌株浸入接种的WT叶子中观察到的表型(图4D)。相比之下，用Pto DC3000浸入接种IR-CYP51转基因植物中细菌生长和水浸疾病症状没有改变(图4C/D)，这表明上述作用是针对Cfa6和HrpL基因的siRNA特异性的。总之，这些数据进一步支持在感染背景中，抗Cfa6和抗HrpL siRNA在减弱Pto DC3000的毒力活性方面的主要作用。他们还提供令人信服的证据，证明AGS是可用于控制稳定转基因植物中细菌致病性的有效策略。
实施例5.外源递送IR-CFA6/HRPL植物来源的总RNA可保护WT拟南芥和番茄植物防御Pto DC3000
环境RNAi是一种现象，通过其(微)生物可以从环境中摄取外部RNA，从而导致触发与RNA具有序列同源性的基因的沉默(24)。这种基于RNA的方法最初已在秀丽隐杆线虫中表征(30-34)，并进一步发现在其他线虫中，以及在昆虫、植物和真菌中起作用(30、35)。但是，这种方法从未用于缺乏典型的真核样RNAi机制的细菌植物病原体(如Pto DC3000)中。为测试这种可能性，我们首先评估IR-CFA6/HRPL植物表达的RNA是否可以在体外条件下触发Cfa6和HrpL基因的沉默。为此，我们从CV和IR-CFA6/HRPL植物中提取总RNA，将它们与PtoDC3000细胞一起孵育，并通过RT-qPCR进一步分析RNA处理后4小时和8小时Cfa6和HrpLmRNA的水平。这些分析的结果表明，用IR-CFA6/HRPL植物的RNA提取物处理后，两种毒力因子mRNA的积累都减少，这种分子效应在源自CV植物的RNA提取物中未观察到(图6A)。相反，在相同条件下，未靶向的ProC和RpoB mRNA的水平保持不变(图6A)。因此，这些数据暗示植物抗菌RNA可能被Pto DC3000细胞摄取，并随后触发Cfa6和HrpL基因的序列特异性沉默。这也表明，这些抗菌性RNA的外源应用可以用作抑制Col-0植物中Pto DC3000发病机理的策略。为验证这个有趣的假设，我们用来自IR-CFA6/HRPL植物的总RNA提取物对拟南芥Col-0叶组织进行1小时的预处理，随后用Pto DC3000对其进行3小时的攻击，并进一步监测细菌诱导的气孔重新打开事件。令人惊讶的是，我们发现IR-CFA6/HRPL植物的RNA提取物完全抑制Pto DC3000重新打开气孔的能力(图6B)，从而模拟感染的IR-CFA6/HRPL转基因植物中观察到的表型(图3)。我们还研究这种方法是否可用于控制植物原位Pto DC3000的生长。为此目的，我们首先用来自IR-CFA6/HRPL植物的总RNA提取物对Col-0拟南芥植物进行一个小时的预处理，然后用Pto Dc3000对其进一步浸入接种。我们发现这些RNA提取物在2dpi时触发降低的Pto DC3000滴度(图6C)，该表型与在受感染的IR-CFA6/HRPL转基因植物(图4C)、以及用PtoΔcfa6菌株接种的Col-0植物中观察到的表型相当(图6C)。相比之下，在相同条件下，施加来自CV植物的总RNA提取物不会改变Pto DC3000的生长(图6C)，支持抗菌RNA在此方法中的特异性作用。为评估这种基于RNA的生物防治方法在栽培植物中是否也有效，我们对番茄(Solanum lycopersicum，栽培品种Moneymaker)重复相同的测定，番茄是PtoDC3000的天然宿主。用IR-CFA6/HRPL植物的RNA提取物对WT番茄叶子预处理一小时，与用源自CV植物的RNA提取物预处理的叶子相比，导致Pto DC3000诱导的坏死性疾病症状受损以及细菌含量降低(图6D-F)。总而言之，这些数据提供证据，证明在拟南芥和番茄植物中外源应用植物来源的抗菌RNA可触发AGS和针对Pto DC3000的疾病保护。
实施例6.小RNA种类而不是其dsRNA前体是外源施加源自IR-CFA6/HRPL发夹的总RNA时观察到的气孔重新打开表型受损的原因
接下来，我们询问在外部施加抗菌RNA时哪些RNA实体负责AGS和发病机理降低。为解决这个问题，我们首先将IR-CFA6/HRPL#4参考品系与dcl2-1 dcl3-1dcl4-2(dcl234)三突变体杂交，然后选择三dcl突变和IR-CFA6/HRPL转基因的纯合子的F3植物。与IR-CFA6/HRPL#4亲本品系中检测到的水平相比，这些IR-CFA6/HRPL#4x dcl234植物的分子表征显示，IR-CFA6/HRPL反向重复转录本(即未加工的dsRNA)的积累增加(图7A)。此外，这种作用与抗Cfa6和抗HrpL siRNA的不可检测水平相关(图7A)。因此，这些数据与DCL2、DCL3和DCL4通过IR-CFA6/HRPL反向重复序列的加工在这些siRNA的生物合成中的作用相一致。随后，我们从这些植物中提取总RNA，将其与Pto DC3000细胞孵育8小时，并通过RT-qPCR分析进一步监测Cfa6和HrpL mRNA的水平。使用这种体外测定，我们发现尽管人工dsRNA前体高积累(图7A)，但IR-CFA6/HRPL#4xdcl234植物的RNA提取物不再能够触发Cfa6和HrpL mRNA的下调(图7B)。相比之下，IR-CFA6/HRPL#4亲本品系的RNA提取物含有高水平的抗Cfa6和抗HrpLsiRNA(图7A)，触发两种靶向毒力因子的积累减少(图7B)。此外，虽然IR-CFA6/HRPL#4植物的RNA提取物抑制Pto DC3000诱导的气孔重新打开事件，但我们发现IR-CFA6/HRPL#4xdcl234植物的RNA提取物在此方法中没有活性，如源自自Col-0或dcl234植物的对照RNA提取物(图7C，数据未显示)。总体而言，这些数据提供令人信服的证据，表明从IR-CFA6/HRPL反向重复序列产生的dsRNA既不参与AGS也不参与发病机理的降低。其实际上表明，小分子RNA可能是负责这些分子和生理表型的抗菌RNA实体。为验证该假设，我们使用基于玻璃纤维滤器的方法从IR-CFA6/HRPL植物总RNA中进一步纯化小RNA种类(图7D)，并将其进行气孔重新打开测定。通过这样做，我们发现这些小的RNA种类抑制Pto DC3000触发的气孔重新打开，其程度与IR-CFA6/HRPL植物总RNA提取物的程度相同(图7E)。相比之下，未通过上述柱过滤的长RNA种类(200bp以上)没有活性(图7E)，进一步支持抗菌性植物dsRNA不参与此反应。总而言之，这些数据提供可靠的证据，表明从反向重复序列IR-CFA6/HRPL产生的DCL依赖性siRNA对AGS和发病机理降低至关重要，而同源dsRNA前体对这两个过程均无效。
实施例7.细菌表达的HrpL的小RNA弹性(resilient)形式对siRNA定向沉默不敏感，并表现出正常的气孔重新打开表型，表明抗HrpL siRNA是AGS和发病机理的降低的原因
尽管以上发现表明，外部施加抗菌siRNA可以触发AGS和抗菌活性，但它们并不能坚定地证明这些RNA实体是造成这些现象的原因。为解决这个问题，我们决定产生和表征表达HrpL基因的siRNA弹性形式的重组细菌，发现该细菌在体外和植物原位条件下均受到AGS调控(图1和6)。为此，我们用WT HrpL转基因或突变形式(突变体HrpL)补偿PtoΔhrpL突变体，所述突变体HrpL在siRNA靶向区域含有尽可能多的沉默突变，预测其能够改变siRNA与HrpL mRNA的结合但产生相同的蛋白序列。此外，为评估抗HrpL siRNA可能作用于这些细菌转基因的转录后调控控制，我们在组成型新霉素磷酸转移酶II(NPTII)启动子下表达它们。两种产生的重组细菌分别称为PtoΔhrpL WT HrpL和PtoΔhrpL mut HrpL，并且发现它们接种到Col-0植物上后恢复重新打开气孔的能力(图8A，数据未显示)，表明这两个转基因均具有功能。我们进一步评估每种重组细菌对AGS的敏感性。为此，我们将PtoΔhrpL WT HrpL和PtoΔhrpL mut HrpL菌株与来自CV和IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA提取物孵育8小时，然后进一步通过RT-qPCR分析监测HrpL转基因mRNA水平。我们发现来自PtoΔhrpL WT HrpL菌株表达的HrpL mRNA的积累显著减少，而这种减少在来自CV植物的对照RNA提取物处理后未检测到(图8B)。这些数据表明，从PtoΔhrpL WT HrpL菌株表达的WT HrpL转基因对AGS完全敏感，尽管其组成型表达由NPTII启动子驱动。相比之下，响应于来自IR-CFA6/HRPL#4植物的RNA提取物，从PtoΔhrpL mut HrpL菌株表达的HrpL mRNA的积累没有改变(图8B)，说明siRNA不再发挥其对该重组细菌的AGS作用。总的来说，这些发现表明抗HrpL siRNA是导致Pto DC3000细胞内HrpL毒力因子基因转录后沉默的原因。接下来，我们通过利用对小RNA作用高度敏感的Pto DC3000诱导的气孔重新打开测定，研究每个重组细菌菌株对siRNA指导的发病机理降低的反应性。为评估siRNA针对抑制HrpL介导的气孔重新打开功能的特异性作用，我们首先克隆IR-HRPL反向重复序列，其靶向与IR-CFA6/HRPL发夹所靶向的区域相同的HrpL序列区域，以及进一步验证其通过农杆菌介导的本氏烟草叶子中瞬时转化产生HrpLsiRNA的能力(图8C)。发现含有抗HrpL siRNA的本氏烟草总RNA提取物可完全抑制PtoDC3000重新打开气孔的能力(图8D)。重要的是，将含有抗HrpL siRNA的本氏烟草RNA提取物与PtoΔhrpL WT HrpL菌株一起孵育时，获得相似的结果(图8D)，支持该菌株对siRNA作用的敏感性。相比之下，PtoΔhrpL mut HrpL菌株在相同条件下完全有能力重新打开气孔(图8D)，表明抗HrpL siRNA不再对该重组细菌菌株发挥其抗菌作用。因此，这些数据提供证据表明抗HrpL siRNA是抑制HrpL介导的气孔重新打开功能的原因。他们还进一步证实HrpL在细菌诱导的气孔重新打开中的新作用，表明AGS可以用作表征细菌基因功能的工具。
实施例8.IR-CFA6/HRPL植物的非原质体流体由功能性抗菌siRNA组成，这些功能性抗菌siRNA可以包埋在EV中以抵御微球菌核酸酶的作用、或呈对微球菌核酸酶消化敏感的游离形式
实施例3和4中描述的表型分析结果表明，在IR-CFA6/HRPL转基因品系中组成型表达的小RNA种类必须从植物细胞外化至叶表面、非原质体环境和木质部维管，以便到达附生和内生细菌菌群。为深入了解可能与这种现象有关的小RNA转运机制，我们首先从IR-CFA6/HRPL植物中提取非原质体流体(APF)，并通过监测其对Pto DC3000诱导的气孔重新打开的影响来检验其抑制细菌发病机理的能力。我们发现，这种细胞外流体在感染期间触发气孔重新打开的完全抑制，从而模拟IR-CFA6/HRPL来源的总RNA触发的效应(图9A)。相比之下，来自IR-CYP51植物的APF是无活性的，支持来自IR-CFA6/HRPL植物AFP的抗Cfa6和抗HrpLsiRNA在该过程中的特异性作用(图9A)。我们进一步检验来自IR-CFA6/HRPL植物的EV是否可能有助于AGS。为此，我们从IR-CFA6/HRPL植物中回收APF，并进一步以40,000g、或以40,000g接着以100,000g进行差速超速离心，这使我们能够分别收集两个级分，即，P40和P100。有趣的是，我们发现这两个级分均能抑制气孔重新打开，尽管在该过程中P100效果稍差(图9B)。重要的是，两种级分在微球菌核酸酶(Mnase)的存在下仍保持活性，这表明小RNA包埋在EV中时可抵御外部降解。有趣的是，我们还注意到，在40,000g和100,000g的顺序离心后回收的上清液级分(SN)表现出很强的抗菌活性，尽管在该级分中未检测到典型的EV(图9B，数据未显示)。这表明与蛋白质结合和/或呈游离形式的EV游离的小RNA可能还胜任AGS。为确定两个小RNA实体中的哪个可以具有这种抗菌活性，我们用Mnase或蛋白酶K处理来自IR-CFA6/HRPL植物的SN级分，并对其进行气孔重新打开测定。有趣的是，我们发现Mnase处理消除IR-CFA6/HRPL来源的SN级分触发的抗菌作用，而在整体降解蛋白的蛋白酶K存在的情况下检测到未改变的抗菌活性(图9B，未显示数据)。总体而言，这些数据表明功能性EV游离的抗菌小RNA不可能与蛋白质结合，因此在这里称为“细胞外游离小RNA”或“efsRNA”。我们的结果还表明efsRNA对Mnase的作用敏感，因为它们在用该核酸酶处理后失去抗菌作用(图9B)。基于这些发现，我们建议IR-CFA6/HRPL植物的APF由至少三个功能性抗菌小RNA的群体组成，即1)包埋在大EV(P40级分)中的功能性抗菌小RNA群体、2)包埋在较小尺寸EV中的功能性抗菌小RNA群体(P100级分)、或3)游离形式的功能性抗菌小RNA群体。
实施例9.小RNA的体外合成是一种简便、快速且可靠的方法以筛选具有抗菌活性的候选小RNA。
为开发筛选平台以鉴定具有抗菌活性的候选小RNA，我们旨在生产针对特定细菌基因转录本的体外合成的siRNA，并进一步检验其在细菌致病性或存活上的活性。为此，我们首先决定生成体外合成的与通过DCL依赖性加工IR-CFA6/HRPL产生的植物siRNA靶向相同序列的抗Cfa6和抗HrpL siRNA。为此，我们使用携带T7启动子序列的引物，从含有IR-CYP51或IR-CFA6/HRPL序列的质粒中扩增CYP51或CFA6/HRPL DNA。所得的PCR产物经过凝胶纯化，随后作为模板用于使用T7 RNA聚合酶进行的体外RNA转录，从而产生预期尺寸的CYP51或CFA6/HRPL dsRNA(图10A)。通过使用
Figure BDA0003024308560000601
RNase III将这些dsRNA消化成18-25bp siRNA，可以进一步获得小RNA，尽管其他非商业性RNase III也可以用于此过程(数据未显示)。正如琼脂糖凝胶电泳所揭示的，从dsRNA中剥离出这些siRNA(图10A)，表明在这些实验中使用的RNase III完全加工dsRNA分子的初始库。接下来，我们分析合成的dsRNA和siRNA抑制气孔重新打开的能力。与我们先前的数据显示植物dsRNA在触发AGS时无活性相一致(图7)，我们发现体外合成的CFA6/HRPL dsRNA不会干扰Pto DC3000诱导的气孔重新打开，用作阴性对照的体外合成的CYP51 dsRNA也不会干扰Pto DC3000诱导的气孔重新打开(图10B)。相比之下，针对Cfa6和HrpL的体外合成siRNA完全阻止Pto DC3000诱导的气孔重新打开，而体外合成的抗CYP51 siRNA在此过程中没有活性(图10B)。后一个结果表明，体外合成的抗Cfa6和抗HrpL siRNA可能能够触发Cfa6和HrpL基因的沉默。为检验该假设，我们进一步将浓度为2ng/ul的体外合成的CYP51和CFA6/HRPL siRNA与1x107cfu/ml的PtoDC3000孵育6小时，并通过RT-qPCR分析进一步监测Cfa6和HrpL mRNA。通过这样做，我们发现与抗CYP51 siRNA相比，抗Cfa6/HrpL siRNA触发Cfa6和HrpL mRNA的积累显著减少(图10B)，这种分子作用与对含有抗Cfa6和抗HrpL siRNA的植物来源总RNA的反应中观察到的作用是可比较的(图6A，7B)。相比之下，与抗CYP51 siRNA相比，针对抗Cfa6和抗HrpL siRNA的非靶向ProC和RpoB mRNA的水平保持不变(图10B)。总体而言，这些数据表明，体外合成的siRNA与植物来源的抗Cfa6和抗HrpL siRNA可在相同程度上触发AGS和抗菌活性。
接下来，我们决定确定这种方法是否可用于鉴定具有杀菌活性的候选siRNA。为测试这个观点，我们进行针对来自Pto DC3000的三个保守的管家基因的siRNA的体外合成，所述三个保守的管家基因，即SecE(PSPTO_0613，前蛋白转位酶SecE亚基)、FusA(PSPTO_0623，翻译延伸因子G)和GyrB(PSPTO_0004，DNA旋转酶亚基B)，并进一步监测其对这种细菌体外生长的影响。为此，我们利用已建立的基于液滴的微流体***，该***适用于细菌生物质和细菌表达的荧光报告基因活性的准确测量。通过使用这种方法，我们发现与缺少siRNA或存在抗SecE siRNA的情况相比，0.33ng/μl的体外合成的针对FusA的siRNA能够减少来自带有GFP标签的Pto DC3000(Pto DC3000-GFP)的生物质和GFP信号(图10E、F)。令人惊讶的是，当Pto DC3000-GFP菌株与1ng/ul的体外合成的抗FusA siRNA孵育时，或者当体外合成的针对GyrB的siRNA以0.33ng/μl或1ng/μl的浓度施用时，我们未检测到任何GFP信号或细菌生物质(图10E、F)。这些数据表明，针对FusA和GyrB的siRNA具有有效的杀菌活性，其模仿在存在抗生素的情况下可以检测到的效果。基于这些概念验证实验，我们得出结论，siRNA的体外合成是用于筛选具有抗菌活性的新型候选小RNA的一种简便、快速且可靠的方法。他们还揭示FusA和GyrB在Pto DC3000存活中的作用，此前尚未报告过针对这种细菌。因此，这些结果进一步支持以下事实：AGS可以用作表征细菌基因功能的工具。
实施例10植物小RNA和体外合成的小RNA可以在铜绿假单孢菌中触发AGS，该调节方法用于通过靶向该细菌的一些必需基因来降低该细菌生长。
上述发现，以及已知哺乳动物细胞表达的长dsRNA触发有力的抗病毒干扰素反应的事实(37)(这与在植物细胞中的情况不同)，促使我们进一步评估是否可以采用植物来生产针对动物病原细菌的小RNA。为此目的，我们在本氏烟草叶子中使用农杆菌介导的转化，首先瞬时表达在实施例2中描述的反向重复序列IR-LuxA/LuxB构建体。作为阴性对照，我们也已经在本氏烟草叶子中瞬时表达与GFP报告子基因具有序列同源性的反向重复序列。含有抗LuxA/B siRNA或抗GFP siRNA的总RNA与之前描述的表达lux报告子***的铜绿假单孢菌(PAK)菌株(64)一起孵育，在体外条件在酶标仪上进一步监测生物发光活性。使用这种方法，我们检测到在存在抗LuxA和抗LuxB植物siRNA时，生物发光活性的特异性降低，而使用抗GFP siRNA未观察到(图11A)。与之相反，在存在任何一个小RNA种类时，带有lux标签的PAK菌株的生长未改变，如在600nm(OD600)处吸光度测量所示(图11B)。该结果表明，上述检测的效果并非是因为在存在抗LuxA和抗LuxB siRNA时降低的细菌滴度。而是指出，植物来源的针对luxA和luxB报告子基因的siRNA可以在带有lux标签的PAK菌株中触发AGS。
为了进一步确定是否针对PAK内源基因还可以检测到AGS，我们进一步生成嵌合反向重复序列，其设计为同时靶向DnaA、DnaN和GyrB基因、或RpoC、SecE和SodB基因。值得注意的是，选择这些铜绿假单胞菌靶是因为已知它们单个缺失会改变该细菌的存活(38-40)。发现这两个反向重复序列构建体在本氏烟草叶子中进行农杆菌介导的转化后，过表达针对这些细菌基因的小RNA(数据未显示)。有趣的是，我们发现，与源自未转化的本氏烟草叶子中的总RNA提取物相比，当20ng/ul的各总RNA提取物与带有lux标签的PAK菌株一起孵育时，生物发光活性降低(图11C)。此外，这些表型也与带有lux标签的PAK菌株的生长降低相关，如在600nm(OD600)的吸光度减少所示(图11D)。与之相反，含有抗GFP siRNA的RNA提取物在相同条件下并不改变生物发光活性或细菌滴度(图11C/D)。这些结果指示，同时靶向来自PAK菌株的必需基因的植物人工siRNA在体外条件下有效触发AGS和细菌生长降低。
最后，我们调查体外合成的siRNA是否在这些原核细胞中也可有活性，如在致植物病细菌Pto DC3000中所观察到的(实施例10、图10)。为了检验该假说，我们进行了针对DnaA、DnaN、GyrB、RpoC、SecE或SodB的siRNA的体外合成。作为阴性对照，我们还合成靶向实施例2中所述的镰刀菌CYP51基因的siRNA。这些siRNA与5ng/ul浓度的铜绿假单胞菌PAO菌株一起孵育，并使用基于液滴的微流体***进一步分析该细菌的生长。来自这些分析的结果显示，与对照抗CYP51 siRNA相比，针对DnaA、RpoC或SodB基因的体外合成的siRNA不改变铜绿假单胞菌PAO菌株的体外生长(图12)。与之相反，与抗CYP51 siRNA相比，针对GyrB、DnaN或SecE基因的siRNA触发该细菌生长的下降，其中使用抗SecE siRNA检测到更强的生长降低作用(图12)。基于这些结果，我们得出以下结论：使用体外合成的特异性siRNA可能不仅在致植物病细菌菌株中起作用(实施例9)、而且还在典型革兰氏阴性人类细菌病原体中起作用(实施例10)。这支持以下观点：不相关的细菌细胞可被动或主动摄取外部小RNA，并随后触发靶向的细菌基因的序列特异性沉默。这些结果还证明，siRNA体外合成，结合筛选***(例如，在该实施例中使用的基于液滴的微流体设备)结合，是一种以简便、快速和可靠的方式筛选对动物细菌病原体具有抗菌活性的小RNA的有效方法。
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序列表
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国家健康科学研究所(INSERM)
巴黎高等师范学院(ENS)
<120> 保护植物防御病原细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益作用的基于RNA的生物防治方法
<130> B376495 D30812
<150> EP18306124.1
<151> 2018-08-17
<160> 249
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000的HrpL和Cfa6基因的HRPL/CFA6 dsRNA的第一臂的序列
<400> 1
atgaacaagc gctacggcaa caacttgccg ggatcctgtt gcgcgctgag caaccggatc 60
gactggacgt caccttcgcg cagcacgcca tctggcaaaa aggccgccgt taatcgtttc 120
caatatttct gcaggagtct gcccgtgacc accttcaccg tgcccctgat tctgtcggat 180
gcaagcccca cggcactcgc cgctaccgcg caacgtctgc gcgccgagca cgagacgcgc 240
tccttcgccg ctgatgactg acatcaccgt gcccttccag ctcggaatgc acttcgtctt 300
cccagctttc ctgatacggc tgacgataca ttttgcggaa gtgattgcgg atcaggttca 360
gcgcgatgcc acacagccag gtctgcggtt tgctggcatg ttgaaacttg tgctcgttac 420
gcagggcttc aagaaacacg cactggagaa tgtcatccac atcatcaggg ttcatcaccc 480
gcttttggat aaacgccctg 500
<210> 2
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于生成所有来自本发明的反向重复序列的CHSA内含子的序列
<400> 2
ggcgcgccca atcgatgatt taaatgtgta agaatttctt atgttacatt attacattca 60
acgttttatc ttaattggct cttcatttga ttgaaatttg acaattattt cttgtttttt 120
tttttgtcac actctttttg ggttggggtg gccgacgaat tgtgggaagg tagaaagagg 180
ggaggacttt tgttatactc cattagtaat tactgtttcc gtttcaattt atgtgacaat 240
atttcctttt tagtcggttc caaaagaaaa tgtcagcatt ataaacaatt taattttgaa 300
attacaattt tgccattaat aaaatgattt acaaccacaa aagtatctat gagcctgttt 360
gggtgggctt ataagcagct tattttaagt ggcttataag tcaaaaagtg acattttttg 420
agaagttaga aaatcctaac ttctcaaaaa gtagctttta agccacttat gacttataag 480
tccaaaaatt tttaagttac caaacatata ttaatgggtt tataagctta taagccactt 540
ttaagctcac ccaaacgggt tctatgtctc actttagact acaaatttta aaagtcttca 600
tttatttctt aatctccgtg gcgagtaaaa ctataacaca taaagtgaaa cggagggaat 660
aagatggagt cataaactaa tccaaatcta tactctctcc gttaatttgt tttttagttt 720
gatttggtac attaataaaa cagatttttc gaaggttata aacacagaca gatgtttccc 780
agcgagctag caaaattcca agatttctgt cgaaaattcg tgtgtttcta gctagtactt 840
gatgttatct ttaacctttt agtaattttt tgtccttttc tttctatttt tcatcttaca 900
atgaattatg agcaagttcc ttaagtagca tcacacgtga gatgtttttt atgatattga 960
ctaaatccaa tctttaccat tccttaacta gtaaaataca acacatgtta attgatacat 1020
tgcttaacac tgaggttaga aaattttaga aattagttgt ccaaatgctt tgaaattaga 1080
aatctttaat cccttatttt tttttaaaat gttttttctc actccaaaga aagagaaact 1140
gacatgaaag ctcaaaagat catgaatctt actaactttg tggaactaaa tgtacatcag 1200
aatgtttctg acatgtgaaa atgaaagctc ttaattttct tcttttattt attgagggtt 1260
tttgcatgct atgcattcaa tttgagtact ttaaagcacc tataaacact tacttacact 1320
tgccttggag tttatgtttt agtgttttct tcacatcttt tttggtcaat ttgcaggtat 1380
ttggatccta ggtgagtcta gaggcgcgcc 1410
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000的HrpL和Cfa6基因的HRPL/CFA6 dsRNA的第二臂的序列
<400> 3
cagggcgttt atccaaaagc gggtgatgaa ccctgatgat gtggatgaca ttctccagtg 60
cgtgtttctt gaagccctgc gtaacgagca caagtttcaa catgccagca aaccgcagac 120
ctggctgtgt ggcatcgcgc tgaacctgat ccgcaatcac ttccgcaaaa tgtatcgtca 180
gccgtatcag gaaagctggg aagacgaagt gcattccgag ctggaagggc acggtgatgt 240
cagtcatcag cggcgaagga gcgcgtctcg tgctcggcgc gcagacgttg cgcggtagcg 300
gcgagtgccg tggggcttgc atccgacaga atcaggggca cggtgaaggt ggtcacgggc 360
agactcctgc agaaatattg gaaacgatta acggcggcct ttttgccaga tggcgtgctg 420
cgcgaaggtg acgtccagtc gatccggttg ctcagcgcgc aacaggatcc cggcaagttg 480
ttgccgtagc gcttgttcat 500
<210> 4
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的Cfa6基因的CFA6-A dsRNA的第一臂的序列
<400> 4
atgaacaagc gctacggcaa caacttgccg ggatcctgtt gcgcgctgag caaccggatc 60
gactggacgt caccttcgcg cagcacgcca tctggcaaaa aggccgccgt taatcgtttc 120
caatatttct gcaggagtct gcccgtgacc accttcaccg tgcccctgat tctgtcggat 180
gcaagcccca cggcactcgc cgctaccgcg caacgtctgc gcgccgagca cgagacgcgc 240
tccttcgccg 250
<210> 5
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的Cfa6基因的CFA6-A dsRNA的第二臂的序列
<400> 5
cggcgaagga gcgcgtctcg tgctcggcgc gcagacgttg cgcggtagcg gcgagtgccg 60
tggggcttgc atccgacaga atcaggggca cggtgaaggt ggtcacgggc agactcctgc 120
agaaatattg gaaacgatta acggcggcct ttttgccaga tggcgtgctg cgcgaaggtg 180
acgtccagtc gatccggttg ctcagcgcgc aacaggatcc cggcaagttg ttgccgtagc 240
gcttgttcat 250
<210> 6
<211> 472
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的Cfa6基因的CFA6-B dsRNA的第一臂的序列
<400> 6
atgaacaagc gctacggcaa caacttgccg ggatcctgtt gcgcgctgag caaccggatc 60
gactggacgt caccttcgcg cagcacgcca tctggcaaaa aggccgccgt taatcgtttc 120
caatatttct gcaggagtct gcccgtgacc accttcaccg tgcccctgat tctgtcggat 180
gcaagcccca cggcactcgc cgctaccgcg caacgtctgc gcgccgagca cgagacgcgc 240
tccttcgccg aatggcaagt attctgccga cagcaactga cacgcgacca tgccgaatac 300
cgcgcggcca tcttagccac cgatcaagcc agcctactca aagggctgga tatgctggcc 360
cgcggccgag cctcgcgcca tctggtgctg ggccgcgccg accagttgcg acagccggta 420
ctggtgtttc caggccaagg accgctatgg ccgcggatga ctaccggact ga 472
<210> 7
<211> 472
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的Cfa6基因的CFA6-B dsRNA的第二臂的序列
<400> 7
tcagtccggt agtcatccgc ggccatagcg gtccttggcc tggaaacacc agtaccggct 60
gtcgcaactg gtcggcgcgg cccagcacca gatggcgcga ggctcggccg cgggccagca 120
tatccagccc tttgagtagg ctggcttgat cggtggctaa gatggccgcg cggtattcgg 180
catggtcgcg tgtcagttgc tgtcggcaga atacttgcca ttcggcgaag gagcgcgtct 240
cgtgctcggc gcgcagacgt tgcgcggtag cggcgagtgc cgtggggctt gcatccgaca 300
gaatcagggg cacggtgaag gtggtcacgg gcagactcct gcagaaatat tggaaacgat 360
taacggcggc ctttttgcca gatggcgtgc tgcgcgaagg tgacgtccag tcgatccggt 420
tgctcagcgc gcaacaggat cccggcaagt tgttgccgta gcgcttgttc at 472
<210> 8
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的HrpL基因的HRPL-A dsRNA的第一臂的序列
<400> 8
ctgatgactg acatcaccgt gcccttccag ctcggaatgc acttcgtctt cccagctttc 60
ctgatacggc tgacgataca ttttgcggaa gtgattgcgg atcaggttca gcgcgatgcc 120
acacagccag gtctgcggtt tgctggcatg ttgaaacttg tgctcgttac gcagggcttc 180
aagaaacacg cactggagaa tgtcatccac atcatcaggg ttcatcaccc gcttttggat 240
aaacgccctg 250
<210> 9
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的HrpL基因的HRPL-A dsRNA的第二臂的序列
<400> 9
cagggcgttt atccaaaagc gggtgatgaa ccctgatgat gtggatgaca ttctccagtg 60
cgtgtttctt gaagccctgc gtaacgagca caagtttcaa catgccagca aaccgcagac 120
ctggctgtgt ggcatcgcgc tgaacctgat ccgcaatcac ttccgcaaaa tgtatcgtca 180
gccgtatcag gaaagctggg aagacgaagt gcattccgag ctggaagggc acggtgatgt 240
cagtcatcag 250
<210> 10
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的HrpL基因的HRPL-B dsRNA的第一臂的序列
<400> 10
ctgatgactg acatcaccgt gcccttccag ctcggaatgc acttcgtctt cccagctttc 60
ctgatacggc tgacgataca ttttgcggaa gtgattgcgg atcaggttca gcgcgatgcc 120
acacagccag gtctgcggtt tgctggcatg ttgaaacttg tgctcgttac gcagggcttc 180
aagaaacacg cactggagaa tgtcatccac atcatcaggg ttcatcaccc gcttttggat 240
aaacgccctg agcatctgaa tctgatcggc cgtcatttgg cgaataccgg cggacgaaga 300
tggctgacgg ggctgggttg agtcgaggat cacaatcttc tgaaacat 348
<210> 11
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的HrpL基因的HRPL-B dsRNA的第二臂的序列
<400> 11
atgtttcaga agattgtgat cctcgactca acccagcccc gtcagccatc ttcgtccgcc 60
ggtattcgcc aaatgacggc cgatcagatt cagatgctca gggcgtttat ccaaaagcgg 120
gtgatgaacc ctgatgatgt ggatgacatt ctccagtgcg tgtttcttga agccctgcgt 180
aacgagcaca agtttcaaca tgccagcaaa ccgcagacct ggctgtgtgg catcgcgctg 240
aacctgatcc gcaatcactt ccgcaaaatg tatcgtcagc cgtatcagga aagctgggaa 300
gacgaagtgc attccgagct ggaagggcac ggtgatgtca gtcatcag 348
<210> 12
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的HrcC基因的HrcC dsRNA的第一臂的序列
<400> 12
gaaggcgtgg ttctggttcg tggtccggcc aaatacgtgg agtttgtgcg cgactacagc 60
aagaaagtcg aaaagcccga cgagaaggcc gacaagcaag atgttgtcgt gctgccactc 120
aaatacgcca acgcggctga tcggactatt cgctaccgtg accagcagtt agtggtggcc 180
ggtgtcgcca gtattcttca agagctgctg gaaagccgtt cgcgtggcga aagcattgac 240
agcgtgaacc tgttgccggg gcagggcagc agtgttgcca acagcacagg tgtcgcggcc 300
gccggcctgc cttacaacct gggctccaat ggtatcgata cgggagcact gcaacagggc 360
<210> 13
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向Pto DC3000的HrcC基因的HRCC dsRNA的第二臂的序列
<400> 13
gccctgttgc agtgctcccg tatcgatacc attggagccc aggttgtaag gcaggccggc 60
ggccgcgaca cctgtgctgt tggcaacact gctgccctgc cccggcaaca ggttcacgct 120
gtcaatgctt tcgccacgcg aacggctttc cagcagctct tgaagaatac tggcgacacc 180
ggccaccact aactgctggt cacggtagcg aatagtccga tcagccgcgt tggcgtattt 240
gagtggcagc acgacaacat cttgcttgtc ggccttctcg tcgggctttt cgactttctt 300
gctgtagtcg cgcacaaact ccacgtattt ggccggacca cgaaccagaa ccacgccttc 360
<210> 14
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的AvrPto和AvrPtoB基因的AvrPto/AvrPtoB dsRNA的第一臂的序列
<400> 14
atgggaaata tatgtgtcgg cggatccagg atggcccatc aggtgaactc cccagaccga 60
gttagtaaca actcgggtga cgaagataac gtaacgtcca gtcaactgct gagcgtcaga 120
catcaacttg cggagtctgc tggtgtacca agagatcagc atgaatttgt tagtaaccaa 180
gcacctcaaa gcctgagaaa atggcgggta tcaatagagc gggaccatcg ggcgcttatt 240
ttgttggcca cacagacccc gagccagtat cggggcaagc acacggatcc ggcagcggcg 300
ccagctcctc gaacagtccg caggttcagc cgcgaccctc gaatactccc ccgtcgaacg 360
cgcccgcacc gccgccaacc ggacgtgaga ggctttcacg 400
<210> 15
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的AvrPto和AvrPtoB基因的AvrPto/AvrPtoB dsRNA的第二臂的序列
<400> 15
cgtgaaagcc tctcacgtcc ggttggcggc ggtgcgggcg cgttcgacgg gggagtattc 60
gagggtcgcg gctgaacctg cggactgttc gaggagctgg cgccgctgcc ggatccgtgt 120
gcttgccccg atactggctc ggggtctgtg tggccaacaa aataagcgcc cgatggtccc 180
gctctattga tacccgccat tttctcaggc tttgaggtgc ttggttacta acaaattcat 240
gctgatctct tggtacacca gcagactccg caagttgatg tctgacgctc agcagttgac 300
tggacgttac gttatcttcg tcacccgagt tgttactaac tcggtctggg gagttcacct 360
gatgggccat cctggatccg ccgacacata tatttcccat 400
<210> 16
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C基因的CYP51 dsRNA的第一臂的序列
<400> 16
cagcaagttt gacgagtccc tggccgctct ctaccacgac ctcgatatgg gcttcacccc 60
catcaacttc atgcttcact gggcccctct cccctggaac cgtaagcgcg accacgccca 120
gcgcactgtt gccaagatct acatggacac tatcaaggag cgccgcgcca agggcaacaa 180
cgaatccgag catgacatga tgaagcacct tatgaactct cggtccattg acaatccccg 240
tctttggtag cgatgtcgta tacgattgtc ccaactcgaa gctcatggaa caaaagaagt 300
ttgtcaagtt tggccttacg caaaaagcac tcgagtcaca cgtccagtta atcgagcgag 360
aggttcttga ctacgtcgaa actgatccat ccttttctgg cagaactagc accatcgatg 420
tccccaaggc aatggctgag ataacaatct ttactgcctc acgttctttg cagggtgagg 480
aagttcggag aaaactcact gccgagtttg ctgcattgga agcaccgtac aatatggcat 540
cgacccgtac gcttttttct tcgactgcag agataaatac ggcgactgct ttacctttat 600
tctccttggc aaatcaacga ctgtctttct tggtcccaag ggcaatgact ttatcctcaa 660
cggcaaacac gccgatctca acgccgagga cgtttatggg aaacttacca cgcccgtgtt 720
tggtgaggag gttgtttatg actgctccaa tg 752
<210> 17
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于靶向禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C基因的CYP51 dsRNA的第二臂的序列
<400> 17
cattggagca gtcataaaca acctcctcac caaacacggg cgtggtaagt ttcccataaa 60
cgtcctcggc gttgagatcg gcgtgtttgc cgttgaggat aaagtcattg cccttgggac 120
caagaaagac agtcgttgat ttgccaagga gaataaaggt aaagcagtcg ccgtatttat 180
ctctgcagtc gaagaaaaaa gcgtacgggt cgatgccata ttgtacggtg cttccaatgc 240
agcaaactcg gcagtgagtt ttctccgaac ttcctcaccc tgcaaagaac gtgaggcagt 300
aaagattgtt atctcagcca ttgccttggg gacatcgatg gtgctagttc tgccagaaaa 360
ggatggatca gtttcgacgt agtcaagaac ctctcgctcg attaactgga cgtgtgactc 420
gagtgctttt tgcgtaaggc caaacttgac aaacttcttt tgttccatga gcttcgagtt 480
gggacaatcg tatacgacat cgctaccaaa gacggggatt gtcaatggac cgagagttca 540
taaggtgctt catcatgtca tgctcggatt cgttgttgcc cttggcgcgg cgctccttga 600
tagtgtccat gtagatcttg gcaacagtgc gctgggcgtg gtcgcgctta cggttccagg 660
ggagaggggc ccagtgaagc atgaagttga tgggggtgaa gcccatatcg aggtcgtggt 720
agagagcggc cagggactcg tcaaacttgc tg 752
<210> 18
<211> 667
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向雷尔氏菌属的HrpG、HrpB和HrcC 基因的HRPG/HRPB/HRCC dsRNA的第一臂的序列
<400> 18
cgcatgcctg gccgtgcaga acgtggaatg tgtccggttc gacgatgccc tgacgctgtt 60
gcgtgcacgg cgtaccgagg cattcagtct gctgctgatc gatgcccagc agttccgcag 120
cgcgggacag ctggtgctgt cctggcgcga gtgcaacgcc gacatgtgct ggccgacgct 180
ggtgttcggc cagttcgcag tgaagaagcg gaagaaggct tccgcctggc gcagcgcctg 240
atccgccatt cggatgacgc gcgatcgcta cgccgcggcg gcgagctgct tctcgcgcat 300
ggccgaagac gatggcgcga cctggaccca gcaggtcgag ggcctgatcg gcccgcggct 360
ggctggccac catcgatctg atcatctacg ttttcgccgt gcaggccggc atccgctgct 420
ccaaccgcct gctcgagcat gcgttctggc aatcggccga aatgggcatc tcgacgcagg 480
tcgagggcag cgtgacgggc tcgttcaacg agacgccgca gaagtttctc gaccgcatgg 540
ccggcacgtt cggctttgcg tggtactacg acggcgcggt gctgcgcgtg accagcgcca 600
acgaagcgca gagcgccacc atcgcgctga cccgcgcctc gaccgcgcag gtcaagcggg 660
cgctgac 667
<210> 19
<211> 667
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向雷尔氏菌属的HrpG、HrpB和HrcC 基因的HRPG/HRPB/HRCC dsRNA的第二臂的序列
<400> 19
gtcagcgccc gcttgacctg cgcggtcgag gcgcgggtca gcgcgatggt ggcgctctgc 60
gcttcgttgg cgctggtcac gcgcagcacc gcgccgtcgt agtaccacgc aaagccgaac 120
gtgccggcca tgcggtcgag aaacttctgc ggcgtctcgt tgaacgagcc cgtcacgctg 180
ccctcgacct gcgtcgagat gcccatttcg gccgattgcc agaacgcatg ctcgagcagg 240
cggttggagc agcggatgcc ggcctgcacg gcgaaaacgt agatgatcag atcgatggtg 300
gccagccagc cgcgggccga tcaggccctc gacctgctgg gtccaggtcg cgccatcgtc 360
ttcggccatg cgcgagaagc agctcgccgc cgcggcgtag cgatcgcgcg tcatccgaat 420
ggcggatcag gcgctgcgcc aggcggaagc cttcttccgc ttcttcactg cgaactggcc 480
gaacaccagc gtcggccagc acatgtcggc gttgcactcg cgccaggaca gcaccagctg 540
tcccgcgctg cggaactgct gggcatcgat cagcagcaga ctgaatgcct cggtacgccg 600
tgcacgcaac agcgtcaggg catcgtcgaa ccggacacat tccacgttct gcacggccag 660
gcatgcg 667
<210> 20
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向雷尔氏菌属的HrpB、HrcC、XpsR和TssB基因的HRPB/HRCC/TssB/XpsR dsRNA的第一臂的序列
<400> 20
gcgcgatcgc tacgccgcgg cggcgagctg cttctcgcgc atggccgaag acgatggcgc 60
gacctggacc cagcaggtcg agggcctgat cggcccgcgg ctggctggcc accatcgatc 120
tgatcatcta cgttttcgcc gtgcaggccg gcatccgctg ctccaaccgc ctgctcgagc 180
atgcgttctg gcaatcggcc gaaatgggca tctcgacgca ggtcgagggc agcgtgacgg 240
gctcgttcaa cgagacgccg cagaagtttc tcgaccgcat ggccggcacg ttcggctttg 300
cgtggtacta cgacggcgcg gtgctgcgcg tgaccagcgc caacgaagcg cagagcgcca 360
ccatcgcgct gacccgcgcc ggccgcgcgt gcggagaccc atcggcggcc gcagagcgaa 420
tgcgactgga agcattactt tgcggacctg ctctatgcgc cgaacggcgc cgagttcaag 480
ctcagcctgt ttccgctgcc cgcgcagcag atcggcgaca cgccctggtc gcgggcattc 540
cgcgggcagc cggcgatgct tgacaaccaa tccgccgcgc tcgcgcagag cgcaccggca 600
gccgagtccg tcaacctgct cgacgagatc gtcgagcaga gccgcgtcgc caagtcggac 660
gccgagcacg cgcgcgccaa ggacatcatc ggcgagctgg tcaac 705
<210> 21
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向雷尔氏菌属的HrpB、HrcC、XpsR和TssB基因的HRPB/HRCC/TssB/XpsR dsRNA的第二臂的序列
<400> 21
gttgaccagc tcgccgatga tgtccttggc gcgcgcgtgc tcggcgtccg acttggcgac 60
gcggctctgc tcgacgatct cgtcgagcag gttgacggac tcggctgccg gtgcgctctg 120
cgcgagcgcg gcggattggt tgtcaagcat cgccggctgc ccgcggaatg cccgcgacca 180
gggcgtgtcg ccgatctgct gcgcgggcag cggaaacagg ctgagcttga actcggcgcc 240
gttcggcgca tagagcaggt ccgcaaagta atgcttccag tcgcattcgc tctgcggccg 300
ccgatgggtc tccgcacgcg cggccggcgc gggtcagcgc gatggtggcg ctctgcgctt 360
cgttggcgct ggtcacgcgc agcaccgcgc cgtcgtagta ccacgcaaag ccgaacgtgc 420
cggccatgcg gtcgagaaac ttctgcggcg tctcgttgaa cgagcccgtc acgctgccct 480
cgacctgcgt cgagatgccc atttcggccg attgccagaa cgcatgctcg agcaggcggt 540
tggagcagcg gatgccggcc tgcacggcga aaacgtagat gatcagatcg atggtggcca 600
gccagccgcg ggccgatcag gccctcgacc tgctgggtcc aggtcgcgcc atcgtcttcg 660
gccatgcgcg agaagcagct cgccgccgcg gcgtagcgat cgcgc 705
<210> 22
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向芸苔黄单孢杆菌芸苔致病变种的 HrpG、HrpX和RsmA基因的HRPG/HRPX/RsmA dsRNA的第一臂的序列
<400> 22
gtgatggacg ccgctgcgaa tgaccgccaa ggatcggcat tcgtactgac gcaggacgcg 60
cggctggcat cacagatcaa cgccagcctg gcgactctgg tcccagaggt caccatcttt 120
tcagacgaac tcgaattgct gcgctgcctg cgccactcgc cgtgcgagct tctggttttc 180
gatgcccatt gcgtggcatc ggacgacagt atgatccttt cgacctactt cgcagcgatc 240
tctgcgttgt cttacgcaga ccgtcttccg atctatacga gcaggatgct tgttggtgct 300
tggccacagg gtctgcagca cctccagcaa cgtcgcgagg ggcaggcagc tccggatggc 360
agcgacgacg aagtcgcatt gctgggcgcc agcgccgatg ccttgttgat tctggagtat 420
atgttgatcc tcactcgccg agtaggcgaa accctgatga tcggcgactt ggtcaccgtg 480
accgtgctcg gcgtcaaggg aaatcaggtg cgcattggca ttgacgcgcc taaggatgtt 540
gccgtgcatc gcgaagaaat ctatcagcgc atccagcgcg gtgacgagcc ggttgcgtcc 600
ggtgcgcatc acaacgacga ttgttcggac tga 633
<210> 23
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向芸苔黄单孢杆菌芸苔致病变种的 HrpG、HrpX和RsmA基因的HRPG/HRPX/RsmA dsRNA的第二臂的序列
<400> 23
tcagtccgaa caatcgtcgt tgtgatgcgc accggacgca accggctcgt caccgcgctg 60
gatgcgctga tagatttctt cgcgatgcac ggcaacatcc ttaggcgcgt caatgccaat 120
gcgcacctga tttcccttga cgccgagcac ggtcacggtg accaagtcgc cgatcatcag 180
ggtttcgcct actcggcgag tgaggatcaa catatactcc agaatcaaca aggcatcggc 240
gctggcgccc agcaatgcga cttcgtcgtc gctgccatcc ggagctgcct gcccctcgcg 300
acgttgctgg aggtgctgca gaccctgtgg ccaagcacca acaagcatcc tgctcgtata 360
gatcggaaga cggtctgcgt aagacaacgc agagatcgct gcgaagtagg tcgaaaggat 420
catactgtcg tccgatgcca cgcaatgggc atcgaaaacc agaagctcgc acggcgagtg 480
gcgcaggcag cgcagcaatt cgagttcgtc tgaaaagatg gtgacctctg ggaccagagt 540
cgccaggctg gcgttgatct gtgatgccag ccgcgcgtcc tgcgtcagta cgaatgccga 600
tccttggcgg tcattcgcag cggcgtccat cac 633
<210> 24
<211> 676
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000和丁香假单胞菌CC440的RpoB、RpoC和FusA基因的RpoB/RpoC/FusA dsRNA的第一臂的序列
<400> 24
aacacgtatc cgcaaggact ttagcaagtt gccggacgta atggatgtgc cgtatctctt 60
ggccatccag ctggattcgt atcgcgaatt cctgcaggcg ggagcgacca aagatcagtt 120
ccgcgacgtc ggtctgcatg cagccttcaa atccgttttc ccgatcatca gctactccgg 180
caatgctgcg ctggagtatg taggttatcg cttgggcgag atcttgaaag acctactgaa 240
tttgctgaaa aaccagggtc aagtcgaaga gttcgacgca atccgtatcg gacttgcatc 300
gcctgagatg atccgctctt ggtcgttcgg tgaagttaaa aagccggaaa ccatcaacta 360
ccgtacgttc aagcctgagc gtgacggtct gttctgcgcc aagatctttg gtccggtaaa 420
agattacgag tgcctgtgcg gtaagtacaa ggcatatggc tcgtactact ccgattagcc 480
gttaccgtaa catcggtatc gtcgctcacg tggatgctgg taaaaccacc accaccgagc 540
gcgtcctttt ttacaccggc aaaagccaca aaatgggcga ggtgcatgat ggcgccgcga 600
ccacggactg gatggttcag gagcaggagc gtggtattac cattacttct gctgctatca 660
ctgccttttg gcggct 676
<210> 25
<211> 676
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000和丁香假单胞菌CC440的RpoB、RpoC和FusA基因的RpoB/RpoC/FusA dsRNA的第二臂的序列
<400> 25
tcaggccaaa aggcagtgat agcagcagaa gtaatggtaa taccacgctc ctgctcctga 60
accatccagt ccgtggtcgc ggcgccatca tgcacctcgc ccattttgtg gcttttgccg 120
gtgtaaaaaa ggacgcgctc ggtggtggtg gttttaccag catccacgtg agcgacgata 180
ccgatgttac ggtaacggct aatcggagta gtacgagcca tatgccttgt acttaccgca 240
caggcactcg taatctttta ccggaccaaa gatcttggcg cagaacagac cgtcacgctc 300
aggcttgaac gtacggtagt tgatggtttc cggcttttta acttcaccga acgaccaaga 360
gcggatcatc tcaggcgatg caagtccgat acggattgcg tcgaactctt cgacttgacc 420
ctggtttttc agcaaattca gtaggtcttt caagatctcg cccaagcgat aacctacata 480
ctccagcgca gcattgccgg agtagctgat gatcgggaaa acggatttga aggctgcatg 540
cagaccgacg tcgcggaact gatctttggt cgctcccgcc tgcaggaatt cgcgatacga 600
atccagctgg atggccaaga gatacggcac atccattacg tccggcaact tgctaaagtc 660
cttgcggata cgctgc 676
<210> 26
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000和丁香假单胞菌CC440的SecE、RpoA和RplQ 基因的SecE/RpoA/RplQ dsRNA的第一臂的序列
<400> 26
aacatgaatc ccaaggctga agcatcagac tctcgctttg atttgctgaa atggctcctg 60
gtagtcattt tggtagtcgt gggtgttgtc ggtaatcagt attactctgc tgagccgatc 120
ctgtaccgtg ttctcgctct ccttgtgatt gccgcagcag ctgcatttgt agcgctgcag 180
actggcaagg gcaaagcttt cttcgttttg gcgaaagaag cgcgtgcaga gatgatctgc 240
agatttcggt aaatgagttc ctgacacccc gccacattga tgtgcaggtt gtcagtccaa 300
cccgcgccaa aatcactctc gagcctctcg agcgtggttt cggccatacc ctgggcaacg 360
cgcttcgccg cattttgttg tcctccatgc ccggctgtgc agtagtcgag gccgagattg 420
acggtgtact ccatgagtac agcgccatcg aaggtgtagc atatgcgtca tcgtaaaagt 480
ggacgtcacc tgagccgtac cagctctcac cgtaaagcca tgtttcaaaa catggcggtg 540
tcgctgttcg agcacgagct gatcaaaact accctgccga aagccaagga actgcgccgc 600
gttgccgagc cgctgatcac cctggccaag gaagacagtg ttgctaaccg tcgtctggct 660
ttcgaccgta ctcgttcggc t 681
<210> 27
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000和丁香假单胞菌CC440的SecE、RpoA和RplQ 基因的SecE/RpoA/RplQ dsRNA的第二臂的序列
<400> 27
tcaggaacga gtacggtcga aagccagacg acggttagca acactgtctt ccttggccag 60
ggtgatcagc ggctcggcaa cgcggcgcag ttccttggct ttcggcaggg tagttttgat 120
cagctcgtgc tcgaacagcg acaccgccat gttttgaaac atggctttac ggtgagagct 180
ggtacggctc aggtgacgtc cacttttacg atgacgcata tgctacacct tcgatggcgc 240
tgtactcatg gagtacaccg tcaatctcgg cctcgactac tgcacagccg ggcatggagg 300
acaacaaaat gcggcgaagc gcgttgccca gggtatggcc gaaaccacgc tcgagaggct 360
cgagagtgat tttggcgcgg gttggactga caacctgcac atcaatgtgg cggggtgtca 420
ggaactcatt taccgaaatc tgcagatcat ctctgcacgc gcttctttcg ccaaaacgaa 480
gaaagctttg cccttgccag tctgcagcgc tacaaatgca gctgctgcgg caatcacaag 540
gagagcgaga acacggtaca ggatcggctc agcagagtaa tactgattac cgacaacacc 600
cacgactacc aaaatgacta ccaggagcca tttcagcaaa tcaaagcgag agtctgatgc 660
ttcagccttg ggattcactg c 681
<210> 28
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向黄单孢菌属的NadHb、NadHd和NadHe基因的NadHb/NadHd/NadHedsRNA的第一臂的序列
<400> 28
aacagaagaa gggagcgctg gaatgggagt gattcagacc ctggatcgtc tgatgaccaa 60
cccgatgccg gaaggccggg tcgaagacat cctgcgcccg gaaggcgaaa acccgttgct 120
cgaaaagggc tacgtgacca ccagcgtcga tgcgctgttg aactgggcgc gtacaggttc 180
gatgtggccg atgacctttg gtctggcctg ctgtgcagtc gagatgatgc agatcgtgag 240
tgagtaccgc caggcaaccg atgccttcgc gagcaatcct gtggaaagca agcaggaaat 300
ccgcaattac acgatgaact tcggcccgca gcatcctgcg gcgcacggcg tattgcgcct 360
gatcctggaa atggacggcg aaaccgtggt gcgtgccgac ccgcatatcg gcctgctgca 420
ccgtggcacc gagaagctgg ccgagtccaa gccgttcaac cagtcggttc cgtacagcat 480
cgacgggtaa tttcgaagcg gcgcgcgacg tcgatccgca ggtagtgctg agcgacaaga 540
cgcgcgcgca catcgatcat tggctgagca agttcccgcc cgaccgcaag cgttcggccg 600
tgttgcaggg tctgcatgcc gcgcaggaac agaaccaggg ttggttgacc gacgagctga 660
tcgtgggcgt ggccaagtat ctggagctgc cgccggtgtg ggcctacgaa gtggggct 718
<210> 29
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向黄单孢菌属的NadHb、NadHd和NadHe基因的NadHb/NadHd/NadHedsRNA的第二臂的序列
<400> 29
tcagccactt cgtaggccca caccggcggc agctccagat acttggccac gcccacgatc 60
agctcgtcgg tcaaccaacc ctggttctgt tcctgcgcgg catgcagacc ctgcaacacg 120
gccgaacgct tgcggtcggg cgggaacttg ctcagccaat gatcgatgtg cgcgcgcgtc 180
ttgtcgctca gcactacctg cggatcgacg tcgcgcgccg cttcgaaatt acccgtcgat 240
gctgtacgga accgactggt tgaacggctt ggactcggcc agcttctcgg tgccacggtg 300
cagcaggccg atatgcgggt cggcacgcac cacggtttcg ccgtccattt ccaggatcag 360
gcgcaatacg ccgtgcgccg caggatgctg cgggccgaag ttcatcgtgt aattgcggat 420
ttcctgcttg ctttccacag gattgctcgc gaaggcatcg gttgcctggc ggtactcact 480
cacgatctgc atcatctcga ctgcacagca ggccagacca aaggtcatcg gccacatcga 540
acctgtacgc gcccagttca acagcgcatc gacgctggtg gtcacgtagc ccttttcgag 600
caacgggttt tcgccttccg ggcgcaggat gtcttcgacc cggccttccg gcatcgggtt 660
ggtcatcaga cgatccaggg tctgaatcac tcccattcca gcgctccctt cttcctgc 718
<210> 30
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向黄单孢菌属的DnaA、DnaE1和DnaE2基因的DnaA/DnaE1/DnaE2dsRNA的第一臂的序列
<400> 30
aacaatgctt ggccccgctg tctggaacgt ctcgaagctg aattcccgcc cgaggatgtc 60
cacacctggt tgaaacccct gcaggccgaa gatcgcggcg acagcatcgt gctgtacgcg 120
ccgaacgcct tcattgttga gcaggtccgc gagcgatacc tgccgcgcat ccgcgagttg 180
ctggcatatt tcgccggcaa tggcgaggtg gcgctggcgg tcggctcccg tcgatcgcgc 240
gaagccttcc tcaagccgtt ggcccaggtg gtcaatgtcg tcgaacggcg tcagacattg 300
ccggtactgg cgaacttgct ggtgcaggtg aacaacggcc agctgtcgct gacggggacc 360
gacctggaag tcgaaatgat ctcgcgcacc atggtcgagg acgcccagga cggcgaaacc 420
acgatcccgg cgcgcaagct gttcgacatc ctggcatatg tccacttccc gcttcgtcca 480
tctgcacgtc cacaccgagt tctcgttggc ggattccacc atccgcgtgc ccgagaaacc 540
ggatcaggct gacccgaaaa aagccaagca ggccaacctg ctgagccgcg cggtcgaact 600
cgacttgccc gcgctggcgg tcaccgacct gaacaacctg ttcgccctgg tcaagttcta 660
caaggccgcc gaaggct 677
<210> 31
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向黄单孢菌属的DnaA、DnaE1和DnaE2基因的DnaA/DnaE1/DnaE2dsRNA的第二臂的序列
<400> 31
tcagttcggc ggccttgtag aacttgacca gggcgaacag gttgttcagg tcggtgaccg 60
ccagcgcggg caagtcgagt tcgaccgcgc ggctcagcag gttggcctgc ttggcttttt 120
tcgggtcagc ctgatccggt ttctcgggca cgcggatggt ggaatccgcc aacgagaact 180
cggtgtggac gtgcagatgg acgaagcggg aagtggacat atgccaggat gtcgaacagc 240
ttgcgcgccg ggatcgtggt ttcgccgtcc tgggcgtcct cgaccatggt gcgcgagatc 300
atttcgactt ccaggtcggt ccccgtcagc gacagctggc cgttgttcac ctgcaccagc 360
aagttcgcca gtaccggcaa tgtctgacgc cgttcgacga cattgaccac ctgggccaac 420
ggcttgagga aggcttcgcg cgatcgacgg gagccgaccg ccagcgccac ctcgccattg 480
ccggcgaaat atgccagcaa ctcgcggatg cgcggcaggt atcgctcgcg gacctgctca 540
acaatgaagg cgttcggcgc gtacagcacg atgctgtcgc cgcgatcttc ggcctgcagg 600
ggtttcaacc aggtgtggac atcctcgggc gggaattcag cttcgagacg ttccagacag 660
cggggccaag catctgc 677
<210> 32
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>GFPpPNpt 质粒中包含的GFP报告子序列
<400> 32
atgagtaagg gggaggagct ctttacaggg gtggtaccca tactcgtcga gctcgacggg 60
gacgtgaacg gtcagaagtt ttcggtaagc ggggaagggg agggggacgc gacgtatggg 120
aagctgacac tcaagttcat atgtacaaca ggaaaactgc cggtcccttg gcccacgctc 180
gttacaacat taacatacgg ggtgcagtgt ttctcgaggt atccggacca catgaagcaa 240
cacgatttct ttaaaagcgc aatgccagag gggtacgttc aagagaggac gattttctat 300
aaggacgatg gtaattataa aacccgggcg gaggttaaat tcgaggggga cacactggtg 360
aacaggatag aattgaaggg gatagacttc aaggaggacg gcaacattct tggacacaaa 420
atggaataca actataactc acataatgta tacatcatgg cagacaaacc aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attaaagatg gaagcgttca attagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttccaaagat cccaacgaaa agagagatca catgatcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于LMW Northern印迹的Cfa6-正向的引物序列
<400> 33
caacaacttg ccgggatcct g 21
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于LMW Northern印迹的 Cfa6-反向引物序列
<400> 34
ggcttgcatc cgacagaatc ag 22
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于LMW Northern印迹的HrpL-正向的引物序列
<400> 35
cacttcgtct tcccagcttt c 21
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于LMW Northern印迹的HrpL-正向的引物序列
<400> 36
tttatccaaa agcgggtgat gaac 24
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于LMW Northern印迹的 miR159探针的引物序列
<400> 37
aaacctaact tccctcgaga t 21
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的GyrA-Fwd的引物序列
<400> 38
aactgctggg tgagtacca 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的GyrA-Rev的引物序列
<400> 39
gagctcttcg cggatcact 19
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的CFA6-Fwd的引物序列
<400> 40
gtcttcatct ttcccggtca 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的CFA6-Rev的引物序列
<400> 41
gtctcgatct ggtcgatggt 20
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的HrpL-Fwd的引物序列
<400> 42
cgagtcattc aggccattga tt 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的HrpL-Rev的引物序列
<400> 43
gtttcctgat aattgccgtc ca 22
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的ProC-Fwd的引物序列
<400> 44
cgcagatgat gaaaagcgtc 20
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的ProC-Rev的引物序列
<400> 45
agtcaggctg gcacaggtg 19
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于细菌转录本RpoB的qPCR引物RpoB-Fwd
<400> 46
gtaggtctgg tccgtgttga 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的RpoB-Rev的引物序列
<400> 47
gcaagtaatc tcggacagcg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于LMW Northern印迹的Cyp3-正向的引物序列
<400> 48
atccgagcat gacatgatga 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于LMW Northern印迹的Cyp3-反向的引物序列
<400> 49
gtacgggtcg atgccatatt 20
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于Northern印迹分析的探针制备：U6
<400> 50
aggggccatg ctaatcttct c 21
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的番茄Ubi-Fwd的引物序列
<400> 51
ggacggacgt actctagctg at 22
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的番茄Ubi-Rev的引物序列
<400> 52
agctttcgac ctcaagggta 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的Pto GFP-Fwd的引物序列
<400> 53
tggaagcgtt caactagcag 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的Pto GFP-Rev的引物序列
<400> 54
aaagggcaga ttgtgtggac 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的IR-CFA6/HRPL-Fwd的引物序列
<400> 55
gttcatcacc cgcttttgga 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的IR-CFA6/HRPL-Rev的引物序列
<400> 56
cccctctttc taccttccca 20
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的Ath-Ubi-Fwd的引物序列
<400> 57
tgaagtcgtg agacagcgtt g 21
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的Ath-Ubi -Rev的引物序列
<400> 58
gggctttctc attgttggtc 20
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于克隆pDON207-attB1/B2中的WT HRPL和mut HRPL的HRPL-pDON207- F
<400> 59
aaaaagcagg cttcatgttt cagaagattg tgatc 35
<210> 60
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于克隆pDON207-attB1/B2中的WT HRPL和mut HRPL的HRPL-pDON207- Rev
<400> 60
agaaagctgg gtcggcgaac gggtcgattt gctg 34
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl2-1等位基因进行基因型分型的引物dcl2-1-WT-fwd
<400> 61
tgaatcatct ggaagaggtg g 21
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl2-1等位基因进行基因型分型的引物dcl2-1-mut-fwd
<400> 62
attttgccga tttcggaac 19
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl2-1等位基因进行基因型分型的引物dcl2-1-WT-Rev
<400> 63
tgaatcatct ggaagaggtg g 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl3-1等位基因进行基因型分型的引物dcl3-1-fwd
<400> 64
acaggtaacc ttgccatgtt g 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl3-1等位基因进行基因型分型的引物dcl3-1-Rev
<400> 65
tggaaaagtt tgctacaacg g 21
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物LBa1
<400> 66
tggttcacgt agtgggccat cg 22
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl4-2等位基因进行基因型分型的引物dcl4-2-G8605 Fwd
<400> 67
ggctgcacag ctgatgatta caa 23
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl4-2等位基因进行基因型分型的引物dcl4-2-G8605 Rev
<400> 68
gccgctcgag atcatcagca aaggaat 27
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物GABI-8474-LP
<400> 69
ataataacgc tgcggacatc tacatttt 28
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Northern印迹分析IR-HHR Fwd引物
<400> 70
ggcatcacag atcaacgcc 19
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Northern印迹分析IR-HHR Rev引物
<400> 71
actgtcgtcc gatgccac 18
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> RT-qPCR LuxA Fwd
<400> 72
cggagtttgg tttgcttggt 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> RT-qPCR LuxA Rev
<400> 73
caagttggcg tactggatgg 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> RT-qPCR LuxB Fwd
<400> 74
gcggaggaag cttgcttatt 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> RT-qPCR LuxB Rev
<400> 75
tgatattcaa ccgggcgatt 20
<210> 76
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> HRPL-pDON207-Fwd
<400> 76
aaaaagcagg cttcatgttt cagaagattg tgatc 35
<210> 77
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> HRPL-pDON207-Rev
<400> 77
agaaagctgg gtcggcgaac gggtcgattt gctg 34
<210> 78
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd CFA6/HRPL
<400> 78
taatacgact cactataggg agatgaacaa gcgctac 37
<210> 79
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev CFA6/HRPL
<400> 79
taatacgact cactataggg agcagggcgt ttatcca 37
<210> 80
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd CYP51
<400> 80
taatacgact cactataggg agcagcaagt ttgacga 37
<210> 81
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev CYP51
<400> 81
taatacgact cactataggg aggcagcaaa ctcggca 37
<210> 82
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd Dc3000_FusA
<400> 82
taatacgact cactataggg agatggctcg tactactccg att 43
<210> 83
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev Dc3000_FusA
<400> 83
taatacgact cactataggg aggccaaaag gcagtgatag cag 43
<210> 84
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd Dc3000_SecE
<400> 84
taatacgact cactataggg agtgaatccc aaggctgaag ca 42
<210> 85
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev Dc3000_SecE
<400> 85
taatacgact cactataggg agatctctgc acgcgcttct tt 42
<210> 86
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd Dc3000_GyrB
<400> 86
taatacgact cactataggg agatgagcga gaacaacacg tac 43
<210> 87
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev Dc3000_GyrB
<400> 87
taatacgact cactataggg agccgtatgg atggtgatgc tga 43
<210> 88
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS06155 : XC_1225
<400> 88
atgcatcgac atgttcatga gcccgaaatc ctagcagacc cggcagcctt cgaagctgcc 60
gaacattggc ggcaacgcga tcttgcggtg gtgtggcacc cctgcaccca gatgcgcgag 120
cacccgcaca cactacccct ggtgccgatc gcacgtggcg acggcgcctg gctgatcggc 180
cacgatggcc gccactatct ggatgcggtc agc 213
<210> 89
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 XC_RS06155 : XC_1225
<400> 89
gctgaccgca tccagatagt ggcggccatc gtggccgatc agccaggcgc cgtcgccacg 60
tgcgatcggc accaggggta gtgtgtgcgg gtgctcgcgc atctgggtgc aggggtgcca 120
caccaccgca agatcgcgtt gccgccaatg ttcggcagct tcgaaggctg ccgggtctgc 180
taggatttcg ggctcatgaa catgtcgatg cat 213
<210> 90
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS02265 = XC_0447
<400> 90
atgagcgttg acgctgccgc gccgacttcc gcctccactc cgccgcaacc gcctgcgcct 60
ccccagttcc ccaccttgct cggccacccc cggccgctgt ggatgctgtt catgaccgaa 120
ttctgggaac gctttgcgtt ctacggcatt cgttgggcgc tggtgctgta catcgtggcg 180
cagttcttc 189
<210> 91
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 XC_RS02265 = XC_0447
<400> 91
gaagaactgc gccacgatgt acagcaccag cgcccaacga atgccgtaga acgcaaagcg 60
ttcccagaat tcggtcatga acagcatcca cagcggccgg gggtggccga gcaaggtggg 120
gaactgggga ggcgcaggcg gttgcggcgg agtggaggcg gaagtcggcg cggcagcgtc 180
aacgctcat 189
<210> 92
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS18260 = XC_3609
<400> 92
atgagcgatg tccttccgat cattctttcc ggcggctccg gcacgcgcct gtggccgttg 60
tcgcgcgaat cgtacccgaa gcagttcctg ccgctggtcg gcgagcacag catgctgcag 120
gccacctggc tgcgctccgc tccggtggcg gcgcacgcac ccatcgtggt ggccaacgaa 180
gagcaccgct tcatgg 196
<210> 93
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 XC_RS18260 = XC_3609
<400> 93
ccatgaagcg gtgctcttcg ttggccacca cgatgggtgc gtgcgccgcc accggagcgg 60
agcgcagcca ggtggcctgc agcatgctgt gctcgccgac cagcggcagg aactgcttcg 120
ggtacgattc gcgcgacaac ggccacaggc gcgtgccgga gccgccggaa agaatgatcg 180
gaaggacatc gctcat 196
<210> 94
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS11930 = XC_2375
<400> 94
gagccgtcgc atcattccct gcctggacgt gcgcgatggc cgcgtggtca agggcgtcaa 60
gttccgcgac cacatcgaca tgggcgacat cgtcgagttg gcgatgcgct accgcgacca 120
gggcgcggac gagttggtgt tctacgacat tggcgccagc ccggaagggc gttcggtgga 180
ctatgcgtg 189
<210> 95
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 XC_RS11930 = XC_2375
<400> 95
cacgcatagt ccaccgaacg cccttccggg ctggcgccaa tgtcgtagaa caccaactcg 60
tccgcgccct ggtcgcggta gcgcatcgcc aactcgacga tgtcgcccat gtcgatgtgg 120
tcgcggaact tgacgccctt gaccacgcgg ccatcgcgca cgtccaggca gggaatgatg 180
cgacggctc 189
<210> 96
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS17005 = XC_3357
<400> 96
atggcaaaga ctcatgaaat caaggtcgag cgccgcgcag acgaggggaa gggtgcgagc 60
cgccgcctgc gtcacgctgg cgtcattccg gccatcgttt acggtggcga actcgagccg 120
gtcagcatcc agctcaacca cgagcagatc tggcttgcgc agcagaacga gtggttctac 180
tcgtcgatcc tcgacc 196
<210> 97
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS17005 = XC_3357
<400> 97
ggtcgaggat cgacgagtag aaccactcgt tctgctgcgc aagccagatc tgctcgtggt 60
tgagctggat gctgaccggc tcgagttcgc caccgtaaac gatggccgga atgacgccag 120
cgtgacgcag gcggcggctc gcacccttcc cctcgtctgc gcggcgctcg accttgattt 180
catgagtctt tgccat 196
<210> 98
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS06155 : XC_1225
<400> 98
taatacgact cactataggg agatgcatcg acatgttcat gagc 44
<210> 99
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS06155 : XC_1225
<400> 99
taatacgact cactataggg aggctgaccg catccagata gt 42
<210> 100
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS02265 = XC_0447
<400> 100
taatacgact cactataggg agatgagcgt tgacgctgcc 40
<210> 101
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS02265 = XC_0447
<400> 101
taatacgact cactataggg aggaagaact gcgccacgat gta 43
<210> 102
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS18260 = XC_3609
<400> 102
taatacgact cactataggg agatgagcga tgtccttccg a 41
<210> 103
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS18260 = XC_3609
<400> 103
taatacgact cactataggg agccatgaag cggtgctctt 40
<210> 104
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS11930 = XC_2375
<400> 104
taatacgact cactataggg aggagccgtc gcatcattcc 40
<210> 105
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS11930 = XC_2375
<400> 105
taatacgact cactataggg agcacgcata gtccaccgaa c 41
<210> 106
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS17005 = XC_3357
<400> 106
taatacgact cactataggg agatggcaaa gactcatgaa atc 43
<210> 107
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS17005 = XC_3357
<400> 107
taatacgact cactataggg agggtcgagg atcgacgagt ag 42
<210> 108
<211> 632
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 IT13 (铜绿假单胞菌)
<400> 108
gtgtccgtgg aactttggca gcagtgcgtg gatcttctcc gcgatgagct gccgtcccaa 60
caattcaaca cctggatccg tcccttgcag gtcgaagccg aaggcgacga attgcgtgtg 120
tatgcaccca accgtttcgt cctcgattgg gtgaacgaga aatacctcgg tcggcttctg 180
gaactgctcg gtgaacgcgg gagggtcagt tgatcatgca tttcaccatt caacgcgaag 240
ccctgttgaa accgctgcaa ctggtcgccg gcgtcgtgga acgccgccag acattgccgg 300
ttctctccaa cgtcctgctg gtggtcgaag gccagcaact gtcgctgacc ggcaccgacc 360
tcgaggtcga gctggttggt cgcgtggtac tggaagatgc cgccgaaccc ggcgagatca 420
ccgcatatga gcgagaacaa cacgtacgac tcttccagca tcaaggtgct gaaggggctg 480
gatgccgtac gcaagcgccc cggcatgtac atcggcgaca ccgacgatgg caccggtctg 540
caccacatgg tgttcgaggt ggtggataac tccatcgacg aagcgctggc cggttactgc 600
agcgaaatca gcatcaccat ccatacgggg ct 632
<210> 109
<211> 632
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 IT13 (铜绿假单胞菌)
<400> 109
tcagccgtat ggatggtgat gctgatttcg ctgcagtaac cggccagcgc ttcgtcgatg 60
gagttatcca ccacctcgaa caccatgtgg tgcagaccgg tgccatcgtc ggtgtcgccg 120
atgtacatgc cggggcgctt gcgtacggca tccagcccct tcagcacctt gatgctggaa 180
gagtcgtacg tgttgttctc gctcatatgc ggtgatctcg ccgggttcgg cggcatcttc 240
cagtaccacg cgaccaacca gctcgacctc gaggtcggtg ccggtcagcg acagttgctg 300
gccttcgacc accagcagga cgttggagag aaccggcaat gtctggcggc gttccacgac 360
gccggcgacc agttgcagcg gtttcaacag ggcttcgcgt tgaatggtga aatgcatgat 420
caactgaccc tcccgcgttc accgagcagt tccagaagcc gaccgaggta tttctcgttc 480
acccaatcga ggacgaaacg gttgggtgca tacacacgca attcgtcgcc ttcggcttcg 540
acctgcaagg gacggatcca ggtgttgaat tgttgggacg gcagctcatc gcggagaaga 600
tccacgcact gctgccaaag ttccacggac ac 632
<210> 110
<211> 803
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 IT14 (铜绿假单胞菌)
<400> 110
tgaaagactt gcttaatctg ttgaaaaacc agggtcaaat cgaagagttc gatgccatcc 60
gtattggcct ggcttcgccc gagatgattc gttcctggtc tttcggcgaa gttaaaaagc 120
cggaaaccat caactaccgt accttcaagc cggagcgcga cggcctgttc tgcgccaaga 180
tcttcggccc ggtgaaggac tacgagtgcc tgtgcggcaa gtacaagcgc ctcaagcacc 240
gcggtgtgat ctgcgagaag tgatcatgaa tgccaaggca gaagccaaag aatcacgttt 300
tgatctcttg aaatggctct tggttgccgt tctggttgtg gttgccgttg tgggcaatca 360
gtacttttcg gctcaaccaa tcctgtatcg cgttctcggt attctcgttc tggcggtgat 420
cgctgccttc ctggctctgc aaacggccaa ggggcaggcc ttctttagtc ttgctaagga 480
agcgcgcgtc gagattcgca aggtcgtatg gccgagtcgt caagaaacaa ctcagaccac 540
gctgatcggc atatggcttt cgaattgccg ccgctgcctt acgaaaagaa cgcccttgag 600
ccgcacattt ccgcagaaac cctggaatac caccacgaca agcaccacaa cacctacgtg 660
gtgaacctga acaacctgat cccgggtacc gagttcgaag gcaagagcct cgaagagatc 720
gtcaagagct cctccggcgg catcttcaac aacgccgccc aggtgtggaa ccacaccttc 780
tactggaact gcctgagccg gct 803
<210> 111
<211> 803
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 IT14 (铜绿假单胞菌)
<400> 111
tcagggctca ggcagttcca gtagaaggtg tggttccaca cctgggcggc gttgttgaag 60
atgccgccgg aggagctctt gacgatctct tcgaggctct tgccttcgaa ctcggtaccc 120
gggatcaggt tgttcaggtt caccacgtag gtgttgtggt gcttgtcgtg gtggtattcc 180
agggtttctg cggaaatgtg cggctcaagg gcgttctttt cgtaaggcag cggcggcaat 240
tcgaaagcca tatgccgatc agcgtggtct gagttgtttc ttgacgactc ggccatacga 300
ccttgcgaat ctcgacgcgc gcttccttag caagactaaa gaaggcctgc cccttggccg 360
tttgcagagc caggaaggca gcgatcaccg ccagaacgag aataccgaga acgcgataca 420
ggattggttg agccgaaaag tactgattgc ccacaacggc aaccacaacc agaacggcaa 480
ccaagagcca tttcaagaga tcaaaacgtg attctttggc ttctgccttg gcattcatga 540
tcacttctcg cagatcacac cgcggtgctt gaggcgcttg tacttgccgc acaggcactc 600
gtagtccttc accgggccga agatcttggc gcagaacagg ccgtcgcgct ccggcttgaa 660
ggtacggtag ttgatggttt ccggcttttt aacttcgccg aaagaccagg aacgaatcat 720
ctcgggcgaa gccaggccaa tacggatggc atcgaactct tcgatttgac cctggttttt 780
caacagatta agcaagtctt tca 803
<210> 112
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 IT16 (铜绿假单胞菌)
<400> 112
atgtcccagc ctttgctccg cgccctgttt gccccttcca gtcgttcgta cgttcccgcc 60
gtccttctca gcctggccct cggcatccag gcggcgcacg ccgaaaacag cggcgggaac 120
gccttcgtcc cggccggcaa ccagcaggag gcgcactgga cgatcaacct caaggatgcc 180
gacatccgcg aattcatcga ccagatttcc gaaatcaccg gcgagacctt gatcatggcg 240
cagatattca accccaaccc ggggaatacc ctcgataccg tggccaatgc cctgaaggag 300
caggccaacg cagcgaacaa ggacgtcaac gacgcgatca aggccttgca ggggaccgac 360
aatgccgaca acccggcgct gctggccgag ctgcaacaca agatcaacaa gtggtcggtc 420
atctacaaca tcaactcgac ggtgacccgt gcgcgcatat gcgccgcctg ctgatcggcg 480
gactgctggc gctgctgcct ggcgcggtct tgcgcgcgca gccgctggac tggcccagcc 540
tgccttacga ctatgtggcg cagggcgaaa gcctgcgcga cgtgctggcc aacttcggcg 600
ccaactacga tgcctcggtg atcgtcagtg acaaggtcaa cgaccaggtc agcggtcgct 660
tcgacctgga aagcccgcag ggct 684
<210> 113
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 IT16 (铜绿假单胞菌)
<400> 113
tcagctgcgg gctttccagg tcgaagcgac cgctgacctg gtcgttgacc ttgtcactga 60
cgatcaccga ggcatcgtag ttggcgccga agttggccag cacgtcgcgc aggctttcgc 120
cctgcgccac atagtcgtaa ggcaggctgg gccagtccag cggctgcgcg cgcaagaccg 180
cgccaggcag cagcgccagc agtccgccga tcagcaggcg gcgcatatgc gcgcacgggt 240
caccgtcgag ttgatgttgt agatgaccga ccacttgttg atcttgtgtt gcagctcggc 300
cagcagcgcc gggttgtcgg cattgtcggt cccctgcaag gccttgatcg cgtcgttgac 360
gtccttgttc gctgcgttgg cctgctcctt cagggcattg gccacggtat cgagggtatt 420
ccccgggttg gggttgaata tctgcgccat gatcaaggtc tcgccggtga tttcggaaat 480
ctggtcgatg aattcgcgga tgtcggcatc cttgaggttg atcgtccagt gcgcctcctg 540
ctggttgccg gccgggacga aggcgttccc gccgctgttt tcggcgtgcg ccgcctggat 600
gccgagggcc aggctgagaa ggacggcggg aacgtacgaa cgactggaag gggcaaacag 660
ggcgcggagc aaaggctggg acat 684
<210> 114
<211> 643
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 IT18 (铜绿假单胞菌)
<400> 114
atgtcccagc ctttgctccg cgccctgttt gccccttcca gtcgttcgta cgttcccgcc 60
gtccttctca gcctggccct cggcatccag gcggcgcacg ccgaaaacag cggcgggaac 120
gccttcgtcc cggccggcaa ccagcaggag gcgcactgga cgatcaacct caaggatgcc 180
gacatccgcg aattcatcga ccagattgat catgcaagga gccaaatctc ttggccgaaa 240
gcagataacg tcttgtcatt ggaacattcc aactttcgaa tacagggtaa acaaggaaga 300
gggcgtatat gttctgctcg agggcgaact gaccgtccag gacatcgatt ccactttttg 360
cctggcgcct ggcgagttgc ttttcgtccg ccgcggaagc tatgtcgtaa gtaccaaggg 420
aaaggacagc cgaatacgca tatgccacgt tgtagtaccc gttccgccca gcgcctgtct 480
ccgctgttcc tggtcctgtc gctggccgtc ctcggcctgg cgccgccggt ccatccggca 540
cctgccgaga ctgccgccgc gcaagaggaa gagcagtgga cgatcaacat gaaggatgcc 600
gagatcggcg acttcatcga gcaggtatcg agcatcagcg gct 643
<210> 115
<211> 643
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 IT18 (铜绿假单胞菌)
<400> 115
tcaggctgat gctcgatacc tgctcgatga agtcgccgat ctcggcatcc ttcatgttga 60
tcgtccactg ctcttcctct tgcgcggcgg cagtctcggc aggtgccgga tggaccggcg 120
gcgccaggcc gaggacggcc agcgacagga ccaggaacag cggagacagg cgctgggcgg 180
aacgggtact acaacgtggc atatgcgtat tcggctgtcc tttcccttgg tacttacgac 240
atagcttccg cggcggacga aaagcaactc gccaggcgcc aggcaaaaag tggaatcgat 300
gtcctggacg gtcagttcgc cctcgagcag aacatatacg ccctcttcct tgtttaccct 360
gtattcgaaa gttggaatgt tccaatgaca agacgttatc tgctttcggc caagagattt 420
ggctccttgc atgatcaatc tggtcgatga attcgcggat gtcggcatcc ttgaggttga 480
tcgtccagtg cgcctcctgc tggttgccgg ccgggacgaa ggcgttcccg ccgctgtttt 540
cggcgtgcgc cgcctggatg ccgagggcca ggctgagaag gacggcggga acgtacgaac 600
gactggaagg ggcaaacagg gcgcggagca aaggctggga cat 643
<210> 116
<211> 637
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 IT21 (福氏志贺氏菌)
<400> 116
aatgatcaag gcgacggaca gaaaactggt agtaggactg gaaattggta ccgcgaaggt 60
tgccgcttta gtaggggaag ttctgcccga cggtatggtc aatatcattg gcgtgggcag 120
ctgcccgtca cgtggtatgg ataaaggtgg ggtgaacgac ctcgaatccg tggtcaagtg 180
cgtacaacgc gccattgacc aggcagaatt gatggcagga tctttgtggt tggcgtgttt 240
cagcttgagg ttggaaatcc cgtgacggta acgttgctca agggtttcgc ggttggtggc 300
ggtaacatcc agatcacgca gcaagccgtc gtgaatgccg taggcccagc cgtgaatggt 360
aactttctgc ccgcgtttcc acgctgattg cataatggtg gagtggccca ggttatacac 420
ctgcattggc tgaaattacc gcatccctgg taaaagagct gcgtgagcgt actggcgcag 480
gcatgatgga ttgcaaaaaa gcactgactg aagctaacgg cgacatcgag ctggcaatcg 540
aaaacatgcg taagtccggt gctattaaag cagcgaaaaa agcaggcaac gttgctgctg 600
acggcgtgat caaaaccaaa atcgacggca actggct 637
<210> 117
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 IT21 (福氏志贺氏菌)
<400> 117
tcagagttgc cgtcgatttt ggttttgatc acgccgtcag cagcaacgtt gcctgctttt 60
ttcgctgctt taatagcacc ggacttacgc atgttttcga ttgccagctc gatgtcgccg 120
ttagcttcag tcagtgcttt tttgcaatcc atcatgcctg cgccagtacg ctcacgcagc 180
tcttttacca gggatgcggt aatttcagcc aatgcaggtg tataacctgg gccactccac 240
cattatgcaa tcagcgtgga aacgcgggca gaaagttacc attcacggct gggcctacgg 300
cattcacgac ggcttgctgc gtgatctgga tgttaccgcc accaaccgcg aaacccttga 360
gcaacgttac cgtcacggga tttccaacct caagctgaaa cacgccaacc acaaagatcc 420
tgccatcaat tctgcctggt caatggcgcg ttgtacgcac ttgaccacgg attcgaggtc 480
gttcacccca cctttatcca taccacgtga cgggcagctg cccacgccaa tgatattgac 540
cataccgtcg ggcagaactt cccctactaa agcggcaacc ttcgcggtac caatttccag 600
tcctactacc agttttctgt ccgtcgcctt gatcat 636
<210> 118
<211> 686
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 IT26 (福氏志贺氏菌)
<400> 118
taccgggggt accactacgc cttcacgcgg cgcttcagga ttcggcgctg gcagattcat 60
caacttcgcc agaatgctcg ccagtttcag gcgcatttcc ggacgacgga cgatcatgtc 120
gatcgcgcct ttctcgatca ggaattcact gcgctggaat ctaggcggca gtttttcgcg 180
aacggtctgt tcgataacac gcggaccggc aaagccgatt aacgcttgat ctttcttgat 240
gtgcttcatc agacgcttac gtttacgcat ctgggttggc gtcagggtgt tacgcttgtt 300
cgcatacggg ttttcccctt ctttgaactg aatacgaatc ggcgatccca ttacgtccag 360
cgatttgcgg aagtagttca tcaagtagcg cttgtaggaa tcaggcaggt ctttcacctg 420
attaccgtga atcaccacaa tcggcggggc attttttatc gtcaaccaat gggctggcgt 480
cgtgttctgc ttcgatctct tcagcaggaa gtggggcggg ttcagcgtct ggcgtaacaa 540
aggtttcggt agatactgcc agcggctggc caattttcgt gacagacagg ctttccagtt 600
gctcaaccag attcacttta cccggtgcaa acaggttgat aacggtggaa ccgagtttaa 660
agcgacccat ttcctggcct ttggct 686
<210> 119
<211> 686
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 IT26 (福氏志贺氏菌)
<400> 119
tcagaaaggc caggaaatgg gtcgctttaa actcggttcc accgttatca acctgtttgc 60
accgggtaaa gtgaatctgg ttgagcaact ggaaagcctg tctgtcacga aaattggcca 120
gccgctggca gtatctaccg aaacctttgt tacgccagac gctgaacccg ccccacttcc 180
tgctgaagag atcgaagcag aacacgacgc cagcccattg gttgacgata aaaaatgccc 240
cgccgattgt ggtgattcac ggtaatcagg tgaaagacct gcctgattcc tacaagcgct 300
acttgatgaa ctacttccgc aaatcgctgg acgtaatggg atcgccgatt cgtattcagt 360
tcaaagaagg ggaaaacccg tatgcgaaca agcgtaacac cctgacgcca acccagatgc 420
gtaaacgtaa gcgtctgatg aagcacatca agaaagatca agcgttaatc ggctttgccg 480
gtccgcgtgt tatcgaacag accgttcgcg aaaaactgcc gcctagattc cagcgcagtg 540
aattcctgat cgagaaaggc gcgatcgaca tgatcgtccg tcgtccggaa atgcgcctga 600
aactggcgag cattctggcg aagttgatga atctgccagc gccgaatcct gaagcgccgc 660
gtgaaggcgt agtggtaccc ccggta 686
<210> 120
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 IT27 (福氏志贺氏菌)
<400> 120
aatgacggtt agctcaggca atgaaacttt gactatcgat gaagggcaaa ttgcttttat 60
agagcgaaat atacaaataa acgtctccat aaaaaaatct gatagcatta atccatttga 120
gattataagc cttgacagaa atttattatt aagcattatt agaataatgg aaccaattta 180
ttcatttcaa cactcctatt ctgaggagaa aagggggtta gatcatggtg gatttgtgca 240
acgacttgtt aagtataaag gaaggccaaa agaaagagtt tacactccat tctggtaata 300
aagtttcctt tatcaaagcc aagattcctc ataaaaggat ccaagattta accttcgtca 360
accaaaaaac gaatgtacgc gatcaagaat ccctaacaga agaatcacta gccgatatca 420
taaaaactat aaagctacaa caattcttcc ctggcatggt agcggtgctg accataacgg 480
tgatggtggt gaggctgtta caggagacaa tctgtttata ataaatggag aaattatttc 540
aggtggacat ggtggcgata gttatagtga tagtgatggg gggaatggag gtgatgccgt 600
cacaggagtc aatctaccca taatcaacaa agggactatt tccggtggta atggaggtaa 660
caattatggt gagggtgatg gcgggct 687
<210> 121
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 IT27 (福氏志贺氏菌)
<400> 121
tcagcgccat caccctcacc ataattgtta cctccattac caccggaaat agtccctttg 60
ttgattatgg gtagattgac tcctgtgacg gcatcacctc cattcccccc atcactatca 120
ctataactat cgccaccatg tccacctgaa ataatttctc catttattat aaacagattg 180
tctcctgtaa cagcctcacc accatcaccg ttatggtcag caccgctacc atgccaggga 240
agaattgttg tagctttata gtttttatga tatcggctag tgattcttct gttagggatt 300
cttgatcgcg tacattcgtt ttttggttga cgaaggttaa atcttggatc cttttatgag 360
gaatcttggc tttgataaag gaaactttat taccagaatg gagtgtaaac tctttctttt 420
ggccttcctt tatacttaac aagtcgttgc acaaatccac catgatctaa cccccttttc 480
tcctcagaat aggagtgttg aaatgaataa attggttcca ttattctaat aatgcttaat 540
aataaatttc tgtcaaggct tataatctca aatggattaa tgctatcaga tttttttatg 600
gagacgttta tttgtatatt tcgctctata aaagcaattt gcccttcatc gatagtcaaa 660
gtttcattgc ctgagctaac cgtcatt 687
<210> 122
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链FusA(福氏志贺氏菌)
<400> 122
atgatcaagg cgacggacag aaaactggta gtaggactgg aaattggtac cgcgaaggtt 60
gccgctttag taggggaagt tctgcccgac ggtatggtca atatcattgg cgtgggcagc 120
tgcccgtcac gtggtatgga taaaggtggg gtgaacgacc tcgaatccgt ggtcaagtgc 180
gtacaacgcg ccattgacca ggcagaattg atggcag 217
<210> 123
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链FusA(福氏志贺氏菌)
<400> 123
ctgccatcaa ttctgcctgg tcaatggcgc gttgtacgca cttgaccacg gattcgaggt 60
cgttcacccc acctttatcc ataccacgtg acgggcagct gcccacgcca atgatattga 120
ccataccgtc gggcagaact tcccctacta aagcggcaac cttcgcggta ccaatttcca 180
gtcctactac cagttttctg tccgtcgcct tgatcat 217
<210> 124
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链Can(福氏志贺氏菌)
<400> 124
tttgtggttg gcgtgtttca gcttgaggtt ggaaatcccg tgacggtaac gttgctcaag 60
ggtttcgcgg ttggtggcgg taacatccag atcacgcagc aagccgtcgt gaatgccgta 120
ggcccagccg tgaatggtaa ctttctgccc gcgtttccac gctgattgca taatggtgga 180
gtggcccagg ttatacacct 200
<210> 125
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链Can(福氏志贺氏菌)
<400> 125
aggtgtataa cctgggccac tccaccatta tgcaatcagc gtggaaacgc gggcagaaag 60
ttaccattca cggctgggcc tacggcattc acgacggctt gctgcgtgat ctggatgtta 120
ccgccaccaa ccgcgaaacc cttgagcaac gttaccgtca cgggatttcc aacctcaagc 180
tgaaacacgc caaccacaaa 200
<210> 126
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链tsf(福氏志贺氏菌)
<400> 126
tggctgaaat taccgcatcc ctggtaaaag agctgcgtga gcgtactggc gcaggcatga 60
tggattgcaa aaaagcactg actgaagcta acggcgacat cgagctggca atcgaaaaca 120
tgcgtaagtc cggtgctatt aaagcagcga aaaaagcagg caacgttgct gctgacggcg 180
tgatcaaaac caaaatcgac ggcaact 207
<210> 127
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链tsf(福氏志贺氏菌)
<400> 127
agttgccgtc gattttggtt ttgatcacgc cgtcagcagc aacgttgcct gcttttttcg 60
ctgctttaat agcaccggac ttacgcatgt tttcgattgc cagctcgatg tcgccgttag 120
cttcagtcag tgcttttttg caatccatca tgcctgcgcc agtacgctca cgcagctctt 180
ttaccaggga tgcggtaatt tcagcca 207
<210> 128
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链accD(福氏志贺氏菌)
<400> 128
taccgggggt accactacgc cttcacgcgg cgcttcagga ttcggcgctg gcagattcat 60
caacttcgcc agaatgctcg ccagtttcag gcgcatttcc ggacgacgga cgatcatgtc 120
gatcgcgcct ttctcgatca ggaattcact gcgctggaat ctaggcggca gtttttcgcg 180
aacggtctgt tcgataacac gcggaccggc aaagccgatt aacgctt 227
<210> 129
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链accD(福氏志贺氏菌)
<400> 129
aagcgttaat cggctttgcc ggtccgcgtg ttatcgaaca gaccgttcgc gaaaaactgc 60
cgcctagatt ccagcgcagt gaattcctga tcgagaaagg cgcgatcgac atgatcgtcc 120
gtcgtccgga aatgcgcctg aaactggcga gcattctggc gaagttgatg aatctgccag 180
cgccgaatcc tgaagcgccg cgtgaaggcg tagtggtacc cccggta 227
<210> 130
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链der(福氏志贺氏菌)
<400> 130
tttcttgatg tgcttcatca gacgcttacg tttacgcatc tgggttggcg tcagggtgtt 60
acgcttgttc gcatacgggt tttccccttc tttgaactga atacgaatcg gcgatcccat 120
tacgtccagc gatttgcgga agtagttcat caagtagcgc ttgtaggaat caggcaggtc 180
tttcacctga ttaccgtgaa tcaccacaat cggcggg 217
<210> 131
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链der(福氏志贺氏菌)
<400> 131
cccgccgatt gtggtgattc acggtaatca ggtgaaagac ctgcctgatt cctacaagcg 60
ctacttgatg aactacttcc gcaaatcgct ggacgtaatg ggatcgccga ttcgtattca 120
gttcaaagaa ggggaaaacc cgtatgcgaa caagcgtaac accctgacgc caacccagat 180
gcgtaaacgt aagcgtctga tgaagcacat caagaaa 217
<210> 132
<211> 230
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链psd(福氏志贺氏菌)
<400> 132
tttttatcgt caaccaatgg gctggcgtcg tgttctgctt cgatctcttc agcaggaagt 60
ggggcgggtt cagcgtctgg cgtaacaaag gtttcggtag atactgccag cggctggcca 120
attttcgtga cagacaggct ttccagttgc tcaaccagat tcactttacc cggtgcaaac 180
aggttgataa cggtggaacc gagtttaaag cgacccattt cctggccttt 230
<210> 133
<211> 230
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链psd(福氏志贺氏菌)
<400> 133
aaaggccagg aaatgggtcg ctttaaactc ggttccaccg ttatcaacct gtttgcaccg 60
ggtaaagtga atctggttga gcaactggaa agcctgtctg tcacgaaaat tggccagccg 120
ctggcagtat ctaccgaaac ctttgttacg ccagacgctg aacccgcccc acttcctgct 180
gaagagatcg aagcagaaca cgacgccagc ccattggttg acgataaaaa 230
<210> 134
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链VirB(福氏志贺氏菌)
<400> 134
atggtggatt tgtgcaacga cttgttaagt ataaaggaag gccaaaagaa agagtttaca 60
ctccattctg gtaataaagt ttcctttatc aaagccaaga ttcctcataa aaggatccaa 120
gatttaacct tcgtcaacca aaaaacgaat gtacgcgatc aagaatccct aacagaagaa 180
tcactagccg atatcataaa aactataaag ctacaacaat tcttccctg 229
<210> 135
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链VirB(福氏志贺氏菌)
<400> 135
cagggaagaa ttgttgtagc tttatagttt ttatgatatc ggctagtgat tcttctgtta 60
gggattcttg atcgcgtaca ttcgtttttt ggttgacgaa ggttaaatct tggatccttt 120
tatgaggaat cttggctttg ataaaggaaa ctttattacc agaatggagt gtaaactctt 180
tcttttggcc ttcctttata cttaacaagt cgttgcacaa atccaccat 229
<210> 136
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链VirF(福氏志贺氏菌)
<400> 136
aatgacggtt agctcaggca atgaaacttt gactatcgat gaagggcaaa ttgcttttat 60
agagcgaaat atacaaataa acgtctccat aaaaaaatct gatagcatta atccatttga 120
gattataagc cttgacagaa atttattatt aagcattatt agaataatgg aaccaattta 180
ttcatttcaa cactcctatt ctgaggagaa aagggggtta 220
<210> 137
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链VirF(福氏志贺氏菌)
<400> 137
taaccccctt ttctcctcag aataggagtg ttgaaatgaa taaattggtt ccattattct 60
aataatgctt aataataaat ttctgtcaag gcttataatc tcaaatggat taatgctatc 120
agattttttt atggagacgt ttatttgtat atttcgctct ataaaagcaa tttgcccttc 180
atcgatagtc aaagtttcat tgcctgagct aaccgtcatt 220
<210> 138
<211> 226
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链icsA(福氏志贺氏菌)
<400> 138
ggtagcggtg ctgaccataa cggtgatggt ggtgaggctg ttacaggaga caatctgttt 60
ataataaatg gagaaattat ttcaggtgga catggtggcg atagttatag tgatagtgat 120
ggggggaatg gaggtgatgc cgtcacagga gtcaatctac ccataatcaa caaagggact 180
atttccggtg gtaatggagg taacaattat ggtgagggtg atggcg 226
<210> 139
<211> 226
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链icsA(福氏志贺氏菌)
<400> 139
cgccatcacc ctcaccataa ttgttacctc cattaccacc ggaaatagtc cctttgttga 60
ttatgggtag attgactcct gtgacggcat cacctccatt ccccccatca ctatcactat 120
aactatcgcc accatgtcca cctgaaataa tttctccatt tattataaac agattgtctc 180
ctgtaacagc ctcaccacca tcaccgttat ggtcagcacc gctacc 226
<210> 140
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 spa47 (福氏志贺氏菌)
<400> 140
gagctataca aaattgctca ctcaattatc ttttcctaat agaatctcgg ggccaatctt 60
ggaaacaagt cttagcgatg tttcgattgg tgagatttgt aacattcagg ctggaattga 120
aagtaatgaa attgttgcaa gagctcaggt tgtaggattt catgatgaaa aaacaatatt 180
aagcttgatt ggaaattctc gtg 203
<210> 141
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 spa47 (福氏志贺氏菌)
<400> 141
cacgagaatt tccaatcaag cttaatattg ttttttcatc atgaaatcct acaacctgag 60
ctcttgcaac aatttcatta ctttcaattc cagcctgaat gttacaaatc tcaccaatcg 120
aaacatcgct aagacttgtt tccaagattg gccccgagat tctattagga aaagataatt 180
gagtgagcaa ttttgtatag ctc 203
<210> 142
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链mukB (福氏志贺氏菌)
<400> 142
attgaacgcg gtaaatttcg ctcactgacg ctgattaact ggaacggctt ttttgcccga 60
acttttgacc ttgacgagct ggtcacgacg ctttccggcg gtaacggggc gggtaaatcc 120
accacgatgg cggcgttcgt tacggcgctg atccccgacc tgaccctgct gcatttccgt 180
aacactacgg aagccggggc caccagcggt tcgcgcgata aaggtctgca cggtaagctg 240
<210> 143
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链mukB(福氏志贺氏菌)
<400> 143
cagcttaccg tgcagacctt tatcgcgcga accgctggtg gccccggctt ccgtagtgtt 60
acggaaatgc agcagggtca ggtcggggat cagcgccgta acgaacgccg ccatcgtggt 120
ggatttaccc gccccgttac cgccggaaag cgtcgtgacc agctcgtcaa ggtcaaaagt 180
tcgggcaaaa aagccgttcc agttaatcag cgtcagtgag cgaaatttac cgcgttcaat 240
<210> 144
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链ybiT(福氏志贺氏菌)
<400> 144
gtttccagta acgtcaccat gcagttcggc agtaagccgt tgtttgaaaa catttccgtc 60
aaattcggcg gcggcaaccg ttacggcctg attggcgcga acggtagtgg taaatccacc 120
tttatgaaga ttctcggcgg cgaccttgag ccgacgctgg gtaacgtttc cctcgatccc 180
aacgagcgca ttggtaagct 200
<210> 145
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链ybiT(福氏志贺氏菌)
<400> 145
agcttaccaa tgcgctcgtt gggatcgagg gaaacgttac ccagcgtcgg ctcaaggtcg 60
ccgccgagaa tcttcataaa ggtggattta ccactaccgt tcgcgccaat caggccgtaa 120
cggttgccgc cgccgaattt gacggaaatg ttttcaaaca acggcttact gccgaactgc 180
atggtgacgt tactggaaac 200
<210> 146
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_dnaaC_Fw
<400> 146
aggtctcagg ctgtgtccgt ggaactttgg cag 33
<210> 147
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_dnaaC_Rv
<400> 147
aggtctcaga tcaactgacc ctcccgcgtt 30
<210> 148
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_dnanC_Fw
<400> 148
aggtctcaga tcatgcattt caccattcaa cg 32
<210> 149
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_dnanC_Rv
<400> 149
aggtctcaat gcggtgatct cgccgggt 28
<210> 150
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_gyrbC_Fw
<400> 150
aggtctcagc atatgagcga gaacaacacg tac 33
<210> 151
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_gyrbC_Rv
<400> 151
aggtctcact gaccgtatgg atggtgatgc tga 33
<210> 152
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_dnaaB_Fw
<400> 152
aggtctcaaa cagtgtccgt ggaactttgg cag 33
<210> 153
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_gyrbB_Rv
<400> 153
aggtctcaag ccccgtatgg atggtgatgc tga 33
<210> 154
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_gyrbD_Fw
<400> 154
aggtctcatc agccgtatgg atggtgatgc tga 33
<210> 155
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_dnaaD_Rv
<400> 155
aggtctcagc aggtgtccgt ggaactttgg cag 33
<210> 156
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_rpocC_Fw
<400> 156
aggtctcagg cttgaaagac ttgcttaatc tgttgaa 37
<210> 157
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_rpocC_Rv
<400> 157
aggtctcaga tcacttctcg cagatcacac cg 32
<210> 158
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_seceC_Fw
<400> 158
aggtctcaga tcatgaatgc caaggcagaa gc 32
<210> 159
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_seceC_Rv
<400> 159
aggtctcaat gccgatcagc gtggtctgag tt 32
<210> 160
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_sodbC_Fw
<400> 160
aggtctcagc atatggcttt cgaattgccg c 31
<210> 161
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_sodbC_Rv
<400> 161
aggtctcact gaggctcagg cagttccagt ag 32
<210> 162
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_rpocB_Fw
<400> 162
aggtctcaaa catgaaagac ttgcttaatc tgttgaa 37
<210> 163
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_sodbB_Rv
<400> 163
aggtctcaag ccggctcagg cagttccagt ag 32
<210> 164
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_sodbD_Fw
<400> 164
aggtctcatc agggctcagg cagttccagt ag 32
<210> 165
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_rpocD_Rv
<400> 165
aggtctcagc agtgaaagac ttgcttaatc tgttgaa 37
<210> 166
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_xcpqC_Fw
<400> 166
aggtctcagg ctatgtccca gcctttgctc c 31
<210> 167
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_xcpqC2_Rv
<400> 167
aggtctcaga tcaatctggt cgatgaattc gcgg 34
<210> 168
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_pscfC_Fw
<400> 168
aggtctcaga tcatggcgca gatattcaac cc 32
<210> 169
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_pscfC_Rv
<400> 169
aggtctcaat gcgcgcacgg gtcaccg 27
<210> 170
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_psccC_Fw
<400> 170
aggtctcagc atatgcgccg cctgctg 27
<210> 171
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_psccC_Rv
<400> 171
aggtctcact gactgcgggc tttccaggt 29
<210> 172
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_xcpqB_Fw
<400> 172
aggtctcaaa caatgtccca gcctttgctc c 31
<210> 173
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_psccB_Rv
<400> 173
aggtctcaag ccctgcgggc tttccaggt 29
<210> 174
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_psccD_Fw
<400> 174
aggtctcatc agctgcgggc tttccaggt 29
<210> 175
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pak_xcpqD_Rv
<400> 175
aggtctcagc agatgtccca gcctttgctc c 31
<210> 176
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_ftsaB_Fw
<400> 176
aggtctcaaa caatgatcaa ggcgacggac ag 32
<210> 177
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_ftsaB_Rv
<400> 177
aggtctcaga tcctgccatc aattctgcct gg 32
<210> 178
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_canB_Fw
<400> 178
aggtctcaga tctttgtggt tggcgtgttt ca 32
<210> 179
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_canB_Rv
<400> 179
aggtctcaat gcaggtgtat aacctgggcc act 33
<210> 180
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_tsfB_Fw
<400> 180
aggtctcagc attggctgaa attaccgcat cc 32
<210> 181
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_tsfB_Rv
<400> 181
aggtctcaag ccagttgccg tcgattttgg tt 32
<210> 182
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_tsfD_Fw
<400> 182
aggtctcatc agagttgccg tcgattttgg tt 32
<210> 183
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_ftsaD_Rv
<400> 183
aggtctcagc agatgatcaa ggcgacggac ag 32
<210> 184
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_accDB_Fw
<400> 184
aggtctcaaa cataccgggg gtaccactac g 31
<210> 185
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_accDB_Rv
<400> 185
aggtctcaga tcaagcgtta atcggctttg cc 32
<210> 186
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_derB_Fw
<400> 186
aggtctcaga tctttcttga tgtgcttcat cagacg 36
<210> 187
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_derB_Rv
<400> 187
aggtctcaat gccccgccga ttgtggtgat tc 32
<210> 188
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_psdB_Fw
<400> 188
aggtctcagc attttttatc gtcaaccaat gggc 34
<210> 189
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_psdB_Rv
<400> 189
aggtctcaag ccaaaggcca ggaaatgggt cg 32
<210> 190
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_psdD_Fw
<400> 190
aggtctcatc agaaaggcca ggaaatgggt cg 32
<210> 191
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_accdD_Rv
<400> 191
aggtctcagc agtaccgggg gtaccactac g 31
<210> 192
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_virfB_Fw
<400> 192
aggtctcaaa caaatgacgg ttagctcagg ca 32
<210> 193
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_virfB_Rv
<400> 193
aggtctcaga tctaaccccc ttttctcctc aga 33
<210> 194
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_virbB_Fw
<400> 194
aggtctcaga tcatggtgga tttgtgcaac gac 33
<210> 195
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_virbB_Rv
<400> 195
aggtctcaat gccagggaag aattgttgta gcttt 35
<210> 196
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_icsaB_Fw
<400> 196
aggtctcagc atggtagcgg tgctgaccat aa 32
<210> 197
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_icsaB_Rv
<400> 197
aggtctcaag cccgccatca ccctcaccat aa 32
<210> 198
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_icsaD_Fw
<400> 198
aggtctcatc agcgccatca ccctcaccat aa 32
<210> 199
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sf_virfD_Rv
<400> 199
ggtctcagca gaatgacggt tagctcaggc a 31
<210> 200
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_dnaA_Fwd
<400> 200
ataatacgac tcactatagg gaggtgtccg tggaactttg gcag 44
<210> 201
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_dnaA_Rev
<400> 201
taatacgact cactataggg agaactgacc ctcccgcgtt 40
<210> 202
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_dnaN_Fwd
<400> 202
taatacgact cactataggg agatgcattt caccattcaa cg 42
<210> 203
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_dnaN_Rev
<400> 203
taatacgact cactataggg agggtgatct cgccgggt 38
<210> 204
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_gyrB_Fwd
<400> 204
taatacgact cactataggg agatgagcga gaacaacacg tac 43
<210> 205
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_gyrB_Rev
<400> 205
taatacgact cactataggg agccgtatgg atggtgatgc tga 43
<210> 206
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_rpoC_Fwd
<400> 206
taatacgact cactataggg agtgaaagac ttgcttaatc tgttgaa 47
<210> 207
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_rpoC_Rev
<400> 207
taatacgact cactataggg agacttctcg cagatcacac cg 42
<210> 208
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_secE_Fwd
<400> 208
taatacgact cactataggg agatgaatgc caaggcagaa gc 42
<210> 209
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_secE_Rev
<400> 209
taatacgact cactataggg agcgatcagc gtggtctgag tt 42
<210> 210
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_sodB_Fwd
<400> 210
taatacgact cactataggg agatggcttt cgaattgccg c 41
<210> 211
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶Pak_sodB_Rev
<400> 211
taatacgact cactataggg agggctcagg cagttccagt ag 42
<210> 212
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_ftsA_Fwd
<400> 212
taatacgact cactataggg agatgatcaa ggcgacggac ag 42
<210> 213
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_ftsA_Rev
<400> 213
taatacgact cactataggg agctgccatc aattctgcct gg 42
<210> 214
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_Can_Fwd
<400> 214
taatacgact cactataggg agtttgtggt tggcgtgttt ca 42
<210> 215
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_Can_Rev
<400> 215
taatacgact cactataggg agaggtgtat aacctgggcc act 43
<210> 216
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_tsf_Fwd
<400> 216
taatacgact cactataggg agtggctgaa attaccgcat cc 42
<210> 217
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_tsf_Rev
<400> 217
taatacgact cactataggg agagttgccg tcgattttgg tt 42
<210> 218
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_accD_Fwd
<400> 218
taatacgact cactataggg agtaccgggg gtaccactac g 41
<210> 219
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_accD_Rev
<400> 219
taatacgact cactataggg agaagcgtta atcggctttg cc 42
<210> 220
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_der_Fwd
<400> 220
taatacgact cactataggg agtttcttga tgtgcttcat cagacg 46
<210> 221
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_der_Rev
<400> 221
taatacgact cactataggg agcccgccga ttgtggtgat tc 42
<210> 222
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_psd_Fwd
<400> 222
taatacgact cactataggg agtttttatc gtcaaccaat gggc 44
<210> 223
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_psd_Rev
<400> 223
taatacgact cactataggg agaaaggcca ggaaatgggt cg 42
<210> 224
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_virF_Fwd
<400> 224
taatacgact cactataggg agaatgacgg ttagctcagg ca 42
<210> 225
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_virF_Rev
<400> 225
taatacgact cactataggg agtaaccccc ttttctcctc aga 43
<210> 226
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_virB_Fwd
<400> 226
taatacgact cactataggg agatggtgga tttgtgcaac gac 43
<210> 227
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_virB_Rev
<400> 227
taatacgact cactataggg agcagggaag aattgttgta gcttt 45
<210> 228
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7聚合酶 sf_icsA_Fwd
<400> 228
taatacgact cactataggg agggtagcgg tgctgaccat aa 42
<210> 229
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_icsA_Rev
<400> 229
taatacgact cactataggg agcgccatca ccctcaccat aa 42
<210> 230
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_spa47_Fwd
<400> 230
taatacgact cactataggg aggagctata caaaattgct cactcaa 47
<210> 231
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_spa47_Rev
<400> 231
taatacgact cactataggg agcacgagaa tttccaatca agc 43
<210> 232
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_mukB_Fwd
<400> 232
taatacgact cactataggg agattgaacg cggtaaattt cg 42
<210> 233
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_mukB_Rev
<400> 233
taatacgact cactataggg agcagcttac cgtgcagacc tt 42
<210> 234
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_ybiT_Fwd
<400> 234
taatacgact cactataggg aggtttccag taacgtcacc atgc 44
<210> 235
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 聚合酶sf_ybiT_Rev
<400> 235
taatacgact cactataggg agagcttacc aatgcgctcg t 41
<210> 236
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-dnaA-qF
<400> 236
aaatacctcg gtcggcttct 20
<210> 237
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-dnaA-qR
<400> 237
gtgggtctgc gatgggac 18
<210> 238
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-dnaN-qF
<400> 238
ggtcgcgtgg tactggaa 18
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-dnaN-qR
<400> 239
ttctgctctt cgacacggat 20
<210> 240
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-gyrB-qF
<400> 240
cagcatcacc atccatacgg 20
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-gyrB-qR
<400> 241
ggaggacggt catgatcact 20
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-rpoC-qF
<400> 242
gtgtgatctg cgagaagtgc 20
<210> 243
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-rpoC-qR
<400> 243
agcgacttca ggaaccagat 20
<210> 244
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-secE-qF
<400> 244
tatggccgag tcgtcaagaa 20
<210> 245
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-secE-qR
<400> 245
gaaaccaacc aacccagcag 20
<210> 246
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-sodB-qF
<400> 246
ggaaccacac cttctactgg a 21
<210> 247
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PAK-sodB-qR
<400> 247
cggaagtctt ggtgaactct 20
<210> 248
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000的LuxA和LuxB基因的LuxA/LuxB dsRNA的第一臂的序列
<400> 248
atgaaatttg gaaacttttt gcttacatac caacctcccc aattttctca aacagaggta 60
atgaaacgtt tggttaaatt aggtcgcatc tctgaggagt gtggttttga taccgtatgg 120
ttactggagc atcatttcac ggagtttggt ttgcttggta acccttatgt cgctgctgca 180
tatttacttg gcgcgactaa aaaattgaat gtaggaactg ccgctattgt tcttcccaca 240
gcccatccag atgaaatttg gattgttctt ccttaacttc atcaattcaa caactgttca 300
agaacaaagt atagttcgca tgcaggaaat aacggagtat gttgataagt tgaattttga 360
acagatttta gtgtatgaaa atcatttttc agataatggt gttgtcggcg ctcctctgac 420
tgtttctggt tttctgctcg gtttaacaga gaaaattaaa attggttcat taaatcacat 480
cattacaact catcatcctg 500
<210> 249
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000的LuxA和LuxB基因的LuxA/LuxB dsRNA的第二臂的序列
<400> 249
caggatgatg agttgtaatg atgtgattta atgaaccaat tttaattttc tctgttaaac 60
cgagcagaaa accagaaaca gtcagaggag cgccgacaac accattatct gaaaaatgat 120
tttcatacac taaaatctgt tcaaaattca acttatcaac atactccgtt atttcctgca 180
tgcgaactat actttgttct tgaacagttg ttgaattgat gaagttaagg aagaacaatc 240
caaatttcat ctggatgggc tgtgggaaga acaatagcgg cagttcctac attcaatttt 300
ttagtcgcgc caagtaaata tgcagcagcg acataagggt taccaagcaa accaaactcc 360
gtgaaatgat gctccagtaa ccatacggta tcaaaaccac actcctcaga gatgcgacct 420
aatttaacca aacgtttcat tacctctgtt tgagaaaatt ggggaggttg gtatgtaagc 480
aaaaagtttc caaatttcat 500

Claims (44)

1.一种抑制靶细菌细胞中至少一个基因表达的体外方法，所述方法包括使所述靶细菌细胞与小RNA、或者含有小RNA的组合物接触的步骤，所述小RNA具有15至30个碱基对的长度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小RNA是siRNA或miRNA，其特异性抑制细菌必需基因、或细菌毒力基因或抗生素抗性基因的表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细菌是动物病原细菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细菌选自：
以色列放线菌(Actinomyces israelii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、包柔氏菌属(Borrelia sp.)(伯氏(burgdorferi)、伽氏(garinii)、埃氏(afzelii)、回归热(recurrentis)、麝鼩(crocidurae)、达氏(duttonii)、赫氏(hermsii)等)、布鲁氏菌属(Brucella sp.)(牛(abortus)、犬(canis)、马耳他(melitensis)、猪(suis))、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、衣原体属(Chlamydiasp.)(肺炎(pneumoniae)、沙眼(trachomatis))、鹦鹉热衣原体(Chlamydophilapsittaci)、肉毒杆菌属(Clostridium sp.)(肉毒杆菌(botulinum)、艰难(difficile)、产气荚膜(perfringens)、破伤风杆菌(tetani))、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、埃立克体菌属(Ehrlichia sp.)(犬、查菲(chaffeensis))、肠球菌(Enterococcus)(粪(faecalis)、屎(faecium))、大肠杆菌(Escherichia coli)O157：H7、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、克雷伯军团菌(Legionella pneumophila)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、单细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)(麻风(leprae)、结核(tuberculosis))、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、奈瑟氏菌(Neisseria)(淋病(gonorrhoeae)、脑膜炎(meningitidis))、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、星状诺卡菌(Nocardia asteroides)、立克次氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)(伤寒(typhi)、鼠伤寒(typhimurium))、志贺氏菌属(Shigella sp.)(猪痢疾(sonnei)、痢疾(dysenteriae))、葡萄球菌(Staphylococcus)(金黄色葡萄球菌(aureus)、表皮(epidermidis)、腐生(saprophyticus))、链球菌属(Streptococcus sp.)(龙舌兰(agalactiae)、变形(mutans)、肺炎(pneumoniae)、化脓(pyogenes)、绿色(viridans))、福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythia)、***(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述组合物包含细胞外游离小RNA，或含有所述小RNA的细胞外小泡、或含有所述小RNA的非原质体流体、或与所述小RNA偶联的纳米颗粒。
6.一种治疗组合物，其包含作为活性成分的小RNA，所述小RNA具有15至30个碱基对的长度，其中所述小RNA特异性抑制至少一个细菌基因的表达。
7.根据权利要求6所述的治疗组合物，其中所述细菌基因是细菌毒力因子基因或细菌生存力基因或抗生素抗性基因。
8.根据权利要求6或7所述的治疗组合物，其包含细胞外游离小RNA、或含有所述小RNA的细胞外小泡、或含有所述小RNA的非原质体流体、或与所述小RNA偶联的纳米颗粒、以及药学上可接受的赋形剂。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的治疗组合物，其中其配制成用于口服、局部、或全身施用，优选作为丸剂、霜剂、或口服喷雾剂。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的治疗组合物，其中所述毒力因子基因、或生存力基因、或抗生素抗性基因选自：包括III型分泌***的分泌***、IV型分泌***的结构基因、VI型分泌***的结构基因、dot/icm***的基因、群体感应基因、参与氨基酸合成的必需基因、转肽酶、细菌转录机制的组分、细菌细胞壁的结构组分、对细胞***至关重要的基因、肌动蛋白的结构同源物、普通抗生素靶标等。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的治疗组合物，其中所述毒力因子基因、或细菌生存力基因、或抗生素抗性基因选自：PscC、PscJ、PscN、VirB1、VirD4、TssM、TssJ、TssB/TssC、TssE、VgrG、Hcp、DotC、DotD、DotF、DotG和DotH、LuxS、Luxl/LuxR、AroA、LysC、CysH、GalU、PbpA、PbpB、PbpC、Pigma70、Sigma 54、Arc、Ptr、Nor、Mep、Cme、TEM、SHV、GES、VIM、NDM、AmpC、VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、CasE、OXA-28、OXA-14、OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116、GES-9、FtsZ、FtsA、FtsN、FtsK、FtsI、FtsW、ZipA、ZapA、TolA、TolB、TolQ、TolR、Pal、MinCD、MreB和Mld。
12.根据权利要求6至11中任一项限定的治疗组合物，用于在需要其的受试者中治疗和/或预防细菌感染的用途。
13.根据权利要求12所述用途的治疗组合物，其中所述受试者是以下属的动物：智人(Homo sapiens)、家犬(Canis lupus)、家猫(Felis catus)、家马(Equus caballus)、普通牛(Bos Taurus)、绵羊(Ovis aries)、家山羊(Capra hircus)、野猪(Sus scrofa)、原鸡(Gallus gallus)、火鸡(Meleagris gallopavo)、灰雁(Anser anser)、绿头鸭(Anasplatyrhynchos)、或穴兔(Oryctolagus cuniculus)。
14.根据权利要求12或13所述用途的治疗组合物，其中其口服、局部或全身施用至所述受试者。
15.具有15至30个碱基对长度并且特异性抑制至少一个细菌基因的表达的小RNA、或如权利要求6至11所述的治疗组合物，用于在需要其的受试者中治疗和/或预防细菌感染的用途，其中所述小RNA通过口服、局部或全身地施用至受试者。
16.根据权利要求15所述用途的小RNA或组合物，其中所述受试者是以下属的动物：智人、家犬、家猫、家马、普通牛、绵羊、家山羊、野猪、原鸡、火鸡、灰雁、绿头鸭、或穴兔。
17.根据权利要求15或16所述用途的小RNA或组合物，其中所述细菌感染是由于选自以下的人病原细菌：
以色列放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、百日咳博德特氏菌、包柔氏菌属(伯氏、伽氏、埃氏、回归热、麝鼩、达氏、赫氏等)、布鲁氏菌属(牛、犬、马耳他、猪)、空肠弯曲杆菌、衣原体属(肺炎、沙眼)、鹦鹉热衣原体、肉毒杆菌属(肉毒杆菌、艰难、产气荚膜、破伤风杆菌)、白喉杆菌、埃立克体菌属(犬、查菲)、肠球菌(粪、屎)、大肠杆菌O157：H7、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、克雷伯军团菌、钩端螺旋体属、单细胞李斯特菌、分枝杆菌属(麻风、结核)、肺炎支原体、奈瑟氏菌(淋病、脑膜炎)、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、星状诺卡菌、立克次氏立克次体、沙门氏菌属(伤寒、鼠伤寒)、志贺氏菌属(猪痢疾、痢疾)、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮、腐生)、链球菌属(龙舌兰、变形、肺炎、化脓、绿色)、福赛斯坦纳菌、***、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森氏菌。
18.根据权利要求15至17中任一项所述用途的小RNA或组合物，其中其特异性抑制至少一个细菌毒力因子、或细菌必需基因、或抗生素抗性基因的表达。
19.根据权利要求15至18中任一项所述用途的小RNA或组合物，其包含细胞外游离小RNA、或含有所述小RNA的细胞外小泡、或含有所述小RNA的非原质体流体、或与所述小RNA偶联的纳米颗粒。
20.具有15至30个碱基对长度并且特异性抑制至少一个细菌基因的表达的小RNA，用于促进共栖的或共生的有益细菌在需要其的受试者中的有益效果的用途，其中所述小RNA通过口服、局部或全身地施用至受试者。
21.根据权利要求20所述用途的小RNA，其中所述共栖的或共生的有益细菌选自：
奈氏放线菌(Actinomyces naeslundii)、殊异韦荣菌(Veillonella dispar)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、肠杆菌(Enterobacteriaceae)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)(长(longum)、双歧(bifidum)、青春(adolescentis)、齿(dentium)、短(breve)、嗜热(themophilum))、迟缓埃格瑟拉菌(Eggerthella lenta)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)(解木聚糖(xylanisolvens)、多型(thetaiotaomicron)、脆弱(fragilis)、普通(vulgatus)、盐藻(salanitronis)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、瘤胃球菌属(Ruminococcus sp.)(布鲁米(Bromii)、champanellensis、SR1/5)、链球菌属(Streptococcus)(副血(parasanguinis)、嗜酸(salivarius)、嗜热(thermophilus)、猪、化脓(pyogenes)、咽峡炎(anginosus))、乳球菌属(Lactococcus)(乳酸(lactis)、格氏(garvieae))、肠球菌(粪、屎、卡塞尔(casseliflavus)、durans、海氏(hirae))、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus plutonius)、嗜盐四球菌(Tetragenococcus halophilus)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)(干酪(casei)、鲁米尼(ruminis)、德尔布吕克(delbrueckii)、布氏(buchneri)、罗伊特氏(reuteri)、发酵(fermentum)、戊糖(pentosus)、淀粉(amylovorus)、唾液(salivarius))、片球菌(Pediococcus)(戊糖(pentosaceus)、克劳森氏(claussenii))、明串珠菌(Leuconostoc)(肠膜(mesenteroides)、乳酸(lactis)、肉质(carnosum)、明胶(gelidum)、柠檬(citreum))、魏斯氏菌(Weissella)(泰国(thailandensis)、朝鲜(koreensis))、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)((土地(terrae)、多粘(polymyxa)、胶质(mucilaginosus)、Y412MC10)、堆肥嗜热芽孢杆菌(Thermobacillus composti)、短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)、芽孢杆菌(Bacillus)(解淀粉(amyloliquefaciens)、枯草(subtilis)，地衣(licheniformis)、萎缩(atrophaeus)、韦氏(weihenstephanensis)、蜡样(cereus)、苏云金(thuringiensis)、凝结(coagulans)、巨大(megaterium)、硒化(selenitireducens))、热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)、盐芽孢杆菌(Halobacillus halophilus)、李斯特菌属(Listeria sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、真细菌(Eubacterium)(直肠(rectale)、挑剔(eligens)、惰性(siraeum))、化糖梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharolyticum)、和产丁酸的细菌(SS3/4和SSC/2)。
22.根据权利要求20或21所述用途的小RNA，其中其特异性抑制编码对受试者有益的途径的负调节子的基因的表达。
23.根据权利要求20至22中任一项所述用途的小RNA，其中其特异性抑制以下基因的表达：编码所述共生有益细菌的负复制因子的基因、或抑制针对周围病原细菌的抗生素或抗微生物化合物产生的基因。
24.根据权利要求20至23中任一项所述用途的小RNA，其中其是细胞外游离小RNA。
25.具有15至30个碱基对长度并且特异性抑制至少一个细菌抗生素抗性基因的表达的小RNA，用于改善需要其的受试者中抗生素治疗的效果的用途。
26.根据权利要求25所述用途的小RNA，其中所述受试者被选自以下的病原细菌感染：
以色列放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、百日咳博德特氏菌、包柔氏菌属(伯氏、伽氏、埃氏、回归热、麝鼩、达氏、赫氏等)、布鲁氏菌属(牛、犬、马耳他、猪)、空肠弯曲杆菌、衣原体属(肺炎、沙眼)、鹦鹉热衣原体、肉毒杆菌属(肉毒杆菌、艰难、产气荚膜、破伤风杆菌)、白喉杆菌、埃立克体菌属(犬、查菲)、肠球菌(粪、屎)、大肠杆菌O157：H7、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、克雷伯军团菌、钩端螺旋体属、单细胞李斯特菌、分枝杆菌属(麻风、结核)、肺炎支原体、奈瑟氏菌(淋病、脑膜炎)、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、星状诺卡菌、立克次氏立克次体、沙门氏菌属(伤寒、鼠伤寒)、志贺氏菌属(猪痢疾、痢疾)、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮、腐生)、链球菌属(龙舌兰、变形、肺炎、化脓、绿色)、福赛斯坦纳菌、***、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森氏菌。
27.一种药物试剂盒，其包含：
a)具有15至30个碱基对长度并且特异性抑制抗生素抗性基因的表达的小RNA，或权利要求6至11所述的治疗组合物，以及
b)抗生素化合物。
28.根据权利要求27所述的药物试剂盒，其中所述抗生素抗性基因选自：VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、Case、OXA-28、OXA-14,OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116和GES-9。
29.根据权利要求27或28所述的药物试剂盒，其中所述抗生素化合物选自：氨基糖苷、碳青霉烯、头孢他啶(第3代)、头孢吡肟(第4代)、头孢吡普(第5代)、头孢洛扎/他唑巴坦、氟喹诺酮、哌拉西林/他唑巴坦、羟基噻吩青霉素/克拉维酸、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、乙基西梭霉素、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除草霉素、利福昔明、艾他培南、多利培南、亚胺培南、美洛培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢哌啶、先锋霉素、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢替坦、头孢羟唑、头孢美唑、头孢尼西、氯炭头孢、头孢罗齐、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮钠、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布希、头孢唑肟、羟羧氧酰胺菌素、头孢曲松钠、头孢菌素、头孢吡肟、头孢菌素、头孢洛林酯、头孢吡普、糖肽、替考拉宁、万古霉素、特拉万星、达巴万星、奥利万星、林可酰胺(Bs)、克林霉素、洁霉素、脂肽、达托霉素、大环内酯(Bs)、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素、非达霉素、单菌霉素、氨曲南、硝基呋喃、呋喃唑酮、呋喃咀啶(Bs)、恶唑烷酮(Bs)、利奈唑胺、波西唑来、雷得唑来、托雷唑来、青霉素、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯甲异噁唑青霉素、青霉素G、青霉素、哌拉西林、替莫西林、羟基噻吩青霉素、青霉素组合、阿莫西林/克拉维酸、氨苄青霉素/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、羟基噻吩青霉素/克拉维酸、多肽、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、喹诺酮类/氟喹诺酮类、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、那氟沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格雷沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺(Bs)、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、银磺胺嘧啶、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲异恶唑(旧称)、柳氮磺吡啶、磺胺异恶唑、复方新诺明(Sulfisoxazole,Trimethoprim-Sulfamethoxazole)(复方新诺名(Co-trimoxazole)(TMP-SMX)、磺胺基甲萘啶(旧称)、四环素(Bs)、地美环素、强力霉素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、氧四环素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇(Bs)、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素(Bs)、磷霉素、夫西地酸、甲硝哒唑、莫匹罗星、板霉素、奎奴普汀/达福普汀、甲砜霉素、替加环素(Bs)、磺甲硝咪唑和甲氧苄氨嘧啶(Bs)。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的药物试剂盒，用于在需要其的受试者中治疗和/或预防细菌感染的用途。
31.一种组合产品，其包含：
a)具有15至30个碱基对长度、并且特异性抑制抗生素抗性基因的表达的小RNA，或权利要求6至11所述的治疗组合物，以及
b)抗生素化合物，
用于同时、分开或交错用于在需要其的受试者中预防和/或治疗细菌感染的用途。
32.根据权利要求31所述的组合产品，其中所述小RNA在抗生素化合物之前施用，优选在一天之前。
33.一种小RNA，其具有15至30个碱基对的长度，并且特异性抑制至少一个细菌基因的表达，所述细菌基因选自：PscC、PscJ、PscN、VirB1、VirD4、TssM、TssJ、TssB/TssC、TssE、VgrG、Hcp、DotC、DotD、DotF、DotG和DotH、LuxS、Luxl/LuxR、AroA、LysC、CysH、GalU、PbpA、PbpB、PbpC、Pigma70、Sigma 54、Arc、Ptr、Nor、Mep、Cme、TEM、SHV、GES、VIM、NDM、AmpC、VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、CasE、OXA-28、OXA-14、OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116、GES-9、FtsZ、FtsA、FtsN、FtsK、FtsI、FtsW、ZipA、ZapA、TolA、TolB、TolQ、TolR、Pal、MinCD、MreB和Mld。
34.如权利要求33所定义的小RNA的体外用途，用于抑制所述基因在细菌细胞中的表达。
35.如权利要求33或34所述的小RNA的体外用途，用于抑制细菌生长、生存力或抗生素抗性。
36.如权利要求33所述的小RNA，用于在需要其的受试者中治疗和/或预防细菌感染的用途。
37.根据权利要求36所述用途的小RNA，其中所述细菌感染由以下的至少一种所导致：
以色列放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、百日咳博德特氏菌、包柔氏菌属(伯氏、伽氏、埃氏、回归热、麝鼩、达氏、赫氏等)、布鲁氏菌属(牛、犬、马耳他、猪)、空肠弯曲杆菌、衣原体属(肺炎、沙眼)、鹦鹉热衣原体、肉毒杆菌属(肉毒杆菌、艰难、产气荚膜、破伤风杆菌)、白喉杆菌、埃立克体菌属(犬、查菲)、肠球菌(粪、屎)、大肠杆菌O157：H7、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、克雷伯军团菌、钩端螺旋体属、单细胞李斯特菌、分枝杆菌属(麻风、结核)、肺炎支原体、奈瑟氏菌(淋病、脑膜炎)、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、星状诺卡菌、立克次氏立克次体、沙门氏菌属(伤寒、鼠伤寒)、志贺氏菌属(猪痢疾、痢疾)、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮、腐生)、链球菌属(龙舌兰、变形、肺炎、化脓、绿色)、福赛斯坦纳菌、***、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森氏菌。
38.一种鉴定参与细菌抗生素抗性的候选基因的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)将细菌细胞与小RNA一起孵育，所述小RNA具有15至30个碱基对的长度并且特异性抑制至少一个细菌基因的表达，
b)将所述小RNA处理的细菌细胞与抗生素化合物一起孵育，
c)评估在所述抗生素化合物存在时，所述小RNA处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性，并且将其与所述抗生素化合物不存在时所述小RNA处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性进行比较。
39.根据权利要求38所述的方法，其中在所述抗生素化合物存在时，所述小RNA处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性低于在所述抗生素化合物不存在时所述小RNA处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性时，则候选基因参与细菌抗生素抗性。
40.一种鉴定具有抗菌活性的候选小RNA的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)在植物细胞中表达至少一个长dsRNA，其同源siRNA抑制至少一个细菌基因，
b)使所述植物细胞与裂解缓冲液接触，
c)将所述植物细胞裂解物或其RNA提取物与细菌细胞一起孵育，以及
d)评估所述细菌细胞的生存力、生长、代谢活性。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述植物细胞来自烟草叶子。
42.一种鉴定影响人病原细菌细胞增殖的候选基因的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)生成抑制至少一个细菌基因表达的小RNA，
b)将所述小RNA与细菌细胞一起孵育，以及
c)评估所述细菌细胞的生存力、生长、代谢活性。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞选自：
以色列放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、百日咳博德特氏菌、包柔氏菌属(伯氏、伽氏、埃氏、回归热、麝鼩、达氏、赫氏等)、布鲁氏菌属(牛、犬、马耳他、猪)、空肠弯曲杆菌、衣原体属(肺炎、沙眼)、鹦鹉热衣原体、肉毒杆菌属(肉毒杆菌、艰难、产气荚膜、破伤风杆菌)、白喉杆菌、埃立克体菌属(犬、查菲)、肠球菌(粪、屎)、大肠杆菌O157：H7、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、克雷伯军团菌、钩端螺旋体属、单细胞李斯特菌、分枝杆菌属(麻风、结核)、肺炎支原体、奈瑟氏菌(淋病、脑膜炎)、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、星状诺卡菌、立克次氏立克次体、沙门氏菌属(伤寒、鼠伤寒)、志贺氏菌属(猪痢疾、痢疾)、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮、腐生)、链球菌属(龙舌兰、变形、肺炎、化脓、绿色)、福赛斯坦纳菌、***、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森氏菌。
44.一种用于处理靶植物抗细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：在人或动物病原细菌的细菌感染之前和/或之后，向所述靶植物的至少一个细胞引入长dsRNA分子，所述长dsRNA分子特异性靶向毒力细菌基因、或必需细菌基因或抗菌抗性基因，或向植物组织递送，例如，靶向基因的小RNA、或含有所述小RNA的植物提取物、或含有所述小RNA的组合物。
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