CN112877339B

CN112877339B - 柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7及其应用

Info

Publication number: CN112877339B
Application number: CN202110212521.3A
Authority: CN
Inventors: 徐莉清; 吴鑫; 罗正荣; 张青林; 陈文兴; 郭大勇
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-02-25
Filing date: 2021-02-25
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-02-25
Also published as: CN112877339A

Abstract

本发明公开了一种柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7及其应用，属于植物基因工程技术领域，本发明通过转录组数据库首次筛选并获得差异表达基因DkMATE7基因，同时首次发现了DkMATE7蛋白具有原花青素转运功能。大肠杆菌体内互补实验分析进一步证明了DkMATE7基因促进柿原花青素前体儿茶素、表儿茶素以及表儿茶素没食子酸的偏好性跨膜转运。为深入研究甜柿中原花青素转运和积累提供了科学依据，也为遗传改良提供了新的基因资源。

Description

柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7及其应用。

背景技术

柿原产中国，其味道鲜美，生津止渴，对人类健康良好，是东亚地区(中国，日本，韩国等)最受欢迎的水果之一。柿的独特之处在于其果实发育期间的果肉单宁细胞中能累积大量的原花青素(Proanthocyanidins，PAs，又称“单宁”)，成为涩感的主要原因。在柿属植物中，原花青素前体物质的合成与PAs聚合分别位于细胞质和液泡，因而PAs的起始单元和延伸单元可能经转运蛋白跨膜转运进入液泡并发生聚合作用。日本甜柿与中国甜柿单宁细胞在液泡内的形态明显不同，并且完全甜柿与非完全甜柿单宁细胞在大小及形态上均有明显差异。近来的研究推测PAs单体可能先于谷胱甘肽-S-转移酶(拟南芥中为AtGST26/AtGSTF12)结合并运向液泡膜，再由位于液泡膜上的MATE家族蛋白(拟南芥中为AtDTX41)和H⁺-ATPase(拟南芥中为AHA10)将其跨膜转运到液泡中，最后由漆酶(拟南芥中为LAC15)等氧化酶类将其缩合成不同聚合度的PA聚合物，但尚缺乏***的研究报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明首次克隆了具有原花青素前体跨膜转运功能的DkMATE7基因，并通过大肠杆菌体内互补实验分析发现，DkMATE7基因在中国甜柿原花青素前体跨膜转运中具有偏好性，其偏好性转运儿茶素、表儿茶素以及表儿茶素没食子酸，为深入研究甜柿中原花青素转运和积累提供了科学依据，为甜柿遗传改良提供了新的基因资源。

本发明的目的之二在于提供上述柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7在偏好性转运儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸中的应用。

本发明的目的之三在于提供上述柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7在原花青素转运中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种用于扩增如上述DkMATE7基因的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。

本发明的目的之五在于提供一种用于检测DkMATE7基因的荧光定量PCR特异引物，所述荧光定量PCR特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

本发明的目的之六在于提供一种表达载体，所述表达载体中包含上述DkMATE7基因。

本发明的目的之七在于提供一种遗传工程菌，所述遗传工程菌中包含上述表达载体。

本发明的目的之八在于提供上述表达载体或遗传工程菌在促进儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸跨膜转运中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过转录组数据库筛选，首次得到DkMATE差异表达基因DkMATE7基因，并发现DkMATE7蛋白具有原花青素前体转运功能。进一步通过大肠杆菌体内互补实验证明DkMATE7基因促进中国甜柿原花青素前体儿茶素、表儿茶素以及表儿茶素没食子酸的偏好性转运，为深入研究甜柿中原花青素转运和积累提供了科学依据，为甜柿遗传改良提供了新的基因资源。

附图说明

图1为本发明实施例1中DkMATE7在不同品种柿果实发育时期的基因表达检测结果；

图2为本发明实施例2中DkMATE7在柿叶片瞬时转化后，可溶性PAs、不溶性PAs以及总PAs的含量测定结果；

图3为本发明实施例3中大肠杆菌功能互补实验检测结果，其中C+为添加有儿茶素、EC+为添加有表儿茶素、ECG+为添加有表儿茶素没食子酸，EGC为添加有表没食子儿茶素，EGCG为添加有表没食子儿茶素没食子酸酯，Empty Vector为空载体对照组，DkMATE7为转化有原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE7的大肠杆菌，其中每行的6个菌斑为初始OD₆₀₀值依次为1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1的菌斑。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1DkMATE7基因序列的获得与分析

1、‘鄂柿1号’果实中DkMATE7基因序列的获得

(1)首先通过Pfam数据库(http://pfam.xfam.org)下载MATE基因家族HMM信息，利用HMMER软件比对油柿基因组(http://www.kakiwi.zju.edu.cn/cgi-bin/persimmon/index.cgi)，获取候选MATE蛋白序列，取候选蛋白序列比对Pfam数据库，保留存在保守结构域的MATE基因为DkMATE家族基因成员，利用转录组数据库查找DkMATE差异表达基因，确定DkMATE7基因差异表达。

(2)采用RNAplant Plus Kit试剂盒(Tiangen Biotech Ltd.,Beijing,China)进行‘鄂柿1号’柿果肉RNA的提取，并使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa,Japan)反转录试剂盒合成cDNA。

(3)利用Primer Premier 5.0软件设计可扩增DkMATE7基因全长的引物，引物序列如SEQ ID NO.2-3所示。使用PrimeSTAR Max Premix(2x)(TaKaRa,Japan)高保真酶，以上述反转录获得的‘鄂柿1号’cDNA为模板进行PCR扩增，分别得到包含完整DkMATE7基因编码区序列的PCR片段，测序后得到如SEQ ID NO.1所示的DkMATE7基因序列。

2、DkMATE7在不同品种柿果实发育时期的基因表达模式

(1)选取‘鄂柿1号’、‘磨盘柿’和‘阳丰’为试材，分别于开花后2.5周、5周、10周、15周、20周和27.5周采取果肉，-80℃保存待用。

(2)取不同品种不同发育时期的柿果实，采用RNAplant Plus Kit试剂盒(TiangenBiotech Ltd.,Beijing,China)提取RNA，并参照PrimeScriptTM RT reagent Kit withgDNA Eraser反转录试剂盒(TaKaRa,Japan)合成cDNA。

(3)分别设计用于定量检测DkMATE7基因的荧光定量PCR特异引物，其序列如SEQID NO.4-5所示。利用

Green Real-time PCR Master Mix荧光染料(TaKaRa,Japan)和ABI QuantStudio 7Flex Real-Time PCR仪对DkMATE7进行定量分析。

定量PCR反应体系：5μL的

Green Real-time PCR Master Mix，1μL的cDNA，0.4μL的正反向引物，加RNA free H₂O至终体积为10μL。

定量PCR反应条件：95℃30s，接着95℃15s，58℃30s，72℃20s，运行40个循环，然后95℃15s，40℃30s。

每个样品设置四个重复，并以Diospyros.kaki Thunb.Actin(GenBank AccessionNo.AB219402)作为内参基因，默认条件下读取Ct值。所有结果显示为具有相应标准误差的均值(SE)。

实时荧光定量PCR检测结果如图1所示。图1结果显示，在开花后不同时期，DkMATE7的表达量逐渐降低，其在果实发育的早期大量表达，并且在‘阳丰’和‘鄂柿1号’中的表达量高于‘磨盘柿’。DkMATE7基因在不同品种不同时期的柿果实中的表达情况存在较大差异。

实施例2DkMATE7在柿叶片瞬时转化分析

(1)根据实施例1获得的如SEQ ID NO.1所示的DkMATE7基因序列，分别设计如SEQID NO.6-7所示的MATE7-OEF和MATE7-OER，并根据说明书，使用Gateway方法将DkMATE7基因导入中间载体pDONR207，再通过LR反应导入超表达载体pK2GW7中，分别构建得到超表达重组质粒，并采用常规方法将超表达重组质粒转入到农杆菌(GV3101)中。

(2)将上述转染后的农杆菌采用常规的注射渗透法瞬时转化到‘鄂柿1号’叶片中，并于注射10d后收集农杆菌侵染的叶片，液氮速冻后-80℃保存使用。根据Folin-Ciocalteau法(Oshida et al.,1996)测定瞬时转化叶片的可溶性、不溶性原花青素(PAs)以及总原花青素含量，并以空载体作为对照组。测定结果如图2所示。

根据图2的检测结果，DkMATE7超表达重组质粒转化至柿叶片后，其与空载体对照组(Control)相比，‘鄂柿1号’叶片中可溶性、不溶性PAs含量和总PAs含量相比于空载体对照组均显著升高(p＜0.05)，该结果表明在完全甜柿中DkMATE7参与PAs的转运。

实施例3大肠杆菌功能互补实验确定DkMATE7转运偏好性

1、PGEX-6P-1-DkMATE7表达载体的构建

使用PrimeSTAR Max Premix(2x)高保真酶(TaKaRa,Japan)，以DkMATE7基因全长质粒为模板，用包含BamH I和Not I限制性酶切位点的引物(如SEQ ID NO.8-9所示)，进行扩增并克隆到原核表达载体PGEX-6P-1上，以构建原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE7。

2、大肠杆菌功能互补实验

将上述构建好的原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE7按照常规方法转化到缺乏药物外排能力的大肠杆菌突变菌株acrB中。挑取成功转化的单菌落至5mL LB液体培养基，37℃，200r/min摇12h左右。取500μL菌液至50mL LB液体培养基中，37℃，200r/min摇菌。测定菌液的OD₆₀₀值，当达到0.6左右时，加入1mM IPTG，待OD₆₀₀值达到1.0时，取1mL菌液。按10倍稀释OD₆₀₀为1.0的菌液为六个连续递减梯度(OD₆₀₀值依次为1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1)，各取1.5μL菌液分别点至含不同底物的六个固体LB平板上(含1mM IPTG)，其中底物分别为儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。于37℃培养24h后观察细菌的生长情况，并以空载体PGEX-6P-1转化至菌株acrB作为对照。测定结果如图3所示。其中C+为添加有儿茶素、EC+为添加有表儿茶素、ECG+为添加有表儿茶素没食子酸，EGC为添加有表没食子儿茶素，EGCG为添加有表没食子儿茶素没食子酸酯，Empty Vector为空载体对照组，DkMATE7为转化有原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE7的大肠杆菌，其中每行的6个菌斑为初始OD₆₀₀值依次为1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1的菌斑。

根据图3的检测结果，大肠杆菌功能互补实验结果显示，在没有添加底物的情况下，含有原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE7的菌株与含空载体PGEX-6P-1的菌株对照组，其菌斑生长状况一致。添加有底物儿茶素(C)或底物表儿茶素(EC)或表儿茶素没食子酸(ECG)时，含有原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE7的菌株，即可表达DkMATE7的菌株生长状况显著优于对照组，而添加有底物表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)时，含有原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE7的菌株的生长情况略优于对照组。该结果证明了DkMATE7的表达补充了缺乏药物外排能力的大肠杆菌突变菌株acrB的功能，即DkMATE7转运蛋白偏好转运儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1461

<212> DNA

<213> 柿(Diospyros kaki)

<400> 1

atgaacagcg ccgccgcgga gcctctactg aacaacaaca accaccgcgt cgaagatgaa 60

gaagggaatg ttagggcagt gagcgtggtg agggagttcg gcgaggagtc gaagaggctg 120

tggagaatcg cggggccggc gattatgacc gccatttttc agtactcgct cggggcgatc 180

actcagactt tcgccggcct ggtcagcgag atcgacctcg ccgccgtctc catcgagaac 240

tctgtcatcg ccggcttttc ctacggcgtc atgctgggaa tgggcagcgc tttggagacg 300

ctatgcgggc aagcattcgg tgcgggacag ctcagaatgc ttggcgtgta catgcagcga 360

tcgtgggtca tcctgctgac cactgcctgt attatcgttc ccgtctacgt cttctctact 420

cctattcttg agctcgtcgg cgagaccacc gagatctctg aagcctcagg aaagttcgcc 480

ttgtggatgc ttccgcaact gttcgcatat gccatgaact tcccgataca gaaattcctg 540

caagcgcaga ggaaagttct ggtaattacg tgggtgtcgg gcatagtgct ggtgctccac 600

gtgctcttca gctggctgct gattctgaag ctgggatggg gcctgaccgg cgccgccatc 660

gccctgaaca gctcgtggtg gctcgtcata atcggccaat tgctctacat cttcattacc 720

aagtccgacg gcgcttggac cggattcact tggcttgctt ttgccgactt gtggggcttt 780

gtcaagctct ctctggcttc tgccgttatg ctatgcttgg agttttggta cttgatggta 840

ctcatcctta taacaggccg cttacccaat tctctaatag cagtcgatgc cgtctctgtc 900

tgcctgaaca ttcaaggatg ggatgctatg attgcgatag gctttaacgc ggccataagt 960

gtgagagtat caaatgaact tggagctggg aaaccaagaa aagcaaagct tgcagtgatg 1020

gtagtgtcag taacgtctat aacaattaga atagtctgca tggctgttgt gcttgcaacc 1080

aaagactact ggccttatct cttcacaagc agtgcggttg ttgccgaaga aactaccaaa 1140

atcgccatcc tccttgcagt cacagtcgct ttaaacagcc ttcaacccgt cttatctggg 1200

gttgctgtgg gagctgggtg gcaacatata gtggcataca tcaacattgg atgctattac 1260

attgttggat tgcctgcagg cattctattg ggatttacat ttgggcttgg agtcacgggt 1320

ctttggggag gaatgctggg aggcatttgc ttgcagacac ttattttaat agtcatcact 1380

tccatcacaa actggaacaa ggaggctgcg gcagcagaaa ctcgagtcaa gaaatgggga 1440

ggcgcaattg cagatcaata a 1461

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacagcg ccgccgcgga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttattgatct gcaattgcgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaagaaggg aatgttaggg 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggcgaaagt ctgagtgat 19

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tgaacagcgc cgccgcgga 49

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tattgatctg caattgcgc 49

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttccaggggc ccctgggatc catgaacagc gccgccgcgg a 41

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcagtcagtc acgatgcggc cgcttattga tctgcaattg cgc 43

Claims

1.一种柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7，其特征在于，所述DkMATE7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7在偏好性转运儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸中的应用。

3.如权利要求1所述的柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE7在原花青素转运中的应用。

4.一种用于扩增如权利要求1所述的DkMATE7基因的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。

5.一种用于检测如权利要求1所述的DkMATE7基因的荧光定量PCR特异引物，其特征在于，所述荧光定量PCR特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中包含如权利要求1所述的DkMATE7基因。

7.一种遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌中包含如权利要求6所述的表达载体。

8.如权利要求6所述的表达载体或如权利要求7所述的遗传工程菌在促进儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸跨膜转运中的应用。