CN112852752A - 新型金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物领域，具体涉及新型金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物和应用，提供了4株金黄葡萄球菌噬菌体，即短尾噬菌体BP‑13，保藏编号CCTCC NO：M 2015142；金黄色葡萄球菌BP‑13A，保藏编号CCTCC M2016535；短尾噬菌体BP‑14，保藏编号CCTCC NO：M 2015143；短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP‑39，保藏编号CCTCC NO：M 2015144。本发明的4株噬菌体为严格的烈性噬菌体、可有效杀灭MRSA、MSSA、BORSA等各型金黄色葡萄球菌、具有较宽的宿主范围，但对正常微生物菌群无毒害作用、且其DNA无法编码毒力基因。因此可以用于预防或治疗由金黄色葡萄球菌引起的人畜细菌感染，为开发新型抗菌制剂提供了优良的菌种资源，具有良好的应用开发前景。而本发明鸡尾酒混合物其宿主范围及抑菌效率又进一步大幅度提高。

Description

新型金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物和应用

本申请是申请号为CN201710048705.4，申请日为2017年01月22日，发明名称为“新型金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物和应用″的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及新的金黄色葡萄球菌噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的***共患病原菌，广泛存在于自然界中，其侵染面广适应性强，可引起伤口感染、心内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合征等多种疾病，造成的死亡率自11％至48％不等。甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)可被青霉素及甲氧西林杀灭，但如今美国过半的金黄色葡萄球菌对青霉素、甲氧西林、四环素和红霉素具有耐药性，其中耐甲氧西林金葡菌(MRSA)是医院中最普遍的病原菌，可耐受除新型先锋霉素外所有的β-内酰胺抗生素。此外，在20世纪90年代末出现了中等水平(4-8μg/mL)耐药性金葡菌，学名边缘型抗苯甲异噁唑青霉素葡萄球菌(BORSA)。临床研究表明近年来由于耐药性金葡菌感染而导致的无法医治率迅速增加，造成每年大量患者死亡，对于金葡菌感染的治疗已经越来越困难，人类急需能够有效抑制金葡菌感染的新型治疗药物。

噬菌体是一种通过与细菌细胞表面特异位点结合后杀灭特异性细菌的病毒，在地球上广泛存在。自20世纪30年代巴斯德实验室(巴黎)提出将噬菌体疗法用于治疗细菌感染以来，越来越多的研究证明了噬菌体具有较高的抗菌活性和专一性，可防治耐药性细菌并防止损伤微生物群落。与抗生素治疗相比，其副作用极低且更加快速有效，不会抑制机体的自然免疫或引起***反应，同时对人类或其他哺乳动物不具有侵染性及毒性。

然而，噬菌体在杀菌过程中也有其不利的因素。首先，噬菌体宿主特异性强，治疗的宿主谱相对较窄，单一的噬菌体往往极难满足临床治疗的需要，另外，相关研究表明，单一的噬菌体长时间与细菌接触，细菌可通过如吸附抑制、流产感染和溶原状态的建立等多种途径抵抗噬菌体的侵袭(HarperDR，et al.Bacteriophage therapy：practicabilityand clinical need meet in the multidrug-resistance era.Future Microbiol，2012，7(7)：797-799.)。由多种噬菌体组成的鸡尾酒制剂不仅可大幅度扩展噬菌体的宿主范围，而且可以降低细菌对噬菌体产生的耐药性。

目前，大部分金黄色葡萄球菌噬菌体文献仅限于对单一噬菌体杀菌能力的研究(Wang，Z.F.，et al.，SLPW：A Virulent Bacteriophage Targeting Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus In vitro and In vivo.Frontiers inMicrobiology，2016.7：p.10.；Jia，H.Y.，et a1.，Characterization and completegenome sequence analysis of Staphylococcus aureus bacteriophage JS01.VirusGenes，2015.50(2)：p.345-348.江南大学，一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用，申请号CN201110380587)，而对于由几种噬菌体组成的鸡尾酒混合物的特性研究却鲜有报道。

发明内容

针对以上技术现状，本发明提供了可裂解金黄色葡萄球菌的新型金黄色葡萄球菌噬菌体以及它们的组合物，本发明噬菌体具有较强的裂解金黄色葡萄球菌MRSA的能力。本发明所述金黄色葡萄球菌噬菌体为：

短尾噬菌体BP-13(Podoviridae sp.BP-13)、保藏编号为CCTCC NO：M 2015142，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年03月23日；

金黄色葡萄球菌BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)、保藏编号为CCTCC M 2016535，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年9月28日；

短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)、保藏编号为CCTCC NO：M 2015143，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年03月23日；或

短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39(Podoviridae picovirinae AhjdlikevirusBP-39)、保藏编号为CCTCC NO：M 2015144保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年03月23日。

本发明中，作为实施方案之一，所述短科噬菌体BP-13(Podoviridae sp.BP-13)具有等轴衣壳以及可收缩性短尾组成的形态结构，且在pH5～pH9、在4℃～37℃条件下具有耐性，且MOI＝0.01条件下培养6h，其效价可达到2.1×10¹⁰pfu/mL；

本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌BP-13A(Staphylococcusaureus phage BP-13A)具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，且在pH5～pH9、在4℃～37℃条件下具有耐性，在MOI＝0.1条件下培养6h，其效价为6.8×10⁸pfu/mL；

本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)具有等轴衣壳以及可收缩性短尾组成的形态结构，且在pH5～pH11、在4℃～37℃条件下具有耐性，且MOI＝0.001条件下培养6h，其效价可达到5×10¹¹pfu/mL；

本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39(Podoviridae picovirinae Ahjdlikevirus BP-39)具有等轴衣壳以及可收缩性短尾组成的形态结构，在pH3～pH9、在4℃～37℃条件下具有耐性、MOI＝0.01条件下培养6h，其效价为2.0×10⁹pfu/mL。

本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体BP-13(Podoviridae sp.BP-13)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌BP-13A(Staphylococcusaureus phage BP-13A)具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39(Podoviridae picovirinae Ahjdlikevirus BP-39)具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

短尾噬菌体BP-13的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌J1为宿主菌，于37℃下过夜培养，BP-13可形成平均直径为2～3mm的噬菌斑；在电子显微镜下观察BP-13噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为150nm，尾部长约为10nm(图1-A)。BP-13噬菌体全基因组序列大小为18178bp，为双链线状DNA。通过对其基因组序列Blast比对发现，BP-13属于短尾噬菌体科(Podoviridae)，基因组序列分析表明，BP-13噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。

金黄色葡萄球菌BP-13A的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌J1为宿主菌，于37℃下过夜培养，BP-13A可形成平均直径为2～3mm的噬菌斑；在电子显微镜下观察BP-13A噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为10nm(图1-B)。BP-13A噬菌体全基因组序列大小为136563bp，为双链线状DNA。通过对其基因组序列Blast比对发现，BP-13A属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)。基因组序列分析表明，BP-13A噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。

短尾噬菌体BP-14的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌J1为宿主菌，于37℃下过夜培养，BP-14可形成平均直径为2～3mm的噬菌斑；在电子显微镜下观察BP-14噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为150nm，尾部长约为10nm(图1-C)。BP-14噬菌体全基因组序列大小为18137bp，为双链线状DNA。通过对其基因组序列Blast比对发现，BP-14属于短尾噬菌体科(Podoviridae)，且与NCBI上已知噬菌体基因组的基因组序列并无完全相同者，这表明所述噬菌体是新种噬菌体；基因组序列分析表明，BP-14噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。

短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌J1为宿主菌，于37℃下过夜培养，BP-39可形成平均直径为2～3mm的噬菌斑；在电子显微镜下观察BP-39噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为20nm，尾部长约为20nm(图1-D)。BP-39噬菌体全基因组序列大小为17641bp，为双链线状DNA。通过对其基因组序列Blast比对发现，BP-39属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。基因组序列分析表明，BP-39噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。

本发明还进一步提供了金黄色葡萄球菌噬菌体的组合物，作为实施方案之一，所述组合物含有短尾噬菌体BP-13(Podoviridae sp.BP-13)、金黄色葡萄球菌BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)、短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)和短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39(Podoviridae picovirinae Ahjdlikevirus BP-39)中的三种或四种组合。

作为实施方案之一，本发明所述三种或四种的组合物，可以是上述噬菌体中的短尾噬菌体BP-13(Podoviridae sp.BP-13)、金黄色葡萄球菌BP-13A(Staphylococcusaureus phage BP 13-A)、短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)和短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39中任意三种的组合或是全部四种的组合，作为示例性的说明，如BP-13、BP-13A和BP-14的组合，BP-13、BP-13A和BP-39的组合，BP-13、BP-14和BP-39的组合，BP-13A、BP-14和BP-39的组合以及BP-13、BP-13A、BP-14和BP-39的组合。

本发明组合物中各噬菌体的量可以由本领域技术人员根据本发明公开内容及具体适用环境和本领域常识进行确定，作为实施方案之一，以单位体积中所含有各噬菌体的效价比计、所述BP-13、BP-13A和BP-14的比例为1∶1∶1，所述BP-13、BP-13A和BP-39的比例为1∶1∶1，所述BP-13、BP-14和BP-39的比例为1∶1∶1，所述BP-13A、BP-14和BP-39的比例为1∶1∶1，所述BP-13、BP-13A、BP-14和BP-39的比例为1∶1∶1∶1。

作为实施方案之一，本发明还提供一种含有上述噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒。本领域技术人员可以根据本发明公开内容和本领域常识来制备本发明含有上述噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒。

本发明提供一种上述的噬菌体、噬菌体组合物或含有噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒在抗人源金黄色葡萄球菌(MRSA，MSSA，BORSA)或动物源金黄色葡萄球菌的应用。

作为实施方案之一，在无论使用单一噬菌体或三种或四种噬菌体组合物进行细菌裂解时，所述噬菌体总有效工作效价为≥1×10⁷pfu/mL。

作为实施方案之一，本发明还提供一种上述噬菌体、噬菌体组合物或含有噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒用于制备治疗由金黄色葡萄球菌引发人类烫伤感染或是奶牛***炎等人畜疾病。

本发明中所述噬菌体BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39，是从加拿大蒙特利尔污水处理厂中分离出的。

作为实施方案之一，所述方法包括：

将采集于加拿大蒙特利尔污水处理厂的噬菌体BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39的来源样品，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用滤膜过滤上清液。

噬菌体的分离：分别取上述过滤后上清液，加入TSB培养基中，同时加入噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养、然后取上述培养物离心、滤膜过滤上清液，备用。取噬菌体宿主菌对数期菌液加入、半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养16h，形成噬菌体点滴斑。

噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至SM缓冲液中震荡，进行梯度稀释，取稀释液分别加入对数期宿主菌，混合均匀静置后，加入半固体TSB培养基，立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置待其凝固，置于37℃温箱培养，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至SM缓冲液中，按照上述方式纯化多次，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有对数期宿主菌菌液的TSB培养基中，37℃条件下摇培。取培养物离心、滤膜过滤上清液，即为得到的纯化噬菌体溶液。

实验证明：本发明所述的金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39所组成的噬菌体组合物对135株人源金黄色葡萄球菌的裂解率可达97％，对44株牛源金黄色葡萄球菌的裂解率可达100％。

与现有技术相比，本发明所述的噬菌体BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39具有的优势包括：为严格的烈性噬菌体并可有效杀灭包括金黄色葡萄球菌；在较低浓度下对宿主菌依然具有较好的裂解能力；对正常微生物菌群无毒害作用；其DNA无法编码毒力基因；特别是，本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明的4株噬菌体BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39可治疗或预防由金黄色葡萄球菌引起的细菌感染，为开发新型抗菌制剂提供了优良的菌种资源，具有良好的应用开发前景。

附图说明

图1：实施1中所得的4株噬菌体透射电子显微镜下的形态特征。

短尾噬菌体BP-13(Podoviridae sp.BP-13)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日、保藏编号CCTCC NO：M 2015142；

金黄色葡萄球菌BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年9月28日、保藏编号CCTCC M2016535；

短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日、保藏编号CCTCC NO：M 2015143；

短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39(Podoviridae picovirinae AhjdlikevirusBP-39)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日、保藏编号CCTCC NO：M 2015144。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何方式限制本发明的有效范围。

以下实例中，

TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL；

TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；

TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水1000mL；

SM液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L TrisHCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水1000mL。

实施例1：噬菌体的分离制备及纯化培养

本发明中短尾噬菌体BP-13，金黄色葡萄球菌BP-13A，短尾噬菌体BP-14以及短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39的来源样品采集于加拿大蒙特利尔污水处理厂，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22μm滤膜过滤上清。

噬菌体的分离：取10mL过滤后上清液，加入10mL 2倍TSB培养基中，同时加入1mL噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养16h后取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，备用。取0.5mL噬菌体宿主菌对数期菌液，加入5mL，40℃半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10μl，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养16h，形成噬菌体点滴斑。

噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mL SM缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀释，取10²，10⁴和10⁶稀释液分别加入对数期宿主菌0.5mL，混合均匀静置15min后，加入5mL，40℃半固体TSB培养基，立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养16h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mL SM缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1mL对数期宿主菌菌液的50mL TSB培养基中，37℃条件下180rpm摇培16h。取培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化噬菌体溶液，分别得到短尾噬菌体BP-13(Podoviridae sp.BP-13)、保藏编号为CCTCC NO：M 2015142，金黄色葡萄球菌BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)、保藏编号为CCTCC No：M2016535，短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)、保藏编号为CCTCC NO：M 2015143，或短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39(Podoviridae picovirinae Ahjdlikevirus BP-39)、保藏编号为CCTCC NO：M 2015144。

实施例2：噬菌体的电镜观察

分别取实施例1制得的各噬菌体培养物上清作电镜观察：取20μL样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸(PTA)于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察：结果如图1所示，BP-13噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为150nm，尾部长约为10nm(图1-A)；BP-13A噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为10nm，尾部的末端具有六条短棘(图1-B)；BP-14噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为150nm，尾部长约为10nm(图1-C)；BP-39噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为20nm，尾部长约为20nm(图1-D)。

实施例3：噬菌体基因组的提取与测序

分别取实施例1制得的各噬菌体100mL，加入终浓度1μg/mL的DNaseI，RNaseA，37℃条件孵育60min后加入5.84g Nacl(终浓度1mol/L)，溶解后置于冰浴中1h。4℃条件下，11000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管中。加入固体PEG8000(终浓度10％，即100mL加入10g)，完全溶解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀。加入等体积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。再次加入DNase I、RNase A至终浓度1μg/mL，37℃反应30～60min。加入EDTA至终浓度20mmol/L(即1mL SM液加入40μL0.5mol/L EDTA)，同时每1mLSM液中加入10μL10％SDS。从加入蛋白酶步骤开始，使用DP315-R TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂盒(Tiangen)试剂盒提取。凝胶电泳验证DNA后用Eppendorf BioPhotometer Plus测定其浓度和纯度。产物送至军事医学科学院测序得：

短尾噬菌体BP-13(Podoviridae sp.BP-13)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

金黄色葡萄球菌BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)具有SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列；

短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39(Podoviridae picovirinae AhjdlikevirusBP-39)具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

实施例4：噬菌体的毒力基因或不良基因缺失检测试验

本专利选取44种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表1)，通过测定噬菌体BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本发明4株供试噬菌体均不含有下列毒力基因。

表1病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因

实施例5：噬菌体MOI及效价的测定

挑取金黄色葡萄球菌J1单个菌落，接种到盛有3mL TSB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1∶100比例转接到10mL TSB培养液，37℃160rprn振荡培养至对数前期。按照感染复数分别为10、1、0.01和0.0001的比例分别加入噬菌体4种噬菌体纯培养液和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中160rpm振荡培养6h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清，按如下方法测定噬菌体效价：用SM液做稀释液，将噬菌体BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39原液(由实施例1制得)分别10倍梯度稀释至10⁷倍。分别取10⁵、10⁶及10⁷稀释度的噬菌体培养液100μL与其宿主菌多重耐药性金黄色葡萄球菌菌液300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4mL冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表2所示。

结果表明，培养6h条件下，噬菌体BP-13效价达到最高(2.1×10¹⁰pfu/mL)时，其MOI＝0.01；噬菌体BP-13A效价达到最高(6.8×10⁸pfu/mL)时，其MOI＝0.1；噬菌体BP-14效价于6h内达到最高(5×10¹¹pfu/mL)，其MOI＝0.001；噬菌体BP-39效价达到最高(2.0×10⁹pfu/mL)时，其MOI＝0.01。

表2 4株噬菌体MOI值

实施例6制备噬菌体鸡尾酒组合物

将实施例5富集得到的噬菌体溶液分装至50ml离心管中，每管40ml；加入固体PEG8000(终浓度10％，即40ml加入4g)，完全溶解后，冰浴至少3h；将噬菌体4℃，12000rpm离心20min；弃去上清液，使用等体积的SM缓冲液充分溶解沉淀；将噬菌体SM洗脱液使用0.22μm滤膜，过滤除菌。检测效价后，根据表3中的要求分别将噬菌体进行稀释混合。最终获得的鸡尾酒混合液总效价均为1.2×10⁷pfu/mL，各噬菌体的单位体积有效工作效价相等。

表3不同的噬菌体组合物及比例

实施例7：噬菌体及噬菌体鸡尾酒组合物pH和温度稳定性的测定

7-1：不同pH条件下噬菌体的稳定性

将效价为1.2×10⁷pfu/mL BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39等4种单一噬菌体，以及总效价为1.2×10⁷pfu/mL的噬菌体鸡尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-14，BP-13+BP-13A+BP-39，BP-13+BP-14+BP-39，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39(由实施例6制得)分别置于pH＝3，5，7，9，11的SM溶液中，4℃培养24h后，再检测其效价。

结果如表4所示，在pH＝5～pH＝9之间，4株噬菌体的效价均无显著变化，表明其在中性，微酸和微碱条件下有较好的稳定性。

在pH＝3条件下，4株噬菌体仅有BP-39仍具有3次方左右的效价，但是相比中性条件也下降了4个数量级，表明噬菌体BP-39与其余噬菌体相比具有一定的抗酸能力；

在pH＝11条件下，4株噬菌体仅有BP-14仍具有4次方左右的效价，但是相比中性条件也下降了3个数量级，表明噬菌体BP-14与其余噬菌体相比具有一定的抗碱能力。

由BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39等4种单一噬菌体中的任意3种或是全部4种组成的鸡尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-14，BP-13+BP-13A+BP-39，BP-13+BP-14+BP-39，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39在pH＝5～pH＝9之间，效价均无显著变化，表明上述4种鸡尾酒混合物在中性，微酸和微碱条件下有较好的稳定性。

含有BP-39的鸡尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-39，BP-13+BP-14+BP-39，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39在pH＝3的条件下仍有3次方左右的效价，

而含有BP-14的鸡尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-14，BP-13+BP-14+BP-3，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39在pH＝11条件下仍有4次方左右的效价。表明，BP-39和BP-14可以有效扩展噬菌体鸡尾酒混合物的pH适应范围。

表4 4株单一噬菌体及其鸡尾酒混合物在不同pH条件下的稳定性

7-2：不同温度条件下噬菌体的稳定性

将效价为1.2×10⁷pfu/mL BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39等4种单一噬菌体，以及总效价为1.2×10⁷pfu/mL的噬菌体鸡尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-14，BP-13+BP-13A+BP-39，BP-13+BP-14+BP-39，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39(由实施例6制得)分别置于4℃，25℃以及37℃条件下，检测其效价。

结果表明(参见表5～7)，在4℃条件下，BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39等4种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-14，BP-13+BP-13A+BP-39，BP-13+BP-14+BP-39，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39都具有较好的稳定性，存放3个月后，效价并无明显下降，存放12个月后，效价均大约仅仅下降一个数量级；在25℃条件下，BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39等4种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-14，BP-13+BP-13A+BP-39，BP-13+BP-14+BP-39，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39在一周之内效价无明显下降，4周后，效价均大约仅仅下降1个数量级；在37℃条件下，BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39等4种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-14，BP-13+BP-13A+BP-39，BP-13+BP-14+BP-39，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39在24小时内效价没有明显下降，72小时后，效价均大约仅仅下降1个数量级。由此表明，由上述4种噬菌体组成的鸡尾酒混合物在不同温度条件下都具有较好的稳定性。

表5 4株噬菌体及其鸡尾酒混合物在4℃条件下的稳定性

表6 4株噬菌体及其鸡尾酒混合物在25℃条件下的稳定性

表7 4株噬菌体及其鸡尾酒混合物在37℃条件下的稳定性

实施例8人源耐药性金黄色葡萄球菌裂解范围试验

采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取临床分离所得的31株甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)、97株耐甲氧西林金葡菌(MRSA)及5株边缘型抗苯甲异噁唑青霉素金葡菌(BORSA)的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。

结果如表8所示，BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达67.66％，78.51％，63.99％和64.66％。

其噬菌体玛尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-14，BP-13+BP-13A+BP-39，BP-13+BP-14+BP-39，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39的裂解率分别为97.74％，89.47％，88.72％，97.74％和97.78％。由此表明，采用上述4种噬菌体的鸡尾酒混合物对人源金黄色葡萄球菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。

表8噬菌体对人源金黄色葡萄球菌裂解谱的测定结果

注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”

实施例9动物源金黄色葡萄球菌裂解范围试验

采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取44株动物源金黄色葡萄菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上。加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果如表9所示，BP-13，BP-13A，BP-14及BP-39具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达61.36％，84.1％，50％和65.9％。其噬菌体鸡尾酒混合物BP-13+BP-13A+BP-14，BP-13+BP-13A+BP-39，BP-13+BP-14+BP-39，BP-13A+BP-14+BP-39以及BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39的裂解率分别为100％，100％，65.9％，100％和100％。由此表明，采用上述4种噬菌体的鸡尾酒混合物除了BP-13+BP-14+BP-39的组合外，对动物源金黄色葡萄球菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。

表9动物源葡萄球菌的裂解谱的测定结果

注：可分为“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”

实施例10：噬菌体对非致病性大肠杆菌的裂解试验

挑取10株非致病性大肠杆菌菌落分别接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μL噬菌体培养液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果如表10所示，在本研究中，4株噬菌体及其鸡尾酒混合物均无法识别10株供试大肠杆菌。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。

表10 4株噬菌体及其鸡尾酒混合物对非致病性大肠杆菌的裂解试验

注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”

实施例11：噬菌体对非宿主性致病性细菌的裂解试验

挑取30株非宿主性病原细菌单菌落，包括停乳链球菌5株，无乳链球菌5株，副溶血弧菌5株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌5株，鲍曼不动杆菌5株。分别接种于盛有3mLTSB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μL噬菌体培养液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果显示，4株噬菌体及其鸡尾酒混合物均无法识别30株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株(表11)。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。

表11 4株噬菌体及其鸡尾酒混合物对非宿主性致病性细菌的裂解试验

(注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”)

实施例12：噬菌体对金黄色葡萄球菌的抑菌效果试验

取装有50ml无菌TSB培养基的锥形瓶10个，编号分别为1-10号；10瓶培养基中，分别接种处于对数期的细菌(来源于浙江省某医院的人类烧伤感染致病金黄色葡萄球菌ZJ-42或山东省某奶牛场的奶牛***炎致病金黄色葡萄球菌SDN-12)100μl；1号加入终浓度为1.2×10⁷pfu/ml的BP-13，2号加入终浓度为1.2×10⁷pfu/ml的BP13-A，3号加入终浓度为1.2×10⁷pfu/ml的BP-14，4号加入终浓度为1.2×10⁷pfu/ml的BP-39，5号加入终浓度为1.2×10⁷pfu/ml的BP-13+BP-13A+BP-14混合液，6号加入终浓度为1.2×10⁷pfu/ml的BP-13+BP-13A+BP-39混合液，7号加入终浓度为1.2×10⁷pfu/ml的BP-13+BP-14+BP-39混合液，8号加入终浓度为1.2×10⁷pfu/ml的BP-13A+BP-14+BP-39混合液，9号加入终浓度为1.2×10⁷pfu/ml的BP-13+BP-13A+BP-14+BP-39混合液，10号加入和以上噬菌体等体积的SM缓冲液。放置于37℃培养箱中作用。分别于0h，3h，6h，24h，48h和96h取出2ml，检测其OD₆₀₀数值。

结果显示，4株噬菌体单独对ZJ-42在24h之内都有明显的抑制效果，而24小时之后抑制效果明显下降，而4株噬菌体的鸡尾酒混合物则在48小时之内对ZJ-42有明显的抑制作用，效果明显优于单株噬菌体；4株噬菌体对奶牛***炎致病菌SDN-12则是在48小时之内有明显的抑制作用，48小时之后，抑制效果明显下降，而4株噬菌体的鸡尾酒混合物则在96小时之内对SDN-12仍有明显的抑制作用。由此表明，鸡尾酒混合物的抑菌效果要明显优于单株噬菌体。具体参见表12～13

表12 4株噬菌体对烧伤感染金黄色葡萄球菌ZJ-42的抑菌效果

表13 4株噬菌体对奶牛***炎致病金黄色葡萄球菌SDN-12的抑菌效果

序列表

<110> 菲吉乐科（南京）生物科技有限公司

<120> 新型金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物和应用

<130> LAC210206P

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18178

<212> DNA

<213> Podoviridae sp. BP-13

<400> 1

aatagggaaa aagtttttgt aaaattacac ccacccaccg tttaaaataa acgattatac 60

aaatcaaaac ttataaattc acttatcatt tctttactaa acttataaat actgtttgac 120

aacttaacaa cttatctaac ctataacata ttcatcaaat acaaaattta tgtatctatt 180

gacttttatt caaaattatg attttaacac aaaataaatt taatttactt atttaaatat 240

tctatgatat aattagatat aaaataattg gaggtgtgta ttaatgtctg agtttgaaga 300

aattattaaa ccagaagata aagaatcaac agaatcaaca gaagaatcaa cagaatcaac 360

agaatcaaca gaatcaacag aatcaacaga agaaactgaa gaatcatctg aaagtgaatc 420

agtagaaaca attgaagaag aaaatgaaaa caaattagaa cctactatta ctgatgaaga 480

tagtgcaaaa ttagaccctg ttgttttaga acaacgtatc gcttcattag aacaacgatt 540

tactaatttt gaaacatcac aaatgcaaca accacaacca caaccacaac cacaaccaga 600

tgttactgaa gcagatgaca acgacaaaga ctattcagat gaagaattag tggataagtt 660

agatttagat taggaggaat ttaaacatgt atgaaggtaa caatatgcgt tctatgatgg 720

gtacatcata tgaagattca agattaaata aacgaacaga attaaatgaa aatatgtcaa 780

ttgatacaaa caaaagtgaa gatagttatg gtgtacaaat tcattcactt tcaaaacaga 840

catttactgg cgatgtagag gaggaataat aaatcatggc agaaaagagt acaaaaaacg 900

aaacagcact attagttgca cagtcagcta aatctgcatt acaagacttt aatcatactt 960

attcaaaatc atggacgttt ggtgataagt gggataattc taatacaatg tttgaaacat 1020

ttgttaataa atttttattc cctaagatta atgaaacgtt attaatcgat attgcattag 1080

gtaaccgttt taattggtta gctaaagagc aggactttat cggtcaatac agtgaagaat 1140

atgtaattat ggatacagta cctattaaca tggacttatc taaaaatgaa gaactaatgt 1200

tgaaacgtaa ctatccacgt atggctacta agttatatgg tagtggtatt gtgaagaaac 1260

aaaaattcac attaaacaac aatgatacac gtttcaattt ccaaacatta gcagacgcaa 1320

ctaattatgc tttaggtgtc tataaaaaga aaatttctga tattaacgta ttagaagaaa 1380

aagaaatgcg tgcaatgtta gttgattact cattgaatca attatctgaa tcaaatgtac 1440

gtaaagcaac atcaaaagag gatttagcaa gtaaagtttt tgaagctatt cttaacttac 1500

aaaacaacag tgctaaatat aatgaagttc atcgtgcttc aggtggtgct atcggacaat 1560

atacaacagt ttcaaaatta aaagatattg ttattttaac gactgatagc ttaaaatctt 1620

atcttttaga tacaaagatt gcgaacactt tccaagtagc aggtattgac tttacagacc 1680

atgttattag ttttgatgac ttaggtggtg tttttaaagt cactaaagat attgtcgtat 1740

caagtgatgt atcagttaat ttcttacgtg cttacggtga ttaccaaact cataaaggtg 1800

atacaattcc agttggttca gtattcactt atgatgtatc aaatttatct gaatttaatt 1860

ctaacgttga agaaattaaa ccaaaatcag atttatacgc atttattttg gatattaatt 1920

caattaaata caaacgctat acaaagggta tgttaaaaca accattctat aatggtgaat 1980

ttgatgaagt cacacactgg attcattatt attcatttaa agccattagc ccattcttta 2040

ataaaatttt aattaccgac caagatgtaa caccaagaac agaataatag aggtgctata 2100

aatgactaaa cataataaag gcgtacaggt tgaattatct aaagaaatca ataaacgtgt 2160

cgtagaacat cgcaacagat ttaaacgtct tatgtttaat cgttatttgg aatttttacc 2220

actattaatt aactatacca atcgtgatac ggttggtata gattttattc aattagaatc 2280

tgcattaagg caaaacatta atgtagttgt tggtaaagca agaaatgaac aaatcatgat 2340

tttgggctat gttaacaaca cttattttaa tcaagcccca aatttttcat caaatttcaa 2400

ttttcaattt caaaaacgat taacaaaaga tgatatttat ttcattgtcc cagactattt 2460

aataccagat gaatgcttac agattcataa aatatatgat aactgtatga gtggtaactt 2520

tgttgtaatg caaaataaac caattcaata taatagtgat atagaaatta tagaacatta 2580

tactgatgaa ttatctgagg ttgttttatc tagattctcg ttaattatgc aagcaaaatt 2640

tagcaaaata tttaaatcag acattaatga cgagtcagtt aatcaacttg tatcggaaat 2700

atacaacggt gcaccatttg ttaaaatgtc acctatgttt aatgcagatg atgatatcat 2760

agatttaacc agtaatagtg tgattccagc actaactgag atgaaacgcg aataccaaaa 2820

caaaattagt gaattaagta actatttagg tattaattca ctagcagtgg ataaggaaag 2880

cggtgtttcg gacgaagagg caaaaagcaa ccgaggtttt actacatcaa atagtaatat 2940

ttatttaaaa ggtcgtgaac cgattacatt cttatcaaaa cgttatggtt tagatattaa 3000

accgtattac gacgatgaag ttacttcaga aatcacaatg atagatacat tgtctaatga 3060

tgaaagtagt gaatacaatg gctagatata caatgacttt atttgatttt attaaatcag 3120

aattaattaa aaaaggtttt aatgaatttg taaataatga taaattaacg ttttatgatg 3180

atgaatttca attcatgcaa aaaatgttga agtttgataa agacgtttta tccatcgtta 3240

atgaaaaagt gtttaaaggt tttaaactta aagatgactt atctgactta ctttttaaaa 3300

aatcatttac aatacacttt ttagatagag aaatcaacag acaaacagtt gaagcttttg 3360

gcatgcaagt gattactgta tgtatcacac atgaggatta tttaaacgtt gtatattcat 3420

caagcgaagt tgaaaaatat ctacaatcac aagggtttac agaacataat gaagatacaa 3480

caaacaacac tgatgaaacc tcaaatcaaa acgctacatc tttagacaat tcaactggta 3540

tgacagcaaa cagaaatgct tatgtgtcat taccacaaag cgaggttaac atagatgtag 3600

ataacacaac gttacgattt gcagataata atacaattga taacggtaaa actgtgaata 3660

aatcaagtaa cgaaagtaat caaaacgcaa aacgtaatca aaatcaaaaa ggtaatgcga 3720

aaggcacaca attttcaaaa cagtatttaa ttgataatat tgataaagta tacgatttaa 3780

gaaagaaaat tttaaatgaa tttgataaaa aatgtttttt acaaatttgg taaaggtgga 3840

aaattatggt atataatgaa aacgatttta aatattttga cgacattcgt ccatttttag 3900

acgaaatata taaaacgaga gaacgttaca caccgtttta cgatgataga gcagattata 3960

ataccaattc aaaatcatat tatgattata tttcaagatt atcaaagctc attgaagtat 4020

tagcacatcg tatttgggac tatgacggtg agttaaaaaa acgttttaga aactgggacg 4080

atttaatgaa agcattccca gaacaggcta aagacttatt tagaggttgg ctcaatgacg 4140

gtacaataga taacatcatt catgatgaat ttactaaata tagtgctggt cttacatccg 4200

catttgcatt atttaaagtt gcagaaatga aacaaatgaa tgactttaaa gcagaagtga 4260

aagacttaat caaagatatt gaccgtttcg ttaatggttt tgaattaaat gaacttgaac 4320

caaagtttgt gatgggtttt ggtggtattc gtaatgctgt taaccaatct attaatattg 4380

ataaagaaac aaaccatatg tactctacac aatcagattc acaaaaacca gagggttttt 4440

ggattaataa attaacgcct agtggtgatt taatatctag tatgcgtatt gtacaaggtg 4500

gtcacggtac tacaataggt ttagaacgtc aatccaatgg tgaaatgaaa atatggttac 4560

atcatgacgg tgtagcaaaa ctgttacaag ttgcatataa agataattat attttagatt 4620

tagaagaagc aaaaggctta acagattata caccacattc acttttaaac aaacacacgt 4680

ttacaccgtt aattgatgaa gcaaatgaca aaatcgtttt aagattcggc gacgggacaa 4740

tacaggtacg ttcaagagct gacgtaaaaa atcacattga taatgtagaa aaagaaatga 4800

cgattgacaa ttcagaaaac aatgataatc gatggatgca agggattgcc gttgacggtg 4860

atgatttata ctggttaagt ggtaacagtt cagttaattc acacgttcaa attggtaaat 4920

attcattaac aacaggtcaa aagatttatg attatccgtt taaattatca tatcaagacg 4980

gaattaattt cccacgtgat aactttaaag agcctgaggg tatttgtatt tatactaatc 5040

caaaaacaaa acgtaaatcg ttattacttg ctatgacaaa tggcggtggt ggaaaacgat 5100

tcaataattt atatggtttc ttccaacttg gagaatatga acactttgaa gcattacgtg 5160

cgagaggttc acaaaactat aaattaacaa aagacgatgg acgtgcgtta tcaattccag 5220

accatattga cgacttaaat gacttaacac aagcagggtt ctattatatt gacggtggta 5280

cagctagtaa acttaaaaat atgccaatga atggtagtaa aaaaattata gacgctggtt 5340

gtttcatcaa tgtataccct acaacacaaa cattaggtac agtacaagaa ttaacgcgtt 5400

tttctactgg tcgaaaaatg gttaaaatca tgcgtggtat gacgctcgat gtatttacat 5460

taaaatggga ttatggttta tggacaacaa tcaaaacaga cgcaccatat caagagtatt 5520

tagaagcaag tcaatataat aactggatag cttacgttac aatacctggt gaatattata 5580

ttacaggtaa ccaaatggaa ttatttagag acgctccaga agaaattaaa aaagtgggtg 5640

catggttacg tgtttcaagt ggtaacgccg ttggtgaagt cagacaaaca ttagaggcta 5700

atgttaaaga gcacaaagag tactttagta acgttaatgc ggaaacgaaa catcgtgagt 5760

atgattgggt taagaaagga taatgttgca atgaaatcac aacaacaagc gaaagattgg 5820

atatataaac atgagggtgt tggcgttgac tttgatggag catatggttt tcaatgtatg 5880

gacttagcag ttgcttatgt ttattacatt actgacggta aagttcgcat gtggggtaac 5940

gccaaagacg ccattaacaa cgactttaaa ggtttagcag cggtgtatga aaatacacct 6000

agctttaaac ctcaattagg tgacgttgct gtatacatta attctcaata tgggcatatt 6060

caatgtgtaa caagtggaaa tcttgattat tatacatgct tagaacaaaa ctggttaaat 6120

ggtggatatg atggttggga aaaagcaaca ataagaacac attattatga cggtgttacg 6180

cattttattc gtccaaaatt ttcaaatagt gatagtaaag tattagaaaa aaatattcaa 6240

caaactaaca actggaaaca aaaccaatac ggcacatatt acagaaatga aaatgctaca 6300

tttacatgtg gttttttacc aatatttgct cgtgtcggta gtccgaaatt atctgtgctt 6360

aatggctatt ggttccaacc aaacggctat acaccatatg acgaagtttg tttatcagac 6420

aggtatgtat ggattggtta caattgggaa ggtacacgtt attatttacc agtgagacaa 6480

tggaacggta aaacaggtaa tagttacagt gttggtattc cgtggggggt gttctcataa 6540

tgggtatttt aggttttttc tttgagttta gttggaaacg atacaaataa gaggtgtgaa 6600

caatggctga tagaatcgta agaagtttaa gacaagttga aacaatagac aggttagcag 6660

attttttaac agaagaaaat gacttaatca gtacatcaga cggacatatt tatgtccgta 6720

ctgatactgg ttattataaa ttaacatttt ataatgattt aaaaacattg attaataaat 6780

acagtggtca aatagaaaat catgatattg caattaatga taataaagag aaaatatcaa 6840

catttctaga gaaaataaaa aaattacaac caatgattga tagtaataaa aaagagattg 6900

attcattaaa agaaaaagat gtcatattaa atgaaagttt agaacaacat caaacacaat 6960

taaatgaatt tgaaaaatca atgttacagt atgatgataa atatgaaaca cttacacaat 7020

cgttaaacgc tactaaagat agtgtaggac gaaacacaaa tgaaattaat ttaattaaag 7080

ctaatactgg tgcagaaaac attgacgcgt taaaaagaga attagctgaa gttaaaaaaa 7140

gtatcaatct tgataaaata aaagatattg aacaacagat tgaattatta aaatctaaac 7200

aaaacaatga caacacaatt caagaaatac aagaggatat taataagtta aaacaaaatt 7260

caagtgctgg gaaacttgaa agtttagaac aaaccattaa tgacatcaaa gcaaatgcca 7320

accttgataa gataaaagag ttagaaacaa aattaaacag tattaaccaa aaagattata 7380

cacaggatat taattcaatt aaatctgaca tcgctgcttt aaaaacaaat aatgataaaa 7440

tatcaaaaat tgaaaaagat attcaagaat taaaagatag accagttgtt gacggaaacg 7500

gacatattga tttatcaaaa tatgataatg atattaatga tttaaaacaa aaaacatcaa 7560

caaatgaatc aagtattaac actttatcaa caagagtgga caacttaaat atagatacta 7620

aaattgcaca atctaaatca gaaattgaac aaaattttga tcaaaaaatc aacagtgcaa 7680

aattacaatt taatgataca ggttggcaag atatatcgct agaaagtggt atagttgcaa 7740

gtgatagcaa cggtggttat cccgcaccgc aatatcgtat tgtaacaatt aatggtgtta 7800

aaaccataca attaaaaggg gtattaaaag ggattaagaa aaacggtgat attaaattag 7860

gtacgattaa cgctaactta aaatcaacac atcactacac acaatgtgcg attgattcga 7920

aaatgattaa tacaagatta tatttaaact ttagtaatga attacatttt gttacatcaa 7980

attatagcga tagtgactta acaaatggag ataaacgttt tgcaatagat acacaaatca 8040

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aaaaatgaga aaattaacaa attttaaatt tttctataac acaccgttta cagactatca 8160

aaatacaatt cattttaata gtaataaaga gcgtgatgat tattttttaa acggtcgtca 8220

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caatgttgat atgcagtggc atgacgcaca agggattaac tacatgacgt ttttatcaga 8340

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attaaatagt catcttcaag tgctaaaaat tcatcatata taatgatagg gtagtgtttt 14940

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acatagaaga attattattt tttgcttgta attcatataa agcatattta tgctttttag 15600

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tagatacata aattttgtat ttgatgaata tgttataggt tagataagtt gttaagttgt 18060

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ataatcgttt attttaaacg gtgggtgggt gtaattttac aaaaactttt tccctatt 18178

<210> 2

<211> 136563

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus phage BP-13A

<400> 2

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acaacaacac ctcttaaaaa tattgagcta agttattctt actatggtga taattggaca 120

aacctaaaaa caataagtaa tttaagtcaa ggtgaaacaa taacacctaa taacctagta 180

gatttatatg gcttagaaac aatagattat tcaagtatta cacctttctc tagggttata 240

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aacatgagca acaactattt caatgctgtg tggcaagagg tagatatgat atataacact 360

acattaagta gcatgagcat acttactgat agtgaaggta atgtatttga tagttcaaca 420

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atagatacat acacagaagt acagtaaaga tattgacaat aaagtattaa tatgatatag 660

taaggtatgc gtattatagt ataccttgtt atattaatac agaatactag acatgaaagg 720

aataaaaaat atggctatag caacaaatgc ttcacatgta gaattagcta aatacattgt 780

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aagtccacct caacctgaag aaacagcaac atcattacaa gaagttatcg gatataaaaa 900

agcaactaag gtagcattag ttagacctgc aaaaacaacg ggtgatgaaa gtaaaaaaga 960

aattacatat ggtaataaac gatgggtaga aattgactca gctaatgcag ttactgaagg 1020

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tagacaagta ggatttgtta tggatttgtt agctaaagat agtatttcta aatttaactt 1140

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aaatagaagt gaacaaacaa ctgtaaaaga gcgctttatc attgaagttt aaaaaggaga 1260

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ccgacattac acatcctgat tttggtgttg tatttagttt tgatgatgca gaggctactt 2880

tatcatacaa ggaagctgta aaccaaccta agattattca aggggatact acagctcatg 2940

tatggggtcg actaatttct gcaccattta cagaagagcg tacaatttat caaggacaag 3000

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taactcctag tgaagataac tggatagaca ctcagaatgt aactatcacg gaacaaaaaa 3120

ctaaaaaagt aacaatgaaa agattctgga gacataatga aagttattat ggagaaacag 3180

aacattactt atattctaac ttacagttag ataaaggaca agagtggaaa ggtaagtcat 3240

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ctagtgctga aactagagta tactttgatg accctatgat ggctgaagca ggtaaagagt 3900

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aattaaaagc tacatttgag tctaataagt atatttcacc tttattaagt tctaatgact 4380

taacgtttac taccttctta actgagttaa aaggttcata tatcggtaga gctattgata 4440

tgacagaagc tccatataac acaataagat ttagttatga agcattctta cctaagggca 4500

ctaatgttat tcctaagtat tcagacgatg atggtaagac ttggaaaaca tttactaagt 4560

ctgctcaggt agttaaggct aatagagact ttaatagata tgttattgat gagaaagtaa 4620

atcaatctac taagaataac aaattacaag taagattaga cttatcaact gaaaatagtt 4680

tcttaagacc tcgtgtacgt agacttatgg ttacaacaag agatgagtaa gtttaaagag 4740

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acccttactc acaagctaaa ctctttattc ctactgtaga agaaaaagct ataaaagaaa 4860

tggaacaaac atataaagat aaactacaag aagttaatga gcttattgat gagcttaaaa 4920

aattgaaagg tgattacaca catgacgttt aactacacac ctctaacaga atcacaaaga 4980

ttaaaggata tgtaccctaa agtaaatgaa atgggtaaat acttaaaaga agaagttaac 5040

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gggtttttac acttagataa aaagggtagt acttattata agttatatta tgctccgtct 5220

aacacaaata aattgtttgt gaaaacttat tataatggta ctgtctatga ttgggttagt 5280

tttaaactag atgaaggtac actatacgat tcaggaaata caattaatgt aaaaaattta 5340

acagagtcca caactcaatt tgcaacactc ataaaccctc ctaaaagtaa tttaaacaca 5400

ggatggataa attataagga aagtaaaaat ggtacctcag ctttagctga atttaatcct 5460

attaattcta cttcaacatt taaaatgatt agaaagttac cacgccaaga ccaacaacct 5520

aacttattaa gagatagttt attcacatta ccaatgacgg atgtagctaa tataagaacg 5580

gattatatag ataatacatc tttttggggt tttactaata atgcatctac ctcaacagtt 5640

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aactattatg acttatctac ggagtggaaa aagttctcct ttacttttac tttacaatca 5940

tataaccaag agtctagtaa tgatagggtt aattatatat cagccctact aagatttaac 6000

tgctctaatt ctactagtaa tggagctatt gtgtattatg cactaccaaa attagaaaaa 6060

tcatactcgg taactccttt tattactcat acttatgata aaagaaaata tgatgaaata 6120

tggagtaatt ggactgagac aacaagtaaa gatgagcttc aatcacacag tagcgtagat 6180

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ctgcaacaat tagcaatgtc tgtacctcaa ggtttttata ccttctactg tgatggttct 6300

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aataatataa acactacaaa taaagtaata caaatggatt ttagtgatac taaaggcaag 6420

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ttagtaaatg atggctctaa ttctagcgta gatttctttg aaggatattg cggcattact 6720

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accacatcag tagcacaatt caaccagaca ggtcacattg aagtactaag agtaataggg 6840

ttaacatata tttaagagaa gaggttttat agatgataaa gtatgacatt ggtaaagatg 6900

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ctgagtttgt tagtactaag tatgtatact ataagaatac taacgaagta atatataaca 7080

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atgttcctaa agaagattat aaaaagctag aaagtgaagt agaagaatta aaaagaatgc 7200

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tatagacaat aatgaaaata gaatgttaag attaacggat attagcacag gaaaagaata 7860

tcttaatgtt aaaaaatcgt atggtagctg gggcacatgg aaaactgatt tagatgtaca 7920

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tttatctgta tatactacag acaacataac atttcaacag gcaatagcta aacatattga 8040

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ctcagttagt tgtagaggtg tattcatatc agattcaact aactttacta acctatatgg 8160

tgtttatact gctataggta ctgatggaag aactattaat ggttctgtaa atggtaatac 8220

atggaacaca acaaaaacac taccaggatt taaagagctg tggaatggtg cacataactt 8280

taaagataca aataaaaaag aaaccatgtc tgattctata tctaactacc agtatgtaga 8340

agtatacaca agatatagag ctctacaaaa tacaaaaggt actgataaaa caggtacact 8400

atgtcataag ttctatatag atggagacgg tatttacaca tgttcaggag cttatgtatc 8460

aggagactct aatattggag tagagtacta tcgagtaact ttatctatta ctggtgatac 8520

ttggacaatt aaagatagtg cagtaaataa taataaagac caatatgtta cacgtgttgt 8580

aggtatctct ttaccataga ctaggataat tcctagtctt ttttttcttg actaacttta 8640

ataaatatgg taagataata aaggactaaa aagaaaggag aatatatgca gttaagacaa 8700

cagaatatat atacatatgt agattttgat gaaagtgacg ggtatattaa agatatcata 8760

cttaagcgtg ttcataaaac gttaggagct aagaaagatg gctatcaaca tagcttagct 8820

tttaaacgag gtgtgtggga tggttatgta gatttctatg attatgctga gaacaaattc 8880

cctagtgggt tgttacctaa gatgataaca ttactaggtg agttacaatc aagacataac 8940

tttcaatacg aaattattga tgaaaaatct gaaagctttt tagctgaaga agatattgat 9000

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attatgtaca atcaagtggt tggaaacagg gagaacctaa gtctcattag atatggttaa 9300

gatatagtct gaactttgta ggagactaca agaaggttag gagtaacgaa cctaatcgta 9360

acaaaattga aaacagaggt tgctagcggt atcatagacc aactattacc acaactagaa 9420

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agtttaatgt cctgtgagaa tgcattatac aggatagcat taacaggctc catagacatg 10020

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attgctaacc ctgatgatat agataatatt aaggattaca gggatgcata taataaaggt 10200

attgtacata acgagtttag aaatacactt attgcaaaac taacagctaa atggtttaat 10260

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aatatgaatt tttatagtag tagcttacct taccctacta aagatatttt taatatgtct 11160

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tttagttcag ataaatatct aactaattat gaaaattatg taaaaggtat taaacgtgga 11580

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atatttaatg gcatgaaaca tattatactt ttatcatata ataaatatat agaacatcta 11820

atagaaaaat tacctagtaa acataaaaac ttattaaata aatttattaa acaatgtatt 11880

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aagtaaatat attagtagca catttaggcg tagagaatag tttaacaggt aaaggctcac 16500

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taagtttaat tatgtagaga tgaataactt tttagctatt gagcatatca agctaaatct 17340

ggataagcaa ggtcttgtac ttattgaagg tattaataaa acaaatgata gttttgaaag 17400

taatggaaca agtaaaacaa gcatgatatc ctctatcaca tatgcactgt tcggaaagac 17460

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taagctttct ttcaacatag gtaaagacga gtatttaatc gaaagatatc gtaaacacaa 17580

ggaacacaag aacaaggtta agctgttctg taataacaaa gagataacag gctctacaaa 17640

tgatgttacg gatactcaaa tacaagagtt atttggtatt ccttttaata catatgtaaa 17700

tgctattata tatggtcaag gagacattcc tatgttttca caagctaccg acaaaggtaa 17760

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cgagaataaa ttaaaagatt tagacaatca gattggtgta tgtaaaggta gtattcctaa 18060

agttgaagac tttgaatttg tatttagtga aaattataca aaagctaacc aaggtattga 18120

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agaaaactta gaattacaaa ttaaagaaaa acaagctaaa atatctcagt acgaacataa 18360

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aggttctaaa gttataactg gttttaccat tacgcaacat cctcactata ttgtttgttt 76920

aattttttaa tgtcttttac taactcgtct tttaattttt taggtagctc atactttgtt 76980

agagattgtt gttgtcctaa tctataccca tattttgtta ttatcacttc tacagtgtac 77040

catgatttat taatatcgtc aacttttcta gctaataaaa ttaaacactt atcatttata 77100

atattagaag cgtacatacc aacacaatgt gatagttttt ttccttcttg ttttaacttt 77160

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aacctactaa agcaggtata tatcctacag taactaatat agcatatagg atgcttagta 80040

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tatacttaat taaattacta ttttcaatag gtttactgat ttcttttaca atgttctcat 82860

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ctgtatatat taatgcagtc ttatgcatat ttatgccttt ctacaaagca agggaacatc 82980

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tacttcttca agtctgtatg actcttctaa aagttcaaac tgctctaata atgtgatact 83280

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ggcatatatg tcacaattac atggtaaaag acaaccaaca gacgacggtc aaataacaaa 11400

cggtcaacgt gtgtggtacg tatataaaaa gttaggtgca aaaacaacac ataatccaac 11460

agtagggtat ggtttttcaa gtaaaccacc atacttacaa gcaacagcat atggcattgg 11520

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catcaccagc aatgtaagat aaaatagatt ctggtttagt ttcgttgttt agttcatcat 17460

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ttaacactcc ttaattcatt ccttatttca tcaacgattt ttttaggtga attatggtct 17700

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gtaaagaaat gataagtgaa tttataagtt ttgatttgta taatcgttta ttttaaacgg 18120

tgggtgggtg taatttt 18137

<210> 4

<211> 17641

<212> DNA

<213> Podoviridae picovirinae Ahjdlikevirus BP-39

<400> 4

aatttacacc tccccaccgt ttaaaataaa cgattataca aatcaaaact tataaattaa 60

cttattattt ctttactaaa cttataaaaa ctgtgcaaca acttcaaaac ttatctaacc 120

tataacatat tcatcaaata caaaatttat gtatctattg acttttatca aaatttatga 180

tttgtattta aaatctaatt tcttctatta aatagtattt ttaaattatt taaacttttt 240

taagaaaaac cattgacaaa acttttaaac gtttgctata ctatgtatgt aataaaatca 300

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gatgatattg ttacattacg aataaaaggt tatattcttc attatttaga tgataaaaat 900

gaatatgttg aagaatttat cccacttcac gagtatcatt tatcaaaatc acaagctaaa 960

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tgaataaaat tataaaattt catataaaaa atgaaatgaa gaaaaatatg agtgaatttg 3960

aaagaaaaga aaaaatatat gaagataact atattgaaaa tacaaagaag tatttaatga 4020

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ataaacatga acgtcgaatg attttatact gggatataga aacattagcg tacaataaag 4140

ttaacggacg aaaaaaacca accaaatata aaaacgtaac gtattcagta gcaattggtt 4200

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aaattccgac atggttatac ttttatgaac attattcaga acctacatta atccctactt 5160

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ttgaccatag tcaatttgat gatattcttt atattgaaag tgacatcggt tcattctcac 6240

ttaatgactt atttccagtt gtacgttcag tgcataataa atctgatttg catatattaa 6300

aacgtgaaca tgatgaatta aaaaaggcaa ctgttaaata acagtcgcct ttttcttttg 6360

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atcaccagcg ttatgaggaa caccattaat caatgtatat aatacaaccc gtgacggtgc 6540

cacgtatggt gggacgttat agtttgctac taagaatgaa ccatcgtcaa atactgctac 6600

aacgacacct gtgtgaccaa tgccatatgc tgttgcttgt aagtatggtg gtttacttga 6660

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actatcagaa ctactatcag atgaaccact attaggtgaa ccacctttac cgtctatttt 7320

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taaataatca ccacgtgcag acgtatgatt taaccaacct aaaccggcac tatacccttc 7680

atttttttca tatacagcaa aaagagtagg cgacacacct atctctttta ctgcttttaa 7740

tacttgtctg attttacttt cattaccacc aagccataca ttaaagcgtc catacccttt 7800

tactttaggg actaactggt ctatcgttaa accgaaatca tcattaatat atgaatgtgt 7860

aaatttatct atcttctctt ggtcgttcat tattatcact cttttcagta tcatttttaa 7920

tgactcttaa tttatcttta atttgatctg ggactaacac gtccatttct gcacaatttt 7980

ctacgataga taagccctca ttagcgatat aatagaaaat cgtaatcatg agtaagccac 8040

cttttaattg taaaatctgg tcaatgatgt tagctaaaat gataatacag aatatcaata 8100

attttttagc aaaacctttc attgattttt tagaccatag attattattt ttaattgctt 8160

tagcaaaacc agtaacaaca tctacaatca tcaaaacaaa taaaaaatat agtaacttta 8220

aatcacctgc atatatgaac atgtgaaatg tttctgtttc cgtaaatctt aattttacct 8280

cattcattta tacacctact ctaaatttat tatttaacgg gttctgtaac attggattac 8340

ctgaaccgtc attatgccaa aatctcacac cagattccaa aatagctttt aattgttcca 8400

ttaacatagg gtcaatgtca cgtattgtat aagtacctgt acattttaaa tagttgcata 8460

cagtcatact gttaattggt tcaataaatg aattataatt atttacttca aaaccaaaca 8520

acatataata tttttgtaaa aatgtaattt ctttaggtga cggtacacta attttcatcg 8580

ttaaaccgtt aatgctattt gcgatttgga atgcatttcc catttctgat tcagtcactg 8640

acgggggttg taaggctaaa tctttatatt ctgcctgttg ttgtttgtag aaattatatt 8700

cttcattaaa cttaccaaat aaagccgttg gacttaaatt acttgctaca cttacagcgt 8760

cataaaaacg tgattttggg tcactaccat ttaatacatt atctatacga tttgtaatta 8820

attgactttc tgcattacgc tgtctattgg cttgttgtga ttgtcctaaa attccgttat 8880

taattaatat aggtacttgc gcaaaactat taaatgttat atttgtattt aagaatgaac 8940

ctgtatcaat taatatatct ttatttttag caagtatcgg tctatcattt tcagcactgt 9000

tataatctac tggataaact cgaacttcat tatgataacc aataatagat tttgttctta 9060

gtttcacgcc tgttttttct gaaattttac cagcgtcgag taacattgta ttcccattcc 9120

aatcataaaa ttcaatcgtc atgtactcat tacgtatcat atgcttaaat tcatcttttt 9180

tagacaacat catctcttga agctttgaga aacttaatga taaatcgttt aaactccatt 9240

cttttgattt tccaccttgt tttaacgtct ttaatccagt aattttttca cttgttttaa 9300

cgtcctctaa atctttttta ttaataaagt ctttaggtat catttgaacc ttttgaaagt 9360

tttgtgtaat ccatggatag gcactcattt tatccataaa attgataaaa tccccgtatt 9420

ccatgacgta taagttaact ggtgatgtga tattgtcata tatcgtacct ttagacgtat 9480

ctaagtttgg ctcttttttc gtaccaaatt tctttgataa atcagcgctt gactggaata 9540

acactaaatt ttccaaatac tgttgcattt ggttatacac atagttttta ttcgatactt 9600

ttaacacatc atcattgtta cgtaacattg gtaacatata gttatacgtg cgttttgata 9660

agtgttgacg ttcaatatta acgtttgaga gttgctctaa tacattacct tgcgtgtacg 9720

tcataatagt atcaatcaca aaatatattt taaccacaac atcattcaca tattcgattt 9780

gattcacaaa cgcgtaatag cgtctatcct caaaatctga taaaaacgtc atgtagttaa 9840

tcccttgtgc attatgccac tgcatatcaa cattgatttc cattctatca cgtataaaat 9900

tatacggttg ttttgaatag tctaacgatt taaaatgacg accatttaaa aaataatcat 9960

cacgttcttt attactatta aaatgaatcg tgttttgata gtctgtaaac ggtgtgttat 10020

agaaaaattt aaaatttgtt aattttctca tttttacctc cataaaaaat agtcgtataa 10080

ataatttata cgactattat atcattttta ttcaatgatt tgtgtatcta ttgcaaaaag 10140

tttataacca tttgaaagct cactatcgct ataatttgat gtaacaaaat gtaattcacc 10200

tttaaaattt aagtacattc ttgtatttat cattttatta tcaatcgcac attgtgtgta 10260

gtgatgtgtt gtttttaagt ttgcgttaat cgtacctaat ttaatatcac cgtttttctt 10320

aataccttta aatacacctt ttaattgtat tgtttttacg tcattgattg taacaatgcg 10380

atattttaaa ggtggataag cattactatt attatctatt gtaataccac tttcaagttg 10440

cacattttgc caacctgtat catttacact tgtttttgaa gatttgattt gttcttgtaa 10500

ttctgtttta gttgattcga tttttttact tgtttcaatt gtgttgtttg aaaccgttga 10560

agctaagttt tcaatacttt gtttattttg tctgattgtt tcttttgtag cgatgatatc 10620

ttgtttattc gtttcaattg ctaatttgtt ttttgtattt tcatcatcta ataacaaaat 10680

agcgtcattg tgattgttta atttatttgt atgttctgat tgtatatcag ataaattttt 10740

aattttttta tcttgttgta tattatcctc tttaatatga ataatatctg tagcgttttg 10800

agatatatta tttttatttg tagcgatatc atttttattt ttatcgatcg cttttgtgtt 10860

tgtattaatt ttttctaata attcatcttt aaatgttagc ttataataat cctcatcacg 10920

tcttatatat atgttatcgt ctttggttgt gattaagtcg tttgcttcaa ctaaattgtc 10980

gtttaacttc tctaatgaat caatacccct taaacttctt acaattctat cagccattgt 11040

tcacacctct tatttgtatc gtttccaact aaattcaaag aaaaatccta aaatacccat 11100

tatgagaaca ctccccacgg aataccaaca ctgtaactat tacctgtttt accgttccat 11160

tgacgtactg gtaaataata acgtgtccct tgccagttat aaccaatcca tacatacccg 11220

tctgataaac aaacttcgtc atatggtgta taaccattcg gttggaacca atagccatta 11280

ggttcagata atttcggact accgacacgt gcaaatattg gtaaaaaacc acatgtaaat 11340

gtcgcattct catttctgta atatgtgcca tattggtttt gtttccattt tccgaatgtg 11400

tttacttttg atgtttctaa ttcgttgctg ttactagcag aaaattttgg acggataaag 11460

tgtgttacac cgtcgtaata atgtgttctg attgttgctt tttcccaacc gtcaaaaccg 11520

ccacctaacc agttttgctc taaacatgta taataatcta aattaccact taacacacat 11580

tgaatatgtc catattgccc atattgtcca tttgtatata cagcaacgtc acctaattga 11640

ggtttaaagc tcggtgtatt ttcatacacc gttgctaatc ctttaaagtc gttgttaatg 11700

gcgtctttag cgttacccca catacgaact ttaccgtcag taatgtaata aacataagca 11760

actgctaagt ccatacattg aaaaccatat gctccatcaa agtcaacgcc aacaccctca 11820

tgtttatata tccattcttt agcttgttgt tgtgatttca tttatatcac tcctatttaa 11880

tgttttgcta cccaatcata ctcacgatgt gtatttttta ctgttacaag actataaaat 11940

tctttatatg ttgatgaatt tattaataac gtttgtctta cttcacctga aacgttacca 12000

cttgatactt gtaaccacgc acctgcatca ccaataccat taggtttatc tttaaattgg 12060

ttcatttgtg ttgaagtaat gtaatattct ccaggtaatg taattttagc aatccaataa 12120

ccaaattttt tagcctcaac gtattctttt tcagttgaat tagtatcaat aaccgaccat 12180

ttaccaaatt caaatttttg tgtatttaag ttatatgtga aacttcttat tagtttcatc 12240

atttttctta atcctgaatt tcttgttaat tcttgatatc cacctaactg ttgtgttttt 12300

ggtgatacaa ataaaaacca gcctgcatca tcattgatat atgggaaatc atccataact 12360

ttagtatgtt ctgtcatcat ataataaaat ccagtttcgg taatttggct taaacttgtc 12420

acaccatctc ttattgataa agctctaccg tcatctttcg ttagtttata gttttgacca 12480

ccttttaacg ttaatgcaac aaaacgttca tattcaccag tttgaaagaa accatacaat 12540

aagttttgtc tttttccacc accagcagtt gtatatgcaa ttaataaaga ttgtttttta 12600

gttctaggat taacgtataa atatataccc tcaggctctc taaaattatc tctaggattt 12660

tcaacaccat gttcaaatga aacatcgttt aaataataat cgtatacttt tgattttgtt 12720

ttaaaactat atttttgaat taatgtttta ctatctagag ctgacctacc acttaaccag 12780

tataaatcat caccataaac tgcaatacct tgcataggtc tgtatggtgt gttttctttt 12840

acatcaattt gtagttcttt ttctacattg tcaatgtgat taattacatc ttctcttgaa 12900

cgtacttgta ttaaaccacc gccatatcta aatactaatt tgtcattttc ttcatccata 12960

ataggcgtaa aatattcgtg tgaagatgct ggcgtgaaat cagttaatgc ttttgcatca 13020

tctactgtta atgttgtatt atctctataa gcgatttgta caagttttga aagtgctaca 13080

tgatacaacc atatttttat ctcaccgtta ctttttcttt ctaaagcaat attagtacca 13140

tgaccaccct ctacaatacg catactagaa attaaatcac cactaggcgt taatttgtta 13200

atccaaaaac cctctttttc ttgtgagtcg gattgtgtag agtacatttg atttgtttct 13260

ctatcaatta atatactttg gtttacagcg ttacgaacac caccaaagcc cgttacaaac 13320

tttggttcaa gctcatttaa ttcaaaccca ttaacgaaac ggtcaatatc tttaattaag 13380

tctttcactt ctgctttaaa gtcattcatt tgtttcattt cagcaacttt aaatacagca 13440

aaagctgaag ttagtccagc agaatatttt gtaaactcgt catgaatgat tttatcaatc 13500

gtaccgtcgt ttaaccatcc tctaaataat tctttagcgt catctggaaa ttttttcatt 13560

aaatcgtccc aatttttgaa acgttttttt aattcaccgt catattccca aatacgacgt 13620

gccaatactt caatcagttg tgatagtttt gaaacataat cataatacga ttttgaatta 13680

gtattataat cagctctatc atcatagaac ggtgtatatg tttctcttgt tttatatatc 13740

tcatctatga atggacgaat atcctcaaaa tatttaaatt cattttcatt atatgccatt 13800

atttaaccac cttaccaaat ttgtaaaaaa catcttttat caaattcgtt taatattttt 13860

tttcttaaat catatgcttt atcgatatta tcgattaagt attgttttgt gaattgtgta 13920

cctttagcat ttcctttttg attttgatta cgttttgcgt tttgattact ttcactactt 13980

gatttattca ctgatttacc attatcaatg gtattgttat cagcaaattg caatgttgta 14040

ttatcaacat cgatattaac ctcactttga ggtaatgtcg caaatgcgtt tctgtttgct 14100

gtcatacctg ttgaattgtc taatgatgta gcattttgat ttgatgtttc atctgtgtta 14160

tttgttgtgt cttcattgtg ttctgtaaat ccttgtgatt gaagatattt ttcaacttca 14220

cttgatgaat aaacaacgtt taaataatcc tcatgtgtaa tacataccgt aatcacttgc 14280

atgccaaacg cttcaaccgt ttgcctgtta atttctctat ctaaaaagtg aatcgtaaat 14340

gattttttaa aaagtaaatc tgataactca tttttaagtg aaaaaccttt aaatactttt 14400

tcatttacaa ttacttgtac atccttatca aatttaagca ttttttgcat aaattgaaat 14460

tcatcatcat aaaaggttaa tttatcgtta tttacaaatt cattaaaacc ttttttaatc 14520

agttctgact ttataaaatc atataatgtc atggtatatc tagccattta catcactact 14580

ttcatcttta aacagtgtat caaccattga aattttagac gtagtttcat catcataata 14640

cggtttaata tctaaaccat aacgttttga taaaaatgta atcggttcac gtccttttaa 14700

ataaatatta ctatttgacg tagtaaaacc acgattactt ttcgcttctt catcagatac 14760

accgctttct ttatcaacag cgagtgaatt tatgcctaaa tagttactta attcactgat 14820

tttattctga tattctcgct tcatttctgt taaagcagga atcactgaat tacttgttaa 14880

atcaataata tcatcatctg cgttgaacat cggtgacatc ttaacaaatg gtgcgccgtt 14940

ataaatttct gatacaagtt gattaattga ttcatcgtta atatctgatt taaatatctt 15000

gctgaatttt gcttgcataa tcaatgaaaa acgagataaa acaacctcag ctaattcatc 15060

tgtataatgt tctataattt caatatcact attatattga atcggtttat tttgcataac 15120

aacaaaattt ccactcatgc aattatcgta ttgcttatga atttgtagac attcatcagg 15180

tattaaatag tctggaacaa tgaaataaat atcatctttt gttaatcgtt tttgaaattg 15240

gaagttaaag ttagatgaga aatttggtgc ttggttaaaa taagtattgt taacataacc 15300

aagaatcata atttgtttat ttctcgcttc tcctaccaca acattaatgt tttgtcttaa 15360

tgcagattct aactgaataa aatctatacc aaccgtatca cgattggtat agtttattag 15420

taggggtaaa aattccaaat aacgattaaa cataagacgt ttaaaacggt tacgatgttc 15480

aactactctt ttattaattt gttttgacag ttcaacatat aaacctcttt tgttatttgt 15540

cataatttac ctcctatgtt tcactatctg gttctggttt aggtgttaca tcttggtcag 15600

taattaaaat tttgttaaag aatggactta cagctttaaa tgaatagtaa tgtatccaat 15660

gtgtaacctc atcatactca ccattataga atggttgttt taacatacct tttgtatagc 15720

gtttatattt aattgaatta atatccaaaa taaacgcata taaatctgat tttggtttga 15780

tttcttcaac gttacctgta aactctttaa gttttgaaac gtcataagtg aatacagcat 15840

ctaaaggaat agtatcaccg atttgtgctt gataatcacc gtaagcacgt aagaaatcaa 15900

ttgtatcttg attttgtaat ttaaattctt tcattacttt aaacacaccg cctaaatcat 15960

caaagctaat aacatggtct gtgaagtcaa taccagcgat ttggaaagtg ttcgcaattt 16020

ttgtatctaa taaataagat tttaatgaat ctgttgttaa aataacaatg tcttttaact 16080

tagacacagt tgtgtattga ccaatagcac caccagaagc acgatgtacc tcattatatt 16140

tagcgctgtt gttttgtaag ttgagaatag cttcaaaaac tttacttgct aaatcttctt 16200

ttgatgttgt tttgcgtatg tttgaatctg ataattgatt taacgagtaa tcaactaaca 16260

ttgctctcat ttctttttct tctaatacat taatatcaga aattttcttt ttataaacac 16320

ctaacgcata atttgtagcg tctgctaatg tttgaaaatt aaaacgaacg tcgttgttgt 16380

ttaatgtgaa tttttgtttt tttacaatac cactaccata tagcttagta gccatacgtg 16440

gataattacg ttttaacatt aattcttcgt tttttgataa gtccatatta attggaacag 16500

tatccataat tacatattct tctgaatatt gtccgataaa gtcttgctct tttgctaacc 16560

aattaaaacg gttacctaat gcaatatcaa ttaataatgt ttcattaatt ttagggaata 16620

aatatttatt aacaaatgtt tcaaacattg tgtttgtatt atcccactta tcaccaaaag 16680

tccaagattt tgaataatca tggttaaaat cttgtaatgc tgattttgct gatttagcaa 16740

ctaataaggc agattcattt tttgttgtag ccataatttt attattcctc ctctacgtct 16800

ccagaaaatg tttgcttaga tagtgaatga atttgaaccc cgtaactatc ttcactttta 16860

ttgacgtcaa ttgacatatt ttcatttaat tcagtacgtt tgtttaaacg tgaatcttca 16920

tatgatgttc ccatcataga acgcatgttg ttactctcat acatattatt ttcctcctaa 16980

tctaaatcta acttatcgac taattcttca tctgaatagt ctttgtcgtt gtcatctgct 17040

tcagtaacat ctgtttgtga ttgtggttgt ggttgttgca tttgtgatgt ttcaaaatta 17100

gtaaatcgtt gttctaatga agcgatacgt tgttctaaaa caacagggtc aaattttgaa 17160

ctatcttcgt cagttgtagt tggttctaat ttgttttcat tttcttcttc aattgtttct 17220

actgttttat cttcagtaga ttcttcggtt gattctgttg attcttcagt tgattctgaa 17280

gttgattctt cagttgattc ttcagttgat tctgaagttt cttctttgtc gtctggtttt 17340

acgatttcat caaattctgt catttagaca cctccaaata ttttataact aattatatca 17400

tagaatattt aaataagtaa attaaattta ttttaaatac aaatcataaa ttttgataaa 17460

agtcaataga tacataaatt ttgtatttga tgaatatgtt ataggttaga taagttttga 17520

agttgttgca cagtttttat aagtttagta aagaaataat aagttaattt ataagttttg 17580

atttgtataa tygtttattt taaacggtgg ggaggtgtaa atttacaata actttttccc 17640

t 17641

Claims (9)

1.新型金黄色葡萄球菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)、保藏编号为CCTCC NO：M 2015143。

2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述短尾噬菌体BP-14(Podoviridaesp.BP-14)具有等轴衣壳以及可收缩性短尾组成的形态结构，且在pH5～pH11、在4℃～37℃条件下具有耐性，且MOI＝0.001条件下培养6h，其效价可达到5×10¹¹pfu/mL。

3.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述短尾噬菌体BP-14(Podoviridaesp.BP-14)具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

4.一种金黄色葡萄球菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物含有短尾噬菌体BP-14(Podoviridae sp.BP-14)和短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39(Podoviridaepicovirinae AHdD-like virus BP-39)、短尾噬菌体BP-13(Podoviridae sp.BP-13)或金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)或它们中的两种或三种的组合。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括短尾噬菌体BP-13、金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A和短尾噬菌体BP-14的组合，短尾噬菌体BP-13、短尾噬菌体BP-14和短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39的组合，金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A、短尾噬菌体BP-14和短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39的组合，或短尾噬菌体BP-13、金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A、短尾噬菌体BP-14和短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39的组合。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物中以单位体积中所含噬菌体效价pfu/mL计、其中所述短尾噬菌体BP-13、金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A和短尾噬菌体BP-14的比例为1∶1∶1，所述短尾噬菌体BP-13、短尾噬菌体BP-14和短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39的比例为1∶1∶1，所述金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A、短尾噬菌体BP-14和短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39的比例为1∶1∶1，所述短尾噬菌体BP-13、金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A、短尾噬菌体BP-14和短尾噬菌体AHJD样噬菌体属BP-39的比例为1∶1∶1∶1。

7.一种含有权利要求1～3任一所述噬菌体或4～6任一所述噬菌体组合物的试剂或试剂盒。

8.权利要求1～3任一所述的噬菌体或4～6任一所述噬菌体组合物用于制备抗人源或是动物源金黄色葡萄球菌的试剂或试剂盒中的应用。

9.权利要求1～7任一所述的噬菌体、噬菌体组合物或含有噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒用于制备治疗由金黄色葡萄球菌引发的人类烧伤感染及奶牛***炎的药物中的应用。

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