CN112843336B - 一种促进牙本质再生的纳米颗粒、凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促进牙本质再生的纳米颗粒、凝胶及其制备方法和应用,涉及生物医药技术领域。本发明以包含AZD2858的储备液的稀释液与壳聚糖为原料制备所述促进牙本质再生的AZD2858‑CD‑壳聚糖纳米颗粒,制备得到的AZD2858‑CD‑壳聚糖纳米颗粒能够促进根尖牙***干细胞迁移、成牙本质分化和牙组织的发育与再生。本发明还基于上述AZD2858‑CD‑壳聚糖纳米颗粒制备了AZD2858‑CD‑壳聚糖凝胶,为一种缓释制剂,将其填充于实验动物模型中,具有促进牙本质再生的活性,在牙髓组织工程中具有显著的优越性,在牙组织的发育与再生具有巨大的应用市场。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种促进牙本质再生的纳米颗粒、凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
牙髓病和根尖周病等牙髓感染性疾病是最常见的口腔疾病,患病率高,患病年龄跨度大,甚至可导致牙齿缺失,严重影响患者口腔和全身健康[1]。目前,临床治疗牙髓病及根尖周病的主要方法是根管治疗。由于细菌可定植于牙本质小管中和根管***解剖结构复杂等原因,该方法存在彻底清除根管内细菌和完全严密充填的困难。近年来,根管治疗的总体临床成功率为78%~98%[2]。另外,根管治疗是针对牙髓及其外侧部分牙本质的切除性治疗,而牙髓及其外侧牙本质在解剖和功能上紧密联系,构成牙髓牙本质复合体,共同发挥应答外界刺激、促进修复性牙本质形成、调控牙根发育以及维持牙内环境稳态等重要生理功能[3]。根管治疗切除牙髓牙本质复合体后,牙齿不再具有免疫保护、感知外界刺激和自身修复等功能,二次感染及牙纵裂风险增高[4]。年轻恒牙根尖尚未发育完全,根管口开放,根管壁薄,根管治疗不能有效的进行根管预备及充填,也不能促进牙根正常完成发育,导致牙根过短、牙齿折断等并发症出现几率增高,远期疗效不理想[4-5]。因此,在充分理解牙髓牙本质复合体发育和再生修复过程及机制的基础上,利用组织工程和再生医学手段,在严格控制感染的根管内,以原位再生组织结构完整、生理功能正常的牙髓牙本质复合体为目标的牙髓再生治疗是牙髓感染性疾病治疗的发展方向与必然趋势,已成为口腔医学研究的热点之一。
参考文献:
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发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于一种促进牙本质再生的纳米颗粒、凝胶及其制备方法和应用,不仅可以提高AZD2858诱导内源性干细胞归巢的准确性、稳定性和可操作性,还能够延长AZD2858在根管内的作用时间,促进生物学效应的发挥。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种促进牙本质再生的AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:将包含AZD2858的储备液的稀释液与壳聚糖混合,得所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒;
所述稀释液中AZD2858的浓度为50nM;
所述储备液中还包括DMSO和β-环糊精的生理盐水溶液,所述DMSO和β-环糊精的生理盐水溶液的体积比为1:(9~19);所述储备液中DMSO的体积百分含量为10%~5%,所述储备液中β-环糊精的质量百分含量为5~25%;
所述稀释液的体积与壳聚糖的质量比为400μl:1~3mg。
优选的,所述β-环糊精的生理盐水溶液中β-环糊精的质量百分含量为15~25%。
优选的,所述储备液中AZD2858的浓度为2.5mM。
优选的,所述储备液的配制方法,包括以混合溶液为溶剂,将AZD2858配制成2.5mM的储备液,所述混合溶液中包括体积百分含量为10%的DMSO和体积百分含量为90%的β-环糊精的生理盐水溶液,所述β-环糊精的生理盐水溶液中β-环糊精的质量百分含量为15~25%。
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒。
本发明还提供了一种基于上述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒制备得到的AZD2858-CD-壳聚糖凝胶,所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒和基质胶的质量比为(3~7):(7~3)。
本发明还提供了上述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶的制备方法,包括以下步骤:将AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒与基质胶混合,得所述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶;所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒和基质胶的质量比为(3~7):(7~3)。
优选的,所述基质胶包括Matrix Gel、虫胶或果胶。
优选的,所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒和基质胶的质量比为5:5。
本发明还提供了上述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒或上述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶在制备牙组织发育和/或再生试剂中的应用。
本发明提供了一种促进牙本质再生的AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:将包含AZD2858的储备液的稀释液与壳聚糖混合,得所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒。利用所述制备方法制备得到的AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒能够促进根尖牙***干细胞迁移、成牙本质分化和牙组织的发育与再生。本发明还基于上述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒制备了AZD2858-CD-壳聚糖凝胶,为一种缓释制剂,填充于实验动物模型中,在动物试验中验证了其促进牙本质再生的活性,在牙髓组织工程中具有显著的优越性,在牙组织的发育与再生具有巨大的应用市场。
附图说明
图1为AZD2858-CD-壳聚糖凝胶的形貌及累计释放量,其中A表示AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒直径范围在150~200nm之间的均匀颗粒结构;B表示AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒:Matrix Gel比例为50:50时AZD2858的累计释放量;
图2为AZD2858和AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒显著提高SCAP迁移能力;
图3为AZD2858-CD-壳聚糖@Matrix Gel与人牙髓干细胞成功再生牙髓组织图,其中A表示空白对照组未见牙髓组织再生;B表示H&E染色结果,AZD2858-CD-壳聚糖@MatrixGel与人牙髓干细胞可成功诱导牙髓组织再生。
具体实施方式
本发明提供了一种促进牙本质再生的AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:所述稀释液中AZD2858的浓度为50~150nM;
所述储备液中还包括DMSO和β-环糊精的生理盐水溶液,所述DMSO和β-环糊精的生理盐水溶液的体积比为1:(9~19);所述储备液中DMSO的体积百分含量为10%~5%,所述储备液中β-环糊精的质量百分含量为5~25%;
所述稀释液的体积与壳聚糖的质量比为400μl:1~3mg。
本发明首先将AZD2858(3-氨基-6-[4-[(4-甲基-1-哌嗪基)磺酰基]苯基]-N-3-吡啶基-吡嗪甲酰胺)配制成2.5~7.5mM的储备液,所述储备液的溶剂为包含DMSO和β-环糊精的生理盐水溶液的混合溶液;所述溶剂中DMSO和β-环糊精的体积比为1:(9~19),优选为1:9。本发明利用所述混合溶液溶解AZD2858并配制成2.5~7.5mM的储备液,本发明实施例中,所述混合溶液优选由10%(v/v)的DMSO和90%(v/v)的β-环糊精的生理盐水溶液混合而成,所述β-环糊精的生理盐水溶液中β-环糊精的质量百分含量优选为5~25%。本发明对所述β-环糊精的生理盐水溶液的制备方法并没有特殊限定,实施例中优选将β-环糊精与生理盐水按照1g:5mL的质量体积比混合,即可制成20%β-环糊精的生理盐水溶液。本发明所述AZD2858优选购自MCE试剂公司(MedChemExpress LLC 50mg包装),所述β-环糊精优选购自MCE试剂公司(MedChemExpress LLC 1g包装)。
得储备液后,本发明利用所述β-环糊精的生理盐水溶液将所述储备液稀释至50~150nM,将稀释溶液与壳聚糖混合,得所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒;所述稀释溶液与壳聚糖的体积质量比为400μl:1~3mg。本发明对所述稀释溶液的制备方法并没有特殊限定,在本发明实施例中优选取25μl所述储备液与975μl所述20%环糊精的生理盐水溶液混合,得到50nM的稀释溶液。本发明将稀释溶液与壳聚糖混合,优选的每1.5mg壳聚糖均匀分散在400μl的50nM溶液中,得到包含AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒的溶液。
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒。本发明所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒,利用分子间氢键和分子间范德华力将AZD2858包和在CD内,再装载到壳聚糖颗粒中。
本发明还提供了一种基于上述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒制备得到的AZD2858-CD-壳聚糖凝胶,所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒和基质胶的质量比为(3~7):(7~3)。
本发明所述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶,在4℃时为溶液态,在20~37℃时为凝胶态,且所述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶中AZD2858的浓度优选为50nM,壳聚糖的浓度优选为3mg/ml。
本发明还提供了上述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶的制备方法,包括以下步骤:将AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒与基质胶混合,得所述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶;所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒和基质胶的质量比为(3~7):(7~3)。
本发明所述基质胶优选包括Matrix Gel、虫胶或果胶,以所述基质胶为支撑,利用Matrix Gel和纳米递药体系联合作用,可优化其药物动力学效应,对AZD2858进行控制释放。本发明所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒和基质胶的质量比优选为5:5,此时,AZD2858在3周内可实现最佳线性释放效果,累计释放量超过92%。本发明所述基质胶的来源并没有特殊限定,利用本领域的常规市售试剂即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种促进牙本质再生的纳米颗粒、凝胶及其制备方法和应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒制备
1.将2gβ-环糊精加入到10ml生理盐水中,制成20%β-环糊精的生理盐水溶液。
2.称取2.12mgAZD2858,利用混合溶液(10%的DMSO+90%的含20%β-环糊精的生理盐水溶液)配制成2.5mM的储备液。
3.取25μl储备液+975μl 20%β-环糊精的生理盐水溶液,稀释成50nM。
4.称取1.5mg壳聚糖分散在400μl的50nM溶液中,得到包含AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒的溶液。将所述溶液滴在云母片上,溶剂挥发干后,在扫描电镜下检测,扫描电镜下可见AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒为直径范围在150~200nm之间的均匀颗粒结构(图1中A)。
二、制备AZD2858-CD-壳聚糖@Matrix Gel
向上述的400μLAZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒的溶液(含AZD2858-CD-壳聚糖60mg)中加入100μLMatrix Gel(BD公司,10mL),即可得到AZD2858-CD-壳聚糖@Matrix Gel凝胶,且该凝胶含50nM AZD2858和3mg/mL壳聚糖,AZD2858-CD-壳聚糖:Matrix Gel质量比为37.5:62.5,4℃时为溶液,20~37℃时为胶状。
按照表1所示比例进行配制,设置不同的AZD2858-CD-壳聚糖:Matrix Gel质量比,确定AZD2858的释放效果,发现AZD2858-CD-壳聚糖:Matrix Ge为50:50时,AZD2858在3周内可实现最佳线性释放效果,累计释放量超过92%(图1中B)。
表1 AZD2858-CD-壳聚糖与Matrix Gel的配比
实施例2
AZD2858及AZD-CD-壳聚糖对根尖牙***干细胞(SCAP)迁移能力的影响
体外分离培养SCAP,按照细胞密度1×104个/孔接种于transwell共培养体系上室,并分别向各组共培养体系下室中加入非特异性调控生物活性因子釉原蛋白(AML),AZD2858和AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒。培养24h后对迁移的SCAP进行消化收集并计数,结果显示AZD2858和AZD-CD2858-壳聚糖纳米颗粒可显著促进SCAP的迁移能力,AZD2858和AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒组间无显著差异(图2)。
实施例3
将AZD2858-CD-壳聚糖@Matrix Gel移植到免疫缺陷小鼠balb/c(购自维通利华实验动物公司)体内。根据Dental pulp tissue engineering with stem cells fromexfoliated deciduous teeth的方法(M.M.Cordeiro,Z.Dong,T.Kaneko et al.,“Dentalpulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth,”Journal ofEndodontics,vol.34,no.8,pp.962–969,2008)检测其再生牙髓组织活性:
将AZD2858-CD-壳聚糖@Matrix Gel与人牙髓干细胞复合回植到免疫缺陷小鼠皮下,组织学观察发现局部可见牙髓组织再生(图3)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种促进牙本质再生的AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒制备得到的AZD2858-CD-壳聚糖凝胶,所述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶的制备方法,包括以下步骤:将AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒与基质胶混合,得所述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶;所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒和基质胶的质量比为(3~7):(7~3);所述基质胶包括Matrix Gel、虫胶或果胶;
所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:将包含AZD2858的储备液的稀释液与壳聚糖混合,得所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒;
所述稀释液中AZD2858的浓度为50~150nM;
所述储备液中还包括DMSO和β-环糊精的生理盐水溶液,所述DMSO和β-环糊精的生理盐水溶液的体积比为1:(9~19);所述储备液中DMSO的体积百分含量为5%~10%,所述储备液中β-环糊精的质量百分含量为5~25%;
所述稀释液的体积与壳聚糖的质量比为400μl:1~3mg;
所述β-环糊精的生理盐水溶液中β-环糊精的质量百分含量为5~25%;
所述储备液中AZD2858的浓度为2.5~7.5 mM。
2.根据权利要求1所述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶,其特征在于,所述AZD2858-CD-壳聚糖纳米颗粒和基质胶的质量比为5:5。
3.权利要求1所述AZD2858-CD-壳聚糖凝胶在制备牙组织发育和/或再生试剂中的应用。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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