CN112824537A - 一种通过rs524533来特异性检测少肌症的试剂盒 - Google Patents

一种通过rs524533来特异性检测少肌症的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过检测rs524533来特异性检测少肌症的试剂盒。该试剂盒包括检测rs524533号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与少肌症遗传易感性密切相关的rs524533上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体少肌症遗传易感性。

Description

一种通过rs524533来特异性检测少肌症的试剂盒
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域中SNP分型检测领域，具体涉及一种通过检测rs524533来特异性检测少肌症的试剂盒。
背景技术
少肌症又叫肌肉衰减综合症(Sarcopenia)，是一种随年龄增加，以骨骼肌肌纤维质量下降、肌肉力量减小、肌肉耐力及代谢能力下降、***和脂肪增多等为主要特征的老年慢性代谢性疾病。少肌症往往使老年人的活动能力降低，行走、坐立、登高和提重物等日常动作受影响，逐渐“手无缚鸡之力”。肌肉功能下降，导致老年人意外摔伤的几率升高40％。据统计，50％死于意外的老人，其死因是因为摔倒。少肌症老人患行动不便的风险是同龄老人的2-5倍，严重影响老人的生活质量和自理能力。
少肌症除增加残疾和丧失生活自理能力的风险外，还会促使骨质疏松、关节炎等疾病的发展，它同时也是诱发高血压、糖尿病、高血脂等老年疾病的重要原因。少肌症已成为全球残疾和死亡的主要原因之一。在70岁以下的老年人中有13％-24％患有少肌症，在80岁以上的人群中患病率高达50％甚至更高。与少肌症相关的年度经济损失超过了1000亿美元。
过去有关候选基因的大量研究已经表明，很多基因与人类肌肉量的变化相关。与人体瘦体重指数(LMI)相关的40％以上的基因变异可以产生性状差异。随着分子遗传学的进展，人们发现少肌症是多基因遗传病，许多国家都在开展少肌症的遗传关联研究。至今为止至少已通过分子遗传学手段检出了20个人类基因或染色体区域并被报道与少肌症相关。此外，遗传学和分子流行病学的证据均表明遗传因子涉及决定在特定饮食或用药情况下增加或损失肌肉量的易感性，以及在少肌症患者中发生其它相关疾病的高危险性。目前候选基因已经很多，但是绝大部分都在检测准确性上有待于进一步的提高。
至于检测少肌症基因的方法，目前常规的检测方法包括限制性片段长度多态性法(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)，其原理是当变异影响到某一限制性内切酶的酶切位点时，简单地通过酶切处理患者的PCR产物继而电泳检测是否有变异的方法。但是这种方法存在耗时长，操作繁琐，准确度不高等缺点。也有利用PCR结合DNA测序方法进行基因多态性位点的检测，但是这种方法在大规模人群筛查或检测多个基因多个位点的应用受到一定限制。因此有必要建立一种高通量、高效能、低成本的少肌症易感基因SNP分型方法，以实现临床快速检测或规模化人群筛查。
发明内容
本发明提供了一种通过检测rs524533来特异性检测少肌症的试剂盒。
本发明的目的之一是提供一种少肌症易感基因SNP分子标记的筛选方法，所述方法为通过分析弗雷明汉心脏病研究(FHS)、堪萨斯城骨质疏松研究样本(KCOS)、妇女健康初步计划(WHI)这三个样本的基因组序列以及通过双能X-射线分析仪测量的四肢肌肉含量，发现了分子标记位点rs524533，位置在6号染色体44240559，所述突变为C/T与人的肌肉含量直接相关。
本发明根据NCBI上公开的rs524533分子标记序列提供一种6p21.1染色体上rs524533分子标记的扩增引物对，所述引物对的上游引物：ACATCTTCTGTTTCATTGCC；下游引物：TTCTCTCCATATCCCTGTT；扩增片段大小：260bp。同时提供了一对检测引物对，基因型一荧光探针序列：5’-FAM-CTCTGCACTcTCCTGTACT-TAMRA-3’；基因型二荧光探针序列：5’-VIC-CTCTGCACTtTCCTGTACT-TAMRA-3’。
染色体6p21.1上的rs524533SNP检测芯片可用于单独或并行检测染色体6p21.1区段 C/T的突变。所述检测芯片采用本领域常规的构建方法制备获得。
本发明提供一种检测少肌症遗传易感性的试剂盒。该试剂盒包括：
检测rs524533SNP多态性基因型的特异性引物对SEQ ID NO：2和3所示；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。
本发明的主要优点：
本发明从染色体6p21.1上鉴定获得rs524533SNP标记可以用于鉴定人少肌症症状，所述鉴定具有准确性好，特异性高的优点；
本发明的检测方法步骤简单，SNP位点检测可通过一步PCR即可完成，含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
附图说明
图1是rs524533的凝胶迁移率(EMSA)实验结果图。
图2是rs524533的双荧光素酶报告基因实验结果图。
具体实施方式
实施例1SNP分子标记的获得
本发明共使用三个样本，包括弗雷明汉心脏病研究(FHS)、妇女健康倡议研究非洲裔美国人(WHI-AA)亚样本以及堪萨斯城骨质疏松症研究(KCOS)。前两个样本是从美国基因型和表型数据库(dbGAP)中获得，第三个样本是与少肌症研究专家邓红文教授课题组合作的样本。其中，FHS做为发现样本，WHI-AA和KCOS样本做为验证样本。
1，发现样本(FHS)
FHS是一个纵向前瞻性的队列，包括跨越三代欧洲血统的16000多名参与者。第一代由居住在美国马萨诸塞州弗明汉镇的5209名参与者组成。第二代是第一代成员的成年子女及其配偶，共有5124名参与者。第三代由4000多名参与者组成，他们是第一代的孙辈。
第一代参与者在第22或24次检查期间接受了双能量X射线仪器(DXA)的扫描。此仪器不仅能够测量骨密度，而且能够精确测量身体组分包括脂肪和肌肉的含量。第二代参与者在第6或7次检查期间接受了DXA扫描，第三代参与者在第2次检查期间接受了DXA 扫描。
2，验证样本
第一个验证样本是WHI-AA样本，它是通过dbGaP访问的WHI观察研究的子样本，共包括845名非洲裔美国人参与者。通过Affymetrix SNP 6.0微阵列进行基因分型，以及HologicQDR DXA仪器进行肌肉含量的测定。
第二个验证样本是KCOS样本，共包含2286名参与者。同样通过Affymetrix SNP6.0 微阵列进行基因分型，以及Hologic QDR DXA仪器进行肌肉含量的测定。
3，表型处理
在所有样本中，使用步进回归法筛查性别、年龄、年龄平方、身高、身高平方、以及从基因组数据计算出的前5个主成分(用于衡量种群分层效应)等协变量的显著性。为了校正脂肪含量的影响，脂肪含量也用于协变量校正。原始肌肉含量经过协变量校正后的残差使用正态分布的分位数来正态化。正态化后的残差用于下游关联分析。
4，基因分型及质控
所有样本使用高通量基因分型芯片分型。质控在样本层面以及SNP层面实现。在样本层面，使用plink软件分析X染色体推断性别，并和问卷调查表中的性别做比较。性别不符的个体从数据中删除。在SNP层面，不符合哈-温平衡的SNP从数据中删除。由于FHS是家系样本，其中不符合孟德尔规律的SNP也被删除。
5，基因型补缺
使用千人基因组的测序数据(2013年5月版本)对所有样本进行基因型补缺。首先从千人基因组网站下载240个测序个体的单体型数据，并对参考基因组(即千人基因组数据)和目标基因组(即GWAS样本)的等位基因做一致性检验，检验不符者将从目标基因组中删除。使用软件FISH开展基因型补缺，这个算法具有运算速度快，占用内存小，无需对目标基因组提前分相(phasing)等优点。软件参数默认设置。
6，关联分析
在发现样本FHS中，使用混合线性模型来检验校正后的肌肉含量和SNP间的遗传关联。在两个验证样本中，使用线性模型来验证发现样本的关联信号。
7，电泳迁移率实验(EMSA)
EMSA实验用到的细胞是小鼠C2C12成肌细胞。培养条件为37℃、5％CO2的加湿培养箱。使用添加了10％的胎牛血清和100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素的培养基中生长。
EMSA用于探讨rs524533与转录因子结合的能力。首先合成一段以rs524533为中心、长度为93bp的单链DNA探针序列，并使用生物素在3’端标记，随后通过PCR反应将该序列合成双链DNA探针序列。使用化学发光EMSA试剂盒,在室温下将从C2C12细胞中提取的核蛋白与DNA探针序列孵育20分钟。孵育产物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳1小时。经UV交联处理后，在含链霉亲和素-hrp结合物的封闭液中孵育15分钟后显影成像。
实验设立分别包含两个等位基因的比较组以及空白对照组。
8，双荧光素酶报告基因实验
双荧光素酶报告基因实验检验rs524533对下游基因表达的影响。首先合成一段以rs524533 为中心、长度为213bp的双链DNA序列。然后***到pGL3-启动子报告质粒的上游。再使用jetPRIME转染试剂将质粒转染到C2C12细胞中，并使用转染表达肾素荧光素酶基因的 PRL-TK载体作为转染效率的内部对照。24小时后用双荧光素酶试剂盒测量荧光素酶活性，并根据肾素荧光素酶活性进行标准化处理和分析。
同样，实验设立分别包含两个等位基因的比较组以及空白对照组。
9，结论
发现样本FHS的样本量是6587，其中55％是女性。在全基因组显著(GWS，5.0×10-8)水平上，共有15个SNP与肌肉含量相关。其中12个位于6p21.1，一个位于5q22.3，一个位于9q21.13，最后一个位于10q24.33。
在验证样本WHI-AA(N＝847)中，位于6p21.1的4个SNP是显著的(p<0.05)，并且与发现样本中的效应具有相同的方向。其余位点上的SNP均不显著。
在验证样本KCOS(N＝2219)中，上述验证出来的4个SNP也都显著(p<0.05)。同时，它们的效应方向与发现样本的相同。
结合发现样本和验证样本的分析，位于6p21.1位点上的4个SNP与肌肉含量有非常显著且可信的遗传关联。其中一个主要SNP是rs524533，其结果如下表1所示表1，rs524533的遗传关联结果
Figure RE-GDA0002390515300000051
注：等位基因C/T中C是起作用的等位基因。
rs524533的三种基因型TT、CT和CC所对应的腿部肌肉含量平均分别为15.49千克、15.09千克和14.56千克，相应于每个等位基因C减少约0.47千克。
为了进一步确定rs524533是否能够结合细胞内的转录因子，我们开展了EMSA实验，结果如图1所示。rs524533在两个等位基因的相同位置显示出迁移条带，表明rs524533确实结合了某个或者某些蛋白转录因子。此外，两个等位基因与转录因子的结合能力不同，具体表现为相应结合条带的灰度有差异。
在EMSA结果的基础上，我们通过双荧光素酶实验进一步探讨rs524533对细胞中基因表达的调控模式，结果如图2所示。与pGL3-启动子质粒相比，含有rs524533的质粒将荧光素酶的表达降低了30倍以上，表明该SNP具有抑制基因表达的调控模式。此外， rs524533的两个等位基因T和C的荧光素酶表达活性间具有统计学差异(p＝8.41×10-4)，表明该调控模式是等位基因特异性的，与前述EMSA结果一致，更好地佐证了rs524533是肌肉含量的遗传风险因子。
综上，rs524533的两个等位基因位点T和C能够很好地区分肌肉含量高和低的组。当等位基因为C时，表现为具有少肌症特性，当为T时不表现出少肌症特性。等位基因型 C导致了肌肉含量的降低，从而最终导致少肌症的发生，这种降低在统计学上是极端显著，因此可以通过检测该位点基因型来检测少肌症。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 胡文珠
<120> 一种通过rs524533来特异性检测少肌症的试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 260
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
acatcttctg tttcattgcc atttttgtgt ttgtcttcgg atgctctctg ggtaccatcc 60
tatccatctg tgtttgctgc ctgggcctct atctctggct ctgatccttc tctgcctctt 120
ggggtgtctc tctctgcact ytcctgtact ggcattccgg tcccctttcc tgtcctctgg 180
cttgctctgt gtcacttctg tttctacctc tggcccctgg ctcccatctt ggtctcacct 240
tttctctcca tatccctgtt 260
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
acatcttctg tttcattgcc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 3
aacagggata tggagagaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 4
ctctgcactc tcctgtact 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 5
ctctgcactt tcctgtact 19

Claims (7)

1.一种检测少肌症的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括能特异性检测与少肌症相关的SNP 位点的探针和引物。
2.如权利要求1 所述的试剂盒，所述试剂盒包括能特异性检测rs524533的探针和引物。
3.如权利要求2 所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括SEQ ID NO：2-5 所述的引物或探针序列。
4.SEQ ID NO：2-5 所述的引物或探针序列组在制备用于少肌症检测的试剂盒中的应用。
5.rs524533 做为检测少肌症的靶点的用途。
6.rs524533 在制备用于少肌症检测的试剂盒中的应用。
7.一种检测少肌症的方法，包括使用权利要求1-3 任一项所述的试剂盒。
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