CN112831478A - 一种调控水稻垩白的蛋白质OsCAT8及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控水稻垩白的蛋白质OsCAT8及其编码基因和应用。该蛋白质OsCAT8的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明基因过表达后能显著降低稻米垩白，改良稻米品质，为育种中稻米品质改良提供了新的基因资源，具有重要的育种利用价值。

Description

一种调控水稻垩白的蛋白质OsCAT8及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控水稻垩白的蛋白质OsCAT8及其编码基因和应用。

背景技术

水稻是我国第一大粮食作物。随着国民经济的发展，人们生活水平不断提高，在满足水稻产量需求的同时，人们对稻米品质提出了更高的要求，不仅要求口味适合，而且要求外形美观。垩白直接影响稻米外观品质、碾磨加工品质和蒸煮食味品质，是稻米最重要的品质性状之一，垩白水平的高低直接影响稻米的商业价值。

当前研究表明，多个途径基因参与了稻米垩白的发生。如水稻胚乳中特异表达的液泡膜质子转运焦磷酸酶Chalk5，通过干扰内膜***PH稳态影响了蛋白体形成，最终影响垩白(Li et al,2014)；颗粒淀粉合成酶Wx作为水稻中直链淀粉合成的主效基因，对稻米垩白具有不同程度的调控作用(Huang et al,2020)；细胞壁转化酶GIF1控制籽粒发育过程中蔗糖运输卸载过程，对籽粒垩白有较大的影响(Wang et al,2008)。尽管如此，关于垩白的研究仍然存在大量空白，发现并克隆一些新的垩白调控基因，进一步发掘其育种应用潜力，对当前稻米品质育种研究具有重要理论和现实意义。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种调控水稻垩白的蛋白质OsCAT8及其编码基因和应用，为水稻垩白分子机理研究提供了新的思路，也为稻米品质改良提供了新的基因资源。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种调控水稻垩白的蛋白质OsCAT8，该蛋白质OsCAT8的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种编码上述蛋白质OsCAT8的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种降低籽粒垩白的制剂，该制剂包括上述蛋白质OsCAT8，或包括能促进上述基因过表达的有效成分。

一种含有过表达上述基因的表达载体。

上述基因在降低水稻籽粒垩白中的应用。

上述基因在稻米品质改良中的应用。

本发明的有益效果：

本发明克隆了一个新的阳离子氨基酸通透酶OsCAT8，该基因敲除突变体表现为籽粒垩白增加，米质变差；而过表达株系籽粒垩白显著降低，米质变好，说明该基因对改良稻米品质具有重要的作用。本发明为水稻垩白分子机理研究提供了新的思路，也为稻米品质改良提供了新的基因资源。

附图说明

图1为本发明实施例一中水稻中OsCAT8基因的表达模式；其中，R1，C1，LB1分别为幼苗期根、茎和叶片；C2，LB2，LS1分别为孕穗期茎、剑叶和叶鞘；YP1-YP15表示长度为2～15cm的幼穗；E3-E9表示灌浆后3～9天的颖果；

图2为本发明实施例二中水稻OsCAT8-CRISPR/Cas9敲除载体示意图；

图3为本发明实施例三中OsCAT8基因编辑结果示意图；结构域和编辑靶位点如图所示，其中下划线表示PAM序列；“.”表示该位置碱基缺失；

图4为本发明实施例三中OsCAT8基因敲除株系垩白表型分析结果；“**”表示在0.01水平下差异显著；

图5为本发明实施例四中水稻OsCAT8基因过表达载体示意图；

图6为本发明实施例四中水稻OsCAT8基因过表达株系表达量鉴定；“**”表示在0.01水平下差异显著；

图7为本发明实施例四中OsCAT8基因过表达株系垩白表型分析；“**”表示在0.01水平下差异显著。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例一：水稻中OsCAT8基因的表达模式分析

1.基因序列获得

OsCAT8蛋白由610个氨基酸组成(SEQ ID NO.1)，对应基因包含了1833个核苷酸(SEQ ID NO.2)，其编码同等功能的蛋白质和核苷酸序列信息来源于Rice GenomeAnnotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu)。

2.qPCR引物设计

使用https://quantprime.mpimp-golm.mpg.de/在OsCAT8基因的编码区设计一对跨外显子的定量引物AC257-F(TTCTGCTACACCGAGTTC)和AC259-R(GACGGAGATGAGGAGGAT)。

3.表达谱分析

以粳稻日本晴为模型，取不同发育时期、不同组织提取RNA并反转录成cDNA，通过上述定量PCR引物检测OsCAT8在不同组织中的表达水平。检测结果如图1所示，该基因在水稻全生育期、各组织中均有表达，尤其在灌浆期的胚乳中高表达，暗示该基因在胚乳发育中可能具有十分重要的生物学意义。

实施例二：水稻中OsCAT8基因的敲除载体构建和转基因检测

1.基因编辑位点设计

本研究根据现有CRISPR/Cas9相关实验方法，在OsCAT8第4外显子上选择含有GGG作为识别位点的ACACGGAGGCGCCATTCTCAGGG序列作为敲除靶位点(图3)，期望获得功能丧失型转基因植株以明确OsCAT8基因生物学功能。

2.CRISPR/Cas9载体构建

本研究所使用CRISPR/Cas9载体为杭州百格公司的BGK03，利用其载体构建试剂盒将目标序列载入后形成含有OsCAT8基因靶位点的重组载体(如图2所示)。具体操作方法如下：

(1)二聚体制备：取10μM靶位点前后引物各1μL并加入18μL Buffer Aneal轻轻混匀，在PCR仪中99℃退火3min自然冷却获得含敲除靶位点的双链序列；

(2)将二聚体连接至BGK03：按照二聚体1μL、酶1μL、CRISPR/Cas9载体2μL、超纯水2μL的反应体系，混匀后20℃反应1h完成序列连接。

3.大肠杆菌转化

(1)转化：将大肠杆菌细胞T1感受态(全式金)从-80℃取出后置于冰上解冻，待细胞溶解后迅速加入上一步连接产物，用移液枪轻轻混匀后冰上静置30min，随后42℃热激30s，再次冰上静置2min，接着向转化产物中加入10倍体积LB无抗培养液，37℃200rpm培养50min；

(2)涂板：取出活化好的菌液，4000rpm离心后去掉大部分上清，剩余液体(约100μL)重悬后涂板(LB+卡那霉素抗性)，37℃过夜静置培养；

(3)菌液PCR检测：次日，挑取单克隆菌落扩大培养3mL(LB+卡那霉素抗性)，利用载体构建专用测序引物(CCCAGTCACGACGTTGTAA)测序验证靶位点序列，选取阳性克隆并提取质粒待用。

4.农杆菌转化

(1)转化：将农杆菌EHA105细胞感受态(化学转化法制备)从-80℃取出后置于冰上解冻，加入备好的阳性克隆质粒1μL，轻轻混匀后置于冰上30min，随后液氮中冻2min，迅速取出置于37℃金属浴中将细胞溶解2min，接着向转化产物中加入10倍体积LB无抗培养液，28℃250rpm培养2-3h；

(2)涂板：取出活化好的菌液，5000rpm离心后去掉大部分上清，用剩余液体(约100μL)将菌体重悬后涂板(LB+利福平+卡那霉素)，28℃过夜静置培养36-48h；

(3)检测和摇菌：挑取单克隆菌落，用潮霉素引物检测获得阳性克隆并扩大培养3mL(LB+利福平+卡那霉素)待用。

5.水稻遗传转化

(1)诱导愈伤：取日本晴(Nip)种子约500颗，按照无菌水(3次)-50％次氯酸钠(40min)-无菌水(8-10次)顺序依次清洗后滤纸吸干水分，用NMB培养基诱导愈伤发生；

(2)农杆菌侵染：将备用的农杆菌菌液继续扩大培养50mL，5000rpm收集菌体后用加入乙酰丁香酮的AAM液体培养基重悬菌体，然后将挑选好的愈伤浸润在重悬的菌体环境下约30min，吸去菌体，愈伤在培养基上继续培养2d；

(3)筛选：培养后的愈伤无菌水和含头孢霉素的无菌水分别清洗后，置于选择培养基上约三周；最后分别用分化培养基继续诱导愈伤生根，待苗高约10cm时，可在室内炼苗准备后续检测和移栽。

实施例三：OsCAT8基因的敲除株系表型分析

1.转基因苗检测

农杆菌侵染转化共获得24株苗，首先用潮霉素检测引物筛选获得阳性苗，接着用跨靶位点的扩增引物AC175-F：AAATGTTCCAGGATTCCGTCTACGGCAAAG和AC176-R：GAAGTAGGCGTTCTCATCGTCGGTTTCG，将阳性单株中序列扩增后送擎科测序公司测序。结果如图3所示，阳性苗测序获得序列经过比对分析显示共获得2种蛋白翻译提前终止的转基因植株。

2.表型分析

在T0和T1代种植中，对不同株系农艺性状观察发现，与野生型Nip相比，敲除突变体除垩白外，其它农艺性状无显著差异。获得稳定遗传的T2代敲除植株后，田间种植三次重复，每个重复种植2行，首先测序检测确认靶位点突变。随后考察农艺性状时，每个重复去掉边行和杂株，选择5-10株稳定株系，考察单株籽粒垩白度和垩白粒率，并进行统计分析。结果显示，与野生型Nip相比，敲除突变体籽粒垩白粒率和垩白度均显著增加。由此说明，OsCAT8是一个水稻籽粒垩白调控基因(图4C)。

实施例四：OsCAT8基因的过表达株系垩白表型分析

1.载体构建

以日本晴cDNA为模板，以引物AC293-F(atttggagaggacagggtaccATGGACAAGGGCGCGCTG)和AC294-R(ggtactagtgtcgactctagaCACCTTGAAGTCTGCAGCCTCG)扩增OsCAT8的编码区序列(不带终止密码子)，利用重组酶，将扩增片段重组到过表达载体pCAMBIA2300-35S-eGFP(Kpn1和Xba1双酶切线性化)，构建35S::OsCAT8-eGFP融合过表达载体，用于下一步转基因实验(示意图如图5)。

2.转基因获得

大肠杆菌、农杆菌转化和水稻遗传转化均如实施例三。

3.垩白表型分析

在后代转基因株系中，用上述AC257-F和AC259-R引物，通过定量PCR检测获得2个表达量显著上调的株系(图6)。对过表达转基因株系T2代农艺性状进行考察，野生型Nip相比，过表达株系表现为垩白粒率和垩白度显著降低(图7)，进一步证实过表达OsCAT8对改良米质具有正向效应，具有重要的育种利用价值。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种调控水稻垩白的蛋白质OsCAT8及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 610

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L)

<400> 1

Met Asp Lys Gly Ala Leu Val Val Gln Val Met Asp Asp Ser Ser Asn

1 5 10 15

Gly Gly Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ser Phe Ser Ser Leu Arg

20 25 30

Ala Tyr Gly Arg Ala Leu Ala Gln Thr Pro Arg Arg Leu Ala Arg Arg

35 40 45

Ala Cys Ala Ala Thr Ser Pro Gly Glu Glu Met Ser Arg Val Arg Ala

50 55 60

Arg Ser Gly Ala Arg Met Ala Arg Arg Leu Arg Trp His Asp Leu Val

65 70 75 80

Gly Leu Gly Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Val Phe Val Thr Thr

85 90 95

Gly Arg Ala Thr Arg Leu Tyr Ala Gly Pro Gly Val Val Val Ser Tyr

100 105 110

Ala Ile Ala Gly Leu Cys Ala Leu Leu Ser Ala Phe Cys Tyr Thr Glu

115 120 125

Phe Ala Val Asp Met Pro Val Ala Gly Gly Ala Phe Ser Tyr Leu Arg

130 135 140

Val Thr Phe Gly Glu Leu Ala Ala Phe Leu Thr Gly Ala Asn Leu Ile

145 150 155 160

Met Glu Tyr Val Phe Ser Asn Ala Ala Val Ala Arg Ser Phe Thr Ala

165 170 175

Tyr Leu Gly Thr Ala Val Gly Val Asp Ala Pro Ser Lys Trp Arg Ile

180 185 190

Ala Val Pro Gly Leu Pro Lys Gly Phe Asn Glu Val Asp Leu Ile Ala

195 200 205

Val Gly Val Ile Leu Leu Ile Ser Val Cys Ile Cys Tyr Ser Thr Lys

210 215 220

Glu Ser Ser Val Val Asn Met Val Leu Thr Ala Val His Val Ala Phe

225 230 235 240

Ile Leu Phe Ile Ile Val Met Gly Phe Trp Arg Gly Asp Thr Arg Asn

245 250 255

Leu Thr Arg Pro Val Asp Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Phe Phe Pro

260 265 270

His Gly Ala Ala Gly Val Phe Asn Gly Ala Ala Met Val Tyr Leu Ser

275 280 285

Tyr Ile Gly Tyr Asp Ala Val Ser Thr Met Ala Glu Glu Val Glu Arg

290 295 300

Pro Ser Arg Asp Ile Pro Val Gly Val Ser Gly Ser Val Val Leu Val

305 310 315 320

Thr Leu Leu Tyr Cys Leu Met Ala Ala Ser Met Ser Met Leu Leu Pro

325 330 335

Tyr Asp Ala Ile Asp Thr Glu Ala Pro Phe Ser Gly Ala Phe Lys Gly

340 345 350

Ser Ser Gly Trp Gly Trp Val Ser Asn Val Ile Gly Ala Gly Ala Ser

355 360 365

Leu Gly Ile Leu Thr Ser Leu Met Val Ala Met Leu Gly Gln Ala Arg

370 375 380

Tyr Leu Cys Val Ile Gly Arg Ser Gly Val Met Pro Ala Trp Leu Ala

385 390 395 400

Lys Val His Pro Cys Thr Ala Thr Pro Val Asn Ala Ser Ala Phe Leu

405 410 415

Gly Val Phe Thr Ala Ala Leu Ala Leu Phe Thr Glu Leu Asp Val Leu

420 425 430

Leu Asn Leu Val Ser Ile Gly Thr Leu Phe Val Phe Tyr Met Val Ala

435 440 445

Asn Ala Val Val Tyr Arg Arg Tyr Val Ala Ala Asp Asp Asp Asp Ala

450 455 460

Asp His Arg Arg Ala Trp Pro Thr Leu Val Phe Leu Ala Ala Phe Ser

465 470 475 480

Leu Val Ala Leu Cys Phe Thr Leu Leu Trp Gln Phe Ala Pro Ala Gly

485 490 495

Arg Ala Arg Thr Gly Leu Leu Ala Ala Cys Gly Ala Ala Ala Val Ala

500 505 510

Thr Val Gly Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Glu Ala Arg Arg Pro Glu

515 520 525

Leu Trp Gly Val Pro Ala Met Pro Trp Val Pro Ala Ala Ser Val Phe

530 535 540

Leu Asn Val Phe Leu Leu Gly Ser Leu Asp Arg Pro Ser Tyr Val Arg

545 550 555 560

Phe Gly Phe Phe Thr Ala Ala Ala Val Leu Val Tyr Val Leu Tyr Ser

565 570 575

Val His Ala Ser Tyr Asp Ala Glu Glu Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly

580 585 590

Ala Ala Ala Leu Asp Gly Ala Lys Val Gln Asp Glu Ala Ala Asp Phe

595 600 605

Lys Val

610

<210> 2

<211> 1833

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L)

<400> 2

atggacaagg gcgcgctggt ggtgcaggtg atggacgact cgtcgaacgg cggcgtcggc 60

gccgccgccg ccggcggctc gttctcgagc ctgcgcgcct acggccgcgc gctggcgcag 120

acgccgcggc ggctggcgcg gcgcgcgtgc gccgcgacgt cgccggggga ggagatgagc 180

cgggtgcgcg cgcgctccgg cgcgcgcatg gcgcggaggc tgcggtggca cgacctcgtc 240

gggctcgggc tcggcggcat ggtgggcgcc ggggtgttcg tcaccacggg gcgcgccacg 300

cgcctctacg ccgggcccgg cgtcgtcgtg tcgtacgcca ttgccggcct ctgcgcgctc 360

ctctccgcct tctgctacac cgagttcgcc gtcgacatgc ccgtcgccgg cggcgccttc 420

agctacctcc gcgtcacctt cggggagttg gcggcgttct tgaccggggc gaacctgatc 480

atggagtatg tcttctccaa cgccgccgtg gcgaggagct tcacggcgta cctcggcacg 540

gcggtgggcg tcgacgcgcc gagcaagtgg cggattgccg tgccgggcct ccccaagggc 600

ttcaacgagg ttgaccttat cgctgtcggc gtcatcctcc tcatctccgt ctgcatctgc 660

tacagcacca aggagagctc ggtggtgaac atggtgctaa cggcggtgca cgtggcgttc 720

atcctgttca tcatagtgat ggggttctgg cgcggcgaca cccggaacct gacgcggccc 780

gtcgacctgg cgcacaaccc gggcgggttc tttcctcacg gcgcagccgg cgtgttcaac 840

ggagccgcca tggtgtacct gagctacatc gggtacgacg ccgtgtccac catggccgag 900

gaggtggagc ggccgtcacg cgacattccc gtcggcgtct ccggctccgt cgtgctcgtc 960

acactcctct actgcctcat ggccgcctcc atgtccatgc tcctccccta cgacgcgata 1020

gacacggagg cgccattctc aggggcgttc aaggggagct ccggatgggg gtgggtgtcg 1080

aacgtgatcg gcgccggcgc cagcctcggc atcctgacgt cactcatggt ggcgatgcta 1140

ggtcaggcca ggtacctctg cgtcatcggc cgctccggcg tcatgccagc gtggctcgcc 1200

aaggtgcacc cctgcaccgc cacccccgtc aacgcctccg ccttcctcgg tgtgttcacg 1260

gcggcgctgg cgctgttcac ggagctcgac gtgctgctca acctcgtctc catcggcacg 1320

ctcttcgtct tctacatggt cgccaacgcc gtcgtctacc gccgctacgt cgccgccgac 1380

gacgacgacg ccgaccaccg ccgcgcgtgg ccgacgctcg tgttcctcgc cgccttctcg 1440

ctcgtggcgc tctgcttcac gctgctgtgg cagttcgcgc cggcggggcg cgccaggacg 1500

gggctcctcg cggcgtgcgg cgcggccgcc gtggcgacgg tcggcgcgtt ccgggcgctg 1560

gtggcggagg cgcggcggcc ggagctgtgg ggcgtcccgg ccatgccgtg ggtgcccgcg 1620

gcgtcggtgt tcctcaacgt cttcctcctc ggctccctcg accgcccctc ctacgtccgc 1680

ttcggcttct tcaccgccgc cgccgtgctc gtctacgtgc tctacagcgt gcacgccagc 1740

tacgacgccg aggagggcgg tggcgccggc gccggcgccg ccgcgctcga cggcgccaag 1800

gtgcaggacg aggctgcaga cttcaaggtg tag 1833

Claims (6)

1.一种调控水稻垩白的蛋白质OsCAT8，其特征在于，所述蛋白质OsCAT8的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的蛋白质OsCAT8的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种降低籽粒垩白的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求1所述蛋白质OsCAT8，或包括能促进权利要求2所述基因过表达的有效成分。

4.一种含有过表达权利要求2所述基因的表达载体。

5.权利要求2所述基因在降低水稻籽粒垩白中的应用。

6.权利要求2所述基因在稻米品质改良中的应用。

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