CN112868675B - 一种臭氧水与木霉菌组合防治白菜根肿病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种臭氧水与木霉菌组合防治白菜根肿病的方法，包括（1）使用浓度为6~10mg/L的臭氧水浇灌土壤，每亩土壤浇灌70~100m³臭氧水；（2）待土壤含水量自然蒸发降至可机械整地时，施用哈茨木霉制剂作为基肥，每亩土壤所施用的哈茨木霉制剂中有效活菌数为(0.5~5)×10¹²CFU；（3）播种前使用深绿木霉制剂对白菜种子拌种，每150g白菜种子用5g深绿木霉制剂拌种，深绿木霉制剂的有效活菌数为(1~10)×10⁸CFU/g。本发明方法对白菜根肿病的防治效果可达到90%以上，且不影响土壤微生态环境。

Description

一种臭氧水与木霉菌组合防治白菜根肿病的方法

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种臭氧水与木霉菌组合防治白菜根肿病的方法。

背景技术

白菜根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的一种土传病害。该病危害白菜根部，严重时引起根部腐烂乃至全株枯死。受土壤酸化、气候变暖、栽培面积和复种指数增加等诸多因素影响，根肿病有逐年加重的趋势，每年约有320-400万公顷的大白菜等十字花科作物被芸薹根肿病菌侵染，平均损失达20%-30%，严重制约了白菜产业的可持续发展。

目前对白菜根肿病的控制主要采取喷施化学农药、撒施石灰改良土壤理化性质、选择适宜抗病品种等措施。部分化学药剂防效不稳且易造成环境污染，长期施用生石灰容易造成土壤板结和碱性化。寻求并建立白菜根肿病绿色防控技术规程，安全、高效防治根肿病对于白菜种植产业具有重要意义。

臭氧是一种具有强氧化性的气体，极易溶于水，可通过氧化作用破坏微生物膜的结构，臭氧的极强灭生性氧化作用，不仅抑制了病原菌的存活，对非靶标类土壤有益微生物和植物生长也会产生负面影响，限制了臭氧在农业病虫害方面的推广应用。

发明内容

针对臭氧的极强灭生性氧化作用容易影响非靶标类土壤有益微生物和植物生长的技术问题，本发明提供一种臭氧水与木霉组合防治白菜根肿病的方法，在白菜种植前，使用臭氧水灌溉土壤，然后施用哈茨木霉制剂作为基肥，播前使用深绿木霉制剂对白菜种子拌种，此方法对白菜根肿病的防治效果可达到90%以上，且不影响土壤微生态环境。

一种臭氧水与木霉组合防治白菜根肿病的方法，包括如下步骤：

（1）使用浓度为6~10mg/L的臭氧水浇灌土壤，每亩土壤浇灌70~100m³臭氧水；

（2）待土壤含水量自然蒸发降至可机械整地时，施用哈茨木霉制剂作为基肥，每亩土壤所施用的哈茨木霉制剂中有效活菌数为(0.5~5)×10¹²CFU；

（3）播种前使用深绿木霉制剂对白菜种子拌种，每150g白菜种子用5g深绿木霉制剂拌种，深绿木霉制剂的有效活菌数为(1~10)×10⁸CFU/g。

进一步的，步骤（1）中，根据土壤中芸薹根肿菌基数确定臭氧水浓度，土壤中芸薹根肿菌基数大于10⁶CFU/g时，选择臭氧水浓度为8~10mg/L；小于等于10⁶CFU/g时，选择臭氧水的浓度为6~8mg/L。

进一步的，步骤（1）中，土壤中芸薹根肿菌基数的确定方法为：提取土样DNA，利用芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)特异性引物PBF(5'-GAACGGGTTCACAGACTAGAT-3')和PBR(5'-GCCCACTGTGTTAATGATCC-3')进行qPCR扩增，计算土壤中芸薹根肿菌基数。

进一步的，步骤（1）中，为保证有效的臭氧浓度，臭氧水采用多点灌溉，如每10~15m设置一个灌溉点。

进一步的，步骤（2）中，哈茨木霉制剂为哈茨木霉TW21990制剂，哈茨木霉TW21990已于2016年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12864，分类命名为哈茨木霉Trichoderma harzianum。

进一步的，步骤（2）中，哈茨木霉制剂的制备方法为哈茨木霉通过发酵制备分生孢子，添加草炭土和/或麦饭石，制得有效活菌数为(1~10)×10⁸CFU/g的哈茨木霉制剂。

进一步的，步骤（2）还包括向土壤施用500~1000kg蘑菇渣和/或200kg生物有机肥。

进一步的，步骤（3）中，深绿木霉制剂为深绿木霉HB20111制剂，深绿木霉HB20111已于2018年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16963，分类命名为深绿木霉Trichoderma atroviride。

进一步的，步骤（3）中，深绿木霉制剂的制备方法为以麦饭石为载体，按质量百分比加入海藻酸钠1%、羧甲基纤维素钠2%、氯化钙0.2%和深绿木霉，制得有效活菌数为(1~10)×10⁸CFU/g的深绿木霉制剂。

本发明的有益效果在于，

本技术方案针对白菜根肿病发生严重土壤，利用臭氧水浇灌降低土壤中芸薹根肿病原菌基数，然后施入木霉菌剂，恢复健康土壤微生态环境，达到防治病害、促进白菜生长和改良土壤的多重功效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1由标准质粒建立的标准曲线图；

图2是实施例4对照处理组白菜根部照片；

图3是实施例4臭氧处理组白菜根部照片；

图4是实施例4不同处理组白菜根肿病发病率对比图；

图5是实施例4不同处理组白菜株高和干重对比图；

图6是实施例4不同处理组白菜根际土壤病原菌数量对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

下述实施例使用的哈茨木霉TW21990制剂为木霉通过发酵制备的分生孢子与麦饭石的混合物；深绿木霉HB20111制剂为麦饭石、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、氯化钙和木霉混合物，海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、氯化钙的质量百分比分别为1%、2%和0.2%。

实施例1 基于qPCR技术确定土壤中芸薹根肿菌基数

长方形地块用蛇形取样法，方形地块用五点交叉取样法。地块面积小于670m²时取3~5个点，大于670m²时取6~10个点，采样深度为耕作层土壤20cm左右。将所取土样集中起来混合均匀，用四分法将多余的土壤弃去，留取200g作为一个样品。每个地块重复取样，获得3个样品。

称取0.5g土壤样品，利用DNeasy Power Soil DNA Isolation Kit（Qiagen，Valencia，CA）试剂盒，按照说明书提取土壤DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。根据芸薹根肿菌ITS区保守序列，设计特异性引物PBF(5'-GAACGGGTTCACAGACTAGAT-3')和PBR(5'-GCCCACTGTGTTAATGATCC-3')，预期扩增片段大小为200bp。扩增的片段连接到T载体上，构建标准质粒。

根据SYBR Green premix DimerEraser（Takara，Japan）的操作说明书配制qPCR反应体系，20μL反应体系包括1×SYBR Premix Ex TaqTM 10μL，引物(0.2μmol/L)各0.4μL，土壤DNA 2μL，超纯水7.2μL。空白对照用水代替土壤DNA。

qPCR反应采用的仪器为iCycler iQ5(Bio-Rad，California，USA)，反应条件为95℃预变性3min；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸20s，共40个循环反应；循环结束后，样品加热到95℃，立刻降至60℃保持5s，然后每5s提高0.5℃递增到95℃，绘制熔解曲线，由标准质粒建立标准曲线（图1），根据标准曲线可计算出土壤中芸薹根肿菌的基数。

实施例2 不同浓度臭氧水对土壤中根肿菌的抑制作用

称取100g新鲜白菜根肿组织，加入100mL无菌水，低温组织匀浆作为根肿菌孢子悬浮液。量取悬浮液，分别以5%和15%的v/w比例与灭菌土混合制成低含量和高含量的病土，留样待测。试验用盆为深20cm、直径15cm的圆形花盆，每盆装土2kg，用浓度分别为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L的臭氧水浇灌，每盆浇臭氧水2L，对照浇等量无菌水，每个处理设3个重复。无菌培养室放置7天后，每盆混合取土样0.5g，利用DNeasy Power Soil DNAIsolation Kit（Qiagen，Valencia，CA）试剂盒，按照说明书提取土壤DNA，以PBF/PBR为引物进行qPCR反应，计算土壤中根肿菌的数量，结果如表1所示。

表1 不同浓度臭氧水处理后土壤中根肿菌的含量（×10⁵CFU/g）

不同土样	处理前	无菌水	2mg/L	4mg/L	6mg/L	8mg/L	10mg/L
								5%低含量病土	416.24	234.17	61.38	0.23	0.17	0.02	0.00
25%高含量病土	1386.36	1081.46	276.35	17.86	0.35	0.11	0.02

结果表明：臭氧水浇灌可显著抑制土壤中根肿菌的数量。浓度为4mg/L的臭氧水处理可将5%低含量病土中根肿菌的数量从4.16×10⁷CFU/g降至2.3×10⁴CFU/g，将25%高含量病土中根肿菌的数量从1.39×10⁸CFU/g降至1.79×10⁶CFU/g；浓度为8mg/L的臭氧水处理可将5%低含量病土中根肿菌的数量降至0.2×10⁴CFU/g，将25%高含量病土中根肿菌的数量降至1.1×10⁴CFU/g，浓度为10mg/L的臭氧水处理，两种土中基本检测不到根肿菌。

一般土壤中根肿病菌孢子量大于10⁴CFU/g时，可以引起根肿病发生。综合考虑，当土壤中芸薹根肿菌基数低于10⁶CFU/g时，臭氧水的浓度为6~8mg/L；高于10⁶CFU/g时，臭氧水的浓度在8~10mg/L。

实施例3 不同浓度臭氧水对白菜发芽及生长的影响

盆栽用土采集于山东省科学院生态研究所实验基地，为普通田园土，除去1~2cm表层土后，采集0~20cm土样，多点采样混匀后过50目筛。试验用盆为深20cm、直径15cm的圆形花盆，每盆装土2kg，分别用浓度为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L的臭氧水浇灌，每盆浇臭氧水2L，对照浇等量无菌水，各处理设3个重复，待土壤湿度合适时进行播种，常规管理，4周后调查白菜各生长指标，结果如表2所示。

表2 臭氧水处理对白菜幼苗的影响

处理	发芽率/%	平均株高/cm	单株干重/g	叶绿素含量/（mg/L）
					对照	96.41±2.35a	13.15±1.38a	0.57±0.03a	0.508±0.012a
2mg/L	94.05±1.64a	14.76±0.87a	0.65±0.18a	0.498±0.025a
					4mg/L	97.82±1.91a	13.67±0.63a	0.61±0.10a	0.514±0.023a
6mg/L	96.53±2.62a	10.06±0.56ab	0.55±0.07a	0.528±0.012a
					8mg/L	91.59±1.24a	9.34±0.81b	0.45±0.03b	0.537±0.084a
10mg/L	92.48±2.76a	8.97±0.38b	0.41±0.02b	0.551±0.116b

注：结果为三次重复的平均值±标准差，不同小写字母表示P>0.05水平差异。

结果表明，臭氧水处理土壤后直接播种，浓度小于4mg/L的臭氧水处理组白菜的发芽率、株高及单株干重和叶绿素含量与对照没有显著差异；但8mg/L的臭氧水处理组对白菜发芽率和幼苗生长产生显著影响，使植株矮小，株高和单株干重与其他处理间差异显著。原因是臭氧的极强灭生性氧化作用，破坏了土壤的微生态环境，从而影响植物的生长，需要在臭氧处理后添加木霉等有益微生物来重建健康土壤微生态环境。

实施例4 臭氧水与木霉组合对白菜根肿病的防治作用

选取白菜根肿病发病严重的地块，除去1~2cm表层土后，采集0~20cm土样，多点采样混匀后过50目筛。

试验设4个处理，分别为对照（CK）、臭氧处理（O）、木霉制剂（T）、臭氧+木霉制剂（OT），每个处理设4个重复。试验用盆为深20cm、直径15cm的圆形花盆，每盆装土2kg。然后直接用臭氧浇灌臭氧处理组和臭氧+木霉制剂组，调节臭氧水浓度为8mg/L，每盆浇臭氧水2L，对照浇等量自来水。待土壤含水量适宜种植操作后，木霉制剂组和臭氧+木霉制剂组每盆加入1.5g有效活菌数为3×10⁷CFU/g的哈茨木霉TW21990制剂，与表层10cm土混匀。取30g白菜种子用1g活菌数为3×10⁸CFU/g的深绿木霉HB20111固体菌剂拌种，每盆播种15粒。依据土壤干湿情况每间隔3~4d浇一次水，温室中培养5周后，调查白菜株高、干重、根肿病发病情况，并以PBF/PBR为引物对白菜根际土壤DNA进行qPCR反应，检测根际土壤中病原菌的数量，具体检测方法同实施例1。

如图2~5所示，对照处理组白菜根部膨大变形，毛细根减少，根肿病发病率为78.17%；而臭氧水浇灌处理组，白菜根系健康，根肿病发病率仅为2.5%，臭氧水与木霉制剂联合处理发病率为6.25%；木霉处理能有效缓解臭氧水消毒土壤后对植株的影响，其株高和干重都与对照无显著差异。

利用根肿病原菌的特异性引物qPCR扩增结果见图6，与对照相比，臭氧水浇灌的两个处理组O和OT均可显著降低根际土壤中病原菌的拷贝数。说明臭氧水浇灌能够降低土壤中根肿菌的数量，从而也可减轻下一茬白菜的发病程度。

实施例5 臭氧水与木霉组合对白菜根肿病的田间防治作用

田间试验在山东省青岛市胶州里岔镇高福庄村白菜种植基地进行，品种为“义和秋”。试验地为白菜连作地块，根肿病发生严重。试验用菌剂为哈茨木霉TW21990制剂和深绿木霉HB20111制剂，二者的有效活菌数均为3×10⁸CFU/g。

田间试验设4个处理，分别为处理1：哈茨木霉TW21990制剂5公斤/亩+蘑菇渣800公斤/亩；处理2：6mg/L臭氧水100m³/亩浇灌+哈茨木霉TW21990制剂5公斤/亩+蘑菇渣800公斤/亩；处理3：常规处理+蘑菇渣800公斤/亩；处理4：常规处理（农民习惯种植）。各处理均机械翻耕20cm，播种前，处理1和处理2用深绿木霉HB20111制剂拌种，具体操作为每150g白菜种子用5g深绿木霉HB20111制剂拌种。11月15日收获时进行病害调查和测产，结果如表3所示。

表3 不同处理对白菜生长和根肿病的大田防治效果

处理	病情指数	防治效果/%	单株重量/kg	平均亩产/kg	增产/%
						1	38.67	53.59	3.92	7056	28.52
2	8.21	90.15	4.37	7866	43.28
						3	56.84	31.79	3.67	6606	20.33
4	83.33	—	3.05	5490	—

结果表明，4个处理中臭氧水与木霉菌联合处理组效果最好，与常规处理相比根肿病防治效果达到87.52%，亩增产达到43.28%。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东省科学院生态研究所（山东省科学院中日友好生物技术研究中心）

<120> 一种臭氧水与木霉菌组合防治白菜根肿病的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gaacgggttc acagactaga t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcccactgtg ttaatgatcc 20

Claims (7)

1.一种臭氧水与木霉组合防治白菜根肿病的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)使用浓度为6～10mg/L的臭氧水浇灌土壤，每亩土壤浇灌70～100m³臭氧水；

(2)待土壤含水量自然蒸发降至可机械整地时，施用哈茨木霉制剂作为基肥，每亩土壤所施用的哈茨木霉制剂中有效活菌数为(0.5～5)×10¹²CFU；

哈茨木霉制剂为哈茨木霉TW21990制剂，哈茨木霉TW21990已于2016年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12864，分类命名为哈茨木霉Trichoderma harzianum；

(3)播种前使用深绿木霉制剂对白菜种子拌种，每150g白菜种子用5g深绿木霉制剂拌种，深绿木霉制剂的有效活菌数为(1～10)×10⁸CFU/g；

深绿木霉制剂为深绿木霉HB20111制剂，深绿木霉HB20111已于2018年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16963，分类命名为深绿木霉Trichoderma atroviride。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，根据土壤中芸薹根肿菌基数确定臭氧水浓度，土壤中芸薹根肿菌基数大于10⁶CFU/g时，选择臭氧水浓度为8～10mg/L；土壤中芸薹根肿菌基数小于等于10⁶CFU/g时，选择臭氧水的浓度为6～8mg/L。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，土壤中芸薹根肿菌基数的确定方法为：

提取土样DNA，利用芸薹根肿菌特异性引物PBF和PBR进行qPCR扩增，计算土壤中芸薹根肿菌基数，其中PBF序列为5'-GAACGGGTTCACAGACTAGAT-3'，PBR序列为5'-GCCCACTGTGTTAATGATCC-3'。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，臭氧水采用多点灌溉。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，哈茨木霉制剂的制备方法为哈茨木霉通过发酵制备分生孢子，添加草炭土和/或麦饭石，制得有效活菌数为(1～10)×10⁸CFU/g的哈茨木霉制剂。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)还包括向土壤施用500～1000kg蘑菇渣和/或200kg生物有机肥。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，深绿木霉制剂的制备方法为以麦饭石为载体，按质量百分比加入海藻酸钠1％、羧甲基纤维素钠2％、氯化钙0.2％和深绿木霉，制得有效活菌数为(1～10)×10⁸CFU/g的深绿木霉制剂。

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