CN112852906B - 一种利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精的方法，属于生物改性淀粉领域。本发明采用来源于Rhodothermus obamensi STB05的淀粉分支酶和来源于Geobacillus thermoglucosidans STB02的淀粉分支酶对淀粉进行协同改性，通过两种淀粉分支酶依次作用于颗粒态淀粉和糊化淀粉，充分利用两种淀粉分支酶各自的催化特点，达到协同增效的目的。不仅能够增强反应效率，显著提升产物的慢消化性能，而且能够处理较高浓度的淀粉乳，提高生产强度，为生物改性制备慢消化麦芽糊精提供新的思路和手段。

Description

一种利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精的方法
技术领域
本发明涉及一种利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精的方法，属于生物改性淀粉领域。
背景技术
淀粉是人类膳食的重要组成，也是人体能量的主要来源，淀粉的“质”和“量”直接影响着人体餐后血糖的稳态。大多数天然淀粉被认为可引起血糖的快速上升，且与肥胖、II型糖尿病等代谢综合征的发生和发展有很大关系。随着人们健康意识的提高，降低淀粉消化性能，开发可维持饱腹感、持续释放能量、避免血糖剧烈波动、并且适合普通人群日常食用的淀粉衍生产品，顺应了当今食品发展的趋势，作为食品原料具有极大市场应用前景。
在食品加工过程中，天然淀粉经过加热、煎煮、高温灭菌等处理后，淀粉的颗粒结构遭到破坏，其消化性能主要由分子结构决定。目前研究主要利用物理、化学或生物手段，改造淀粉的分子结构，从而降低淀粉的消化性能，使之匹配消费者对健康的需求。其中，酶法具有反应效率高、反应条件温和等特点，适合大规模工业化生产，应用较为广泛。淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme,GBE,EC 2.4.1.18)是生物酶法改性淀粉的一种重要用酶，可催化淀粉分子中α-1,4-糖苷键的断裂，产生具有非还原性末端的短链，并将所得短链通过α-1,6-糖苷键连接于受体链上，进而有效修饰淀粉结构，使其结构高度分支化，并降低消化性能。这个过程不引入其他化学基团，也不产生其他类型的糖苷键，仅发生淀粉分子内部α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的重组装，因此得率和产物安全性高。此外，在淀粉分支酶对淀粉的改性过程中，淀粉分子发生轻微降解，相对分子质量有所降低，介于淀粉和寡糖之间，因此，产物被称为慢消化麦芽糊精。
已有的报道多采用单一种类的淀粉分支酶对淀粉进行改性，产物慢消化麦芽糊精的慢消化性能仍有较大的改善空间，并存在改性时间较长、底物浓度较低等问题，导致生产强度较低。
在公开号为CN108949861B的专利文本中，公开了一种制备慢消化麦芽糊精的方法，制备过程如下：采用来源于Rhodothermus obamensi的淀粉分支酶Ro-GBE和来源于Geobacillus thermoglucosidans的淀粉分支酶Gt-GBE对淀粉进行协同改性，当反应底物为颗粒淀粉时，第一阶段Ro-GBE处理时间必须在2h以上，导致反应周期较长，难以满足绿色低碳、节能降耗的产业发展需求。
并且，发明人课题组在针对该申请文件中记载的慢消化淀粉含量的体外评价方法进行研究时，发现其测定结果与在哺乳动物体内实际的餐后血糖应答水平存在较大差异，体外测定的快消化淀粉含量偏低，慢消化和抗性淀粉含量偏高。
因此，为更好实现慢消化麦芽糊精的工业化生产，提高其生产强度，亟需探索一种高效制备慢消化麦芽糊精的工艺，及建立一种科学评价该慢消化组分含量的方法。
发明内容
技术问题
本发明为了得到一种高效制备慢消化麦芽糊精的工艺，以及采用该工艺制备得到一种慢消化麦芽糊精，并且建立一种科学评价该慢消化组分含量的方法。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供一种利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将淀粉颗粒分散于水中得到淀粉乳，向淀粉乳中加入淀粉分支酶Ro-GBE进行恒温反应，得到产物1；
(2)将产物1通过程序升温至95℃，并在95℃条件下反应20～40min，进行灭酶并使淀粉充分糊化，得到产物2；程序升温是指以0.5～2℃/min的速度进行升温；
(3)将产物2降温后，添加淀粉分支酶Gt-GBE进行反应，反应结束后，升温灭酶得到反应液；
(4)将步骤(3)得到的反应液干燥，即得到慢消化麦芽糊精。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶Ro-GBE来源于Rhodothermusobamensi，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述淀粉分支酶Gt-GBE来源于Geobacillusthermoglucosidans，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中恒温反应的反应温度为60～65℃；步骤(2)中的升温，是指从60～65℃升温至95℃。
在本发明的一种实施方式中，所述Ro-GBE添加量为10～40U/g干基淀粉，所述Gt-GBE添加量为20～50U/g干基淀粉。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，恒温反应时间为0～2h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，将产物2的温度降至45～55℃后，添加淀粉分支酶Gt-GBE进行反应6～24h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中淀粉乳的浓度为5％～30％(w/w)，pH为6.0～7.5。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中，在将反应液干燥之前还包括以下步骤：过滤，脱色和离子交换；
所述过滤为，将步骤(3)得到的反应液冷却后，经过滤，除去蛋白质与杂质，得到澄清溶液；
所述脱色为，调节过滤得到的澄清溶液的pH，加入活性炭搅拌脱色，得到脱色溶液；
所述离子交换为，采用离子交换树脂，去除脱色溶液中的金属盐及色素。
在本发明的一种实施方式中，所述过滤的方法为板框过滤或膜过滤。
在本发明的一种实施方式中，所述离子交换树脂为强酸性阳离子-弱碱性阳离子-强酸性阳离子交换树脂；离子交换的反应温度为40-50℃。
在本发明的一种实施方式中，脱色时，调节澄清溶液的pH为4.0-5.0，活性炭添加量为1％，在80-90℃下保温15-30min进行脱色。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述干燥方法为冷冻干燥、滚筒干燥或喷雾干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉为普通玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米淀粉和小麦淀粉等中的一种或多种。
本发明还提供了利用上述方法得到的慢消化麦芽糊精。
本发明还提供了上述慢消化麦芽糊精在益生产品、保健食品、代餐产品方面的应用。
本发明还提供了一种样品体外消化性能评价的方法，所述评价方法具体如下：
1、溶液的配制
胃蛋白酶溶液的配制：将50mg胃蛋白酶和50mg瓜尔胶与10mL HCl(0.05M)溶液充分混匀，现配现用，冰浴保存。
混酶液的配制：将3g猪胰淀粉酶(活力8×USP，产品编号P7545,Sigma)与20mL水充分混匀旋涡振荡5min，并在3500×g、4℃下冷冻离心10min。取上清液15mL，与1.1mL糖化酶(产品编号A-7095，Sigma)充分混合制得混酶液，现配现用，冰浴保存。
2、具体评价方法如下：
(1)取0.1g(干基)待测样品分散于2.5mL 0.25M(pH 5.2)醋酸钠缓冲液中，沸水浴糊化30min后，加入15颗玻璃珠，并于37℃ 160r/min水浴摇床中预热10min；
(2)向步骤(1)得到充分糊化的产物中加入1.67mL胃蛋白酶溶液，振荡反应30min，模拟胃消化过程。胃消化结束后，加入2.5mL醋酸钠缓冲液(pH 5.2)，继续振荡反应30min，并加入0.83mL混酶液，模拟小肠消化过程。模拟小肠消化20min、120min时，分别于吸取200μL消化液于5mL 66.6％(v/v)的乙醇中终止反应，混合物于3500×g室温离心5min后，准确吸取0.05mL上清液用于葡萄糖激酶法测定葡萄糖含量。
具体计算公式如下：
快消化组分比例(％)＝G20×0.9×100
慢消化组分比例(％)＝(G120-G20)×0.9×100
抗性组分比例(％)＝100-快消化组分比例-慢消化组分比例
其中：G20—样品消化20min后产生的葡萄糖含量；
G120—样品消化120min后产生的葡萄糖含量。
有益效果
1.本发明利用生物酶法改性淀粉制备慢消化麦芽糊精，原料易得，工艺简单，操作方便，产物得率高。利用淀粉分支酶改性淀粉，不引入其他化学基团，也不产生其他类型的糖苷键，仅发生淀粉分子内部α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的重组装，因此产物安全性高。
2.本发明提供了一种基于程序升温的慢消化麦芽糊精制备方法，酶促反应和淀粉溶胀同步进行，大大缩短了制备工艺所需时间，将第一阶段Ro-GBE的反应时间缩短至2h以下；并且通过对温度的理性设计与精准调控策略，有效保障不同批次产物品质的一致性，具有较强的品质稳定性。
3.本发明充分利用两种淀粉分支酶各自的催化特点，达到协同增效的目的，增强反应效率，能够显著提升产物的慢消化性能。制备得到了一种慢消化组分比例为18.7％的慢消化麦芽糊精，其中抗性组分比例为18.6％，快消化组分比例降至62.7％，相比于天然淀粉，快消化组分比例降低了32.7％，慢消化和抗性组分比例分别增加了2.5倍和11.4倍。
4.本发明提供了一种对慢消化麦芽糊精体外消化性能的评价方法，采用改进后的方法分析的结果更接近样品在哺乳动物体内实际的血糖应答水平。
5.慢消化麦芽糊精本发明利用两种淀粉分支酶依次作用于颗粒态淀粉和糊化淀粉，能处理较高浓度的淀粉乳，提高了生产强度，并降低生产所需的水耗和干燥所需的能耗，为生物改性制备慢消化麦芽糊精提供了一种绿色低碳、节能降耗、环境友好的新思路和手段。
附图说明
图1：不同样品灌胃后对ICR小鼠餐后血糖的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实例对本发明实施方式进行详细描述。但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：体外消化性能评价方法
具体步骤如下：
1、溶液的配制
胃蛋白酶溶液的配制：将50mg胃蛋白酶、50mg瓜尔胶、10mL HCl(0.05M)溶液充分混匀，现配现用，冰浴保存。
混酶液的配制：将3g猪胰淀粉酶(活力8×USP，产品编号P7545，Sigma)与20mL水充分混匀旋涡振荡5min，并在3500×g、4℃下冷冻离心10min。取上清液15mL，与1.1mL糖化酶(产品编号A-7095，Sigma)充分混合制得混酶液，现配现用，冰浴保存。
2、改进前的体外消化过程：
取0.6g(干基)待测样品分散于5.0mL 0.25M(pH 5.2)醋酸钠缓冲液中，沸水浴糊化30min后，并于37℃ 160r/min水浴摇床中预热10min。随后，加入10.0mL胃蛋白酶溶液，振荡反应30min，模拟胃消化过程。胃消化结束后，加入30颗玻璃珠和5.0mL醋酸钠缓冲液(pH5.2)，继续振荡反应30min，并加入5.0mL混酶液，模拟小肠消化过程。模拟小肠消化0min、20min、120min时，分别于吸取125μL消化液于5mL 66.6％乙醇中终止反应，混合物于3500×g室温离心5min后，准确吸取0.05mL上清液用于葡萄糖激酶法测定葡萄糖含量。
具体计算公式如下：
RDS(％)＝(G20-G0)×0.9×100
SDS(％)＝(G120-G20)×0.9×100
RS(％)＝100-RDS-SDS
其中：RDS—快消化淀粉含量
SDS—慢消化淀粉含量
RS—抗性淀粉含量
G0—样品中游离的葡萄糖含量；
G20—样品消化20min后产生的葡萄糖含量；
G120—样品消化120min后产生的葡萄糖含量。
3、改进后的体外消化过程：
取0.1g(干基)待测样品分散于2.5mL 0.25M(pH 5.2)醋酸钠缓冲液中，沸水浴糊化30min后，加入15颗玻璃珠，并于37℃ 160r/min水浴摇床中预热10min。随后，加入1.67mL胃蛋白酶溶液，振荡反应30min，模拟胃消化过程。胃消化结束后，加入2.5mL醋酸钠缓冲液(pH 5.2)，继续振荡反应30min，并加入0.83mL混酶液，模拟小肠消化过程。模拟小肠消化20min、120min时，分别于吸取200μL消化液于5mL 66.6％乙醇中终止反应，混合物于3500×g室温离心5min后，准确吸取0.05mL上清液用于葡萄糖激酶法测定葡萄糖含量。
具体计算公式如下：
快消化组分比例(％)＝G20×0.9×100
慢消化组分比例(％)＝(G120-G20)×0.9×100
抗性组分比例(％)＝100-快消化组分比例-慢消化组分比例
其中：G20—样品消化20min后产生的葡萄糖含量；
G120—样品消化120min后产生的葡萄糖含量。
分别采用改进前后的两种方法分析玉米淀粉及其经两种淀粉分支酶协同改性产物的体外消化性能，结果如表1和表2所示。
由于改进前的方法采用的淀粉溶液浓度较大(12％)，在加热糊化过程中黏度急剧上升，且在降温至37℃后，容易形成凝胶块，无法充分混匀，不利于胰淀粉酶和糖化酶与底物的充分接触，因此测得的玉米淀粉和淀粉分支酶改性产物的RDS含量均较低，分别为78.0％和39.5％。改进后的方法采用了较低的底物浓度(4％)，其在糊化之后黏度较低，降温至37℃后可以充分混匀。此外，由于样品中游离的葡萄糖，在实际的消化过程中，能够直接被小肠吸收至血液，因此，在评价消化性能时，将其算入样品的快消化组分含量。
采用改进后的方法测得的玉米淀粉和淀粉分支酶改性产物的快消化组分含量分别为93.2％和62.7％，均较改进前方法测得的RDS值更高。此外，采用ICR小鼠分析玉米淀粉和淀粉分支酶改性产物在体内引起血糖应答的水平，结果如附图1所示，玉米淀粉引起的峰值血糖为16.5mmol/L，是等量葡萄糖的92.7％，淀粉分支酶改性产物引起的峰值血糖为10.7mmol/L，是等量葡萄糖的60.1％。因此改进后的方法测得的两种样品的体外消化性能更接近两种样品在小鼠体内血糖应答的水平。
以上结果说明，采用改进后的体外消化性评价方法分析的结果更接近样品在哺乳动物体内实际的血糖应答水平。因此，对本发明的实施例，均采用改进后的方法评价产物的体外消化性能。
表1采用改进前的方法分析的体外消化性能结果
Figure BDA0002895146860000061
表2采用改进后的方法分析的体外消化性能结果
Figure BDA0002895146860000062
/>
实施例2：慢消化麦芽糊精的制备
具体步骤如下：
(1)将玉米淀粉分散于水中得到10％(w/w，以干基计的淀粉乳，65℃下搅拌预热15min，并调节pH至7.0，向淀粉乳中加入30U/g的Ro-GBE，于65℃恒温反应1h；
(2)将步骤(1)得到的反应产物通过程序升温进行灭酶，所述程序升温为，以1℃/min的速度升温至95℃，并在95℃下继续加热30min，灭酶终止反应并使淀粉充分糊化；
(3)将步骤(2)得到的产物降温至50℃，并加入25U/g的Gt-GBE，在50℃条件下反应10h，采用沸水浴加热30min终止反应；
(4)过滤：反应液冷却后，经板框压滤机过滤，除去蛋白质与杂质，得到澄清溶液。
(5)脱色：调节步骤(4)得到的澄清溶液的pH为4.5，85℃下按照质量比加入1％的活性炭，并搅拌脱色30min，得到脱色液。
(6)离子脱色：在45℃下，采用的离子交换树脂结构为强酸性阳离子-弱碱性阳离子-强酸性阳离子交换树脂除去步骤(5)得到的脱色液中的金属盐及色素，得到含有慢消化麦芽糊精的溶液。
(7)将步骤(6)得到的含有慢消化麦芽糊精的溶液进行喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为170℃，出风温度为85℃，物料流速为18mL/min，得到慢消化麦芽糊精1。
采用改进后的方法分析上述慢消化麦芽糊精1及未处理的玉米淀粉的体外消化性能，结果如表3所示。结果表明，利用两种淀粉分支酶对玉米淀粉进行协同改性后，所得产物的体外消化性能大幅降低，其中快消化组分比例为74.5％，慢消化组分比例提升至13.5％，抗性组分比例提升至12.0％；相比于玉米淀粉，快消化组分比例降低了20.0％，慢消化和抗性组分比例分别增加了1.5倍和7倍。并且第一阶段所需的反应时间大幅缩短，Ro-GBE仅需反应1h。
表3两种淀粉分支酶协同改性的效果
Figure BDA0002895146860000071
以上结果说明本发明的方法能够充分利用两种淀粉分支酶各自的催化特点，达到协同增效的目的，增强反应效率，缩短反应时间，显著提升产物的慢消化性能，在制备慢消化麦芽糊精时具有明显优势。
实施例3：升温方式对慢消化麦芽糊精制备的影响
具体步骤如下：
(1)将玉米淀粉分散于水中得到10％(w/w，以干基计)的淀粉乳，65℃下搅拌预热15min，并调节pH至7.0，向淀粉乳中加入25U/g的Ro-GBE，得到混合物；
(2)将步骤(1)得到的混合物通过a、b、c三种升温方式进行反应，并维持30min，灭酶终止反应并使淀粉充分糊化；
a、自65℃，1℃/min的速度升温至95℃(程序升温)；
b、自65℃，自由升温至95℃(自由升温)；
c、自65℃，直接沸水浴(100℃)加热(沸水浴加热)；
(3)将步骤(2)得到的产物降温至50℃，并加入25U/g的Gt-GBE，在50℃条件下反应10h，采用沸水浴加热30min终止反应，得到反应液；
(4)过滤：将步骤(3)得到的反应液冷却后，经板框压滤机过滤，得到澄清溶液。
(5)脱色：调节步骤(4)得到的澄清溶液的pH为4.5，在85℃下按照质量比加入1％的活性炭，并搅拌脱色30min，得到脱色液。
(6)离子脱色：在45℃下，采用的离子交换树脂结构为强酸性阳离子-弱碱性阳离子-强酸性阳离子交换树脂除去脱色液中的金属盐及色素，得到含有慢消化麦芽糊精的溶液。
(7)将步骤(6)得到的含有慢消化麦芽糊精的溶液进行喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为170℃，出风温度为85℃，物料流速为18mL/min，得到改性后的玉米淀粉，即分别得到慢消化麦芽糊精a，慢消化麦芽糊精b，慢消化麦芽糊精c。
按照上述步骤，分别在不同的恒温水浴锅中，重复制备3次改性产物。采用改进后的方法分析上述慢消化麦芽糊精a(程序升温)，慢消化麦芽糊精b(自由升温)，慢消化麦芽糊精c(沸水浴加热)及玉米淀粉的体外消化性能，结果如表4所示。
表4升温方式对协同改性效果的影响
Figure BDA0002895146860000081
Figure BDA0002895146860000091
由于Ro-GBE的热稳定性较强，在Ro-GBE改性结束、升温灭酶的过程中，Ro-GBE不会立即失活，仍会继续作用于淀粉分子。因此，即使加入Ro-GBE后立即(即65℃恒温反应0h)升温，所得产物的体外消化性能仍有较大的改善作用。
升温方式对协同改性效果和产物品质的稳定性具有很大影响。其中，采用自由升温或者沸水浴加热方式制备的改性样品效果较差，快消化组分比例较高，且更换不同的恒温水浴锅重复制备的产物品质不一。
本发明采用程序升温的方式，能够稳定控制Ro-GBE失活的时间节点，有效保障不同批次产物品质的一致性，同时实现了更好的改性效果，所得产物的体外消化性能较其他升温方式更低，快消化组分比例降至70.1％～70.9％，慢消化组分比例提升至17.9％～18.6％，抗性组分比例提升至11.1％～11.3％。
实施例4：淀粉乳浓度对协同改性效果的影响
具体实施方式同实施例2，区别在于，将步骤(1)具体调整为，将玉米淀粉分散于水中分别得到质量分数为5％、10％、15％、20％、25％、30％(w/w，以干基计)的淀粉乳，65℃下搅拌预热15min，并调节pH至7.0，向淀粉乳中加入30U/g的Ro-GBE，于65℃恒温反应1h，分别得到不同的慢消化麦芽糊精。
采用改进后的方法分析上述改性产物的体外消化性能，结果如表5所示，其中慢消化麦芽糊精5％、慢消化麦芽糊精10％、慢消化麦芽糊精15％、慢消化麦芽糊精20％、慢消化麦芽糊精25％、慢消化麦芽糊精30％分别代表采用质量分数为5％、10％、15％、20％、25％、30％(w/w，以干基计)的淀粉乳制备得到的慢消化麦芽糊精。
表5淀粉乳浓度对协同改性效果的影响
Figure BDA0002895146860000092
结果表明，利用两种淀粉分支对玉米淀粉进行协同改性，能处理较高浓度的淀粉乳(15％～30％)。其中，当淀粉乳浓度为20％(w/w，以干基计)时，所得产物的体外消化性能进一步降低，快消化组分比例降至70.8％，慢消化组分比例提升至16.1％，抗性组分比例提升至13.1％。相比于玉米淀粉，快消化组分比例降低了24.0％，慢消化和抗性组分比例分别增加了2倍和7.7倍；相比于实施例2，淀粉乳初始浓度提升2倍，所得产物的快消化组分比例降低了5.0％。
以上结果说明本发明的方法能够处理较高浓度的淀粉乳，提高生产强度，降低生产所需的水耗和干燥所需的能耗，同时进一步显著提升产物的慢消化性能，在制备慢消化麦芽糊精时具有明显优势。
实施例5：Ro-GBE处理时间对协同改性效果的影响
具体实施方式同实施例2，区别在于，将步骤(1)具体调整为：将玉米淀粉分散于水中得到20％(w/w，以干基计)的淀粉乳，65℃下搅拌预热15min，并调节pH至7.0，向淀粉乳中加入30U/g的Ro-GBE，于65℃恒温分别反应0、0.5、1、2h，分别得到不同的慢消化麦芽糊精；
采用改进后的方法分析上述改性产物的体外消化性能，结果如表6所示；其中慢消化麦芽糊精0h、慢消化麦芽糊精0.5h、慢消化麦芽糊精1h、慢消化麦芽糊精2h分别代表向淀粉乳中加入30U/g的Ro-GBE，于65℃恒温分别反应0、0.5、1、2h得到的慢消化麦芽糊精。
表6 Ro-GBE处理时间对协同改性效果的影响
Figure BDA0002895146860000101
结果表明，随着Ro-GBE处理时间的延长，所得产物的体外消化性能先降低后增加。因此，在利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精时，Ro-GBE处理时间不宜过长。
在Ro-GBE处理时间降至0.5h时，所得产物的体外消化性能进一步降低，快消化组分比例降至69.2％，慢消化组分比例提升至18.8％，抗性组分比例为12.0％。相比于玉米淀粉，快消化组分比例降低了25.8％，慢消化和抗性组分比例分别增加了2.5倍和7倍；相比于实施例2和实施例4，总制备时长缩短0.5h，所得产物的快消化组分比例分别降低了8.3％和2.2％。
实施例6：Ro-GBE添加量对协同改性效果的影响
具体实施方式同实施例2，区别在于，将步骤(1)具体调整为：将玉米淀粉分散于水中得到20％(w/w，以干基计)的淀粉乳，65℃下搅拌预热15min，并调节pH至7.0，向淀粉乳中分别加入10、20、25、30、40U/g的Ro-GBE，于65℃恒温反应0.5h，分别得到不同的慢消化麦芽糊精；
采用改进后的方法分析上述改性产物的体外消化性能，结果如表7所示，其中，慢消化麦芽糊精10U/g、慢消化麦芽糊精20U/g、慢消化麦芽糊精25U/g、慢消化麦芽糊精30U/g、慢消化麦芽糊精40U/g分别代表向淀粉乳中分别加入10、20、25、30、40U/g的Ro-GBE得到的慢消化麦芽糊精。
表7 Ro-GBE添加量对协同改性效果的影响
Figure BDA0002895146860000111
结果表明，随着Ro-GBE添加量的增多，所得产物的体外消化性能先降低后增加。因此，在利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精时，Ro-GBE添加量不宜过大。
在Ro-GBE添加量为25U/g时，所得产物的体外消化性能进一步降低，快消化组分比例降至66.6％，慢消化和抗性组分比例分别为18.2％和15.2％。相比于玉米淀粉，快消化组分比例降低了28.5％，慢消化和抗性组分比例分别增加了2.4倍和9.1倍；相比于实施例2和实施例4～5的最佳反应条件下，Ro-GBE加酶量减少5U/g淀粉，所得产物的快消化组分比例分别降低了10.6％、5.9％和3.8％。
实施例7：Gt-GBE处理时间对协同改性效果的影响
具体步骤如下：
(1)将玉米淀粉分散于水中得到20％(w/w，以干基计)的淀粉乳，65℃下搅拌预热15min，并调节pH至7.0，向淀粉乳中加入25U/g的Ro-GBE，于65℃恒温反应0.5h；
(2)将步骤(1)得到的反应产物通过程序升温进行灭酶，所述程序升温为，以1℃/min的速度升温至95℃，并继续加热30min，灭酶终止反应并使淀粉充分糊化；
(3)将步骤(2)得到的产物降温至50℃，并加入25U/g的Gt-GBE，在50℃条件下反应6、8、10、12、16、20、24h，采用沸水浴加热30min终止反应，得到反应液；
(4)过滤：将步骤(3)得到的反应液冷却后，经板框压滤机过滤，除去蛋白质与杂质，得到澄清溶液。
(5)脱色：调节步骤(4)得到的澄清溶液的pH为4.5，85℃下按照质量比加入1％的活性炭，并搅拌脱色30min，得到脱色液。
(6)离子脱色：在45℃下，采用的离子交换树脂结构为强酸性阳离子-弱碱性阳离子-强酸性阳离子交换树脂除去步骤(5)得到的脱色液中的金属盐及色素，得到含有慢消化麦芽糊精的溶液。
(7)将步骤(6)得到的含有慢消化麦芽糊精的溶液进行喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为170℃，出风温度为85℃，物料流速为18mL/min，得到改性后的玉米淀粉，即为慢消化麦芽糊精，分别得到不同的慢消化麦芽糊精。
采用改进后的方法分析上述改性产物的体外消化性能，结果如表8所示，其中，慢消化麦芽糊精6h、慢消化麦芽糊精8h、慢消化麦芽糊精10h、慢消化麦芽糊精12h、慢消化麦芽糊精16h、慢消化麦芽糊精20h、慢消化麦芽糊精24h分别代表加入Gt-GBE，在50℃条件下反应6、8、10、12、16、20、24h得到的慢消化麦芽糊精。
表8 Gt-GBE处理时间对协同改性效果的影响
Figure BDA0002895146860000121
结果表明，随着Gt-GBE处理时间的延长，所得产物的体外消化性能进一步降低。因此，在利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精时，Gt-GBE处理时间不宜过短。
在Gt-GBE处理时间达到20h时，所得产物的体外消化性能进一步降低，快消化组分比例降至62.7％，慢消化组分比例提升至18.7％，抗性组分比例为18.6％。相比于玉米淀粉，快消化组分比例降低了32.7％，慢消化和抗性组分比例分别增加了2.5倍和11.4倍；相比于实施例2和实施例4～6的最佳反应条件下，所得产物的快消化组分比例分别降低了15.8％、11.4％、9.4％和2.9％。
实施例8：干燥方式对慢消化麦芽糊精品质的影响
具体实施方式同实施例7，区别在于，将步骤(7)具体调整为：将步骤(6)得到的产物分别通过冷冻干燥、滚筒干燥、喷雾干燥，分别得到改性后的玉米淀粉，即分别通过冷冻干燥、滚筒干燥、喷雾干燥得到不同的慢消化麦芽糊精；
分析各干燥方式制备慢消化麦芽糊精的得率，并采用改进后的方法分析其体外消化性能，结果如表9所示，其中，慢消化麦芽糊精(冷冻干燥)、慢消化麦芽糊精(滚筒干燥)、慢消化麦芽糊精(喷雾干燥)分别代表通过冷冻干燥、滚筒干燥、喷雾干燥得到的慢消化麦芽糊精。
结果表明，三种干燥方式制备的慢消化麦芽糊精体外消化性能接近，干燥方式不影响产物品质；冷冻干燥制备的产品得率略高，滚筒干燥制备的产品得率略低。
表9干燥方式对慢消化麦芽糊精品质的影响
Figure BDA0002895146860000131
对比例1：
具体实施方式同实施例2，区别在于，调整步骤(2)为，将步骤(1)得到的反应产物在65℃恒温反应2、3、5、10、15h，沸水浴终止反应；分别得到不同的慢消化麦芽糊精。
采用改进后的方法分析上述改性产物的体外消化性能，结果如表10所示，其中，产物2h、产物3h、产物5h、产物10h、产物15h分别代表在65℃恒温反应2h、3h、5h、10h、15h得到的慢消化麦芽糊精。
表10两种淀粉分支酶协同改性的效果
Figure BDA0002895146860000132
结果表明，随着第一阶段Ro-GBE恒温时间的延长，所得产物的体外消化性能进一步降低。
因此，说明采用延长第一阶段Ro-GBE恒温时间并加以直接沸水浴的改性方法，无法达到与采用程序升温方式改性得到样品的消化性能，进一步突出了程序升温方式的独特的优势。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精的方法
<130> BAA201157A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1860
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agctggctca cggaagaaga catccggcgc tgggaaagcg gtacgttcta cgacagttac 60
cgaaagctgg gcgcccatcc cgacgacgaa ggcacctggt tctgcgtctg ggcgccgcat 120
gccgatggcg tctcggtgct cggagcgttc aacgactgga atccggaggc caacccgctg 180
gagcgctacg gcggcggcct gtgggccggt tacgtaccgg gagcgcgccc gggccacacc 240
tacaagtatc gcatccggca cggcttctat caggccgaca agacggatcc ctacgccttc 300
gccatggagc cgcctaccgg cagtcccatc gaagggctgg cctccatcat cacgcggctc 360
gactacacct ggcacgacga cgaatggatg cggcgccgga agggtccggc cagcctttac 420
gagccggttt ccatctacga ggtacatctg ggctcctggc gtcacaaacg gcccggcgag 480
tccttctctt accgggagat tgccgagccg ctggccgact acgtgcagga gatgggcttc 540
acgcacgtgg agctgctgcc cgtcatggaa catccctact acggctcctg gggctatcag 600
gtggtgggct actacgcccc aacgtttcgc tacggatcac cccaggacct gatgtacctg 660
atcgactacc tgcaccagcg cggcatcggc gtcatcctcg actgggtccc gagccacttt 720
gcggccgatc cccagggact ggttttcttc gacgggacca cactcttcga atacgacgat 780
cccaagatgc gctatcaccc tgactggggt acgtatgtgt tcgattacaa caagccgggc 840
gtacgcaact ttctgatttc caacgcactt ttctggctcg aaaagtacca cgtcgacggg 900
ctgcgcgtcg atgcggtggc ttctatgctc taccgggact actcacgcaa ggagtggaca 960
cccaacatct tcggcggccg tgaaaacctg gaggccattg atttcatcaa gaaattcaac 1020
gaaacggtct acctgcactt ccccgaggcc atgacgatcg ccgaggagtc gacggcctgg 1080
cccggcgtgt cggcccccac ctacaacaac ggtctgggct tcctctacaa gtggaacatg 1140
ggctggatgc acgacacgct ggactacatc cagcgcgatc ccatctaccg caagtatcac 1200
cacgacgagc tgaccttctc gctctggtac gccttttcgg agcactacgt cctgccgctc 1260
tcgcacgacg aggtggtgca cggcaagggc tcgctctggg gtaaaatgcc cggcgacgac 1320
tggcagaagg cagccaactt gcgcctgctc tttggccaca tgtggggcca tccgggcaaa 1380
aaactgctct tcatgggcgg cgagttcggc cagcaccacg agtggaacca cgacacgcag 1440
ctcgaatggc acctgctgga ccagccctac catcgaggta ttcagctgtg ggtgtgcgat 1500
ctgaaccacc tctaccgtac gaatccggcc ctctggcacg acggaccgga agggttcgag 1560
tggatcgact tcagcgaccg cgaccagagc gtgatctgtt acctgcgcaa gaatgccggc 1620
cgcatgctgc tgttcgtgct gaactttacg cccgtgccac gcgagcacta ccgcgtgggc 1680
gtgccgatcg gtggcccctg gcacgaggtg ctcaacagcg acgcggtggc ctacggcggg 1740
agcgggatgg gcaacttcgg ccgcgtcgag gcggtgcccg agtcctggca cggccgcccc 1800
ttccacttag agctgacgct tcccccgctg gccgccctca tcctggagcc ggagcacggg 1860
<210> 2
<211> 1926
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcgttgtcc ctccgaccga tctggaaatt tatttatttc acgaaggcag cttatataaa 60
agttatgaat tgtttggcgc gcatgtgata aaacaaaacg acgttgtcgg aacccggttt 120
tgcgtatggg ctccgcatgc gcggcaagtg cggttagtcg gcagttttaa tgactggaac 180
ggaactaatt ttaatcttgt aaaagtaagt aatcaaggtg tatggacgat ttttattccg 240
gaaaacttgg aagggcattt atataaatac gaaattacca ctagcgatgg aaatgtcgtg 300
ttaaaagcag atccatacgc gtttcactcc gaattgcgcc cccgtactgc ctccatcgtc 360
tacgacataa aaggttatca atggaatgac caaacatggc gacggaagaa acagcgaaag 420
cgaatatatg accagccttt gttcatttat gagcttcact tcggttcgtg gaaaaagaaa 480
gaaaacggca atttttatac atatcgggag atggcagatg agttacttcc atacgtgatg 540
gaacatggtt ttacccacat tgaattgctt ccgctcgttg aacatccgct tgaccgctcc 600
tggggatatc aaggaacagg ttattattca gcaacaagcc gctacgggac gccgcatgat 660
ttgatgcatt ttattgatcg cttccatcaa gcgggcattg gcgtcatttt cgattgggtt 720
cccggccact tttgcaaaga tgaacatgga ttatacatgt ttgatggagc accgacatac 780
gaatatgaca acatacaaga tcgggaaaat ggcgaatggg gcacggcgaa ttttgatctt 840
ggcaagccgg aagtccgcag ctttttgatt tccaatgcgt tgttttggat ggaatatttc 900
cacgtcgacg gatttcgggt ggatgcggtg gccaatatgc tgtattggcc aaatagagag 960
gcagcacagc aaaacccgca tgctgttcag tttttgcaaa aattaaatga gaccgtattt 1020
gcgcatgacc cgggcatatt gatgattgcc gaagattcga cggaatggcc gctcgtcact 1080
gctccaacgt atgccggagg gctggggttt aactataaat ggaacatggg gtggatgaac 1140
gatattttaa catatatgga aacggcgccg gagaagcgaa aacatgtgca caataaagta 1200
accttttccc ttttgtacgc gtattcggaa aattttattt tacctttttc ccacgatgag 1260
gtcgtgcatg gaaaaaaatc gctgctaaat aaaatgccgg ggacgtatga ggaaaagttt 1320
gcacaattaa ggctgctgta tgggtatttg ctaacacatc ccggcaagaa actattgttt 1380
atgggcggcg aatttgccca gtttgatgag tggaaggatg cagagcagct ggattggatg 1440
ctttttgatt tcgagatgca ccagaaaatg aatatgtacg tgaaagcatt attgaaatgt 1500
tataagcgct gcaaatcttt gtatgagcta gaccattctc cagacgggtt tgagtggatt 1560
gatgttcata acgctgaaca aagtattttc tcatttgtcc gcagaggaaa aaaagaaaac 1620
gatttgcttg ttgtcgtgtg caattttacc agtaaagtgt atcacgatta taaagttggc 1680
gttccgctat ttgccaaata ccgggaaatc atcagcagcg atgcggccaa attcgggggg 1740
tggggcaatg tcaatgcaaa gccggttgcg gcgagcaaag aaccgtttca tggaaagccg 1800
tatcatattc gcatgacggt tccgccgttt ggcatttcca ttttaagacc agtgaaaaaa 1860
cggggggaga gaagcgttga tggcaaagaa aaagtgcatc gccatgttat tggcgggagg 1920
gcaagg 1926

Claims (9)

1.一种利用两种淀粉分支酶协同制备慢消化麦芽糊精的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将淀粉颗粒分散于水中得到淀粉乳，65℃ 条件下搅拌预热15 min，向淀粉乳中加入淀粉分支酶Ro-GBE，得到产物1；所述淀粉分支酶Ro-GBE来源于Rhodothermus obamensi，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）将产物1通过程序升温，自65℃ ，采用1℃ /min的速度升温至95℃ ，并在95℃ 条件下反应20~40 min，进行灭酶并使淀粉充分糊化，得到产物2；
（3）将产物2降温后，添加淀粉分支酶Gt-GBE进行反应，反应结束后，升温灭酶得到反应液；所述淀粉分支酶Gt-GBE来源于Geobacillus thermoglucosidans，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
（4）将步骤（3）得到的反应液干燥，即得到慢消化麦芽糊精。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述Ro-GBE添加量为10~40 U/g干基淀粉；步骤（3）中，所述Gt-GBE添加量为20~50 U/g干基淀粉。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，淀粉乳的浓度为5%~30%，pH为6.0~7.5。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，在将反应液干燥之前还包括以下步骤：过滤，脱色和离子交换；
所述过滤为，将步骤（3）得到的反应液冷却后，经过滤，除去蛋白质与杂质，得到澄清溶液；
所述脱色为，调节过滤得到的澄清溶液的pH，加入活性炭搅拌脱色，得到脱色溶液；
所述离子交换为，采用离子交换树脂，去除脱色溶液中的金属盐及色素。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述过滤的方法为板框过滤或膜过滤；所述离子交换树脂为强酸性阳离子-弱碱性阳离子-强酸性阳离子交换树脂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述干燥方法为冷冻干燥、滚筒干燥或喷雾干燥。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，将产物2的温度降至45~55℃后，添加淀粉分支酶Gt-GBE进行反应6~24 h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述淀粉为普通玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米淀粉和小麦淀粉中的一种或多种。
9.权利要求1~8任一所述的方法在益生产品、保健食品或代餐产品中的应用。
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