CN112830969A - 一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体及包含其的药物和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区；所述的重链可变区包括：如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1，如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR2，以及如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3；所述的轻链可变区包括：如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2，以及如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。本发明还公开了基于上述单克隆抗体的双特异性抗体，以及基于上述单克隆抗体或特异性抗体的用于治疗或缓解癌症的药物或试剂盒。

Description

一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体及包含其的药 物和试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体及包含其的药物和试剂盒。
背景技术
Claudin家族基因基因编码的四次跨膜蛋白对于细胞的紧密连接起着非常关键的结构与功能作用，而紧密连接对于上皮细胞和内皮细胞的渗透性和极性又至关重要。在哺乳动物中，Claudin家族共发现24种不同的蛋白，每种蛋白都特异地表达某一组织上。Claudin蛋白的胞外loop结构与临近细胞的该结构相连接，起到弥合细胞层和调节腔室与基底层之间的并行运输。
Claudin18蛋白具有该蛋白家族的典型结构性质，该蛋白有两种剪接变体，分别称作Claudin18.1(CLDN18.1)和Claudin18.2(CLDN18.2)，两个剪接体在第一个跨膜(TM)区和环1的N端部分中存在差异，而C端的蛋白质一级序列相同。在正常组织中，CLDN18.1选择性地表达于肺部细胞中，CLDN18.2仅在胃细胞上表达。而越来越多的检测表明CLDN18.2也在多种肿瘤细胞中表达。正是由于Claudin18.2这一有选择性表达的特性，使其成为肿瘤治疗的一个全新靶点。
目前尚未有上市的针对Claudin18.2的抗体药物，进展较快的是安斯泰来公司的IMAB362(Zolbetuximab)抗体，目前在针对胃癌和胃食管交界腺癌症进行临床三期试验，针对胰腺癌进行临床二期试验，中国的临床中心正在招募胃癌和胃食管交界腺癌症患者，容量为200人以上。该抗体是一个亚型为IgG1的嵌合抗体，特异性地结合Claudin18.2，而不结合Claudin18.1，体外活性研究表明，它介导了ADCC活性和CDC活性而起到抑制肿瘤的作用。公开报道的临床数据是一项临床二期(NCT01630083)结果：IMAB362联合标准化疗方案EOX治疗胃腺癌、食管癌、胃食管交界腺癌，共计161例，显著延长中位PFS(7.5VS5.3个月；p<0.0005)和中位OS(13VS8.4个月；p＝0.0008)，提高了ORR(39vs 25％；P＝0.022)疗效与EOX标准化疗方案相比，疗效显著。
胃癌和GEJ癌是目前最不能满足医疗需求的恶性肿瘤之一，胃癌也是全球第三大癌症死亡原因。此外，转移性胃癌和GEJ癌的5年总生存率低于20％。化疗和抗HER2抗体广泛用于转移性或复发性胃癌和GEJ癌的治疗，然而，尤其是在HER2阴性患者缺乏有效的靶向治疗，治疗方案亟待解决。所以anti-Claudin18.2抗体及其双功能抗体等其它药物的开发对于部分实体瘤尤其是胃部相关肿瘤的治疗具有极大意义。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体及包含其的药物和试剂盒。
本发明的种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体，所提供的Claudin18.2抗体展现出以下特性但不局限与以下性质：(1)与人Claudin18.2具有高亲和性和特异性；(2)可以结合特异性地Claudin18.2重组蛋白；(3)可以特异性地结合Claudin18.2过表达细胞；(4)并且与同家族成员Claudin18.1不结合；(5)可通过结合靶细胞的抗原位点和效应细胞的FC受***点，介导ADCC活性，达到杀伤靶细胞的目的。
具体技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体。
一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；
所述的重链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3；
所述的轻链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
上述技术方案的有益效果是：本发明所提供的CDR区使得Claudin18.2抗体与人Claudin18.2具有高亲和性和特异性，与同家族其它成员Claudin18.1不结合，能够显著杀伤靶细胞。
在上述技术方案的基础上，本发明还包括如下改进技术方案：
进一步，所述的单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列包含如下任一序列：SEQ IDNO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:12；所述的单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列包含如下任一序列：SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：16。
再进一步，所述的单克隆抗体，其重链可变区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，其轻链可变区包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
再进一步优选，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列与所述氨基酸序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO：13具有至少90％的整体序列同一性。
采用上述进一步方案的有益效果是提供可供选择的抗体，与人Claudin18.2具有高亲和性和特异性，并且与同家族其它成员Claudin18.1不结合，所述抗体可通过结合靶细胞的抗原位点和效应细胞的FC受***点，介导ADCC活性，达到杀伤靶细胞的目的。
再进一步优选，所述的单克隆抗体或其抗原结合部分重链氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
采用上述进一步方案的有益效果是本发明所提供的重链和轻链氨基酸序列使得Claudin18.2抗体与人Claudin18.2具有高亲和性和特异性，并且与同家族其它成员Claudin18.1不结合，所述抗体可通过结合靶细胞的抗原位点和效应细胞的FC受***点，介导ADCC活性，达到杀伤靶细胞的目的。
进一步，所述的单克隆抗体为IgG1、IgG2或IgG4同种型的全长抗体。
采用上述进一步方案的有益效果是免疫球蛋白更易扩散到血管外的间隙内，因而在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物和肿瘤细胞，中和细菌毒素的能力方面，具有重要作用，能有效地抗感染和抗肿瘤。另一方面，免疫球蛋白在体内具有较长的半衰期和更好的稳定性。
进一步，所述的单克隆抗体为抗体片段或单链抗体。
采用上述进一步方案的有益效果是提供更多的抗体可选形式。
本发明的目的之二是提供一种双特异性抗体，其包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。
其中：a)第一抗原结合结构域来自上述的特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体；
和b)第二抗原结合结构域来自特异性结合人PDL1的抗PDL1抗体。
在上述技术方案的基础上，本发明还包括如下改进技术方案：
进一步，所述的抗PDL1抗体包含如下CDR区：
氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示重链可变区CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示的重链可变区CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的重链可变区CDR3，氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示轻链可变区CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的轻链可变区CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的轻链可变区CDR3。
再进一步，所述的抗PDL1抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述的抗PDL1抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。
进一步，所述的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域通过FC连接或通过连接片段连接。优选地,所述FC连接采用Knobs into holes技术；优选地，所述连接片段优选为(GGGGS)3。
再进一步，所述的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域独立地为免疫球蛋白或其抗原结合片段，例如半抗体、Fab、F(ab)2或单链抗体。
再进一步优选，所述的第一抗原结合结构域为免疫球蛋白，所述的第二抗原结合结构域为单链抗体。
采用上述进一步方案的有益效果是同时靶向Claudin18.2和PDL1的双功能抗体，包括了抗Claudin18.2和抗PDL1的双重功能活性，靶向Claudin18.2结构域提供了结合肿瘤细胞活性，靶向PDL1结构域提供了免疫激活的能力。同时，提高了ADCC活性，进一步增加杀伤靶细胞的能力。
本发明的目的之三是一种用于治疗或缓解癌症的药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包含上述特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体或双特异性抗体。
根据本发明的结合特异性，本发明的目的之四是提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体或双特异性抗体。
采用上述进一步方案的有益效果是将本发明中抗体或者其抗原结合部分应用到试剂盒，可有效检测和诊断相关疾病。
附图说明
图1为实施例1中单克隆抗体与过表达Claudin18.2细胞的结合活性结果；结果显示不同的单克隆抗体与过表达Claudin18.2细胞结合活性不同，其中213-m0306-4的EC50达到86.09ng/mL；
图2为实施例1中单克隆抗体与过表达Caludin18.1细胞的结合活性结果；结果显示五个不同的单克隆抗体与过表达Caludin18.1细胞的结合表现为不同的结合活性；
图3为实施例4中人源化抗体与Claudin18.2过表达细胞结合活性结果；图A和图B显示结果，不同的人源化抗体与Claudin18.2过表达细胞结合活性的EC50值都在10ng/mL左右；
图4为实施例4中人源化抗体HA1LA1与Claudin18.2过表达细胞、Claudin18.1过表达细胞结合活性结果；结果显示HA1LA1与对照抗体都和Claudin18.2过表达细胞结合，而都和Claudin18.1过表达细胞不结合，二者与Claudin18.2过表达细胞结合的EC50值分别为27.96ng/ml，118.6ng/ml，HA1LA1结合活性明显强于对照抗体；
图5为实施例5中人源化抗体HA1LA1与Claudin18.2重组蛋白结合活性结果；结果显示HA1LA1与重组蛋白的结合活性高于对照抗体，对照抗体由于反应信号值未达到平台，计算出的EC50值非常巨大，HA1LA1的EC50值为490ng/mL；
图6为实施例6中人源化抗体HA1LA1的ADCC活性结果；结果显示，HA1LA1抗体与对照抗体相比较，ADCC活性明显优异，杀伤靶细胞的比例在EC50上的表现分别为HA1LA1为0.01263nM，对照抗体为0.05754nM；
图7为实施例7中抗体HA1LA1在MiaPaca2-Claudin 18.2裸小鼠模型的体内抑瘤活性；结果显示，HA1LA1显著抑制MiaPaca2-Claudin 18.2移植瘤生长；
图8为实施例7中抗体HA1LA1在人胃癌PDX裸小鼠模型的体内抑瘤活性；结果显示，HA1LA1抑制人胃癌PDX移植瘤生长；
图9为实施例9中对称双特异性抗体分别和PDL1细胞与Claudin18.2细胞的结合活性；结果显示，对称双特异性抗体213H204CC，204H213CC，213CC204H和204CC213H与PDL1细胞结合的EC50分别为0.1685nM,0.2342nM，0.2387nM和0.0825nM，与Claudin18.2细胞的结合的EC50分别为0.4003nM，0.6503nM，0.3301nM和0.5441nM；
图10为实施例9中不对称双特异性抗体分别和PDL1细胞与Claudin18.2细胞的结合活性；结果显示，0413CC和1304CC与PDL1细胞结合的EC50分别为11.7ng/ml和12.8ng/ml，与Claudin18.2细胞的结合的EC50分别为169.5ng/ml和231.7ng/ml；
图11为实施例9中对称双特异性抗体的ADCC活性；结果显示，对称双特异性抗体213H204CC，204H213CC，213CC204H和204CC213H的ADCC活性EC50分别为0.01986nM,0.1305nM,0.01864nM和0.03851nM；
图12为实施例9中不对称双特异性抗体的ADCC活性；结果显示，不对称双特异性抗体0413CC和1304CC的ADCC活性EC50分别为0.04309nM和0.03575nM；
图13为实施例9中对称双特异性抗体抑制PDL1与PD1的结合活性，结果显示，对称双特异性抗体213H204CC，204H213CC，213CC204H和204CC213H抑制结合活性的IC50分别为1.795nM,1.586nM，1.663nM和1.702nM；
图14为实施例9中双特异性同时结合Claudin18.2与PDL1的活性，结果表明，双特异性抗体213H204CC，204H213CC，213CC204H和204CC213H均可以同时结合Claudin18.2与PD1。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：制备表达抗人Claudin18.2单抗的杂交瘤细胞
通过杂交瘤细胞技术制备鼠源单克隆抗体。有关实验方案参见文献(Ed Harlow,David Lane.Antibody:A laboratory manual.1988)。
首先通过基因合成技术合成Claudin18.2全长基因。将Caludin18.2全长基因的克隆入PCDNA3.1(Invitrogen)，转染该质粒进入CHO-K1(ATCC No.CCL-60)细胞株，经过G418(GIBCO)加压筛选，获得Caludin18.2稳定过表达细胞株，用于检测与筛选；瞬转该质粒进入293细胞(TaKaRa，Lenti-X，632180)细胞株，作为免疫使用。
用2×107个Claudin18.2瞬转293细胞，对BALB/c小鼠进行腹腔注射，首次免疫后，分别在第14天和第35天，用2×107个细胞腹腔注射对小鼠进行加强免疫，第56天用1×106个对BALB/c小鼠静脉注射，同时用2×107个细胞腹腔注射进行最终免疫，4天后取脾脏进行融合。
将鼠脾细胞与SP2/0细胞(ATCC No.CRL-1581)按4：1比例融合，在96孔板(Corning)中以HAT(GIBCO)培养基培养，然后进行杂交瘤细胞筛选，所得细胞克隆进行结合筛选。
鉴定筛选过程分为三个步骤：
(1)一定数量的Caludin18.2稳定过表达细胞铺在96孔板(Corning)中，加入克隆表达上清孵育1小时后，用PBS洗涤1次，使用羊抗鼠IgG-HRP(Jackson Immuno)鉴定具有Claudin18.2结合活性的细胞克隆上清，从而获得可与Claudin18.2直接结合的阳性克隆。
(2)随后将步骤(2)中的阳性克隆转移入24孔板(Corning)培养，以有限稀释法进行亚克隆，经多次检测后获得单克隆阳性细胞。
(3)将获得的单克隆抗体细胞株冻存并用进行SFM培养基(Gibco)培养，得到单克隆抗体进行质量鉴定。
将稳定表达人Claudin18.2的CHO-K1细胞铺于细胞培养板，次日洗涤，并封闭后，加入梯度稀释的小鼠单克隆抗体，室温孵育1小时后，PBST洗涤并加入羊抗鼠IgG-HRP(Jackson Immuno)，室温孵育1小时后，PBST洗涤后，以TMB(Thermo)显色，终止后在酶标仪上于450nm读数。结果如图1所示，显示单克隆抗体213-m0306-4与稳定表达Claudin18.2的CHO-K1细胞结合的EC50达到86.09ng/ml。
通过PEI转染试剂向293细胞(TaKaRa，Lenti-X，632180)瞬时转染人Claudin18.1表达质粒，检测单克隆抗体与人Claudin18.1的结合活性，结果如图2所示，显示单克隆抗体与过表达人Claudin18.1的293细胞结合活性存在不同水平。
实施例2：小鼠单克隆抗体基因调取
将所筛选的阳性克隆的杂交瘤细胞裂解，提取mRNA后逆转录得cDNA。以此cDNA为模板，采用PCR方法分别扩增出鼠IgG抗体的轻链和重链可变区核酸序列，对重链可变区、轻链可变区进行分析，其编码的重链可变区含有如SEQ ID NO.1所示的亲本序列(TYGVH)、如SEQ ID NO.2所示的亲本序列(VIWNGGNTDYNAAFIS)、以及如SEQ ID NO.3所示的亲本序列(NRRGGGFGMDY)；轻链可变区含有如SEQ ID NO.4所示的亲本序列(KSSQSLLNGGIQKNYLT)、如SEQ ID NO.5所示的亲本序列(WASTRES)、以及如SEQ ID NO.6所示的亲本序列(QNAYTYPFT)。
然后，通过序列末端互补的方法，拼接重链可变区或轻链可变区与其对应的人源抗体的恒定区序列，将全长的嵌合抗体的重链和轻链片段，均包含信号肽，分别克隆入pCDNA3.1(Invitrogen)质粒。共转染轻、重链质粒至293F细胞，培养5天，收集上清，采用proteinA(GE)亲和层析纯化上清，最终获得重组表达的抗人Claudin18.2的嵌合抗体。
所述的抗人Claudin18.2的嵌合抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
QVQLKQSGPDLVHPSQSLSISCTVSGFSLTTYGVHWIRQSPGKGLEWLGVIWNGGNTDYNAAFISRLSITKDNSKSQVFFKMNSLLPSDTAIYYCARNRRGGGFGMDYWGQGTSVTVSS；
所述的抗人Claudin18.2的嵌合抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNGGIQKNYLTWYQQRPGQPPKLLFFWASTRESGVPVRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIK。
实施例3：人源化的设计及表达
实施例3是将实施例2中获取的鼠源特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体进行人源化，具体按照以下步骤进行：
分析鼠源抗体序列，与IMGT的人胚系(germ line)基因比对，最终确定IGKV4-1*01或IGKV3-7*02为轻链的人源化构架序列，确定IGHV3-33*01或IGHV4-4*08为重链人源化构架序列，然后分别选择合适的FR4人源模板，通过CDR-grafting，将重链和轻链的CDR并置到构架序列；同时，对构架区上的关键位点进行回复突变设计，得到若干人源化抗体可变区，具体可变区序列如表1所示。
表1 Claudin18.2人源化抗体的可变区序列
抗体名称 重链可变区 轻链可变区
HA1LA1 SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.13
HA1LA2 SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.14
HA1LB1 SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.15
HA1LB2 SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.16
HA2LA1 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.13
HA2LB1 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.15
HA3LA1 SEQ ID NO.11 SEQ ID NO.13
HA3LA2 SEQ ID NO.11 SEQ ID NO.14
HA3LB1 SEQ ID NO.11 SEQ ID NO.15
HA3LB2 SEQ ID NO.11 SEQ ID NO.16
HB2LA2 SEQ ID NO.12 SEQ ID NO.14
HB2LB2 SEQ ID NO.12 SEQ ID NO.16
通过overlap-PCR法，分别将抗体重轻链可变区与对应的抗体恒定区连接，获得全长抗体重轻链序列，然后，将全长抗体重轻链序列分别构建到pCDNA3.1表达质粒。将抗体重轻表达质粒共瞬转至293F细胞，培养5天，收集上清，采用proteinA亲和层析纯化。
实施例4：抗体与过表达细胞结合活性测定
采用PEI转染法，将人Claudin18.1或人Claudin18.2表达质粒转染293细胞(TaKaRa，Lenti-X，632180)，隔天使用。将两种过表达细胞置于反应板内，1％BSA封闭，室温孵育1小时；加入梯度稀释抗体，100uL/孔，室温孵育1小时，PBS洗一次，然后，加入羊抗人IgG-HRP(Jackson Immuno)，每孔100uL，室温反应1小时，PBS洗两次，最后，加入TMB显色，后以1M硫酸终止，酶标仪于450nm读数。
如图3所示，细胞结合实验表明，不同抗Claudin18.2人源化抗体结合EC50都在10ng/mL左右。另外，与对照抗体(来自专利CN20148000912，其可变区序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，其全长抗体的制备方法同实施例2描述)的结合活性相比,如图4所示，HA1LA1的EC50(27.96ng/ml)优于对照抗体的EC50(118.6ng/mL)，同时，不与Claudin18.1表达细胞结合。
实施例5：抗体与人Claudin18.2重组蛋白结合活性测定
包被人Claudin18.2-His重组蛋白(Kactus,Cat.CLD-HE1821)于酶标板上，4℃过夜。封闭后加入梯度稀释的抗体，37℃反应1小时，PBST洗两次后，加入Goat anti-human-IgG-HRP，每孔100uL，37℃反应1小时，最后，PBST洗三次后，加入TMB显色后终止，酶标仪于450nm读数。
结果显示见图5，HA1LA1(EC50为490ng/mL)与重组蛋白结合活性明显优于对照抗体。
实施例6：抗体ADCC活性测定
将过表达人Claudin18.2的NUGC4胃癌细胞铺入细胞培养板内，5x103/well，次日加入梯度稀释的抗体，37℃孵育30分钟，再加入NK92细胞(效应细胞)(ATCC)，2x104/well，37℃孵育4小时，后使用LDH试剂盒(Dojido)进行显色，计算靶细胞的裂解百分比。
结果见图6所示，HA1LA1(EC50为0.01263nM)的ADCC活性强于对照抗体(EC50为0.05754nM)，而非特异的人IgG(hIgG)没有ADCC活性。
实施例7：抗Claudin18.2抗体的体内药物活性
采用MiaPaca2-Claudin 18.2细胞皮下裸小鼠模型和人胃癌PDX裸小鼠模型，检查抗Claudin18.2抗体抑制肿瘤生长的体内效果。在雌性裸小鼠皮下接种人胰腺癌细胞MiaPaca2-Claudin 18.2细胞或人胃癌组织细胞，待肿瘤体积生长至合适大小时，挑选肿瘤体积为100mm3左右的瘤小鼠，随机分组，分别为IgGisotype组(40mg/kg)、HA1LA1 40mg/kg组或和HA1LA1 10mg/kg组，给药当日测量小鼠体重和肿瘤体积，后续每周给药和测量2次，共静脉注射给药4周。
结果如图7和图8所示，在小鼠肿瘤模型中，HA1LA1显著抑制人胰腺癌细胞和人胃癌组织细胞移植肿瘤的生长。
实施例8：双特异性抗体的设计及表达
本发明中的双特异性抗体采用了IgG连接scfv的对称结构和knobs into hole的不对称结构。其中，本发明的IgG连接scfv的对称结构,即在一个IgG抗体重链的C端或N端，通过(GGGGS)3连接另一个抗原结合域的scfv片段，具体设计如表2。
表2对称结构
Figure BDA0002924209060000121
Figure BDA0002924209060000131
表2所示的抗PDL1抗体scfv片段的氨基酸序列为SEQ ID NO.29所示(重链可变区如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，轻链可变区如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列)，抗PDL1抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO.30所示，抗PDL1抗体轻链的氨基酸序列为SEQ IDNO.31所示，抗Claudin18.2抗体scfv片段的氨基酸序列为SEQ ID NO.32所示，抗Claudin18.2抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO.17所示，抗Claudin18.2抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO.18所示。
另外，本发明的knobs into hole的不对称结构，设计为一个抗原结合域为Fab结构，另一抗原结合域为scfv-FC结构，两者通过FC之间的二硫键结合，具体设计如表3。
表3不对称结构的设计
Figure BDA0002924209060000132
通过分子克隆的方法，分别构建上述双功能抗体的重轻链和scfv-FC结构表达质粒。然后，将双功能抗体对应的重轻链表达质粒或和scfv-FC结构表达质粒共瞬转至293F细胞，培养5天，收集上清，采用protein A亲和层析纯化。
实施例9：双特异性抗体的活性检测
(1)特异性抗体和PDL1细胞与Claudin18.2细胞的结合活性。方法参照实施例4。
对称双特异性抗体和PDL1细胞与Claudin18.2细胞的结合结果如图9所示，由图可见，双特异性抗体213H204CC，204H213CC，213CC204H和204CC213H均能PDL1细胞与Claudin18.2细胞的结合,且结合活性与单抗对照相当。其中，PDL1单抗对照为402F1,其抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO.30所示，抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO.31所示。Claudin18.2单抗对照为HA1LA1,抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO.17所示，Claudin18.2抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO.18所示。
不对称双特异性抗体和PDL1细胞与Claudin18.2细胞的结合结果如图10所示，由图可见，双特异性抗体1304CC和0413CC均能PDL1细胞与Claudin18.2细胞的结合,且与PDL1细胞结合活性与单抗对照402F1相当。
(2)双特异性抗体的ADCC活性测定
将靶细胞即过表达Claudin18.2的293细胞按照15000个/50μL/孔铺板，37℃，5％CO2培养箱培养过夜。次日，移走靶细胞培养上清。抗体用培养基梯度稀释，加入到靶细胞培养板内，37℃孵育1小时。取效应细胞Jurkat-ADCC(BPS Bioscience，60541)计数，按75000个/50μL/孔加入到50μL/孔的抗体中，置于37℃5％CO2培养箱孵育5小时。加入50μlBright-Glo(Promega，E2620)荧光素酶检测试剂，室温下反应后使用PheraStar酶标仪及相关软件程序进行读数。
对称双特异性抗体的ADCC活性结果如图11所示，由图可见，双特异性抗体213H204CC，204H213CC，213CC204H和204CC213H均能针对靶细胞，介导较强的ADCC活性，其中213H204CC和213CC204H的活性均优于单抗对照。
不对称双特异性抗体的ADCC活性结果如图12所示，由图可见，双特异性抗体1304CC和0413CC均能针对靶细胞介导较强的ADCC活性，活性与单抗对照抗体相当，其中HUT104为阴性抗体对照。
(3)双特异性抗体的抑制PDL1与PD1结合的活性
包被PDL1-Fc重组蛋白于酶标板上，4℃过夜；洗涤封闭后加入梯度稀释的双特异性抗体及对照抗体，37℃反应15分钟；加入一定浓度的PD1-Fc-Biotin至上述抗体反应板内，37℃反应1小时；洗涤后加入Streptavidin-HRP(Jackson Immuno)，每孔100uL，37℃反应1小时；洗涤后，加入TMB显色后终止，酶标仪于450nm读数。
双特异性抗体的抑制PDL1与PD1结合的活性结果如图13所示，由图可见，双特异性抗体213H204CC，204H213CC，213CC204H和204CC213H抑制PDL1与PD1结合的活性，与PDL1单抗对照402F1相当。
(4)双特异性抗体同时结合PDL1与Claudin18.2的活性检测
将过表达Claudin18.2的293细胞置于反应板内；加入梯度稀释抗体与上述细胞室温孵育10分钟；加入一定浓度的PDL1-Fc-Biotin，继续室温反应1小时；PBS洗涤后，加入Streptavidin-HRP(Jackson Immuno)，室温反应1小时；最后，PBS洗涤，加入TMB显色后终止，酶标仪于450nm读数。结果如图14所示,双特异性抗体213H204CC，204H213CC，213CC204H和204CC213H可同时结合PDL1与Claudin18.2两个靶点。
本发明的抗体可用基因工程技术制得，因为编码本发明人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。
一旦制得本发明的抗体分子，就可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱，亲和色谱，特别是通过蛋白A的亲和色谱和其它色谱柱)、离心、利用溶解度差异，或通过任何其它纯化蛋白质的标准技术。在许多实施方案中，抗体从细胞分泌到培养基中，通过收集培养基并进行纯化得到抗体。
本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作均为相关领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为更好理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本发明中，术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1,CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步分为高变区，称为互补决定区(CDR),CDR散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗原的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫***的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体***的第一成分(C1q)。构架区和互补决定区的范围已被精确定义(参见"SequencesofProteins of Immunological Interest,"E.Kabat等，U.S.Department of HealthandHuman Services,1991)。此处所讨论的所有抗体氨基酸序列的排序都参照Kabat***。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制，例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。
本发明中，术语“抗原结合域”是指保留与抗原特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括：(1)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(2)F(ab’)2片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(3)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341:544-546)；和(6)分离的互补决定区(CDR)。
本发明中，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。术语“人源化抗体”是指其中来源于另外一种哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列被移植到人构架序列上的抗体。在人构架序内也可以进行其它的修饰。术语“嵌合抗体”是其重链和轻链基因经过构建的抗体，特别是利用基因工程改造的属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因。例如，可以将鼠单克隆抗体基因的可变区片段连接到人抗体恒定区片段如γ1和γ3。当然，嵌合抗体的基因来源也可以使用其它哺乳动物物种。
本发明中，术语Knobs into holes技术,是指利用基因工程技术，使抗体的其中一条重链CH3上做一个钮(knob)的突变，在另一条重链CH3上做一个扣(hole)突变，便于两条重链咬合，形成异二聚体。
本发明所述至少90％的整体序列同一性是指序列同一性为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％，本发明中单克隆抗体或其抗原结合部分重链可变区和轻链可变区氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO：13具有至少90％的整体序列同一性，指单克隆抗体或其抗原结合部分重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的总和与氨基酸序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO：13的序列总和具有至少90％的序列同一性。
本发明Claudin18.2抗体的重链和轻链，以及Claudin18.2抗体还可以用于与Claudin18.2相关的科学研究，如发育生物学、细胞生物学、代谢、结构生物学、功能基因组学等多个领域的科学研究、或肿瘤、自身免疫性疾病等医学和药学的应用研究。
本发明所述Claudin18.2抗体可以为单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及前述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
本发明所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体和/或稀释剂。
本发明还可以是一种试剂或芯片，包含前述的Claudin18.2抗体。
本发明还公开了采用Claudin18.2抗体用来结合靶细胞的抗原位点和效应细胞的FC受***点，介导ADCC活性的方法，以及该抗体用于治疗相关疾病或使用含有该抗体的试剂盒进行相关诊断与检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏诺迈博生物医药科技有限公司
<120> 一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体及包含其的药物和试剂盒
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Tyr Gly Val His
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly Gly Ile Gln Lys Asn Tyr Leu
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Thr
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Asn Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val His Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Leu Pro Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Arg Gly Gly Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly
20 25 30
Gly Ile Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Val Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Arg Gly Gly Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Arg Gly Gly Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Arg Gly Gly Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Arg Gly Gly Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly
20 25 30
Gly Ile Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly
20 25 30
Gly Ile Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
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Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly
20 25 30
Gly Ile Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile
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Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly
20 25 30
Gly Ile Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Phe Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 17
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Arg Gly Gly Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly
20 25 30
Gly Ile Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
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Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ser Gly Tyr Trp Asn
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
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<400> 23
Tyr Arg Asp Trp Leu His Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Lys Ala Ser Gln Asn Val Met Asp Asn Val Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser
1 5
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<400> 26
Gln Gln Tyr Asn Gly Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 119
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Cys Leu Glu Tyr Ile
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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35 40 45
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Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
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35 40 45
Gly Tyr Val Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ile Pro Ser Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Tyr Arg Asp Trp Leu His Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Tyr Asn Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 30
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
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Gly Tyr Val Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ile Pro Ser Leu Lys
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65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Gly Tyr Arg Asp Trp Leu His Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Met Asp Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Gly Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 32
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Arg Gly Gly Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asn Gly Gly Ile Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
180 185 190
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 33
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Arg Gly Gly Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 34
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Cys Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ile Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Tyr Arg Asp Trp Leu His Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
145 150 155 160
Gln Asn Val Met Asp Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asn Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
485
<210> 35
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Tyr Arg Asp Trp Leu His Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 36
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Arg Gly Gly Gly Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Asn Gly Gly Ile Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
180 185 190
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
260 265 270
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
485 490

Claims (17)

1.一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述的重链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3；
所述的轻链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，
所述的单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列包含如下任一序列：SEQ ID NO:9，SEQ IDNO:10，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:12；
所述的单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列包含如下任一序列：SEQ ID NO:13，SEQID NO:14，SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：16。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体，其重链可变区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，其轻链可变区包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列与所述氨基酸序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO：13具有至少90％的整体序列同一性。
5.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体为IgG1、IgG2或IgG4同种型的全长抗体。
7.根据权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体为抗体片段或单链抗体。
8.一种双特异性抗体，包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，所述的第一抗原结构域来自如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的第二抗原结构域来自特异性结合人PDL1的抗PDL1抗体。
9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的抗PDL1抗体包含如下CDR区：
氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示重链可变区CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示的重链可变区CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的重链可变区CDR3，氨基酸序列如SEQID NO:24所示轻链可变区CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的轻链可变区CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的轻链可变区CDR3。
10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的抗PDL1抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述的抗PDL1抗体的轻链可变区包括如SEQ IDNO：28所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求8-10任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域通过FC连接或通过连接片段连接。
12.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其特征在于，
所述的FC连接采用Knobs into holes技术；
所述的连接片段为(GGGGS)3。
13.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域独立地为免疫球蛋白或其抗原结合片段；所述的抗原结合片段为半抗体、Fab、F(ab)2或单链抗体。
14.根据权利要求13所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的第一抗原结合结构域为免疫球蛋白，所述的第二抗原结合结构域为单链抗体。
15.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的第二抗原结合结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的scfv单链抗体。
16.一种用于治疗或缓解癌症的药物，包含如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或如权利要求8-15任一项所述的双特异性抗体。
17.一种试剂盒，包含如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或如权利要求8-15任一项所述的双特异性抗体。
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