CN112876673B - 一种pH响应性纳米共聚物载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种pH响应性纳米共聚物载体及其制备方法和应用。本发明提供的HP@PHis/LC NPs用于制备肿瘤微环境靶向制剂，通过检测癌症干细胞的表达，表明其纳米载体能够在肿瘤组织响应性解离释放HP，实现位置精准性释放从而抑制癌症干细胞；通过抗肿瘤实验结果显示，HP@PHis/LC NPs纳米制剂大大提高了抗肿瘤效果，有效阻断了细胞发生上皮间质转化，降低肿瘤的侵袭和转移，解除对光动力治疗的的耐受性。

Description

一种pH响应性纳米共聚物载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种pH响应性纳米共聚物载体及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
肿瘤干细胞是肿瘤组织中具有无限增殖潜能的极少量干细胞样癌细胞亚群，是一群具有自我更新、启动和重建肿瘤组织表型能力的肿瘤细胞。正常的肿瘤细胞中存在自我更新和分化的平衡状态，然而肿瘤干细胞中处于非平衡状态，自我更新能力强，显著促进了肿瘤的成长。肿瘤干细胞还在肿瘤侵袭、转移和耐药方面发挥着重要作用。肿瘤的侵袭和转移是指肿瘤细胞从原发部位脱落，通过血液循环在不同靶部位长出相同性质的肿瘤的过程。然而，除了肿瘤组织内在的肿瘤干细胞外，肿瘤进程中发生上皮间质转化也会诱导肿瘤干细胞的生成，进而促进肿瘤生长、侵袭和转移。
上皮间质转化是指上皮细胞到***的转化，在肿瘤发育过程中起着关键的作用，不仅赋予肿瘤细胞转移和入侵的能力，而且获得干细胞的特征。一方面可以改变肿瘤细胞的特性使肿瘤细胞间连接分子表达缺失，极性丧失，粘附力减弱、运动性提高，使肿瘤细胞本身的侵袭能力增强；另一方面，上皮间质转化还可赋予肿瘤细胞干细胞特征，促进肿瘤干细胞的生成。发明人研究发现只有抑制内在癌症干细胞和上皮间质转化两个进程才能够完全消除癌症干细胞，避免肿瘤的侵袭和转移。
发明内容
为了解决现有技术存在的清除或抑制癌症干细胞方法较为单一，减少肿瘤生长和转移的效果不明显的问题，本发明提出一种pH响应性纳米共聚物载体及其制备方法和应用，制备一种高载药量、多功能的响应性纳米递药体系，从而实现消除肿瘤干细胞，减少肿瘤生长和转移的临床应用。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种pH响应性纳米共聚物载体，化学结构式如下：
Figure BDA0002914563740000021
n值范围为1-16。
本发明第二方面，提供一种用pH响应性纳米共聚物载体的制备方法，以聚乙烯亚胺的氨基作为引发剂，聚合N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸生成pH响应性纳米共聚物载体，即聚组氨酸PHis。
本发明第三方面，提供一种pH响应性纳米胶束，包括pH响应性纳米共聚物载体和癌症干细胞抑制剂。
本发明第四方面，提供一种pH响应性纳米胶束的制备方法，pH响应性纳米共聚物载体和癌症干细胞抑制剂通过透析法在水中自组装得到pH响应性纳米胶束。
本发明第五方面，提供一种分级响应性纳米复合物，由pH响应性纳米胶束作为复合物的核心，由低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物作为复合物外壳。
本发明第六方面，提供一种分级响应性纳米复合物的制备方法，低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物通过静电作用吸附于pH响应性纳米胶束表面，即为分级响应性纳米复合物。
本发明第七方面，提供一种纳米制剂，包括分级响应性纳米复合物。
本发明第八方面，提供一种pH响应性纳米共聚物载体，pH响应性纳米胶束，分级响应性纳米复合物在制备抗肿瘤药物的应用。
本发明第八方面，提供一种氟哌啶醇在促进癌症干细胞分化为肿瘤细胞中的应用。
本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
(1)本发明首次运用聚乙烯亚胺聚合N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸，合成pH响应性的纳米共聚物载体PHis。该载体不仅解决了N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸疏水性强，无法载药的缺点，还可以在酸性环境中质子化完成疏水到亲水的转换，实现精准靶点释放负载药物，实现长循环、肿瘤微环境响应性释放，在较长时间内发挥抗肿瘤作用。
(2)本发明首次运用带负电的纳米载体低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物(LC)通过静电吸附于pH响应性纳米胶束表面，合成分级响应性纳米复合物。该制剂不仅实现癌症干细胞的内在抑制和癌症干细胞的外在诱导，还有效实现上皮间质转化阻断和光动力杀伤效果，抑制肿瘤的生长、侵袭和转移，并通过Ce6的荧光信号实现药物体内追踪。
(3)本发明制得的pH响应性纳米HP@PHis胶束载药量高，HP:PHis在质量比为5:1时，HP载药量高达33.0％，且易于运输和保存，为工业的贮存提供了有利条件。
(4)本发明制得的纳米制剂形态均匀，粒径小于200nm，适合静脉注射，可以通过被动靶向效应蓄积于肿瘤部位。
(5)本发明制得的分级响应性纳米复合物具有pH响应性，能够实现多靶点给药。
(6)本发明通过实验表明癌症干细胞抑制剂为氟哌啶醇(HP)时，制备的HP@PHis/LC具有强大的抑制癌症干细胞效果，且该制剂生物相容性好，并具有强大的阻断上皮间质转化效果。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明实施例1的聚组氨酸的核磁图谱；
图2为本发明实施例3的HP@PHis/LC抑制癌症干细胞实验表征图；
图3为本发明实施例4的HP@PHis/LC的体内抗肿瘤效应中肿瘤体积的变化曲线；
图4为本发明实施例4的HP@PHis/LC的体内抗肿瘤效应中肿瘤重量的表征图；
图5为本发明实施例5的HP@PHis/LC抑制体内上皮间质转化实验表征图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了解决现有技术存在的清除或抑制癌症干细胞方法较为单一，减少肿瘤生长和转移的效果不明显的问题，本发明提出一种pH响应性纳米共聚物载体及其制备方法和应用，制备一种高载药量、多功能的响应性纳米递药体系，从而实现消除肿瘤干细胞，减少肿瘤生长和转移的临床应用。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种pH响应性纳米共聚物载体，化学结构式如下：
Figure BDA0002914563740000041
n值范围为1-16，优选为4-16。
本发明首次运用聚乙烯亚胺聚合N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸，合成pH响应性纳米共聚物载体PHis。该载体不仅解决了N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸疏水性强，无法载药的缺点，还可以在酸性环境中质子化完成疏水到亲水的转换，实现精准靶点释放负载药物。
本发明第二方面，提供一种用pH响应性纳米共聚物载体的制备方法，以聚乙烯亚胺的氨基作为引发剂，聚合N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸生成pH响应性纳米共聚物载体，即聚组氨酸PHis。
实验流程为：
Figure BDA0002914563740000051
优选地，所述聚乙烯亚胺为分支聚乙烯亚胺，来源于麦克林，型号25987-06-8，结构式为：
Figure BDA0002914563740000052
重均分子量为800。
在本发明一个或多个实施例中，将N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸溶解在第一溶剂中，加入亚硫酰氯，沉淀、离心获得N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐，将N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐溶解在第二溶剂中，并在保护气氛下搅拌，加入聚乙烯亚胺进行反应，除杂、透析、冻干即得；
优选地，第一溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺，N,N二甲基乙酰胺，
优选地，N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸与亚硫酰氯的摩尔比为0.5-2.5:8-15，优选为2-3:11，进一步优选为2.37:11；
优选地，沉淀过程使用***沉淀；
优选地，离心后还包括纯化步骤，使用丙酮溶解粗产物N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐并经过***沉淀获得纯化的N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐；
优选地，N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐与聚乙烯亚胺的摩尔比为4:1-6:1，优选为5:1；
优选地，所述第二溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺，N,N二甲基乙酰胺；
优选地，所述搅拌为室温搅拌，搅拌时间为2-4天，优选为3天；
优选地，所述除杂步骤为使用2-巯基乙醇除去Boc基团，即叔丁氧羰基。
本发明第三方面，提供一种pH响应性纳米胶束，包括pH响应性纳米共聚物载体和癌症干细胞抑制剂。
癌症干细胞抑制剂和pH响应性纳米共聚物载体的质量比为1:1-6:1，优选为5:1。
优选地，所述癌症干细胞抑制剂选自氟哌啶醇、氯丙嗪、三氟拉嗪和奋乃静，优选为氟哌啶醇。
优选地，所述pH响应性纳米共聚物载体通过疏水作用包载癌症干细胞抑制剂合成pH响应性纳米胶束。
当癌症干细胞抑制剂为氟哌啶醇时，制备的pH响应性纳米胶束为HP@PHis。
本发明第四方面，提供一种pH响应性纳米胶束的制备方法，pH响应性纳米共聚物载体和癌症干细胞抑制剂通过透析法在水中自组装得到pH响应性纳米胶束。
在本发明一个或多个实施例中，将癌症干细胞抑制剂溶液和pH响应性纳米共聚物载体溶液混合搅拌，加水反应，利用水透析获得pH响应性纳米胶束；
优选地，所述癌症干细胞抑制剂溶液的溶剂为二甲基亚砜；
优选地，所述pH响应性纳米共聚物载体溶液的溶剂为甲酰胺；
优选地，所述癌症干细胞抑制剂与pH响应性纳米共聚物载体的质量比为1:1-6:1，优选为5:1。
优选地，所述癌症干细胞抑制剂选自氟哌啶醇、氯丙嗪、三氟拉嗪和奋乃静，优选为氟哌啶醇；
优选地，所述加水方式为逐滴加水；
优选地，反应时间为1-3h，优选为2h，
优选地，所述水透析采用0.45mm3的水系膜进行透析得到尺寸均一的pH响应性纳米胶束。
使用pH响应性纳米共聚物载体包载癌症干细胞抑制剂，既能解决N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸疏水性强，无法载药的问题，又可以在酸性环境中质子化完成疏水到亲水的转换，实现精准靶点释放癌症干细胞抑制剂。
本发明第五方面，提供一种分级响应性纳米复合物，由pH响应性纳米胶束作为复合物的核心，由低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物作为复合物外壳。
优选地，所述分级响应性纳米复合物的核心pH响应性纳米胶束带正电，外壳低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物带负电；
优选地，所述低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物与pH响应性纳米胶束质量比为4:1-1:1，优选为2:1。
本发明第六方面，提供一种分级响应性纳米复合物的制备方法，低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物通过静电作用吸附于pH响应性纳米胶束表面，即为分级响应性纳米复合物。
在本发明一个或多个实施例中，低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物(LC)中，低分子肝素和二氢卟吩e6质量比为1:1-3:1，优选为2:1；
低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物制备方法为：将二氢卟吩e6、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于有机溶剂中，搅拌。加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和低分子肝素(LMWH)，反应一段时间后，透析，冻干得到LMWH-Ce6(LC)。
优选地，所述二氢卟吩e6、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为5-10:13-16:15-20，优选为8:15.6:17.4；
优选地，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜。
优选地，所述搅拌是在N2下搅拌，搅拌时间为3-6小时，优选为4小时；
优选地，所述4-二甲氨基吡啶DMAP和低分子肝素LMWH的质量比为12.217:100；
优选地，所述透析为采用N,N-二甲基甲酰胺和水进行透析反应；
优选地，低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物与pH响应性纳米胶束的质量比为4:1～1:1，优选为2:1；
优选地，pH响应性纳米胶束为氟哌啶醇@pH响应性纳米共聚物载体，即HP@PHis；
优选地，孵育温度为37℃，时间为10-50min，优选为20min；
优选地，离心参数为8000-15000rpm，3-10min，优选为10000rpm，5min。
本发明首次运用带负电的分子肝素和二氢卟吩e6共聚物(LC)通过静电吸附于两亲性纳米胶束HP@PHis表面，合成分级响应性纳米复合物HP@PHis/LC。该制剂不仅实现癌症干细胞的内在抑制和癌症干细胞的外在诱导，还有效实现上皮间质转化阻断和光动力杀伤效果，抑制肿瘤的生长、侵袭和转移。
本发明第七方面，提供一种纳米制剂，包括分级响应性纳米复合物。
在本发明一个或多个实施例中，所述纳米制剂为静脉制剂。
本发明第八方面，提供一种pH响应性纳米共聚物载体和/或pH响应性纳米胶束和/或分级响应性纳米复合物在制备抗肿瘤药物的应用。
优选地，抗肿瘤药物选自烷化剂、生物碱类、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类抗癌药物；
优选地，抗肿瘤药物还包括光疗药物，所述光疗药物选自吲哚菁绿、新吲哚菁绿、二氢卟吩e6、IR780碘化物。
本发明第八方面，提供一种氟哌啶醇在促进癌症干细胞分化为肿瘤细胞中的应用。
由于癌症干细胞的存在，导致肿瘤在各种治疗策略下无法完全根除。此外，肿瘤干细胞处于非平衡状态，自我更新能力强，分化能力弱，在驱动肿瘤发生侵袭、转移和耐药方面发挥着重要作用。癌症干细胞的危害性远远大于肿瘤细胞，因此通过将癌症干细胞分化为肿瘤细胞是非常有前景的策略来根除癌症干细胞，进而在光疗作用下完全消除肿瘤细胞。本发明发现氟哌啶醇能促进癌症干细胞分化为肿瘤细胞，进而降低癌症干细胞的危害，避免产生耐药性。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
pH响应性纳米胶束HP@PHis的合成
将2gN-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸(Boc-His(DNP)-OH)溶解在15mL四氢呋喃中，然后亚硫酰氯(1.6mL)逐滴加入。最后***沉淀和离心获得产物。为了进一步纯化产品，使用丙酮溶解产品并经过***沉淀获得纯化的产品N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐(Boc-His(DNP)-NCA)。将Boc-His(DNP)-NCA(1g，2.6mmol)溶解在20mL干燥二甲基甲酰胺中，并在N2环境下搅拌1h。将聚乙烯亚胺PEI(0.52mmol)加入混合物中，反应3天。之后，使用2-巯基乙醇(3mL)除去Boc。利用H2O进行透析，然后冻干收集产物(PHis)。接着将4mg PHis溶解在甲酰胺(1mL)中，在搅拌下将20mg HP的DMSO溶液加入到PHis混合物中。然后，将H2O逐滴滴加到反应中。2小时后，通过H2O透析获得产物HP@PHis。
图1为本发明实施例1的聚组氨酸的核磁图谱，通过核磁氢谱数据分析，证明成功制备纳米载体PHis。
实施例2
分级响应性纳米复合物HP@PHis/LC的制备
低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物(LC)的制备方法为：
将Ce6(0.08mmol，50mg)、EDC(0.156mmol)和NHS(0.174mmol)溶于干燥DMF(6mL)中，在N2下搅拌4小时。然后，向上述混合物中加入DMAP(0.1mmol)和LMWH(100mg)。48小时后，分别采用DMF和水进行透析反应。最后通过冻干得到LMWH-Ce6(LC)。
HP@PHis/LC NPs由pH响应性纳米胶束HP@PHis和低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物(LC)通过静电相互作用获得。将LC与HP@Phis按照质量比为2:1混合，并孵育20分钟。最后离心(10000rpm，5分钟)获得分级响应性纳米复合物HP@PHis/LC。
实施例3
分级响应性纳米复合物HP@PHis/LC抑制癌症干细胞增殖实验
癌症干细胞(2×103)在超低附着六孔板中孵育3天。之后，细胞接受PBS缓冲液，氟哌啶醇HP，HP@PHis/LC(pH 6.5)和HP@PHis/LC(pH 7.4)的处理。3天后，通过荧光倒置显微镜观察癌症干细胞的数量。
图2为HP@PHis/LC抑制癌症干细胞实验表征图，比较PBS缓冲液组和HP组，使用HP后，能明显降低癌症干细胞数量，说明癌症干细胞已分化为肿瘤细胞。由于肿瘤干细胞中处于非平衡状态，自我更新能力强，促进肿瘤的成长，而且肿瘤干细胞在肿瘤侵袭、转移和耐药方面发挥着重要作用，也就是说癌症干细胞比肿瘤细胞具有更强的危害性。利用HP促进癌症干细胞分化为肿瘤细胞的特点，可以降低癌症干细胞的危害，同时降低耐药性。
HP@PHis/LC NPs在肿瘤微环境能够响应性释放HP，进而作用于肿瘤干细胞，与只使用PBS缓冲液的癌症干细胞进行比较，HP@PHis/LC NPs能促进癌症干细胞分化为肿瘤细胞，降低癌症干细胞的数量。
癌症干细胞和PBS缓冲液共孵育时，癌症干细胞仍保持强的自我更新潜能。HP@PHis/LC(pH 6.5)和HP@PHis/LC(pH 7.4)组的差别，主要归因于在pH 6.5实现了胶束的解离，进而释放癌症干细胞精准靶向于癌症干细胞细胞表面多巴胺受体，促进癌症干细胞分化为肿瘤细胞。
HP@PHis/LC相较于HP的优点在于通过自组装策略合成纳米制剂，提高其在肿瘤组织的富集，同时在癌症干细胞消除的策略下，采用光动力治疗，一方面可以削弱肿瘤的成长和转移，一方面可以通过Ce6的荧光信号实现药物体内追踪。
实施例4
分级响应性纳米复合物HP@PHis/LC的体内抗肿瘤效果
本实施例体内抗肿瘤实验表明HP@PHis/LC具有强大的抑瘤效果。
将4T1细胞(1×106)注入小鼠的右腋窝。当肿瘤达到约100mm3时，每隔一天分别给予小鼠药物治疗生理盐水NS(0.2mL)，HP(7.5mg/kg)，二氢卟吩e6(Ce6)(2.5mg/kg)，低分子肝素LMWH和HP@PHis/LC NPs。6小时后，以0.1W/cm2的近红外光(660nm，10分钟)处理HP@PHis/LC NPs和游离的Ce6组的小鼠。在治疗过程中记录瘤体积的变化。7次治疗过后，处死老鼠，取出肿瘤，称重。
从图3和图4可以看出，由于HP@PHis/LC NPs的靶向治疗，提高了光敏剂Ce6在肿瘤部位的蓄积，产生活性氧杀伤癌细胞，还由于在肿瘤组织精准性释放癌症干细胞抑制剂HP，促进癌症干细胞分化为普通肿瘤细胞，解除了对光动力治疗的耐受性，肿瘤的体积、重量都有显著减少，所以HP@PHis/LC NPs制剂抑瘤效果明显优于Ce6。
实施例5
分级响应性纳米复合物HP@PHis/LC体内抑制上皮间质转化效果
将4T1细胞(1×106)注入小鼠的右腋窝。当肿瘤达到约100mm3时，每隔一天分别给予小鼠药物治疗生理盐水NS(0.2mL)，HP(7.5mg/kg)，二氢卟吩e6(Ce6)(2.5mg/kg)，低分子肝素LMWH和HP@PHis/LC NPs。6小时后，以0.1W/cm2的近红外光(660nm，10分钟)处理HP@PHis/LC NPs和游离的Ce6组的小鼠。
治疗小鼠15天后，收集所有组的肿瘤并进行消化用来检测上皮间质有关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达。
从图5可以看出，对于HP@PHis/LC NPs来讲，在LMWH的作用下，有效抑制了上皮间质转化过程，相较于对照组(NS)，明显增加了上皮细胞E-cadherin蛋白的表达，同时下调了***N-cadherin蛋白的表达。
本实施例分级响应性纳米复合物HP@PHis/LC的构建和应用，不仅解决了疏水性Ce6和HP的体内递送问题，还实现异靶点药物精准性释放、肿瘤干细胞的抑制、肿瘤的侵袭和转移减少。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (56)

1.一种分级响应性纳米复合物，其特征在于，由pH响应性纳米胶束作为复合物的核心，由低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物作为复合物外壳；
所述pH响应性纳米胶束，包括pH响应性纳米共聚物载体和癌症干细胞抑制剂；
所述pH响应性纳米共聚物载体的化学结构式如下：
Figure 958462DEST_PATH_IMAGE001
；
n值范围为1-16。
2.根据权利要求1所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述n值范围为4-16。
3.根据权利要求1所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述pH响应性纳米共聚物载体的制备方法包括以聚乙烯亚胺的氨基作为引发剂，聚合N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸生成pH响应性纳米共聚物载体，即聚组氨酸Phis。
4.根据权利要求3所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述聚乙烯亚胺为分支聚乙烯亚胺。
5.根据权利要求3所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，将N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸溶解在第一溶剂中，加入亚硫酰氯，沉淀、离心获得N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐，将N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐溶解在第二溶剂中，并在保护气氛下搅拌，加入聚乙烯亚胺进行反应，除杂、透析、冻干即得。
6.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述第一溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺，N,N二甲基乙酰胺。
7.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸与亚硫酰氯的摩尔比为0.5-2.5:8-15。
8.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸与亚硫酰氯的摩尔比为2-2.5:11。
9.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸与亚硫酰氯的摩尔比为2.37:11。
10.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述沉淀过程使用***沉淀。
11.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述离心后还包括纯化步骤，使用丙酮溶解粗产物N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐并经过***沉淀获得纯化的N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐。
12.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐与聚乙烯亚胺的摩尔比为4:1-6:1。
13.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述N-(叔丁氧羰基)-1-(2,4-二硝基苯基)-L-组氨酸羧酸酐盐酸盐与聚乙烯亚胺的摩尔比为5:1。
14.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述第二溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N二甲基甲酰胺，N,N二甲基乙酰胺。
15.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述搅拌为室温搅拌，搅拌时间为2-4天。
16.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述搅拌为室温搅拌，搅拌时间为3天。
17.根据权利要求5所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述除杂步骤为使用2-巯基乙醇除去2,4-二硝基苯。
18.根据权利要求1所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述癌症干细胞抑制剂选自氟哌啶醇、氯丙嗪、三氟拉嗪和奋乃静。
19.根据权利要求1所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述pH响应性纳米共聚物载体通过疏水作用包载癌症干细胞抑制剂合成pH响应性纳米胶束。
20.根据权利要求1所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述pH响应性纳米胶束的制备方法包括pH响应性纳米共聚物载体和癌症干细胞抑制剂通过透析法在水中自组装得到pH响应性纳米胶束。
21.根据权利要求20所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，将癌症干细胞抑制剂溶液和pH响应性纳米共聚物载体溶液混合搅拌，加水反应，利用水透析获得pH响应性纳米胶束。
22.根据权利要求20所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述癌症干细胞抑制剂溶液的溶剂为二甲基亚砜。
23.根据权利要求20所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述pH响应性纳米共聚物载体溶液的溶剂为甲酰胺。
24.根据权利要求20所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述癌症干细胞抑制剂与pH响应性纳米共聚物载体的质量比为1:1-6:1。
25.根据权利要求20所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述癌症干细胞抑制剂与pH响应性纳米共聚物载体的质量比为5:1。
26.根据权利要求21所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述加水方式为逐滴加水。
27.根据权利要求21所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，反应时间为1-3h。
28.根据权利要求1所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，反应时间为2h。
29.根据权利要求21所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述水透析采用0.45mm3的水系膜进行透析得到尺寸均一的pH响应性纳米胶束。
30.根据权利要求1所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述分级响应性纳米复合物的核心pH响应性纳米胶束带正电，外壳低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物带负电。
31.根据权利要求1所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物与pH响应性纳米胶束质量比为4:1-1:1。
32.根据权利要求1所述的分级响应性纳米复合物，其特征在于，所述低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物与pH响应性纳米胶束质量比为2:1。
33.权利要求1所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物通过静电作用吸附于pH响应性纳米胶束表面，即为分级响应性纳米复合物。
34.根据权利要求33所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，将低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物与pH响应性纳米胶束混合，孵育，离心获得分级响应性纳米复合物。
35.根据权利要求34所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物中，低分子肝素和二氢卟吩e6质量比为1:1-3:1。
36.根据权利要求34所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物中，低分子肝素和二氢卟吩e6质量比为2:1。
37.根据权利要求34所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物制备方法为：将二氢卟吩e6、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶于有机溶剂中，搅拌；加入4-二甲氨基吡啶DMAP和低分子肝素LMWH，反应一段时间后，透析，冻干得到低分子肝素和二氢卟吩e6共聚物。
38.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述二氢卟吩e6、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的摩尔比为5-10:13-16:15-20。
39.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述二氢卟吩e6、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的摩尔比为8:15.6:17.4。
40.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜。
41.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述搅拌是在N2下搅拌，搅拌时间为3-6小时。
42.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述搅拌是在N2下搅拌，搅拌时间为4小时。
43.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述4-二甲氨基吡啶DMAP和低分子肝素LMWH的质量比为12.217:100。
44.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述透析为采用N,N-二甲基甲酰胺和水进行透析反应。
45.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物与pH响应性纳米胶束的质量比为4:1~1:1。
46.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述低分子肝素和二氢卟吩e6的共聚物与pH响应性纳米胶束的质量比为2:1。
47.根据权利要求37所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述pH响应性纳米胶束为氟哌啶醇@pH响应性纳米共聚物载体，即HP@Phis。
48.根据权利要求34所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述孵育温度为37℃，时间为10-50min。
49.根据权利要求34所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，孵育温度为37℃，时间为20min。
50.根据权利要求34所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，离心参数为8000-15000 rpm，3-10min。
51.根据权利要求34所述的分级响应性纳米复合物的制备方法，其特征在于，离心参数为10000 rpm，5 min。
52.一种纳米制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的分级响应性纳米复合物。
53.根据权利要求52所述的纳米制剂，其特征在于，所述纳米制剂为静脉制剂。
54.权利要求1所述的分级响应性纳米复合物在制备抗肿瘤药物的应用。
55.根据权利要求54所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物选自烷化剂、生物碱类、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类抗癌药物。
56.根据权利要求54所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物还包括光疗药物，所述光疗药物选自吲哚菁绿、新吲哚菁绿、二氢卟吩e6、IR780碘化物。
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